JP2002508958A

JP2002508958A - Ｃｃｒ５あるいはｃｘｃｒ４を開裂するリボザイム核酸

Info

Publication number: JP2002508958A
Application number: JP2000540220A
Authority: JP
Inventors: イーグルズ，ピーター・アンソニー・ミンター; ヂオン，リチヤード・チーハオ
Original assignee: ビー・テイー・ジー・インターナシヨナル・リミテツド
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2002-03-26
Anticipated expiration: 2019-01-15
Also published as: JP4312957B2; EP1045901A1; US6916653B2; WO1999036518A1; HK1028788A1; DE69921609D1; ATE281518T1; DK1045901T3; AU2067799A; AU763325B2; ES2233017T3; US20020061585A1; CA2317895A1; DE69921609T2; EP1045901B1

Abstract

(57)【要約】少なくとも１個のＤＮＡベクターを含み、かかる単数又は複数のベクターが、ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下にあり、ＲＮＡへの転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂する標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含む、リポソームに組み込むことができるベクター系。好ましくはリボザイムＤＮＡは、第一認識配列（５’から３’）：ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４についてそれぞれｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔ、及びその下流に第二認識配列：ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４についてそれぞれａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、組換えＤＮＡテクノロジーの分野に属するものであり、リボザイム
に関する。

【０００２】関連技術の説明当該技術は現在、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に代表されるヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）を攻撃する多くの異なる方法、あるいはＨＩＶによる感染とｉｎ
ｖｉｖｏでのその進行に関わる細胞機序を探求している。最近になって、ヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）は、ウイルスエ
ンベロープ蛋白質と２つの細胞表面膜レセプタ：ＣＤ４及び経膜ケモカインレセ
プタの間で複合体を形成することによって標的細胞に入り込むことが示された。
細胞屈性が異なるＨＩＶ単離物は、侵入補因子として異なるサブセットのケモカ
インレセプタを使用する：マクロファージ親和性ＨＩＶは主としてＣＣＲ５を使
用するのに対し、二元親和性分離物はＣＣＲ５とＣＸＣＲ４（「フュージン（Ｆ
ｕｓｉｎ）」とも称される）レセプタの両方を用いる；ＣＸＣＲ４はＴ親和性ウ
イルスによっても使用される。

【０００３】ＣＣＲ５の役割はＳ．Ｏ’ＢｒｉｅｎとＭ．Ｄｅａｎ，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ，２８−３５（１９９７年９月）によって検討された。この
総説は、この段階のＨＩＶ感染あるいは維持を遮断しうるいくつかの方法を示唆
している。かかる方法は次のものを含む： −天然ケモカインと競合するケモカイン誘導体を使用することによる、あるいは
合成抗体を使用することによる、ＨＩＶに関するＣＣＲ５上の結合部位の遮断、
−ＣＣＲ５断片によるワクチン接種、 −その産物が、ＣＣＲ５が産生されるのを妨げる若しくはＣＣＲ５がＨＩＶに関
するドッキング部位として働くのを停止させる新しい遺伝子。

【０００４】ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／４５５４３号は、抗体による治療、ＣＣＲ５の突
然変異体を作製しておとり（デコイ）として使用し、それによって細胞の融合を
妨げること、ＣＣＲ５をコードするＤＮＡの発現を防ぐためにＣＣＲ５に結合す
る作用物質及びアンチセンスオリゴマーとリボザイムを使用することを含めて、
様々な方法でＣＣＲ５レセプタの作用あるいは産生を阻害することを提案してい
る。

【０００５】ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／４４０５５号は同様に、ＣＸＣＲ４を含めた他のケモ
カインレセプタにまでコンセプトを拡大して、ＣＣＲ５レセプタの作用あるいは
産生を阻害する多くの方法を提案している。

【０００６】ＡｎｔｉｖｉｒａｌＡｇｅｎｔｓＢｕｌｌｅｔｉｎ１０（第９号）、２
６１−２６２（１９９７年９月）の中の“ＴｒｏｊａｎＨｏｒｓｅＶｉｒｕ
ｓ’ ＣｏｎｔｒｏｌｓＨＩＶｉｎｖｉｔｒｏ”と題する論文において、
ＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現するように改変した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
はｉｎｖｉｔｒｏでＨＩＶ細胞を選択的に標的し、死滅させうることが報告さ
れている。このアプローチは問題があると述べられているが、「ＨＩＶプロテア
ーゼ阻害因子、他の抗レトロウイルス薬剤、アンチセンス作用物質、遺伝子治療
、リボザイムあるいはＨＩＶ感染細胞に対する他の作用物質を標的送達するため
に、ＨＩＶ模倣弱毒化ウイルスあるいは表面細胞ＨＩＶレセプタを持つリポソー
ムを使用する潜在的可能性を強調している」。

【０００７】発明の要旨ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４蛋白質をコードするｍＲＮＡが、これらの蛋白質の産生
を遮断するほど有効にハンマーヘッドリボザイムによって開裂されうることが認
められた。

【０００８】ひとつの局面では、本発明は、少なくとも１個のＤＮＡベクターを含み、かか
る単数又は複数のベクターが、ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下に
あり、ＲＮＡへの転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺
伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂する、標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤ
ＮＡ配列を含むベクター系を提供する。

【０００９】リボザイムＤＮＡ配列のプロモーターへの結合は直接的であり、１個のベクタ
ーだけを用いる必要がある。しかし、間接結合にはプロモーターの作用を増幅す
るという利点がある。そのような間接結合は通常２個又はそれ以上のベクターを
必要とする。従って本発明は、少なくとも２個のＤＮＡベクターを含み、第一ベ
クターが、第二プロモーターに作用することができる活性化因子蛋白質を産生す
るように発現されうる遺伝子に機能的に結合された、ヒト細胞において有効な第
一プロモーターを含み、第二ベクターが、上述した標的開裂ハンマーヘッドリボ
ザイムＤＮＡ配列に機能的に結合された第二プロモーターを含むベクター系を包
含する。リボザイムＤＮＡ配列は、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ＲＮＡを開裂する
ための単一配列、あるいはＣＣＲ５とＣＸＣＲ４ＲＮＡの両方を開裂するため
の複数配列を含みうる。本文中で使用するとき「ベクター系」という用語は、１
個のベクターあるいは２個又はそれ以上のベクターのキット又は組成物を包含す
る一般的な用語である。

【００１０】厳密には、リボザイムはＲＮＡ標的を開裂するＲＮＡ分子である。一部の文献
は、ＲＮＡに転写される、従って本来のリボザイムを生じるＤＮＡ分子を表すの
にこの語を使用している。本明細書では、「リボザイムＤＮＡ」の語は本来のリ
ボザイムに転写されうるＤＮＡを意味する。

【００１１】本発明は、上記に定義したようなＤＮＡベクター系を含むリポソーム及びかか
るリポソームを含む製薬組成物を包含する。

【００１２】さらに、本発明は、感染、特にＨＩＶ及びＡＩＤＳに関連する疾患の治療に使
用するための、上述したようなベクター、組成物及びリポソームを包含する。本
発明はまた、そのような目的のための医学的製剤の製造における核酸、ベクター
あるいはリポソームの使用も包含する。さらに、特許法で認められる場合には（
例えばオーストラリア、米国）、ベクター、組成物あるいはリポソームを有効用
量で、あるいはもうひとつ別の治療と組み合わせて投与するときには有効用量の
一部として患者に投与することを含む、ＨＩＶ感染を生じている患者を治療する
方法を包含する。

【００１３】さらに本発明は、リボザイムＤＮＡをそれ自体として及びベクター内に含まれ
るリボザイムＤＮＡ配列として包含し、かかるリボザイムＤＮＡは標的開裂リボ
ザイム配列の下流に３’自己触媒的ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含み
、その結果リボザイムＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、２個のハンマーヘッド
に接合する共通の第三ステムと共に、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを標的
する標的開裂リボザイムの第一及び第二ステムと、３’自己触媒的リボザイムの
第一及び第二ステムを備えた二重ハンマーヘッドとして表現される形態を持つ。
この第三ステムは、塩基対合の際に標的開裂リボザイムと３’自己触媒的リボザ
イムのハンマーヘッドに接合する上記の共通ステムを形成するように、好ましく
は自己触媒的リボザイム配列の３’末端近くの少なくとも４個の塩基の相補的配
列と塩基対合することができる、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４リボザイム配列の３’
末端近くの少なくとも４個の塩基である。

