JPH08505521A

JPH08505521A - ＴＮＦ−αリボザイムおよびＴＮＦ−αリボザイムにリンクした耐分解性ｍＲＮＡ誘導体

Info

Publication number: JPH08505521A
Application number: JP6510474A
Authority: JP
Inventors: シオウド、モウルディー
Original assignee: ジーン・シアーズ・プロプライアタリー・リミテッド
Priority date: 1992-11-03
Filing date: 1993-11-03
Publication date: 1996-06-18
Also published as: WO1994010301A1; EP0672133A1; NZ257484A; DE69333550D1; EP0672133B1; ATE269405T1; US6040159A; US5985620A; AU5412094A; AU680843B2; EP0672133A4; CA2148368A1; IL107480A0; DE69333550T2; ZA938208B

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＴＮＦ−αに対して活性な化合物を記述する。更に、内因性のリボザイム結合性タンパク（類）を介して、イン・ビボにおいてＲＮＡに対して安定性を付与することができるＲＮＡ分子を記述する。安定化されるべき可能なｍＲＮＡ分子には、リボザイム、アンチセンス分子およびタンパク製造に有用なポリペプチドをコードするｍＲＮＡか含まれる。ここに記載されるリボザイム分子およびアンチセンス分子は、哺乳動物および植物において有用であり、特にウイルス性疾患に適している。また、その製造方法および使用方法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＮＦ−αリボザイムおよびＴＮＦ−αリボザイムにリンクした耐分解性ｍＲＮＡ誘導体〔発明の背景〕この出願の全体を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字により参照される。これらの刊行物の開示は全体として、本発明が属する技術の状態をより完全に記載するために、参照としてこの出願に組み込まれる。酵素の自己開裂活性を有するＲＮＡ分子（リボザイム）の発見は、遺伝子発現を人工的に制御する新しい方法を提供している（Foster & Symons，（1987）Cel l，49:585-591）。リボザイムは、開裂に必要な配列のほぼ全体を含むように設計されている。ハンマーヘッドタイプについては、標的ＲＮＡは、ＸＵＸから３ ’で起こる開裂を伴う配列ＸＵＸだけを含んでいる必要がある（Haseloff & Ger lach，（1988）Nature，（London）334:585-591;Perriman et ａl.，Gene（1992 ）113：157-163）。この高度の特異性および限られた標的要求性によって、これらの触媒的ＲＮＡ分子には、ウイルス性病原体の阻害能力、および高度に特異的な仕方で転写を妨害することによる特定の遺伝子発現を調節する能力が付与するされる（Uhlenbeck，（1987）Nature，（London）328：596-600；Haseloff & Ge rlach，（1988）Nalure，（London）334：585-591）。幾つかの報告は、ハンマーヘッドタイプのリボザイムが、生細胞中で機能することを示している。Collen & Birnstiel （1989，EMB0 J.，8:3861-3866）およびCameron & Jennings（1989，Proc．Natl ．Acad．Sci.，USA86:9139-9143）は、ゼノパスラエビスの卵母細胞並びにサル（COS1）細胞において、夫々リボザイムに媒介された破壊および特定の遺伝子発現の低下を報告している。Sarver et al．（1990，Science，247：1222-1225 ）は、HIV-1gagＲＮＡに対して向けられたリボザイムが、CD4⁺ＨｅＬａ細胞におけるp24抗原の発現を減少させたことを示している。最近ではHIV-1のインテグラーゼ（integrase）遺伝子を開裂するように設計されたリボザイムが、大腸菌におけるプラスミドから転写された場合に有効であることを示すことによって、この研究系統は細菌性細胞にまで拡大された。インテグラーゼＲＮＡは除去され、インテグラーゼタンパク質の合成はブロックされた（Sioud & Drlica，（1991） Proc．Natl．Acad．Sci.，USA88:7303-7307）。リボザイムは生体内で有効であるから、今や、リボザイムの安定性およびデリバリーの問題を検討し得る。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）遺伝子の発現を阻害するために、我々は、陽イオンのリポゾームに媒介されたトランスフェクション（Malone et al.，（1989 ）Proc．Natl．Acad．Sci.，USA86:6077-6081）を用いて、ＴＮＦ−αに対して向けられたリボザイムを、ヒトの前骨髄球白血病細胞（ＨＬ６０）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）へ供給した。ＴＮＦ−αは、多くの炎症性リュウマチ疾患において重要な役割を演じており（Shinmei et al.，（1989）Sem．Arth．Rhe um．18 （suppl．1）27-32）、主組織適合性複合体（ＭＨＣ）およびインターロイキン１およびインターロイキン６のようなサイトカインを含む幾つかのタンパク質の発現を調節する（Beutler & Cerami，（1988）Annu．Rev．Biochem．57:505-518 および（1989）Annu．Rev．Immnol．7:625-655）。ＴＮＦ−αはまた、正規の免疫応答のために必要であるように思えるが、大量のＴＮＦ−αは、リュウマチ性関節炎で見られるような破壊的効果を生じ得る（Brennan et ａl.，（1989）Lan cet ii244-247）。更に、ＴＮＦ−αは、ACH-2 細胞内におけるHIV-1 発現を誘発する原因となるサイトカインである（Rosenberg & Fauci，（1990）Immunol． Today 11：176-180）。ＴＮＦ−αは、ウイルスの長い末端繰り返し配列内のNF- XB賦活成分と結合してHIV-1発現を活性化する細胞因子の生産を誘発する。触媒的ＲＮＡ分子の有効性は、生体内でのｍＲＮＡの安定性に依存する。ＤＮＡの構造的因子に関する知識と比較すれば、ｍＲＮＡの安定性因子については僅かしか知られていない。ｍ−ＲＮＡの半減期は、線維芽細胞インターフェロンおよびｃ−ｆｏｓについては３０分間よりも短く、βグロブリンについては１７時間よりも長い。殆どの真核生物のｍＲＮＡは、細胞内において、５’キャップ構造および３’ポリ（Ａ）テール並びにポリ（Ａ）結合タンパク質により、エキソヌクレアーゼの攻撃から保護される。さらに、真核生物のｍＲＮＡは、コード領域の何れか一方の側に、５’および３’非コード領域の両方を有している。この５’非コード領域は、ｍＲＮＡのタンパク質への転写の開始速度と係わり合いがある。３’非コード領域は、ポリ（Ａ）の形成を開始するように働き、またｍＲＮＡを安定化するように作用することができる（Baralle，F.E.，Int. Rev．of Cytology（1983）81:7 1-106）。特に、３’非コーディング鉄応答性要素（3′non-coding iron-respon sive elements）は、鉄の存在下でｍＲＮＡの安定性を調節することが証明された。他の特徴づけられたモチーフは、幾つかの細胞性ｍＲＮＡ、特にサイトカインｍＲＮＡの急速な分解の原因となるＡＵＵＵＡ要素である(Saini，K. S ｅt ａl.，Mol．Cel．Biochem．（1990）96:15-23；Ross，H．J，etal.，Blood（19 91）77:1787-1795）。幾人かは、急速な分解が起きる前に最初のエンドヌクレアーゼ攻撃が必要とされると仮定している（Nielson，D．A．and Shapiro，D．J. ，Mol．Endocrlnology（1990）4:953-957）。タンパク質を生産するために特定のｍＲＮＡの生体内における半減期を延長する方法が必要とされ、また植物および動物で使用するための遺伝子制御のオリゴヌクレオチド法（アンチセンスおよび三重螺旋）が必要とされる。さらに、ｍＲＮＡ要素の安定化は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに加えて、リボザイムにも適用することができる。〔発明の概要〕本発明は、ＴＮＦ−α・ｍＲＮＡに対する活性な化合物を開示する。更に、一つ又は複数の内因性タンパク質によって、ＲＮＡに生体内での安定性を付与することが可能なＲＮＡ分子を開示する。安定化される得るＲＮＡ分子には、リボザイム、アンチセンス分子、タンパク質の生産に有用なポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびその他の細胞性ＲＮＡが含まれる。この明細書に記載されるリボザイムおよびアンチセンス分子は、動物および植物において有用であり、特に、ウイルス性疾患に適している。製造方法および使用方法も開示される。〔図面の簡単な説明〕図１：ＴＮＦ−α ＲＮＡテンプレートを有するリボザイムＡ、ＢおよびIIの塩基の組み合わせ（配列番号15−18）リボザイムＡは、Haseloff & Gerlach（1988）に記載されているように、保全リボザイム配列、ＴＮＦ−α ＲＮＡヌクレオチド374および393に相補的な5′ および3′フランキング配列（ナンバリングについてはPennica et al.，（Natur e（1984）312:724-729）を参照）、およびＣＵミスペア（Ｃ）を有するバクテリオファージＴ７転写ターミネータ（Rosenberg et ａl.，Gene（1987）56:125-13 5）からなる。リボザイムＢは、Ｔ７転写ターミネータを欠くことを除いてＡと同一である。リボザイム11は、９および11塩基対のハイブリダイズするアームを有する、リボザイムＢの短縮版である。アンチセンスＲＮＡは、触媒ドメインの代わりに単一のグアノシンヌクレオチドを有することを除いてリボザイムＡと同一である。抗ＴＮＦ−αハンマーヘッド触媒遺伝子およびアンチセンスＲＮＡコントロールは、Sioud & Drlica（（1991）Proc．Natl．Acad，Sci.，USA88:7303 -7307）によって記述された通りに作製された。簡潔に述べると、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、リボザイムの5′および3′認識配列、触媒ドメインおよびＴ７転写ターミネータの配列を含む２つの重複する半オリゴヌクレオチドを合成し（Xbal制限部位をＴ７ターミネータとリボザイムの3′ 末端との間に、PvuIIおよびXhoI部位をリボザイム配列の5′および3′末端にそれぞれ導入した）、ハイブリダイズさせた後、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントで伸長させた。伸長に続いて、ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、ゲル精製した後、Smal開裂ｐＵＣ 18ベクターにクローニングした。重複プライマーの配列（公衆衛生研究所、New York 10016、N．Y．）は以下の通り用いた：（１）リボザイムプライマー（配列番号19−22）：（２）アンチセンスプライマー：図中、下線を付した配列は、ＤＮＡテンブレート中の制限部位の存在の結果生じたものである。リボザイムＡおよびＢとは異なり、リボザイムIIはこれらの配列を欠いている。したがって、安定性のために制限配列を必要とすることはない。しかしながら、これら３つの全てのリボザイムはイン・ビボにおいて安定であり、タンパク質に結合する。図２ａ−２ｂ：（Ａ）イン・ビトロＲＮＡ転写体および（Ｂ）イン・ビトロ活性（Ａ）リボザイムＡ、ＢおよびＴＮＦ−αアンチセンスのイン・ビトロ転写。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、組換えプラスミドから開裂したＰＡＧＥ精製テンプレートＤＮＡ断片から、（Uhlenbeck，O.，Nature（1987）328:596-600）によって記述された通りにリボザイムおよびアンチセンスＲＮＡを転写した。転写の過程で、ＲＮＡを［α³²ｐ］ＣＴＰで内部的に標識した。全ての場合において、７-メチルグアノシン（5′）トリホスホ（5′）グアノシンで転写を開始した。転写体をＤＮＡse（ＲＮＡse非含有）で処理し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた後、７Ｍ尿素を含有する15％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分析した。リボザイムＡ、Ｂおよびアンチセンスの長さは、それぞれ、97、49および76ヌクレオチドである。（Ｂ）イン・ビトロにおけるＴＮＦ−α ＲＮＡの開裂。ＰＢＭＮＣ細胞をＰＭＡおよびＣｏｎＡで刺激してＴＮＦ−αタンパク質を発現させる。全細胞ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡ（20μｇ）をリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡのいずれか１μｇと50℃で60分間インキュベートした。その後、ゲル電気泳動によりＲＮＡ種を分離し、ＴＮＦ−α ＲＮＡをノーザンブロッティングにより同定した（ｋｂ＝１０³塩基）。図３ａ−３ｃ：形質導入後のリボザイム安定性ＲＮＡ安定性に対するバクテリオファージＴ７転写ターミネータの効果を、ＨＬ60細胞にリボザイムＡおよびＢを共形質導入することにより比較した。全ＲＮＡを抽出し、７Ｍ尿素を含有する15％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動することにより分析した。リボザイムＡは形質導入後72時間を越えても検出可能であったのに対して、リボザイムＢの量は徐々に減少した（図３（ａ））。その後、各バンドに含まれる放射活性を測定し、結果をゼロ時間での放射活性に対する割合として表わした。図３（ｃ）は、リボザイムＢがリボザイムＡよりも急速に劣化することを示している。形質導入後72時間でのリボザイムＡおよびＢの残留放射活性は、それぞれ57％および18％であった。アンチセンスＲＮＡコントロール（触媒ドメインを欠くリボザイムＡ）の安定性は、リボザイムＡに似ている（データは示さず）。このように、リボザイムの3′末端へのバクテリオファージＴ７ターミネータの付加は、その安定性を増加させる。また、細胞質および核ＲＮＡを分析することにより、ＨＬ60細胞におけるリボザイムＡの区分けも研究した。図３（ｂ）（レーンＮおよびＣ）に示されるように、リボザイムＡは、核内に優先的に存在する。 20％（ｖ／ｖ）仔ウシ血清（ＦＣＳ）が補足されたＲＰＭＩ1640中で増殖して対数増殖期にある1000万のヒトＨＬ6O細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ 240）をＲＮＡ形質導入に用いた。細胞を、血清非含有培地で２回洗浄した。血清非含有培地１滴（５ｍｌ）、次いでリポフェクチン（Bethesda Research Laboratories）35μ ｇをポリスチレンチューブに入れた。キャリアＲＮＡ（大腸菌ｔＲＮＡ）10μｇ。３×10⁶ disintsmin のキャップされた³²Ｐ標識リボザイムＡ、ＢまたはアンチセンスＲＮＡ（５μｇ）。この混合物を直ちに混合した。血清非含有培地リポフェクチン／ＲＮＡ／キャリアＲＮＡの混合物中に細胞を再懸濁させ、インキュベータに20時間戻した。形質転換に続いて、ハンクス緩衝生理食塩水で３回洗浄し、その後、20％ＦＣＳで補足されたＲＰＭＩと共にインキュベータに戻した。各レーンの上に示される時間で細胞（10⁶）を収集し、全ＲＮＡを調製して、７Ｍ尿素を有する15％ポリアクリルアミドゲルで分析した。形質転換に用いられたＲＮＡサンプルは、図３の頂部に示されている。リボザイムＢのみは、共形質導入実験において、その位置を示すマーカーとして機能する。（ｂ）核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）ＲＮＡの分析。標識され、キャップされたリボザイムＡのサンプル（50μＭ）を、ＨＬ60細胞の形質導入に20時間用いた。細胞を３回洗浄し、核および細胞質ＲＮＡを調製して、ゲル電気泳動により分析した。細胞質および核の画分を調製するために、細胞を10ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ7.5）中にホモジナイズした。４℃で10分間、５ｍＭＫＣｌ、140ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭジチオスレイトールおよび0.49％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ40（Noni det P40）、並びに800ｇで５分間遠心することにより核を収集した。上清液中のＲＮＡは沈殿させ、細胞質画分として保存した。