【００１４】どのような文法形態でも本文中で使用するときには常に、「含む」という動詞
は、「〜から成る」又は「包含する」ことを意味する。

【００１５】追加先行技術ＡＩＤＳＷｅｅｋｌｙＰｌｕｓ１９９７年５月１９日、ｐ．３１は、Ｄ
ｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＮｏｖｅｌＴｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｇｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅ２１^ｓｔＣｅｎｔｕｒ
ｙと題するＫｅｙｓｔｏｎｅＳｙｍｐｏｓｉａｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１９９７年５月１６日−２１日、
Ｔａｍａｒｒｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡに提出されたＲ．Ｔｒｉｔｚらに
よる抄録の報告を載せている。この抄録は、ＣＣＲ５がリボザイム遺伝子治療の
適切な標的であると提案し、ＣＣＲ５ＲＮＡを標的するいくつかのヘアピンリ
ボザイムを作製したことを報告している。

【００１６】（好ましい実施態様の説明）本発明におけるリボザイムはハンマーヘッド型である。リボザイムは、所望す
る標的部位でＲＮＡを開裂する触媒配列を持つ。ハンマーヘッドリボザイムの触
媒配列は通常、（１）ｃｕｇａｎｇａ・・・及び（２）・・・ｇａａという形態
（５’から３’まで）であり、ｎはヌクレオチドである。本発明においては、ｎ
は好ましくはｕである。それらは安定な構造、好ましくはステムループによって
分けられている。本発明におけるリボザイムＤＮＡはこの形態を持ちうる（ウラ
シルをチミンで置換する）。

【００１７】本発明のために最も好ましい標的配列は次のものである：ＣＣＲ５：５’ ｃａａｇｕｃｃａａｕｃｕａ３’（配列番号：１
）ＣＸＣＲ４：５’ ａｃａａｃｇｕｃａｇｕｇａｇ３’（配列番号：２
）下線を付した部分が、本発明で使用するハンマーヘッドリボザイムが必要とす
る３個の塩基の基本配列である。

【００１８】触媒配列のすぐ上流と下流に標的結合（すなわち標的認識）配列がある。標的
はＲＮＡであり、ＲＮＡであるリボザイムは標的ＲＮＡと相補的である（以下に
説明するように、標的中に存在する付加的なｃヌクレオチドは考慮しない）。

【００１９】従って、好ましい標的及びそれに結合する好ましいリボザイムに関わる配列は
次のように要約できるであろう： CCR5 (a)5’ Caagu c* caaucua 3’(標的RNA) (b)3’ guuca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-guuagau 5’(rzRNA) (c)5’ caatg-触媒配列-ステムループ-触媒配列-caatcta 3’(rzDNA;鎖1) (d)3’ gttca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-gttagat 5’(rzDNA;鎖2) CXCR4 (a)5’acaacgu c* agugag 3’(標的RNA) (b)3’ uguugca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-ucacuc 5’(rzRNA) (c)5’ acaacgt-触媒配列-ステムループ-触媒配列-agtgag 3’(rzDNA;鎖1) (d)3’ tgttgca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-tcactc 5’(rzDNA;鎖2) (*=開裂されたヌクレオチド、cat.seq.=触媒配列;s.l.=ステムループ) ＣＣＲ５ｍＲＮＡを標的するリボザイムについては、５’ｕａｇａｕｕｇ３
’が最初の標的認識配列であり、５’ａｃｕｕｇ３’が２番目の標的認識配列で
ある。標的中の開裂部位はｇｕｃ^＊である；星印をつけたｃヌクレオチドは開裂
部位であり、従ってリボザイム中の対応部分を持たない。ＣＣＲ５に関する配列
（ａ）と（ｂ）は図面の図４に示されている。ＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを標的とす
るリポザイムに関しては、５’ｃｕｃａｃｕ３’と５’ａｃｇｕｕｇｕ３’が第
一及び第二標的認識配列である。標的中の開裂部位はやはりｇｕｃ^＊である。本
発明で使用するためのリボザイムの好ましい亜属は、これらの標的認識配列を持
つものである。

【００２０】下記の説明では、ハンマーヘッドリボザイムの構造をＲＮＡの見地から論じる
が、それらが転写されるリボザイムＤＮＡは、ウラシルをチミンで置換したもの
に対応することは理解されるであろう。また、本文中で示すこれらのリボザイム
のコンフォメーションは塩基対合や他のエネルギー関係から明白なものであるこ
と、また本発明はいかなる意味においてもこれらの図面によって限定されない、
すなわち本発明が同じ分子の他のコンフォメーションを包含することも認識され
るであろう。

【００２１】ハンマーヘッドリボザイムは２つのステムループによって保持されており、第
一ステムループ（「ステムＩ」）は第一標的認識配列に先行し、第二ステムルー
プ（「ステムＩＩ」）は第一と第二の標的認識配列の間に位置する。これら２つ
のステムループはどのような所望形態も持ちうるが、典型的にはステムを形成す
る３−５個の相補的塩基対とループ中の４又は５個の塩基を含む。ＣＣＲ５ｍ
ＲＮＡを標的するリボザイムに関する図１は、本来のステム部分の４個の塩基対
とループ部分の５個の塩基を例示している。ＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを標的するリ
ボザイムに関する図１１は、ステムＩの５個の塩基対、ステムＩＩの４個及び各
ループ部分の４個の塩基対を例示している。

【００２２】第二触媒配列に続いて、第二標的認識配列から成る又は第二標的認識配列を含
む３番目のステムが存在する。本発明のひとつの実施態様では、ステムＩＩＩは
３’末端にｇｕｃの特別な配列を持ち、これは、天然に存在しなければ部分的あ
るいは全面的に付加することができる。本発明におけるように、ｇが天然の末端
である場合には、その最後の数個の塩基が第二触媒配列の塩基と対合するように
ｕｃを突出部分として付加する。図１参照。図１では、これはａ−ｕ及びｇ−ｃ
塩基対によって実現されている。このタイプの構築は、リボザイムが３’自己触
媒配列を含まないときに適するが、３’自己触媒配列を含むときにも使用できる
。

【００２３】より好ましくは、リボザイムは３’自己触媒配列を含む。そのような配列は、
それ自体が、特にＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／１７４３３号（Ｍｅｄｉｃａｌ
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＣａｒｏｌｉｎａ）から既知である
。３’自己触媒配列は、好ましくは標的開裂リボザイムの３’末端近くの配列が
その３’末端で又はその近くで自己触媒配列の下流部分と塩基対合するように設
計される。これらの好ましい構築物は、ステムＩＩＩに少なくとも４個の塩基対
、すなわち自己触媒的リボザイムからの４個と塩基対合する標的開裂リボザイム
からの４個の塩基対を持つ。それらの塩基対を１０個持つ場合もある。典型的に
はステムＩＩＩを越えて伸びる非塩基対合ヌクレオチドの突出部は、標的開裂リ
ボザイム配列の３’末端の１又は２個だけと自己触媒配列の３’末端の０−５個
である。そのような構築は、図２でＣＣＲ５に関して、また図１１でＣＸＣＲ４
に関して例示されている。ここでは、３’自己触媒（＝自己開裂）配列は、３’
開裂部位（ｇｕｃ）、第一ステムループ（「ｓｃａｓステムＩ」）、第二ステム
ループ（「ｓｃａｓステムＩＩ」）及び第三ステム（「ｓｃａｓステムＩＩＩ」
）を含むハンマーヘッドリボザイムの形態であり、第三ステムは標的開裂リボザ
イムのステムＩＩＩと塩基対合する。開裂はｇｕｃ３’開裂部位のｃのあとで起
こる。ｓｃａｓステムＩとｓｃａｓステムＩＩの間の触媒配列（ｃｕｇａｕｇａ
）はハンマーヘッド構造を安定させるのを助けるものであり、第ＷＯ９７／１７
４３３号においても使用されている。ステムＩＩとＩＩＩの間にｇａａ触媒部位
が位置する。