核は、Chomezynski & Sacchi（ 1987，Anal．Biochem．162:156-160）が記述する通りに処理して全ＲＮＡ調製物とした。矢印は、リボザイムＡモノマーの位置を示す。（ｃ）ＲＮＡ定量を示す一実験。（ａ）に示されるリボザイムバンド中の放射活性の移動量を決定し、20 時間の形質導入期間の直後に存在する放射活性に対する割合として表わした。□リボザイムＡ：◆リボザイムＢ。図４：ＨＬ60細胞中におけるリボザイムＡ、ＢおよびIIの安定性 50を越える実験により（Mean of more 50experiments）、ＤＯＴＭＡカチオン性リポソーム介在形質導入を用いて、リボザイムを細胞に導入した。形質導入に続いて、細胞を洗浄し、完全培地中に再懸濁した。培養物１ｍｌに含まれる細胞を様々な時間で収集した。全ＲＮＡを調製した後、７Ｍ尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲルにより分析した。リボザイム放射活性の量をアクチンｍＲＮＡまたはリボゾームＲＮＡに標準化し、ポスト形質導入時間の16時間後に存在する放射活性に対する割合として表わした。これらの実験は、ただ一回の実験である図３（ｃ）に対して、ある時点については50回繰り返した。さらに、図３（ｃ）の再実験はリボザイムＡおよびＢと平行な曲線を示し、これはリボザイムＢと同様の安定性であることを示している。図５ａ−５ｂ：イン・ビボにおけるリボザイム活性形質導入期間（20時間）の後の、ＨＬ60細胞内でのリボザイムおよびアンチセンスＲＮＡ活性を分析した。リボザイムＡまたはアンチセンスＲＮＡでの形質導入に続いて、細胞を６時間刺激してＴＮＦ−αを発現させた。ＲＮＡを抽出し、 1-2％（ｗ／ｖ）アガロース・ホルムアルデヒドゲルを通してゲル電気泳動することにより分離して、放射活性プローブを用いるノーザンブロッティングによってＴＮＦ−α遺伝子を検出した。末梢血単核球ＰＢＭＮＣの場合には、ＴＮＦ− αブローブとハイブリダイズさせた後、フィルターを細長く切断し、アクチンプローブ（British Biotechnology Limited）とハイブリダイズさせた。細胞を分離し（Sioud et ａl.，1990）、ハンクス緩衝生理食塩水で４回、並びに血清非含有培地で３回洗浄した。細胞（10⁶）に形質導入し、ＨＬ60細胞と同様に処理した。レーン１および４、（キャリアＲＮＡ１μｇ大腸菌ｔＲＮＡでのみ形質導入された）コントロール；レーン２、アンチセンスＲＮＡ；レーン３および５、リボザイムＡ。このオートラジオグラムは、リボザイムＡレーンにおけるＴＮＦ−αシグナルを表示するために、過剰露光した。（ｂ）ＴＮＦ−αタンパク質に対するラジオイムノアッセイ。刺激工程の間にイオノマイシンを用いて、培地中にＴＮＦ−αタンパク質を放出させた。培地中に存在するＴＮＦ−αタンパク質の量を、ＴＮＦ−α［¹²⁵Ｉ］アッセイシステム（Amersham）を用いて測定した。レーン１ないし５は、それぞれ図５（ａ）および５（ｂ）のレーン１ないし５に対応する。図６ａ−６ｂ：ＨＬ60細胞におけるリボザイムＢおよびIIの免疫染色図６ａは、転写の間にジゴキシゲニン結合ウリジンかりボザイムに取り込まれたことを示す。細胞にジゴキシゲニン結合リボザイムを形質導入した。形質導入に続いて、顕微鏡スライドを調製し、その後、抗ジゴキシゲニン−フルオレセインＦａｂ結合体を用いて細胞内部のリボザイムを検出した。図６ｂは、蛍光発光細胞の写真を示す。図７ａ−７ｃ：ＴＮＦ−αリボザイムＢおよびIIを用いる、ＨＬ60細胞およびＰＢＭＮＣ由来の細胞質抽出物のゲル遅延アッセイ（gel retardation assay）Ａ）リボザイムIIを、抽出タンパク質と共に、ＲＴで25-30分間インキュベートし（レーン２、３、４および５）（下記参照）、またはインキュベートせず（レーン１）に、電気泳動で分析した（25μｇオリゴ＋５μｇ細胞質抽出物（ＣＥ））。レーン４および５は、ＲＮＡsin 20ユニットを加えたことを除いて、それぞれレーン２および３と同様である。レーン４および５に見られる複合体は全てレーン２および３で観察することができた（オリジナルフィルム）。Ｂ）従来記載されている通り（Sioud，et al.，1992）のイン・ビトロ転写によって25ｎｇのＴＮＦ−αリボザイムIIを生成させ、これを、材料および方法において既述した通りにＨＬ60もしくはＰＢＭＮ細胞から調製した細胞質抽出物（ＣＥ）と共に、室温で25分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、タンパク質リボザイム複合体を４％純粋ポリアクリルアミドゲルで分離した。レーン１：ＣＥなしのコントロール；レーン２：＋５μｇのＨＬ60細胞由来ＣＥ；レーン３：さらに１μｇのｔＲＮＡを加えたこと以外はレーン２と同じ；レーン４：さらに10ユニットのＲＮase阻害剤を加えたこと以外はレーン３と同じ；レーン５：電気泳動の前にサンプルをプロテイナーゼＫで処理したこと以外はレーン４と同じ；レーン６：５μｇのＰＢＭＮ細胞由来のＣＥを加えたこと以外はレーン１と同じ；レーン７：１μｇを越えるｔＲＮＡを加えたこと以外はレーン６と同じ；レーン８は、高分子複合体から回収されたリボザイムＲＮＡを含む（この複合体は１つの調製ゲルから切り取られ、物質は溶出された後フェノール抽出された）。Ｃ）リボザイムＢを用いたゲル遅延：パネルＡに示すように、リボザイムＢおよびＨＬ60細胞から調製されたＣＥ５μｇと共にインキュベートしたもの（レーン２）。図８：競合アッセイ 25ｎｇのリボザイムIIを、図５において記述したＨＬ60細胞もしくはＰＢＭＮ由来の細胞質タンパク質５μｇと共にインキュベートした。レーン１はＣＥなしのコントロール、レーン２はレーン１と同様であるが、ＨＬ60細胞由来のＣＥ５ μｇおよびポリｄＣｄＩ 2500ｎｇの両者が添加されており；レーン３はレーン２と同様であるが、ポリｄＣｄＩの代わりに2500ｎｇの冷リボザイムが添加されており；レーン４はレーン３と同様であるが、500倍過剰の冷リボザイムが添加されており；レーン５はレーン１と同様であるが、ＰＢＭＮ由来のＣＥ５μｇが添加されており；レーン６、７、８はレーン５と同様であるが、それぞれ300、4 00もしくは500の冷リボザイムが添加されている。図９：インターロイキン２（ＩＬ−２）リボザイムおよびＴＮＦ−αリボザイムまたはアンチセンスの５末端に連結したＩＬ−２リボザイムの推定二次構造（配列番号23-25）。図10ａ−10ｃ：ＩＬ−２リボザイムを用いた細胞質抽出物のゲル遅延アッセイＡ）イン・ビトロ転写によって生成したＩＬ−２リボザイム25ｎｇをＨＬ60細胞由来のＣＥと共にインキュベートした；レーン１はＣＥなしのコントロール；レーン２はＨＬ60細胞由来のＣＥを伴う。Ｂ）ＩＬ−２を、ＨＬ60細胞由来のＣＥの代わりに、ＰＢＭＮ細胞由来のＣＥと共にインキュベートした（レーン２）。図11ａ−11ｃ；ゲル遅延およびＵＶ架橋実験Ａ）イン・ビトロ転写によって生成したＴＮＦ−αリボザイムII 50ｎｇを、ＰＢＭＮ細胞から調製した細胞質抽出物（ＣＥ）と共に、室温で25分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、タンパク質リボザイム複合体を６％純粋ポリアクリルアミドゲルで分離した。レーン１はＣＥなしのコントロール；レーン２：＋ＰＢＭＮ細胞由来のＣＥ１５μｇ；レーン３：＋ＰＢＭＮ細胞由来のＣＥ２５μｇ。レーン４および５はそれぞれレーン２および３と同様であるが、電気泳動の前にプロテイナーゼＫで15分間処理している。ＣＥ１およびＣＥ２は２種類の異なる細胞質タンパク質調製品に相当する。Ｂ）Ａと同様のパネルであるが、過剰露光されている。Ｃ）矢印で示される複合体を含むゲルの領域を純粋ゲルから切断し、ＵＶに30 分間さらしてトリス緩衝液中に浸漬し、リボヌクレアーゼＴ１で処理して10％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析した。図12Ａ：ＩＬ−２、ＴＮＦ−αリボザイムの5′に連結したＩＬ−２連結リボザイム（IL-2 linked ribozyme）を用いたゲル遅延ＴＮＦ−αリボザイム、ＩＬ−２リボザイム、ＴＮＦ−αリボザイムの5′に連結したＩＬ−２リボザイムまたはＴＮＦ−αアンチセンスの5′に連結したＩＬ−２ 50ｎｇを、ＰＢＭＮ細胞から調製した２種類の異なる細胞質抽出物（ＣＥ１およびＣＥ２）と共に、室温でインキュベートした：レーン１：ＴＮＦ−αリボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン２：ＴＮＦ−αリボザイム＋ＣＥ；レーン３：ＩＬ−２リボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン４：ＩＬ−２リボザイム＋ＣＥ；レーン５：ＩＬ−２リボザイム＋ＣＥ２；レーン６：ＴＮＦ−αの5′末端に連結したＩＬ−２リボザイム− ＣＥ：レーン７：ＴＮＦ−αの5′末端に連結したＩＬ−２リボザイム＋ＣＥ１；レーン８：ＴＮＦ−αリボザイムの5′末端に連結したＩＬ−２リボザイム＋ＣＥ２。図12Ｂ：ＴＮＦ−αアンチセンスの5′に連結したＩＬ−２を用いたゲル遅延レーン１：ＴＮＦ−αアンチセンスに連結したＩＬ−２リボザイム−ＣＥ；レーン２および３：ＴＮＦアンチセンスに連結したＩＬ−２＋各々、２μｇのＣＥ１または５μｇのＣＥ。図13Ａ−13Ｂ：Ａ）ＴＮＦ−αリボザイムに連結したＴ７ターミネータの椎定二次構造Ｂ）ＴＮＦ−αリボザイムの3′末端に連結したＴＮＦ−αアンチセンス（配列番号26−27）★アンチセンス分子の折り畳みを得るために、連結部に２つのＡを加えた。図14Ａ：ＴＮＦ−αリボザイムまたはＴＮＦ−αリボザイムに連結したＴＮＦアンチセンスを用いるゲル遅延イン・ビトロ転写によって生成したＴＮＦ−αリボザイムIIまたはＴＮＦリボザイムに連結したＴＮＦアンチセンスを、ＰＢＭＮ細胞から調製した細胞質抽出物（ＣＥ）と共に、室温で25分間インキュベートした。レーン１：ＴＮＦ−α−コントロールとしてのＣＥ；レーン２：ＴＮＦ−α＋ＣＥ；レーン４：ＴＮＦ−αリボザイムに連結したＴＮＦアンチセンスーコントロールとしてのＣＥ；レーン５および６はレーン４と同様であるが、それぞれ、ＣＥ１およびＣＥ２と共にインキュベートした。図14Ｂ：競合実験レーン１：コントロール−ＣＥ；レーン２＋ＣＥ；レーン３はレーン２と同様であるが、300過剰の冷ＴＮＦ−αリボザイムを反応に加え、レーン４はレーンｗと同様であるが、500の冷ＴＮＦ−αリボザイムを反応に加えた。図15Ａ−15Ｂ：Ａ）ＩＬ−２リボザイムおよびＢ）ＴＮＦ−αリボザイムの3 ′末端に連結したＩＬ−２リボザイムの椎定二次構造（配列番号28−29）。図16：ＩＬ−２リボザイムまたはＴＮＦ−αリボザイムの3′に連結したＩＬ −２リボザイムのゲル遅延イン・ビトロ転写によって生成したＩＬ−２およびＴＮＦ−αの3′に連結したＩＬ−２リボザイム 50ｎｇを、細胞質抽出物と共に、あるいは細胞質抽出物なしで、室温で25分間インキュベートした。レーン１：ＩＬ−２リボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン２はレーン１と同様であるが、＋ＣＥである；レーン３：ＴＮＦ−αリボザイムの3′末端に連結したＩＬ−２リボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン４はレーン３と同様であるが、＋ＣＥである。ＩＬ−２リボザイムおよびＴＮＦ−αに連結したＩＬ−２の電気泳動移動度は、おそらく分子内相互作用のために、再現性がなかった。図17Ａ−17Ｂ：Ａ）5′末端が丸められたＴＮＦ−αリボザイムおよびＢ）3′ 末端か丸められたＴＮＦ−αリボザイムの推定二次構造（配列番号30−31）。図18Ａ−18Ｄ：ＴＮＦ−αリボザイム、3′もしくは5′が丸められたＴＮＦ− αリボザイムおよびインテグラーゼリボザイムを用いるゲル遅延Ａ）イン・ビトロ転写によって生成したＴＮＦ−αリボザイム、3′もしくは5 ′が丸められたＴＮＦ−αリボザイムおよびインテグラーゼリボザイム50ｎｇを、ＰＢＭＮ細胞から調製した細胞質抽出物（ＣＥ）と共に、室温で25分間インキュベートした。レーン１：ＴＮＦ−αリボザイム−ＣＥ；レーン２：ＴＮＦ−αリボザイム＋ＣＥ；レーン３：3′が丸められたＴＮＦ−αリボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン４：＋ＣＥ以外はレーン３と同様；レーン５：5′が丸められたＴＮＦ−αリボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン６：＋ＣＥ以外はレーン５と同様；レーン７：インテグラーゼリボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン８：＋ＣＥ以外はレーン７と同様。Ｂ）パネルＡと同様であるが、過剰露光されている。Ｃ）レーン１：5′が丸められたＴＮＦ−αリボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン２はレーン１と同様であるが、＋ＣＥである；レーン３：インテグラーゼリボザイム−コントロールとしてのＣＥ；レーン４はレーン３と同様であるが、＋ＣＥである。Ｄ）イン・ビトロ転写によって生成した、3′が丸められたＴＮＦ−αリボザイム25ｎｇを、異なる型の細胞から調製した細胞抽出物と共に、室温で25分間インキュベートした。レーン１：−コントロールとしてのＣＥ；レーン２：ＰＢＭＮ細胞から調製されたＣＥと共にインキュベートした以外はレーン１と同様；レーン３：ＨＬ60細胞から調製されたＣＥとインキュベートした以外はレーン１と同様；レーン４：ＣＥ以外はレーン１と同様であり、このＣＥはＷＨ164細胞から調製されたものである。図19：ＴＮＦ−αリボザイムＢ（配列番号32）およびＴＮＦ−αリボザイムII 上のタンパク質の潜在的連結部位図20：ＩＬ−２リボザイムおよびＴＮＦ−αリボザイムの3′末端に連結したＩＬ−２リボザイムのイン・ビボ活性図21Ａ−21Ｂ：ＴＮＦ−αリボザイムおよびＴＮＦ−αリボザイムの3′末端に連結したＴＮＦ−αアンチセンスのイン・ビボ活性Ａ）形質導入時間６および12時間での細胞毒性アッセイＢ）ラジオイムノアッセイによるＴＮＦ−αレベルの定量図22：ＣＴＬＬ２アッセイによるＩＬ−２のイン・ビボレベルの定量（詳細な説明を参照）図23：ＩＬ２遺伝子発現に対するＴＮＦ−αリボザイムおよびアンチセンスの影響〔発明の詳細な説明〕ここに説明される本発明は、ＴＮＦ−αリボザイムまたは下記の構造（配列ＩＤ番号１）を有する化合物に関する。ここで、各Ｘは同一または異なるリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々はリボヌクレオチドを表し、またａ，ｃ，ｕ（ｔ）およびｇの夫々は、その糖、リン酸または塩基が修飾もしくは非修飾、または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′の夫々は、所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｎおよびｎ′の夫々は０〜100の整数を表し；夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａはリボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、もし０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３ ′側に位置するＸと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は１以上（典型的には100 以上）の整数を表し；夫々の断続線（dashed line）は独立に、その両側に位置するヌクレオチドの間に共有結合を与える学的結合、或いはこのような化学的結合の不存在を表し；（Ｘ）_bは存在し又は不存在であり得るオリゴヌクレオチド［但し、（Ｘ）_bが存在するときは、ｂは２以上の整数を表す］を表す。このような化合物は、ＴＮＲ−αをイン・ビボで開裂するためにターゲッティングされる。該化合物がイン・ビボにおいてＴＮＦ−α・ｍＲＮＡとハイブリダイズするように十分な相補性が維持されるとすれば、ハイブリダイズ性のアーム、即ち、ｇｇｕ（ｔ）ｃｃｇｕ（ｔ）ｃＡ、並びにｕ（ｔ）ｃｕ（ｔ）ａｇｕ（ｔ）ａｇａａ（配列ＩＤ番号２）における部位指向性の突然変異が可能である。また、ＤＮＡアームおよびＲＮＡ触媒領域を含む化合物である限り、全てのＲＮＡ化合物は本発明の一部である。（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が存在しない化合物もまた、本発明の一部である。上記化合物の一つの形態は、下記の構造（配列ＩＤ番号３）を有している。ここでのヌクレオチド類は上記に定義した通りである。該化合物の全てのＲＮＡバージョンもまた説明される。更に、該化合物は下記の構造（配列ＩＤ番号４）を有し得る。ここで（Ｘ）ⁿはオリゴヌクレオチドを表す。更に、該化合物は下記の構造（配列ＩＤ番号２７）を有し得る。なお、ここでの３′末端は、ＴＮＦ−αの異なった標的にターゲットされるＴＮＦ−αアンチセンス分子である。本発明には更に、下記の構造を有する多リボザイム化合物が含まれる。３′−［−（Ｚ）_r−Ｑ−（Ｚ）_s−］_z−５′ ここで、夫々のＱは、同一または異なり得る上記の化合物を表し；夫々のＺは、同一または異なり得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；ｒおよびｓの夫々は０以上の整数を表し；ｚは１以上の整数を表す。