【００２４】本発明において使用するリボザイムは、例えばＷＯ９７／１７４３３号に述べ
られているような５’自己触媒配列を含みうる。ＷＯ９７／１７４３３号には、
所望する標的認識配列及び触媒配列を挿入することができる、中心に位置するＢ
ｇ／ＩＩクローニング部位、ａｇａｔｃｔを含む二重リボザイムが提供されてい
る。ＷＯ９７／１７４３３号では、インサートは４２塩基である。これらは、第
一標的認識配列（８塩基）、触媒及び構造安定化配列（２３塩基）及び第二標的
認識配列（１１塩基、その内最後の２個はＢｇ／ＩＩ部位のａｇである）から成
る。重要でない改変を加えて、例えばＷＯ９７／１７４３３号の２３塩基を３６
塩基のＤＮＡ等価物、図１の１３‐４８に置換し、その３’末端のＢｇ／ＩＩ部
位にクローニングするために必要なヌクレオチドを付加して、同じ構築物を本発
明に適合させることができる。この構築物では、ステムＩを削除して、５’自己
触媒部位を含むＷＯ９７／１７４３３号の５’配列に置き換える。しかし、ＷＯ
９７／１７４３３号では触媒部位の間の配列部分は緊密なステムループの形態で
はなく、そのためあまり構造が安定していないと思われる。

【００２５】本発明における構築物は、リボザイムＤＮＡを含む１又はそれ以上のベクター
である。真核細胞、特にヒト細胞において有効であるためには、リボザイムＤＮ
Ａは直接又は間接的に真核細胞プロモーターによって制御されなければならない
。特に適切なそのようなプロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターであ
る。トランスフェクトされる宿主細胞中の内因性ポリメラーゼに全面的に依存す
るのではなく、ＲＮＡの転写のためのＲＮＡポリメラーゼの他の供給源を提供す
ることも好ましい。好ましくはポリメラーゼは、典型的にはｉｎｔｒａｎｓで
作用することによってプロモーターの作用を触媒するものである。すなわち、最
初のＤＮＡ分子又はＤＮＡの長さが発現されて、もうひとつのＤＮＡ分子又はＤ
ＮＡの異なる長さに含まれるプロモーターに作用するポリメラーゼを産生し、そ
れがリボザイムＤＮＡの転写を促進する。好都合には、ポリメラーゼをコードす
るＤＮＡはベクター内のリボザイムＤＮＡの下流に位置する。ＤＮＡによって産
生されるポリメラーゼはそれ自体がプロモーターを刺激するように「フィードバ
ックする」ので、今度はｉｎｃｉｓで作用する。例えば、図１７、プラスミド
２あるいは図１８の自己ポリメラーゼベクター参照。

【００２６】図１７を参照すると、プラスミド２はＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ＲＮＡ又はそ
の両方を開裂するリボザイムＤＮＡ「ｒｚ１」を含む。しかし、ＨＩＶをその感
染、増殖及び複製の周期中１つ以上の時点で攻撃することが望ましいと長い間考
えられてきた。従って、同じベクターが、ＨＩＶによって産生される、又はＨＩ
Ｖがその増殖又は複製のために依存する蛋白質を生成するのに必要な、他のＲＮ
Ａを標的する１又はそれ以上の他の種のリボザイムＤＮＡを含みうる。例えば、
図１７はｒｚ１、ｒｚ２及びｒｚ３の３種類のリボザイムＤＮＡを例示している
。これらのいずれか１つがＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ＲＮＡ又はその両方に対す
るものと考えられ、他は存在しないかあるいはＨＩＶ又はケモカインレセプタに
よって産生されるもうひとつ別のＲＮＡを標的することができる。特に好ましい
のは、ケモカインレセプタＣＣＲ２ｂ又はＣＣＲ３のｍＲＮＡを標的するリボザ
イム配列である。ＣＸＣＲ４のＲＮＡ／ＤＮＡ配列はＢ．Ｆｅｄｅｒｓｐｐｉｅ
ｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１６，７０７−７１２（１９９３）に記述されている
。ＣＣＲ２ｂ及びＣＣＲ３のＲＮＡ／ＤＮＡ配列も既知であり、これらのケモカ
インレセプタを標的するリボザイムを、好ましくはＣＣＲ５やＣＸＣＲ４に関す
るものと同様にして開発することが可能である。これまではヒト単球化学誘引性
蛋白質１レセプタ（ＭＣＰ−１ＲＢ）と呼ばれていたＣＣＲ２ｂについてはＧｅ
ｎＢａｎｋ，受託番号Ｕ０３９０５及びＩ．Ｆ．Ｃｈａｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，２７５２−２７５６（１９９４）参照
、そしてＣＣＲ３についてはＧｅｎＢａｎｋ、受託番号Ｕ２８６９４及びＣ．Ｃ
ｏｍｂａｄｉｅｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１６４９１−１６４
９４及び３０２３５（１９９５）及び同上、２７１、１１０３４（１９９６）参
照。ＨＩＶ感染におけるＣＣＲ２ｂとＣＣＲ３の役割は、Ｂ．Ｊ．Ｄｏｒａｎｚ
，Ｃｅｌｌ８５，１１４９−１１５８（１９９６）及びＲ．Ｉ．Ｃｏｎｎｏｒ
，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６２１−６２８（１９９７）によって記述され
ている。

【００２７】もうひとつの標的は、ＨＩＶウイルスｍＲＮＡの３’末端の配列（ＤＮＡで言
えば５’リーダー配列）である。ヘアピンリボザイムを記述し、標的を同定して
いるＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／０７６６７号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）参照。

【００２８】プロモーターを「キックスタートさせる」ためには、酵素それ自体として、あ
るいはより好ましくはこの目的に供されるもうひとつ別のベクターの形態で、ポ
リメラーゼの別個のソースを提供することが望ましく、かかるもうひとつのベク
ターは好ましくはプラスミドである。図１７、プラスミド１及び図１８参照。

【００２９】図１８を参照すると、第一プラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子の転写を推進
するＣＭＶプロモーターを含み、第二プラスミドはＴ７プロモーターとＴ７ポリ
メラーゼ産生のための翻訳エンハンサー（ＩＲＥＳとして例示され、ＥＭＣウイ
ルスからのものが図示されている）を含み、さらに第三プラスミドでは、最初の
２つのプラスミドによって産生されるポリメラーゼによって活性化されるＴ７プ
ロモーターがＣＣＲ５及び／あるいはＣＸＣＲ４リボザイムの転写を推進する。
図示したものの代わりに他の翻訳エンハンサーも使用できる。

【００３０】他の標的は、ＬＴＲ（ロングターミナルリピート）及びＨＩＶのｔａｔ遺伝子
領域である。このためのハンマーヘッドリボザイムはＰＣＴ出願公開第ＷＯ９５
／０４８１８号に記述されており、これはｇａｇ遺伝子［Ｃｈａｎｇら、Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２，２３（１９９０）及びＮ．Ｓａ
ｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１２２２−１２２５（１９９０）］及び
ｖｉｆ遺伝子［Ｅ．Ｕ．Ｌｏｒｅｎｔｚｅｎら、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ５，
１７−２３（１９９１）］を含めて、これまでに標的された他のＨＩＶ遺伝子の
目録も含んでいる。

【００３１】効率を高めるため、図１７に示すように、各リボザイム配列ならびにポリメラ
ーゼ配列の前にプロモーターを挿入することができる。しかしこの配置は、遺伝
子の順序を変化させる１個のプロモーターを使用して変えることができる。また
、プラスミド２の代わりにいくつかのベクターを使用することにより、リボザイ
ムの発現を変化させうる。

【００３２】使用しうる送達の方法は、薬剤送達ビヒクル、特にリポソーム中への被包、レ
トロウイルスベクターによる形質導入、及びコレステロールとの接合を含む。

【００３３】薬剤送達ビヒクルは全身投与と局所投与の両方に有効である。それらは徐放性
レザバーとして働くように、あるいは内容物を直接標的細胞に送達するようにデ
ザインすることができる。そのような特殊薬剤送達ビヒクルの一部の例は、リポ
ソーム、ヒドロゲル、サイクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生物
粘着性ミクロスフィアである。

【００３４】リポソームが好ましい。リポソームは、細胞膜の脂質と同じように配列された
脂質から成る中空球状小胞である。内部に水溶性化合物を捕捉する水性空間を持
ち、サイズは直径０．０５から数ミクロンの範囲である。リポソームはＤＮＡを
細胞に送達できるので、核酸は生物学的に活性なままである。