更に、本発明は、問題のｍＲＮＡの細胞間での分解の速度を低下させ、ｍＲＮＡの定常状態レベルを増大させることによって、タンパク製造を増大させるための化合物および方法に関する。このような化合物および方法は、リボザイムおよびアンチセンスＲＮＡの安定性を増大するために有用であり、従って効果的である。また、本発明の化合物および方法は、転写に利用可能なｍＲＮＡの量を増大することによって、タンパク製造を増加するために利用することができる。リボザイムは、ＲＮＡ開裂反応を触媒することができるＲＮＡである。最も単純で且つ最も普通に使用されるのは、保存された触媒ドメインと、基質ＲＮＡにハイブリダイズする隣接配列（flanking sequences）とを含んだハンマーヘッド型のリボザイムである（Haseloff et al．ＰＣＴ国際公開第WO89/05852 号）。ハンマーヘッド型リボザイムは、開裂を受けるべきＸＵＸトリプレットを含んだ何れのＲＮＡ配列に対してもターゲッティングされ得る。幾つかの研究によって、これらのリボザイムはイン・ビボで標的ＲＮＡを開裂し、タンパクの発現を抑制できることが立証されている。他の分類のリボザイムは、テトラヒメナＩＶＳ（グループＩイントロン）（1988年４月26日に発行されたCech et al．の米国特許第4,740,463号）、ＲＮＡｓｅＰ（Altman et al．ＰＣＴ国際公開第WO 92/03566 号）、肝炎デルタリボザイム（例えば、Blumenfeld et al ，ＰＣＴ国際出願第WO/90/05157号）およびヘアピンリボザイム（欧州特許出願第EP 360,257号、Hampel et al.，Nuc．Acids Res．（1990）18:299-304）。ここに権利請求された発明の安定化ｍＲＮＡは、文献中の方法を用いて、例えばＴ７ターミネータ、ρ独立性ターミネータ、ｃｒｙ要素（1987年５月19日に発行されたGelfand et al．の米国特許第4,666,848 号）またはＴｒｐＥターミネータのような３′上の転写ターミネータを用いることによって、更に安定化され得る。更に、ポリ（Ａ）追加信号ＡＡＴＡＡＡのような配列を添加することや、３′非コーディング領域の長さを変化させるとを含む戦略が可能である（1992年９月22日に発行されたGilliesの米国特許第5,149,635号を参照されたい）。これらの技術は、リボザイム、アンチセンスまたはタンパクを製造する目的で、ｍＲＮＡを安定化するために用いることができる。具体的には、本発明は、（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′で表される問題の単鎖ＲＮＡに対して安定性を付与することができる、下記の構造（配列ＩＤ番号５）を有するＲＮＡ分子を包含する。ここで、各Ｘは同一または異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′の夫々は、所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｎおよびｎ′の夫々は０〜1000の整数を表し；夫々の★は、その両側に位置するリボヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａはリボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、もし０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＸと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上（典型的には100以上）の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［但し、ｂは２以上の整数を表す］を表す。本発明の他の態様は、下記の構造（配列ＩＤ番号６）を有するＲＮＡ分子である。ここで、各Ｘは同一または異なり得るリボヌクレオチドを表し；Ｇ★は存在しても存在しなくてもよく；（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′は上記で定義した通りである。上記のように、夫々ＴＮＦ−αリボザイム構造またはＴＮＦ−αアンチセンス構造における、ＧＧＵＣＣＧＵＣＡおよびＵＣＵＡＧＵＡＧＡＡ（配列ＩＤ番号７）において、部位指向性の突然変異が可能である。これらのアームはイン・ビボでＲＮＡ結合と結合するから、著しい多様性が可能である。３′または５′末端のアームを欠失した化合物もまた、ここに記載する発明に包含される。好ましくは、５′末端のアームが欠失される。また好ましくは、該化合物はＴＮＦ−αリボザイムの３′末端に結合される。一つの態様においては、ＴＮＦ−αリボザイムの３′末端の複数のバージョンが、安定化要素として使用される。本発明の一態様において、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′は少なくともーつのリボザイムをコードする。該リボザイムはヘアピン型リボザイム、ＲＮＡａｓｅＰ型リボザイム、より好ましくはハンマーヘッド型リボザイムであり得る。（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が少なくともーつのハンマーヘッド型リボザイムをコードする場合、これは下記の構造（配列ＩＤ番号８）を有し得る。ここで、ＸおよびＹの夫々は、同一または異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）_pおよび（Ｙ）_p′の夫々は、開裂されるべきＲＮＡ標的配列とハイブリダイズすることができる所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｐおよびｐ′の夫々は、前記オリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド数を定義する整数［但し、ｐ＋ｐ′の和は前記リボザイムを前記ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズさせるために十分な数である］を表し；（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′の夫々は、所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；夫々の★は、その両側に位置するリボヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａはリボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、もし０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＸと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［但し、ｂは２以上の整数を表す］を表す。本発明の態様において、ＲＮＡ分子は以下の構造（配列ＩＤ番号９，１０）を有し得る。または本発明の更なる態様においては、以下の構造（配列ＩＤ番号１１〜１３）を有し得る。または上記の特定のＩＬ-2リボザイムについて、当業者は他のリンカーが可能であることを認識するであろう。或いは、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′は、下記の構造を有し得る。ここで、夫々のＹは同一または異なるリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；（Ｙ）_nおよび（Ｙ）_n′はオリゴヌクレオチド（ｎおよびｎ′は該オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド数を限定する整数である）であって、開裂されるべき所定のＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするように、該ＲＮＡ標的配列に対して十分に相補的な所定の配列を有ししており、また前記ＲＮＡ標的配列が当該化合物内には存在していないようなオリゴヌクレオチドを表し；Ｎはアデニン、グアニン、シトシンまたはウラシルであり；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；Ｍは２〜20の整数を表し；ヌクレオチド（Ｙ）_mは当該化合物内の他の何れのヌクレオチドともワトソン・クリックの塩基対を形成していない。本発明の他の態様は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを安定化するためにも用いられ得る上記のＲＮＡ分子である。特に、該ＲＮＡ分子は、工業的または商業的に重要なタンパクの製造に有用である。このような多くのタンパクは既に商業的に入手可能であるか、或いは商業的に開発されている最中である。かかるタンパクの例には、ヒトおよび動物の成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化剤、エリスロポエチンおよびVIII因子が含まれる。本発明は、細胞培養系、特に培養で増殖しているＣＨＯ細胞のような動物細胞培養系において、このようなタンパクの製造を改良するために用いられ得る。それによって、かかるタンパクの商業的製造に含まれる実質的なコストを低減できるであろう。本発明の他の態様は（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′、即ち標的を開裂することができるリボザイムである。或いは、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′は、哺乳動物または植物に固有のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、これを不活性化することができるアンチセンス配列である（植物については、1992年４月21日に発行されたSh ewmaker et al．の米国特許第5,107,065号を参照されたい）。更に、このリボザイム配列またはアンチセンス配列の標的は、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、ＥＢＶ、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、鼻炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘-帯状庖疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸器系シンシチウムウイルス（respiratory syncytial virus）、アデノウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトパルボウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、アルボウイルス、またはヒトＴ細胞白血病リンホーマウイルスのようなウイルス標的を含むウイルス遺伝子であり得る。本発明はまた、上記の化合物およびＲＮＡ分子の製造方法として具現され、この方法は、（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせからなる導入ベクター中に、前記化合物に対応するヌクレオチド配列を連結する工程と；（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼを用いて、工程（ａ）のヌクレオチド配列を転写する工程と；（ｃ）前記化合物を回収する工程とを具備する。本発明にはまた、転写に際して上記の化合物またはＲＮＡ分子を生じるヌクレオチド配列を含んだ、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの組み合わせからなるバクテリア性またはファージ性の導入ベクターが含まれる。更に、クローン化された真核細胞ＤＮＡを、培養された哺乳動物細胞中に導入するための多くの方法が開発されている（Sambrook et al.，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual 2ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）：即ち、リン酸カルシウムまたはＥＤＴＡ-デキストランに媒介されたトランスフェクション；ポリブレン（Polybrene）；プロトプラスト融合；電気穿孔；および核への直接的なマイクロインジェクションである。本発明は、ＴＮＦ−αの過剰発現に関連した疾病を治療する方法であって、患者に対して、ＴＮＦ−αの過剰発現を低減して前記疾病を治療するように、有効量のＴＮＦ−αリボザイムを投与することを具備した方法を提供する。このような疾病には、リウマチ性関節炎、ＡＩＤＳ、敗血症性ショック、移植片-宿種性の疾患、癌に付随した悪液質および自己免疫疾患が含まれる。本発明はまた、上記のＲＮＡ分子を用いて、特定のＲＮＡ標的配列を開裂しまたは不活性化する方法を提供する。このようなＲＮＡは、哺乳動物または植物に固有のものであり得る。これは、ＨＩＶのようなウイルス遺伝子をターゲッティングするために特に適している（1989年２月21日に発行されたGoodchild et al ．の米国特許第4,806,463号を参照のこと）。ここで説明した化合物および方法において、（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′の５′末端および３′末端は、エンドヌクレアーゼを分解から安定化するために修飾され得る。例えば、末端からのヌクレアーゼ攻撃、特に３′−５′進行性のエクソヌクレアーゼ活性を防止するために、ブロック基が追加され得る。例えば、ブロック基は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたフェニル、任意に置換されたアルカノイルから選択され得る。任意の置換基は、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ等から選択され得る。或いは、末端ブロック基として、ヌクレアーゼの攻撃に対して抵抗性であるホスホロチオエート、メチルホスホネート若しくはホスホロアミデートのようなヌクレオチド類縁体、またはヌクレオシド誘導体（例えば、リボース部分のαアノマー）を用いてもよい。或いは、他のヌクレアーゼに対する当該エンドヌクレアーゼ分子の感受性を変化させる非核酸基が、該エンドヌクレアーゼの３′および／または５′末端に挿入され得る。例えば、該エンドヌクレアーゼに結合した9-アミノ-アクリジンは、当該エンドヌクレアーゼに対するヌクレアーゼ攻撃に対する抵抗性を生じさせるための末端ブロック基とし、および／またはエンドヌクレアーゼ活性を補助するための挿入剤として作用し得る。種々の他の化学基、例えばスペルミンまたはスペルミジンが関連した仕方で使用され得るであろうことは、容易に承認されるであろう。本発明のエンドヌクレアーゼは、基質ヌクレオチド配列に対する結合親和性を修飾し、または標的細胞に対する親和性もしくは細胞分画における局在性を増大させるために、タンパク、ステロイド、ホルモン、脂質、核酸配列、挿入分子（例えば9-アミノアクリジンのようなアクリジン誘導体）等の親和性剤に共有結合的または非共有結合的に結合され得る。例えば、本発明のエンドヌクレアーゼは、標的配列のハイブリダイゼーションおよび開裂が起こり得るように、該エンドヌクレアーゼを標的核酸に対して並列にすることを補助し得るＲＮＡ結合性のペプチドまたはタンパクに結合され得る。ヌクレオチド配列は、基質に対する親和性を増大するために、（Ｘ）_n基および（Ｘ）_n′基の５′末端および３′末端に組み込まれ得る。このような追加のヌクレオチド配列は、標的配列と共に三重螺旋を形成することができ（Strobel，S．A.，et al.，（1991 ），Nature 350:172-174、およびその中で参照として記載されている参考文献）、これは分子内的に折り畳まれた基質との相互作用を可能にする。或いは、上記追加のヌクレオチド配列内の修飾された塩基（非天然の塩基または既出の核酸構造の原理（Principles of Nucleic Acid Structure）に記載されているようにして修飾された塩基）を使用し得る。これは、基質内のヌクレオチドと共に塩基のペア相互作用、トリプレット相互作用またはカルテット相互作用を生じる単鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに会合するであろう。適切な塩基には、イノシン、5′- メチルシトシン、5′-ブロモウラシルおよび当該技術で周知の他の塩基、例えば上記「核酸構造の原理」に記載されているものが含まれる。合成によるｍＲＮＡの製造は周知である（Sambrook et al.，Molecular Clonl ng：A Laboralory Manual 2ed．Cold Sprlng Harbor Laboralory Press 1989を参照のこと）。ＴＮＦ−αリボザイムのための修飾された塩基対を伴なうＤＮＡ -ＲＮＡ混合オリゴマーは、アプライド・バイオシステムズ社、バイオサーチ社またはミリゲン社によって製造されている機械のように、商業的に入手可能なＤＮＡ合成機によって製造することができる（例えば、Perrault et al.