【００３５】リポソーム形成の技術において既知であるように、リポソームはジアルキル又
はジアシルグリセロール又はホスファチジルコリンのようなリポソーム形成脂質
とＤＮＡを混合することによって容易に調製できる。Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉら、Ａ
ＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ
８，１８３−１８９（１９９２）参照。

【００３６】本発明において有用なリポソーム製剤は次のものを含む：（ａ）分子比のポリ
カチオン性脂質を含むリポフェクタミン試薬（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）、（ｂ）２：１の比率の陽イオン脂質、ＤＤＡ
Ｂ及びＤＯＰＥ、Ｒ．Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４，２４
１１−２４１８，（１９９４）；及び（ｃ）例えば１：１のモル比で、任意にＤ
ＯＰＥと組み合わせたＤＭＲＩＥ（ＶＩＣＡＬＣｏｒｐ．ＳａｎＤｉｅｇｏ
，ＣＡ，ＵＳＡ）。より新しいリポソーム、例えば血清耐性陽イオン脂質ＧＳ２
８８８、Ｊ．Ｇ．Ｌｅｗｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９３，３１７６（１９９６）やポリリシン／ＤＮＡ複合体を含むリポソーム
、Ｓ．ＬｉとＬ．Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ＬｉｐｏｓｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ７，
６３−７５（１９９７）も使用できる。

【００３７】ナノ粒子やヒドロゲル担体が化学療法剤や蛋白質ベースの薬剤のために開発さ
れたものであり、従って本発明のためのリボザイム送達に適合させうる。

【００３８】もうひとつの送達方法はＴ細胞を通してである。適合性Ｔ細胞、好ましくは患
者自身のＴ細胞を、例えばエレクトロポレーションによって本発明のリボザイム
ＤＮＡに感染させ、次にこれらの細胞を患者に注入する。ＤＮＡによるＴリンパ
球のエレクトロポレーションはＰＣＴ出願公開第ＷＯ９６／２２６３８号（Ｇｅ
ｎｅＳｈｅａｒｓＰｔｙＬｔｄ．）の実施例６に述べられており、この方
法は本発明に適用できる。

【００３９】製薬用途のための組成物は通常、好ましくは緩衝塩化マグネシウムとしてマグ
ネシウム塩を含み、これはリボザイムの機能に必要である。かかる組成物はまた
担体あるいは希釈剤も含むことができ、それには沈殿防止剤あるいは乳化剤が含
まれうる。

【００４０】好ましくはリポソーム製剤中の本発明のベクター系は、例えば静脈内、皮下、
腹腔内、鼻腔内あるいはクモ膜下腔内経路によって、好ましくは全身的に投与さ
れる。ベクター系によって供給されるリボザイムの用量は、適応疾患及び投与経
路に依存するが、２００ｍｇ／ｋｇまで、通常は少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重
／日とすべきである。投与回数は疾患、送達ビヒクル及び臨床試験からの有効性
データに依存するであろう。

【００４１】下記の実施例は本発明を例示するものである。

【００４２】実施例１．ＣＣＲ５ＤＮＡのクローニングと発現ヒトＣＣＲ５ｍＲＮＡを次のようにして健常者の血液サンプルから単離した
。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を「ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒ．Ｆ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａ
ｌｂｅｒｔ及びＮ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｐｕｂ．Ｖ．Ｃ．Ｈ．Ｖｅｒｌａｇ，
ＷｅｉｎｈｅｉｍＧｅｒｍａｎｙ（１９９３），第３巻、「Ｃｅｌｌｓａｎ
ｄＴｉｓｓｕｅｓ」、ｐ．１２１−１３５に述べられているように培養し、勾
配遠心分離を用いて単離する。次に細胞を１μｇ／ｍｌのベニバナインゲンレシ
チン（ＰＨＡ−Ｌ，Ｓｉｇｍａ）で２４時間刺激した。刺激した細胞を４Ｍグア
ニジニウムチオシアネートとＳＤＳ溶液で処理し、その後酸−フェノール分離及
びイソプロパノール沈殿法に供した。これらはすべて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、Ｊ．Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編集、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，第２版、１９８９に述べられている手順に従った。
次に標準的な手順によってオリゴｄＴ（１６−１８塩基）と逆転写酵素でｃＤＮ
Ａを作製した。Ｍ．Ｓａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５，３３６
２−３３６７（１９９６）に開示されているＤＮＡ配列に基づいてデザインした
プライマーでＰＣＲを実施した。すなわち、正プライマーの配列は 5’-tgcacagggt ggaacaagat gg-3’(配列番号:3) であり、逆プライマーの配列は 5’-cacttgagtc cgtgtcacaa gc-3’(配列番号:4) である。

【００４３】３’末端に（アデノシン）突出末端を与えるＴａｑポリメラーゼを使用した。
次にＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＵＫＬｔｄ．から市販されている
５．４Ｋｂプラスミド、ｐｃＤＮＡ３（図７参照）にＥｃｏＲＶ制限部位でクロ
ーニングした。その後、ベクター中に「ｔａクローニング」部位を生じるように
、ｔ（チミジン）ヌクレオチドをベクターのＥｃｏＲＶ制限部位の３’末端に付
加した。「ｔａクローニング」は、Ｊ．Ｍ．Ｃｌａｒｋ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６，９６７７―９６８６（１９８８）、米国特許
第５，４８７，９９３号及びＷｏｒｌｄｗｉｄｅＷｅｂのｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｇｅｎｅ−ｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏ４２．ｈｔｍに記述されている。次に
プラスミドを大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅにトランスフェクトし、スクリーニングし
た。ＣＣＲ５ＤＮＡインサートを完全に塩基配列決定し、公表されているＣＣ
Ｒ５ＤＮＡ配列と同一であることを認めた。図７に示すように、ｐｃＤＮＡ３
はマルチクローニングサイトの前にＴ７プロモーターを含む。Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｌｔｄ．の「ＰｒｏｔｏｃｏｌｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＧｕｉ
ｄｅ」に述べられているように「Ｒｉｂｏｍａｘ」溶液にＴ７ポリメラーゼを加
えることによりＣＣＲ５ｍＲＮＡ転写産物を生成した。

【００４４】２．ＣＣＲ５リボザイムＤＮＡカセット図３により詳細に示す、配列番号：５のヌクレオチド配列を有する完全なリボ
ザイムＤＮＡカセットを構築した：

【００４５】

【表１】これは、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いてコード配列の１−８０位か
らの正オリゴマーと１３７−５６位からの逆オリゴマーから作製した。オリゴマ
ーの３’末端の２５塩基は互いに全面的に相補的であり、２本の鎖をアニールし
た。完全な二本鎖になるようにＰＣＲ装置でＤＮＡポリメラーゼによる延長を行
った。５’末端と３’末端にそれぞれＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位を使用して１３
７の長さの二本鎖ＤＮＡカセットをｐＵＣ１９にクローニングした（図３参照）
。ＤＮＡ塩基配列決定によってその配列を確認した。市販のｐＵＣ１９がＴ７プ
ロモーターを含まないときに、カセットはこの部位を含む。

【００４６】図３及び１を参照して、カセットは順に（５’から３’）次のものを含む：

【００４７】

【表２】

【００４８】リボザイムＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａの「ＰｒｏｔｏｃｏｌｓａｎｄＡｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＧｕｉｄｅ」マニュアルに述べられているように「Ｒｉ
ｂｏｍａｘ」溶液にＴ７ポリメラーゼを加えて作製した。「Ｒｉｂｏｍａｘ」は
リボザイム活性に必要なマグネシウムイオンを含む平衡塩類溶液である。Ｔ７ポ
リメラーゼはＴ７プロモーターがＤＮＡからＲＮＡを転写する引き金になる。Ｒ
Ｎａｓｅ不含ＤＮａｓｅを使用し、次いでＲＮＡの酸／フェノール単離、さらに
エタノール沈殿によって転写産物を単離した。これは上記に引用した「Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」に述
べられているように実施した。

【００４９】ＲＮＡをアガロースゲル上におくと、開裂前のリボザイム（１０３塩基）は開
裂後のリボザイム（４８塩基、図１）から明瞭に分離された。ＲＮＡはゲルに含
まれる臭化エチジウムによって示した（ＵＶ光の下で視覚化した）。