，Nalure ，344:565-567（1990），for derivatives Uhlmann，E．and Peyman，A．Chemic al Reviews（1990）90:543-584，H-phoshonate monomers see Agrawal et al．U ．S．Patent No．5,149,798）。保存されたＴＮＦ−αモチーフに結合するタンパクは、リボザイム反応の速度および特異性を増大するように作用し得る。最近、ツチハシ等は、ｐ７ヌクレオキャプシド（ＮＣ）タンパクがハンマーヘッド型リボザイムの開裂を10〜20倍加速することを報告した（Science（1993），262:99-102）。従って、ＴＮＦ−α モチーフに結合するタンパクは同様の効果を有し得る。ここで用いる「有効量」の用語は、所定の状態および投与レジメ（administra tion regimen）を有する哺乳動物において所望の効果を与える量を意味する。適切な稀釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアと共に、有効量を含有する組成物は治療に有用である。このような組成物は液体処方、または凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥された処方であり得る。また、この組成物には種々の緩衝剤（例えばTris-HCl，リン酸アセテート）、ｐＨおよびイオン強度、表面への吸着を防止するためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、洗浄剤（例えばTween 20，Tween 80，Pluronic F68，胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばThimeros al，ベンジルアルコール）、増量剤または浸透圧調節剤（例えばラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールのようなポリマーのオリゴヌクレオチドへの共有結合的結合、金属イオンとの錯形成、或いはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン等のようなポリマー化合物の粒状製剤への組み込み、またはリポソーム、微細エマルジョン、ミセル、単層もしくは多層担体、赤血球ゴーストもしくはスフェロプラストへの組み込みが含まれ得る。このような組成物は、上記オリゴヌクレオチドの物理的状態、可溶性、安定性、イン・ビボでの放出速度およびイン・ビボでのクリアランス速度に影響するであろう。抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド（約１０残基以下）、即ち、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコールのような他の成分を添加してもよい。可能な持続的放出性の組成物には、脂質親和性のデポー剤（lipophilic depots）（例えば脂肪酸、ワックス、オイル）の処方が含まれる。また、本発明には、ポリマー（例えばポリオキサマー（polyoxamers）若しくはポリオキサミン（polyo xamines））で被覆された粒状組成物、並びに組織特異的受容体、リガンド若しくは抗原に対する抗体に結合され、または組織特異的受容体のリガンドに結合されたオリゴヌクレオチドが包含される。更に、本発明のオリゴヌクレオチドを核、細胞質または特定のタイプの細胞にターゲッティングするために、特異的ヌクレオチド配列が添加され得る。本発明の組成物の他の態様においては、粒子形状保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、または非経腸的投与、気管支投与、鼻腔投与および経口投与を含む種々の投与経路のための浸透エンハンサが組み込まれる。適切な局所投与処方には、ゲル、クリーム、溶液、乳剤、糖鎖ポリマー、その生体分解性マトリックス；蒸気、ミスト、エアロゾルまたは他の吸入剤が含まれる。前記オリゴヌクレオチドは、ウエハー、ワックス、チューインガムを含む膜もしくは固体キャリア中に封入し得る。また、上皮層を通した移行導入を補助する浸透エンハンサも当該技術において公知であり、ジメチルスルホキシドおよびグリコールが含まれるが、これらに限定されるものではない。以下の実験の詳細のセクションにおいて、本発明を例示する。これらのセクションは本発明の理解を助けるために記載されるものであり、如何なる意味においても、後述の請求の範囲に記載する本発明を限定することを意図しておらず、またそのように限定するものと解釈されてはならない。〔実験の詳細〕目的とするリボザイムはＴＮＦ−αＲＮＡを in vitroで切断するＴＮＦ−αＲＮＡを切断するようにデザインされた３つのハンマーヘッド型リボザイム（Haseloff & Gerlach，1988）を、図１に示す。イングリッシュら（ English et al．）（1991）による記載の様に、ホルボース１２ミリステート１３アセテート（phorbol 12-myristate 13 acetate）およびコンカナバリン（ＣｏｎＡ）によって、ＴＮＦ−α遺伝子転写を刺激した後にＰＢＭＮＣから抽出した全ＲＮＡを使用して、ハンマーヘッド型リボザイムのin vitro活性を研究した。リボザイムＡは、バクテリオファージＴ７のターミネーターをその３′末端に含んでいたが、リボザイムＢは含んでいなかった。リボザイムＩＩは、下線を施した制限部位を欠いていた。図２は、ゲル電気泳動およびＴＮＦ−αプローブを使用したノーザレンブロット・ハイブリデイゼーションによって分析されたリボザイムか仲介するＲＮＡの切断を示す。ＴＮＦ−αリボザイムは、約１８００のヌクレオチドの長さの目的ＲＮＡを１４２０と３８０のヌクレオチド断片に切断した。リボザイムによって産生されたＴＮＦ−α断片の該サイズから見ると、切断部位が予想と一致していた。この様に、リボザイムＡおよびＢは、無関係なＲＮＡｓの存在下でＴＮＦ−α目的部位をin vitroで切断する。リボザイムＡ、ＢおよびＩＩの生細胞中での安定性リボザイムＡ、ＢおよびＩＩの生細胞中での安定性を、図３および４に示す。細胞膜は、高電荷高分子量分子の侵入に対する実質的なバリヤーとして存在するので、高電荷高分子量分子を細胞質内に送達する事が、主要な課題である。これを解決するために、トランスフェクション技法［例えば、カチオン性リポソーム介在トランスフェクション技術（Malone et al.，（1989 ）Proc．Natl．Acad．Sci.，USA86:6077-6081）、および電気穿孔法（Callis et al,，（1987）Nucl．Acids．Res．15:5823-5831）およびマイクロインジェクション（Rosa et al.，（1989）J．Cell．Biol．109:17-34）等］が開発されてきた。リポソームベースの方法が、最も多用性に富むようであるので、リポソームが、ＴＮＦ−αＲＮＡをうまく切断する機能的リボザイムを送達できるかについてテストがなされた。ＲＮＡトランスフェクションの有効性は、まず、ＨＬ６０細胞中で測定され、細胞に付加する完全な³²ｐ標識されたＲＮＡを測定することで測定される。リボザイムがトランスフェクションされた後、細胞はハンクス緩衝塩類溶液（GIBCO ）で洗浄された。全ＲＮＡを細胞から調整し、ＲＮＡ種をゲル電気泳動によって分離した。次ぎに、リボザイムＲＮＡバンド中に含まれる放射活性を測定した。その結果、放射活性バンドは、８から２０時間のトランスフェクション期間中に、リポソームに添加した初期ＲＮＡに対して２から４％に変化していた。これは細胞当たり約300,000分子のリボザイムＡが送達されたことに相当する。図４は、リボザイムＡ、ＢおよびＩＩの安定性を示す。、２０％（ｖ／ｖ）の子牛胎児血清（ＦＣＳ）の供給されたＲＰＭＩ１６４０中で対数増殖期に成長させた１０百万のヒトＨＬ６０細胞（ATCC CCL 240）が、ＲＮＡトランスフェクションに使用された。細胞は無血清培地で二回洗浄され、無血清培地の一滴（５ｍｌ）をポリスチレンチューブに添加し、続いて３５μｇのリポフェクチン（Bethesda Research Laboratories）、１０μｇのキャリアＲＮＡ（E．Coli．tRNA）、および３ｘ１０⁶崩壊時間（分；disints min）の³²ｐ標識キャップリボザイムＡ、Ｂ、ＩＩ（５μｇ）を添加した。混合物は速やかに混合された。細胞を無血清培地リポフェクチン／ＲＮＡ／キャリアＲＮＡの混合物中に再懸濁し、インキュベータ中に戻し２０時間置いた。トランスフェクション後、細胞を三回、ハンクス緩衝塩類溶液で洗浄し、２０％ＦＣＳの供給されたＲＰＭＩのインキュベータ中に戻した。