【００５０】３．ヒトＣＣＲ５標的開裂上記の第１項で述べたように調製し、ｐｃＤＮＡ３にクローニングしたヒトＣ
ＣＲ５ＤＮＡを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ（上記に引用した「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」）にトランスフ
ェクトしてＣＣＲ５のＲＮＡ転写産物を生成した。

【００５１】上記の第２項で述べたプラスミドから転写したリボザイムを、リボザイム１モ
ル対ＣＣＲ５ＲＮＡ転写産物１０モルのモル比でＣＣＲ５ＲＮＡ転写産物と
共にインキュベートした。３７℃でインキュベートして３時間以内にＣＣＲ５
ｍＲＮＡ標的の完全な開裂が達成された。臭化エチジウムを含む２％アガロース
ゲル上にＲＮＡをおいた。ＵＶ照射下で撮影したゲル写真を図５ａと５ｂに示す
。図５ａの左側のレーンは１時間のインキュベーション後の産物を示しており、
ＣＣＲ５ｍＲＮＡは完全には開裂されておらず、上部の高分子量のバンドとし
て発現した。右側のレーンは分子量マーカから成る。左側のレーンには、（分子
量の高いものから順に）開裂後のＣＣＲ５ｍＲＮＡの３’断片、開裂後のＣＣ
Ｒ５ｍＲＮＡの５’断片及びリボザイムＲＮＡに帰せられる低分子量のバンド
も存在した。従って、ｒｚｓｃｃｒ５リボザイムが自己開裂して、ＣＣＲ５を触
媒的に開裂する活性リボザイムを産生することは明らかである。図５ｂを参照す
ると、右側のレーンは、ＣＣＲ５ｍＲＮＡが完全に開裂した、３時間のインキ
ュベーション後の産物を示している。図５ａ中の開裂していないｍＲＮＡを示す
バンドは消失しており、より低い分子量の開裂した産物の３’末端に対応するバ
ンドに置き代わっていた。ＣＣＲ５ｍＲＮＡの５’末端を含む断片は、図５ａ
よりもさらに低い分子量で認められる。ＣＣＲ５リボザイムを含む可視のバンド
は存在しない。これは、図５ａで使用したものより１０倍希薄なサンプルをゲル
に充填したためである。

【００５２】４．プラスミドのＰＢＭＣへのトランスフェクションプラスミドを血液銀行から入手した健常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にト
ランスフェクトした。細胞を単離し、Ｓ．Ｊ．Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５２，３３０−３４２（１９９４）の標準的な手順を用いてＰＨＡ−Ｌ
とＩＬ−２で刺激した。６日後、次のようにしてＧｉｂｃｏＬｉｆｅＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ．のものから適合させた手順で細胞を処理した。リ
ポソーム形成製剤、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ
．）１２μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ還元血清培地０．５ｍｌと混合した。プラ
スミド２０μｌ又は２００μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地０．５ｍｌ中で混合
物に加え、十分に混合した。次に溶液を室温で４５分間放置したあと、４百万個
の細胞を含むＰＢＭＣ懸濁液０．２ｍｌを加えた。１／４の培養上清と３／４の
ＲＰＭＩで細胞懸濁液を調製し、ＩＬ−２を加えて１０Ｕ／ｍｌにした。最終混
合物を５％ＣＯ_２と共に３７℃で４〜５時間インキュベートした。その後、分割
量の混合物を培地に加えることによって細胞を標準培地（ＲＰＭＩ６４０、ＩＬ
−２１０Ｕ／ｍｌ及び１０％ウシ胎児血清）に懸濁した。この時点での生存度
はトリパンブルー染色によって９０％以上であった。次に細胞を通常の方法で分
析用に培養した。

【００５３】上記の手順を最初に、マウスモロニー白血病ウイルスプロモーター及びリポー
ター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む９．８Ｋｂプラスミドを使
用して実施した。トランスフェクション後８日目に、内因性β−ガラクトシダー
ゼの阻害（ＲｅａｇｅｎｔｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）後、β−ガラクトシダーゼ産物をＦＡＣＳ−ＦＤＧ染
色によって分析した。パーセンテージとしての細胞数を縦軸に、蛍光の強さを横
軸にとった図６ａと６ｂに示すように、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）の明らかなシフトが存在し、これはプラスミドのヒトＰＢＭＣへのトラ
ンスフェクションが成功したことを示唆している。

【００５４】第９項に示すように、リボザイムＤＮＡを担う本発明のプラスミドを使用して
、わずかな変更を加えてこの手順を実施することができる。

【００５５】５．ＣＸＣＲ４リボザイムＤＮＡヒトＣＸＣＲ４リボザイムＤＮＡを、上記の第１項におけるようにヒトＣＣＲ
５リボザイムＤＮＡと同様にして調製した。ＣＸＣＲ４ＤＮＡ配列はＢ．Ｆｅ
ｄｅｒｓｐｐｉｅｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１６，７０７−７１２（１９９３）
に開示されている。正プライマーの配列は

【００５６】

【表３】（配列番号：６）であり、逆プライマーの配列は

【００５７】

【表４】（配列番号：７）であった。

【００５８】図１２により詳しく示すように、配列番号：８のヌクレオチド配列を持つリボ
ザイムＤＮＡカセットを構築した：

【００５９】

【表５】

【００６０】図１２を参照すると、カセットは順に（５’から３’）次のものを含む：

【００６１】

【表６】

【００６２】６．ポリメラーゼベクターの構築図１８を参照すると、ポリメラーゼベクターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）からのプロモーターとＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含む。完全なＴ７ポリメラー
ゼＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬから受託番号Ｍ．３８３０８の下に
入手可能である。本実施例では、改変したＴ７ポリメラーゼＤＮＡを入手し、プ
ラスミドｐＴ７Ａｕｔｏｌ［Ｊ．ＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆとＦ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９，６１−６８（１９９１）］でＰＣＲによって増
幅した。ＰＣＲに使用したプライマーは、正プライマーの５’末端にＥｃｏＲＩ
とＮｃｏＩ制限部位、逆プライマーの５’末端にＢａｍＨＩ制限部位が組み込ま
れていた（ＢａｍＨＩは後程自己ポリメラーゼベクターのクローニングのために
使用した）。プライマーの配列は次の通りであり、重複Ｔ７ポリメラーゼに下線
を付している。

【００６３】正プライマー： 5’acgaattccatggacacgattaacatcg3’(配列番号:9) EcoRI部位=gaattc;NcoI部位=ccatgg 逆プライマー： 5’atataaggatccttacgcgaacgcgaac3’(配列番号:10) BamHI部位=ggatcc Ｖｅｎｔポリメラーゼ（これはＰＣＲ産物において「平滑末端」を提供した）
を使用してＰＣＲを実施した。正プライマーによって導入されるＮｃｏＩ部位は
クローニング外の部位であり、Ｔ７ポリメラーゼの第二コドン、ＡｓｎからのＤ
ＮＡ（ａａｃ）をＡｓｐ（ｇａｃ）に変更することによって生成した。これはＴ
７ポリメラーゼの活性を変化させない。

【００６４】Ｔ７ポリメラーゼのＰＣＲ産物をｐＣＳ２−ＮＬＳプラスミド（［Ｒ．Ａ．Ｗ
．Ｒｕｐｐら、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ８，１３１１−
１３２３（１９９４）及びＤ．Ｌ．Ｔｕｒｎｅｒ＆Ｈ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ
、同上、１４３４−１４４７］にクローニングした。図８はプラスミドｐＣＳ２
−ＮＬＳのマップである。Ｔ７ポリメラーゼＤＮＡをＣＳ２のＥｃｏＲＩ部位及
びＳｎａＢ１（平滑末端）部位に導入し、時計回り方向でＮＬＳのすぐあとに位
置付けた。ｐＣＳ２中のＮＬＳ配列はこの段階では本発明の目的に必要なく、Ｎ
ＬＳ配列は２つのＮｃｏＩ部位の間に位置しているので、制限酵素ＮｃｏＩで切
断することによって削除した。次にＮｃｏＩ部位を通して再びプラスミドを連結
した。図９はこれらの操作を説明している。図１８に示すようにポリメラーゼプ
ラスミドベクターが完成した。かかるベクターはＣＭＶプロモーター（ＣＳ２ベ
クター中に既に存在する）を含み、これがＴ７ポリメラーゼの産生を開始させた
。Ｔ７ポリメラーゼはリボザイムＤＮＡベクター及び下記に詳述する自己ポリメ
ラーゼベクターに必要である。

【００６５】７．自己ポリメラーゼベクターの構築このベクターの目的は、Ｔ７ポリメラーゼを安定且つ適切に供給することであ
る。Ｔ７プロモーターを使用してＴ７ポリメラーゼの産生を開始させた。このポ
リメラーゼは、より多くのＴ７ポリメラーゼを産生する、より多くのＴ７プロモ
ーターを生成するように自己触媒的に作用した（図１８）。

【００６６】哺乳類の細胞質に非哺乳類プロモーターを通してトランスフェクトしたベクタ
ーによって作製したｍＲＮＡは通常、蛋白への翻訳に関して細胞によって認識さ
れない。細胞に、プロモーターによって転写されたＴ７ポリメラーゼｍＲＮＡを
翻訳させるために、脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスのＵＴＲ（非翻訳領域）配列（
Ｍｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ３４８，９１−９２（１９９０）を付加した。この
配列はリボソームのための結合部位を提供する翻訳エンハンサーとして働き、ｐ
ＴＭ１ベクターからＥＭＣＵＴＲをＰＣＲ増幅することによって得た。Ｂ．Ｍ
ｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ３４８，９１−９２（１９９０）参照。プライマーは
正鎖にＸｂａＩ制限部位を含んだ。このベクターから得られるＥＭＣ配列はＢａ
ｍＨＩやＮｃｏＩのようないくつかの構築された制限部位を含むため、逆プライ
マーには制限部位を導入しなかった。プライマーは次の通りであり、重複ＥＭＣ
配列に下線を付している：正プライマー： 5’gctctagaccacaacggtttccctctag3’(配列番号:11) XbaI部位=tctaga、逆プライマー： 5’cagcttcctttcgggctttgttagcagc3’(配列番号:12) 次にＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位を使用してＥＭＣ配列をｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖ
ａｇｅｎＬｔｄ．）にクローニングした。マップについては、例えばＲ＆
ＤＳｙｓｔｅｍｓＬｔｄ．，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，
Ｅｎｇｌａｎｄの１９９６／９７カタログ、ｐ．７４参照。ＥＭＣＵＴＲ配列
は、天然でその３’末端に、ＢａｍＨＩ部位の前にＮｃｏＩ制限部位を含んでい
た。従って、第６項で上述したように、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ部位を含むＴ７ポ
リメラーゼ配列は、Ｘ．Ｃｈｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈ２２，２１１４−２１２０（１９９４）が述べているように、ＥＭＣ
ＵＴＲ配列の下流でプラスミドに容易にクローニングされた。

【００６７】８．リボザイムベクターの構築完全なリボザイムＤＮＡとＴ７プロモーターを含むカセットを周知のプラスミ
ドｐＵＣ１９にクローニングした。ひと組の実験については、ＸｂａＩとＥｃｏ
ＲＩ部位を使用してヒトＣＣＲ５リボザイムＤＮＡをプラスミドにクローニング
した。もうひと組みの実験に関しては、ＣＸＣＲ４カセットをＣＣＲ５カセット
の直前で同じプラスミドにクローニングした。これはＰｓｔＩ及びＸｂａＩ制限
酵素を用いて実施した。ＣＸＣＲ４カセットはその５’末端近くにＰｓｔＩ部位
を持ち、３’末端の近くにＸｂａＩ部位を持つ（図１２）。ＸｂａＩによる制限
は、ＣＸＣＲ４カセットの３’末端をＣＣＲ５カセットの５’末端近くのＸｂａ
Ｉ部位に直接連結する（図３）。生じるプラスミドは、図１８に示す「リボザイ
ムベクター」に適合する。

【００６８】９．ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４ＲＮＡの強力な阻害を示す、ヒト末梢血単核細
胞におけるベクターの発現ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を第１項で述べたように単離し、培養した。
図１８に示すように、３種類のベクター、すなわちポリメラーゼ、自己ポリメラ
ーゼ及びリボザイムＤＮＡのいくつかをトランスフェクションのために等しい割
合で付加した。次の３種類の実験を実施した：（１）３つのベクター全部を付加
する、（２）ポリメラーゼベクターとリボザイムＤＮＡベクターだけを付加する
、及び（３）ポリメラーゼベクターだけを付加する。

【００６９】ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬を供給するＧｉｂｃｏＬｔｄ．が述べているようにトラ
ンスフェクションを実施した。ＤＭＲＩＥ−Ｃ８μｌをＯｐｔｉｃ−ＭＥＭ１
ｍｌ中４μｇと混合したあと、Ｇｉｂｃｏの指示に述べられているようにしてト
ランスフェクションのために２×１０^６細胞を加えた。次に細胞を１μｇ／ｍｌ
のＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）とＩＬ−２１０Ｕ／ｍｌで４８時間刺激したあと
（最終容量、３ｍｌ）、分析のために採集した。最初のセットの実験では、ＣＣ
Ｒ５リボザイムＤＮＡだけを含むリボザイムＤＮＡプラスミドを使用した。２番
目のセットの実験では、単一プラスミド中にＣＸＣＲ４とＣＣＲ５リボザイムＤ
ＮＡの両方を含むプラスミドでＰＢＭＣをトランスフェクトした（図１８、上記
第８項）。

【００７０】第１項で述べたようにトランスフェクトした細胞からＲＮＡを単離し、ＰＣＲ
を実施して、上述したＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４プライマーを用いて細胞ＣＣＲ５
又はＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを同定した。また、細胞は天然でアクチンを発現する
ので、アクチンのｍＲＮＡの量は定量的対照となる。そのような対照は、ＣＣＲ
５及び／あるいはＣＸＣＲ４の阻害がＲＮＡの一般的な分解によるものではない
ことを確認する；さもなければアクチンＲＮＡも分解していたはずである。同様
に、リボザイムはアクチンＲＮＡを開裂しないことから、リボザイムの作用が特
異的であることも確認される。アクチンを用いるこの対照は分子生物学において
広く適用されている。

【００７１】結果を図１３ａ、１３ｂ及び１４に示しており、これらは該当するＰＣＲ産物
の染色アガロースゲル写真である。図１３ａと１３ｂはそれぞれ第一セットと第
二セットの実験に関するものであり、図１３ａはＣＣＲ５ＲＮＡに対するリボ
ザイムの作用を示し、１３ｂはＣＸＣＲ４ＲＮＡに対する作用を示している。
図１３ａと１３ｂの設定は同じで、次の通りであり、レーンは左から右に１〜８
の番号を付している：

【００７２】

【表７】

【００７３】レーン１は、３つのベクター全部、すなわちポリメラーゼ、自己ポリメラーゼ
及びリボザイムＤＮＡベクターでトランスフェクトしたＰＢＭＣからＣＣＲ５及
びｍＲＮＡが欠失されていないことを示し、従ってＣＣＲ５ｍＲＮＡの完全な
阻害を示唆している。レーン２は、ＣＣＲ５ｍＲＮＡの弱いバンドを含み、自
己ポリメラーゼベクターがない場合にはＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４ｍＲＮＡの阻
害が不完全であることを示している。レーン３はＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ＲＮ
Ａの明るいバンドを含み、リボザイムベクターがない場合にはＣＣＲ５（図１３
ａ）及びＣＸＣＲ４（１３ｂ）ｍＲＮＡの阻害が全く起こらないことを示してい
る。レーン５−７の対照は、レーン１−３と同じトランスフェクション細胞から
のアクチンｍＲＮＡの明るいバンドを明瞭に示しているので、ＣＣＲ５又はＣＸ
ＣＲ４ＲＮＡの阻害は特異的であった。従って、本発明によってＣＣＲ５及び
ＣＸＣＲ４の特異的で強力な阻害が実現された。強力な阻害は自己ポリメラーゼ
ベクターを必要としたが、当業者は、リボザイム産生を等しい又はそれ以上のレ
ベルまで高める代替方法を考案することができるであろう。これは、例えば単数
又は複数のベクター中のリボザイムＤＮＡ配列の多重コピーを使用してリボザイ
ムの濃度を高めることによって、及び／あるいはプロモーターの量及び／あるい
は効率を高めることによって実施できる。

【００７４】本文中で述べるＴ７関連の作業はすべて、ｐＬｙｓＳゲル精製を含めてＮｏｖ
ａｇｅｎＬｔｄ．によるプロトコールの推奨に従った。残りの部分は「Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」第
２版、１９８９年版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｚｃｈとＭａｎｉａｔｉｓの
中のプロトコールに従った。

【００７５】上述したように、ＣＸＣＲ４リボザイムＤＮＡを含むリボザイムＤＮＡベクタ
ーは、同時にＣＣＲ５リボザイムＤＮＡも含む。このベクターで処理したＰＢＭ
ＣからのＣＣＲ５のｍＲＮＡレベルをモニターし、結果を表１４に示している。
図１４を参照すると、レーンを右から左に番号付けている。レーン１は分子量マ
ーカーであり、大きな明るいバンドを含むレーン２は、リボザイムを含まない対
照ベクターＣＳ２で処理したＰＢＭＣである。レーン３はポリメラーゼとリボザ
イムＤＮＡベクターだけで処理したＰＢＭＣを示し、レーン４はポリメラーゼ、
自己ポリメラーゼ及びリボザイムＤＮＡベクターで処理したＰＢＭＣを示す。Ｃ
ＣＲ５バンドの消失が示すように、完全な開裂が認められる。このことはまた、
自己開裂リボザイムが同じベクターから多数のリボザイムを精製できることの明
瞭な証拠を提供した。

【００７６】１０．リボザイムによる処理後のＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４蛋白質分子のＰＢＭ
Ｃ細胞発現ヘの影響第９項で述べたようなトランスフェクションに続いて、個々のドナーからのヒ
トＰＢＭＣ（プールされていない）を第４項で述べたようにＰＨＡ−ＬとＩＬ−
２で刺激するか、又はＭａｓｓｅｙｅｆｆらが「ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ」（ｐｕｂ．ＶＣＨＶｅｒｌａｇ，
ＷｅｉｎｈｅｉｍＧｅｒｍａｎｙ（１９９３））の中で述べているように、Ｕ
ＣＨＴ−１と呼ばれるＣＤ３に対するモノクローナル抗体（Ｄｅｐｔ．ｏｆＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＨｏｓｐｉｔａ
ｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫより入手可能）と１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で刺激した。
３、５、７、１０、１２日目に、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４に対するモノクローナ
ル抗体あるいはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎＬｔｄ．から市販されている蛍光物質と
直接結合した対照抗体で細胞を染色した。染色の手順は同社からの指示に従った
。第４項におけるようにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌ
ｌＳｏｒｔｅｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬｔｄ．）を使用して
データを解析した。結果を下記ならびに図１６ａ、１６ｂ（ＣＣＲ５）及び１７
ａ、１７ｂ（ＣＸＣＲ４）に要約する。これらの図は第４項で言及した図６ａ及
び６ｂと同様である。これらの図は細胞群の左側への明瞭なシフトを示しており
、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４の発現低下を示唆している。

【００７７】異なる各個人によって異なる日に最大抑制が認められた。平均すると、ＣＣＲ
５リボザイムはＣＣＲ５発現の７８％を抑制した。ＣＸＣＲ４リボザイム（同時
にＣＣＲ５リボザイムも含む）はＣＸＣＲ４の発現を６９％抑制し、ＣＣＲ５の
発現を７９％抑制した。

【００７８】１１．リボザイムで処理したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＨＩＶ
感染の抑制第９項で述べたようなトランスフェクションに続いて、第４項で述べたように
細胞をＰＨＡ−ＬとＩＬ−２で刺激した。これらの細胞を５日目にペレット化し
たあと、ＭＲＣ（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌ，ＵＫ）
から入手できるＬＡＩと呼ばれるＨＩＶ株１００μｌと共にインキュベートした
。これは、ＣｏｕｌｔｅｒＬｔｄ．から供給されているサンドイッチＥＬＩＳ
Ａで定量したとき、ｐ２４ＨＩＶ表面抗原蛋白質３０００ｐｇを含有した。（
これは患者の血液中のウイルスの量を調べるために臨床で使用されるのと同じア
ッセイである。）次に混合物を５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした
。懸濁液をＲＰＭＩ１６４０（ＧｉｂｃｏＬｔｄ．）で３回洗浄し、２００ｇ
で遠心分離にかけた。その後百万個の細胞を、前に述べたように、１０％ウシ胎
児血清と１０Ｕ／ｍｌＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地４ｍｌに懸濁した
。３、４日後にＩＬ−２を１００ｍｌとなる様に加えた。培養上清を感染後７日
目に採集した。上述したようなサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ウイルス量
の直接の指標を示すｐ２４の量を測定した。ＥＬＩＳＡの標準曲線の信頼検量区
間内のｐｇ／ｍｌのデータを得るため、アッセイ用に培養上清を１：１００及び
１：５００に希釈した。結果は次の通りである。

【００７９】

【表８】

【００８０】上記のデータは、すべてのＨＩＶ感染性がリボザイムベクター系での処理によ
って抑制されたことを明らかに示している。

【００８１】既知の物質、配列及び手順を参照するために本文中で引用したこれまでの参考
文献はすべて、言及されている物質、配列及び手順を説明する範囲まで、参照し
て明白にここに組み込まれる。

【００８２】配列リストのフリーテキスト配列リストのための「人工的」とみなされる配列は、次のような識別子＜２２
３＞の下でのフリーテキストを含む：

【００８３】

【表９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＣＲ５に関する本発明の標的開裂リボザイム配列の概要図である。

【図２】図２は、それぞれＣＣＲ５とＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを標的とするための二重ハ
ンマーヘッドリボザイムＤＮＡを提供する、３’自己触媒的配列に連結された標
的開裂リボザイムＤＮＡ配列の概要図である。

【図３】図３は、Ｔ７プロモーターによって推進される、図２及び１１のリボザイムＤ
ＮＡを含むカセットのＤＮＡ配列を示す。

【図４】図４ａ及び４ｂは、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４ｍＲＮＡ標的に関連して、本発明
において使用する標的開裂リボザイム配列の概要図である。

【図５】図５ａ及び５ｂは、ヒトＣＣＲ５ｍＲＮＡを含み、本発明のベクター系によ
って提供されるリボザイムＤＮＡ配列に対応するリボザイムと共にインキュベー
トした、臭化エチジウムによるアガロースゲルの写真である；これらの写真は、
１時間のインキュベーション後（図５ａ）及び３時間のインキュベーション後（
図５ｂ）にどの程度ＣＣＲ５ＲＮＡが開裂されたかを示している。

【図６】図６ａと６ｂは、トランスフェクトしていない細胞（６ａ、１５ａ、１６ａ）
とβ−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子を発現するプラスミドを
含むリポソーム製剤（６ｂ）あるいはＣＣＲ５ｍＲＮＡ（１５ｂ）又はＣＸＣ
Ｒ４ｍＲＮＡ（１６ｂ）を標的とするリボザイムを含む本発明のプラスミドベ
クター系でトランスフェクトした細胞（６ｂ、１５ｂ、１６ｂ）の蛍光の強さ（
ｘ軸）に対して細胞数（ｙ軸）をプロットしたものである；蛍光の強さは、β−
ガラクトシダーゼのレベル（６ａ、６ｂ）、ＣＣＲ５蛋白質の発現（１５ａ、１
５ｂ）及びＣＸＣＲ４蛋白質の発現（１６ａ、１６ｂ）を示唆する。

【図７】図７は、ＣＣＲ５ｃＤＮＡのクローニングにおいて使用するプラスミドｐｃ
ＤＮＡ３のマップである。

【図８】図８は、Ｔ７ポリメラーゼＤＮＡのクローニングのために使用するプラスミド
ｐＣＳ２＋ＮＬＳの概要図である。

【図９】図９は、図８のプラスミドｐＣＳ２＋ＮＬＳにおいてＴ７ポリメラーゼをクロ
ーニングするために必要な操作のある程度の詳細を図式的に示している。

【図１０】図１０は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）から
のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を含むプラスミドｐ
ＴＭ１の概要図である。

【図１１】図１１は、それぞれＣＣＲ５とＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを標的するための二重ハ
ンマーヘッドリボザイムＤＮＡを提供する、３’自己触媒的配列に連結された標
的開裂リボザイムＤＮＡ配列の概要図である。

【図１２】図１２は、Ｔ７プロモーターによって推進される、図２及び１１のリボザイム
ＤＮＡを含むカセットのＤＮＡ配列を示す。

【図１３】図１３ａ、１３ｂは、本発明のリボザイムでトランスフェクトしたヒト末梢血
単核細胞から転写したＲＮＡの断片を含むアガロースゲルの写真である；

【図１４】図１４は、本発明のリボザイムでトランスフェクトしたヒト末梢血単核細胞か
ら転写したＲＮＡの断片を含むアガロースゲルの写真である。

【図１５】図１５ａと１５ｂは、トランスフェクトしていない細胞（６ａ、１５ａ、１６
ａ）とβ−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子を発現するプラスミ
ドを含むリポソーム製剤（６ｂ）あるいはＣＣＲ５ｍＲＮＡ（１５ｂ）又はＣ
ＸＣＲ４ｍＲＮＡ（１６ｂ）を標的するリボザイムを含む本発明のプラスミド
ベクター系でトランスフェクトした細胞（６ｂ、１５ｂ、１６ｂ）の蛍光の強さ
（ｘ軸）に対して細胞数（ｙ軸）をプロットしたものである；蛍光の強さは、β
−ガラクトシダーゼのレベル（６ａ、６ｂ）、ＣＣＲ５蛋白質の発現（１５ａ、
１５ｂ）及びＣＸＣＲ４蛋白質の発現（１６ａ、１６ｂ）を示唆する。

【図１６】図１６ａと１６ｂは、トランスフェクトしていない細胞（６ａ、１５ａ、１６
ａ）とβ−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子を発現するプラスミ
ドを含むリポソーム製剤（６ｂ）あるいはＣＣＲ５ｍＲＮＡ（１５ｂ）又はＣ
ＸＣＲ４ｍＲＮＡ（１６ｂ）を標的するリボザイムを含む本発明のプラスミド
ベクター系でトランスフェクトした細胞（６ｂ、１５ｂ、１６ｂ）の蛍光の強さ
（ｘ軸）に対して細胞数（ｙ軸）をプロットしたものである；蛍光の強さは、β
−ガラクトシダーゼのレベル（６ａ、６ｂ）、ＣＣＲ５蛋白質の発現（１５ａ、
１５ｂ）及びＣＸＣＲ４蛋白質の発現（１６ａ、１６ｂ）を示唆する。

【図１７】図１７は、本発明の２つのプラスミドベクター系の概要図であり、最初のプラ
スミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子からのＲＮＡの転写を推進するＣＭＶプロモー
ターを含み、２番目はタンデム中の３個のリボザイムＤＮＡからのＲＮＡの転写
を推進するＴ７プロモーターを含む。

【図１８】図１８は、本発明の３つのプラスミドベクター系を示す概要図であり、最初の
プラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子からのｍＲＮＡの転写を推進するＣＭＶプ
ロモーターを含み、２番目のプラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子からのｍＲＮ
Ａの転写を推進するＴ７プロモーターを含み、さらに３番目のプラスミドはＣＣ
Ｒ５又はＣＸＣＲ４ＲＮＡ又はその両方を標的するリボザイムＤＮＡからのＲ
ＮＡの転写を推進するＴ７プロモーターを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ヂオン，リチヤード・チーハオイギリス国、ロンドン・ダブリユ・３・８・エイチ・イー、ロマン・クローズ・４、“フレジダンス" Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA03 EA04 FA02 GA13 4B050 CC03 DD07 LL01 4C084 AA13 NA14 ZB212 ZC551 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZC55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１個のＤＮＡベクターを含み、かかる単数又は複
数のベクターが、ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下にあり、ＲＮＡ
への転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺伝子から転写
されたｍＲＮＡを開裂する、標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含
むベクター系。
【請求項２】ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４標的遺伝子の両方から転写されたｍ
ＲＮＡを開裂するための標的開裂リボザイム配列を含む、請求項１に記載のベク
ター系。
【請求項３】少なくとも２個のＤＮＡベクターを含み、その内の第一ベク
ターが、第二プロモーターに作用することができる活性化因子蛋白質を産生する
ように発現される遺伝子に機能的に結合された、ヒト細胞において有効な第一プ
ロモーターを含み、第二ベクターが、ＣＣＲ５標的遺伝子、ＣＸＣＲ４標的遺伝
子あるいはＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方の標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを
開裂するための標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列に機能的に結合さ
れた第二プロモーターを含む、請求項１又は２に記載のベクター系。
【請求項４】少なくとも３個のＤＮＡベクターを含み、その内の第二ベク
ターがＣＣＲ５標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂するための標的開裂リ
ボザイムＤＮＡを含み、第三ベクターがＣＸＣＲ４標的遺伝子から転写されたｍ
ＲＮＡを開裂するための標的開裂リボザイムＤＮＡを含む、請求項３に記載のベ
クター系。
【請求項５】第二プロモーターがＴ７ポリメラーゼプロモーターであり、
活性化因子蛋白質がＴ７ポリメラーゼである、請求項３又は４に記載のベクター
系。
【請求項６】プロモーターが、ヒト細胞におけるＴ７ポリメラーゼ遺伝子
の翻訳を助けるためのインターナルリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を提
供するＤＮＡをさらに含む、請求項５に記載のベクター系。
【請求項７】リボザイムＤＮＡ配列が、標的開裂リボザイム配列の下流に
３’自己触媒的ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列をさらに含み、その結果リ
ボザイムＤＮＡがＲＮＡに転写されたとき、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ｍＲＮＡ
を標的する標的開裂リボザイムの第一及び第二ステムと、３’自己触媒的リボザ
イムの第一及び第二ステムを備えた二重ハンマーヘッドとして表現される形態を
持つ、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項８】第一及び第二構造安定化ステムループが第一認識配列の両側
にひとつずつ位置する、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項９】第二認識配列が第二構造安定化ステムループの下流に位置す
る、請求項８に記載のベクター系。
【請求項１０】標的開裂リボザイム配列が順に（５’から３’）次のもの
を含む、請求項９に記載のベクター系：第一構造安定化ステムループ；第一標的認識配列；第一触媒配列；第二構造安定化ステムループ；第二触媒配列；及び第二標的認識配列。
【請求項１１】標的開裂リボザイムＤＮＡ配列が、ＲＮＡに転写されたと
き、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ＲＮＡに存在する標的ＲＮＡ配列を開裂し、また
次の第一認識配列（５’から３’）：ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、ｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔを含み、さらにその下流に次の第二認識配列：ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、ａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項１２】請求項１から１１のいずれかに定義されているベクター系
を含む製薬上許容される担体。
【請求項１３】リポソームの形態の請求項１２に記載の担体。
【請求項１４】請求項１３に記載のリポソームと希釈剤又は担体を含む製
薬組成物。
【請求項１５】ＨＩＶ感染に関連する疾患の治療において使用するための
製剤を製造するための、請求項１から１１のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項１６】ＨＩＶ感染に関連する疾患の治療において用いるための、
請求項１から１１のいずれか１項に記載のベクター系の使用。
【請求項１７】（１）ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下にあ
り、ＲＮＡへの転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺伝
子から転写されたＲＮＡを開裂する標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配
列、及びその下流に、（２）リボザイムＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、２個
のハンマーヘッドに接合する共通の第三ステムと共に、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ｍＲＮＡを標的する標的開裂リボザイムの第一及び第二ステムと、３’自己触
媒的リボザイムの第一及び第二ステムを備えた二重ハンマーヘッドとして表現さ
れる形態を持つ３’自己触媒的ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含む、リ
ボザイムＤＮＡ。
【請求項１８】ＲＮＡに転写されるとき、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ＲＮ
Ａに存在する標的ＲＮＡ配列を開裂し、また次の第一認識配列（５’から３’）
：ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、ｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔ
を含み、さらにその下流に次の第二認識配列：ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、ａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む、リボザイムＤＮＡ
【請求項１９】タンデムＣＣＲ５ＲＮＡ及びＣＸＣＲ４ＲＮＡ開裂配
列を含む、請求項１８に記載のリボザイムＤＮＡ。