細胞（１０⁶）は、上述の各レーンに示された時間に採集し、全ＲＮＡを調整し、７Ｍ尿素配合１５％ポリアクリルアミドゲルで分析された。トランスフェクションに使用したＲＮＡサンプルは、図４の上部に示してある。標識されキャップされたリボザイムＡ（５０μＭ）は、２０時間のＨＬ６０細胞トランスフェクトに使用された。細胞を３回洗浄し、核および細胞質ＲＮＡ調整し、ゲル電気泳動で分析した。核および細胞質分画を調製するために、細胞を１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ−ＫＣｌ、１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭジチオトレイトールおよび０．４％（ｗ／ｖ）ノニデット（Nonidet）Ｐ４０中で１０分間４℃でホモジナイズした。核は８００ｇで５分遠心分離して採集した。上澄液中のＲＮＡを沈殿させ、細胞質画分として貯蔵した。核は、Chomezynski & Sacchi（Anal．Biochem（1 987）162:156-160）による全ＲＮＡの調製法に記載のように処理した。矢印は、リボザイムＡのモノマーの位置を示す。（ａ）に示すリボザイムバンドの放射活性量が測定され、２０時間のトランスフェクション直後に存在した放射活性に対するパーセンテージとして表わされた。図５はin vivoにおけるリボザイムの活性を示すＨＬ６０細胞（ａ）におけるリボザイムおよびアンチセンスＲＮＡの活性を２０時間のトランスフェクション後に分析した。リボザイムＡまたはアンチセンスＲＮＡによるトランスフェクション後、細胞を６時間刺激してＴＮＦ−αを発現させた。ＲＮＡを抽出して、１−２％（ｗ／ｖ）アガロース・ホルムアルデヒド・ゲルを使用したゲル電気泳動法で分離し、ＴＮＦ−α遺伝子に対する放射活性プローブでノーザレンブロットによる検出を行った。ＴＮＦ−αプローブによってハイブリデイゼーションした後、そのフィルターをを剥がして、アクチンプローブ（British Biotechnology Limited）でハイブリダイズした。ＰＢＭＮＣ（ｂ）の場合、細胞は、分離され（Sioud et al.，Scand．J．Immol.（1990 31: 415-421）、ハンクス緩衝塩類溶液で４回、無血清培地で３回洗浄された。細胞（１０⁶）は、トランスフェクトされＨＬ６０前胞として処理された。レーン１および４は、（キャリアＲＮＡ単独でトランスフェクトされた）対照；レーン２は、アンチセンスＲＮＡ；レーン３および５はリボザイムＡ。このオートラジオグラムを過剰露光し、リボザイムＡレーンにＴＮＦ−αシグナルを表示させた。ＴＮＦ−α蛋白（ｃ）のラジオイムノアッセイ培地中に存在するＴＮＦ−α蛋白の量は、ＴＮＦ−α［¹²⁵Ｉ］分析システム（Amersham）を使用して測定された。レーン１から５は、図５（ａ）および５（ｂ）のレーン１から５に夫々相当する。リボザイムによる内在性ＴＮＦ−αＲＮＡの in vivoにおける破壊リボザイムＡがＲＮＡトランスフェクション後のそのターゲットを排除するかどうかを確かめる為に実験を行った。ＨＬ６０細胞内でのＴＮＦ−αＲＮＡ合成の予備経時研究では、ＴＮＦ−αＲＮＡが、ＰＭＡおよびＣｏｎＡによる２時間の刺激後には検出され得ることを示し、４から６時間後には最大発現に至る事がわかった。リボザイムがトランスフェクションされた細胞は、ＰＭＡおよびＣｏｎＡで６時間刺激し、全ＲＮＡを抽出し、ＴＮＦ−αプローブを使用したノーザレンブロットによって分析した。ＴＮＦ−αおよびアクチンｍＲＮＡは、電気泳動移動度がほぼ同じであるので、剥離後、アクチンプローブによって同じブロットがハイブリダイズされた。過少露光フィルムのデンシトメトリックスキャンからのデータでは、ＴＮＦ−α信号が４０％（図５（ａ）アンチセンス・レーン）および９０％（図３（ａ）リボザイムＡレーン）減少した。更に、ラジオインムノアッセイを使用して、培養培地中のＴＮＦ−α蛋白を測定した。本システムは、ＴＮＦ−αに特異的であるという点で、バイオ分析を凌ぐ利点を持つ。該データは、ＨＬ６０がＰＭＡおよびＣｏｎＡによって刺激されて、ｍｌ当たり1000fmolの多量のＴＮＦ −αを分泌されることを示すが、細胞がリボザイムＡおよびアンテイセンスで夫々トランスフェクトされた場合（図５（ｂ））には、僅か１５０および４００fm olしか分泌しない事を示している。アンテイセンスＲＮＡの効果がリボザイムＡより小さく、またリボザイムＡもアンテイセンスＲＮＡも細胞内部に、同様な濃度で存在していた（データは表示せず）ので、リボザイムＡの活性の一部は、ＲＮＡを切断するその能力に起因しているのではないかと我々は示唆する。in vivoにおけるリボザイム介在ＲＮＡ切断は、真核細胞で観察されている（Saxena & Ackerman，J．Biol．Chem．（19 90）265:17106-17109）。この場合、切断生成物は何も見られなかった。先に示唆したように、（Cotten & Birnstiel，1989；Sarver et al.，1990; Sioud & Drlica，1991）、リボザイム介在切断による産物は、たぶん細胞ヌクレアーゼ（５′断片、その５′末端はキャップされていたけれども、３′→５′エクソヌクレアーゼによって速やかに分解されたと予想される）によって分解されたのであろう。同様の条件を使用して、リボザイムＡをＰＢＭＮＣに送達した。図５（ａ）および（ｂ）に見ることができるように、リボザイムＡは、ＴＮＦ−αＲＮＡの量を８０％減少させ、ＴＮＦ−α蛋白の量を７０％減少させて、リポソームに仲介されるＲＮＡトランスフェクションが、リボザイムを様々なタイプの細胞に送達する方法を提供する可能性を高めた。分析中、リボザイムＢは、リボザイムＡと同様な減少をＴＮＦ −α・ｍＲＮＡにおいて誘導したようだ（データ無表示）。この様に、Ｔ７トランスフェクションターミネータの添加はリボザイムＡの特異的活性を減少させ得る。図６はＴＮＦ−αリボザイムの細胞分布を示すＴＮＦ−αリボザイム類（図１）は非常に安定である。ＴＮＦ−αリボザイム類は、ヒト細胞内で７日間にわたり検出可能であるが、一方、リボザイム類は通常、ヒト細胞内で不安定である（図４参照）。細胞分画研究では、ＴＮＦ−α リボザイム類が細胞から回収可能である事が示されているが、リボザイムの主要部分が細胞ヌクレアーゼが接近出来ない場所に隔離されているという可能性を示すものではなかった。この疑問にむけて、細胞にジゴキニン標識リボザイムをトランスフェクションした。トランスフェクション以後７２時間後に顕微鏡用スライドを調製し、リボザイムを抗−ジゴキニン蛍光Ｆａｂ接合体によって、材料および方法に記したように検出した。図５ＡおよびＢに提示したデータは、安定効果が細胞の区画性に起因するものではないことを示している。なぜならば、リボザイムの免疫蛍光染を行なうや否や、細胞全体が蛍光性を獲得したからである。図６（ａ）および６（Ｂ）参照。図７は細胞抽出物によるＴＮＦ−αリボザイム類電気泳動移動度シフト分析を示す初期の仮説では、腫瘍壊死因子の特定部位に抗して行動するリボザイムが、タンパク等のある細胞制因子によって保護されているとされていた。もし蛋白がリボザイムに結合してリボザイムを分解させないよう防御していたならば、移動性シフト実験でそれらを検出できるはずである。ＨＬ６０細胞の細胞蛋白で実施された初期の実験では、形成された複合体は、反応混合物中のポリｄＣｄＩおよびｔＲＮＡの存在によって阻害されなかった事が明らかになった。これらの実験では、抽出物中に存在しているヌクレアーゼによってリボザイムがかなり分解された。そこでＲＮＡｓｉｎがインキュベーション混合物中に添加され、リボヌクレアーゼの影響を減らすと、投入ＲＮＡの大部分が、主要複合体中（図７ｂレーン２、３および４）に補足された。ＰＢＭＮ細胞からの細胞質抽出物を使用すると、低電気泳動移動度を持つ複合体も検出可能であった（図７ｂレーン６、７）。これはリボザイムに結合した蛋白が、全細胞タイプに共通の蛋白である事を示唆している。ＲＮａｓｉｎ存在下または無存在下で形成された複合体は、同一の移動度をもっていた。これは、蛋白が全長に結合したことを示す。さらに、フェノール抽出後に複合体から回収されたリボザイムは、完全な長さのリボザイムに相当する（図７ｂレーン８）。複合体の形成はＴＮＦ−αリボザイム類に特異的であるｔＲＮＡを反応に添加しても、形成される複合体の量は減少しなかった。これは、リボザイムに対するある特異的な結合がある事を示唆する。結合の特異性は、競合分析によって確認された（図８）。ｔＲＮＡおよびＰｏｌｄＣｄＩと対比させて、複合体形成を無標識リボザイムを標識リボザイムと競合させて行った。面白いことに、ＩＬ−２またはＨＩＶインテグレースのｍＲＮＡ指向性のハンマーヘッド型リボザイムによる複合体形成は見られなかった。これは、結合がＴＮＦ−αリボザイム類の触媒ドメインに起因していないことを示す。ＴＮＦ−αとは異なり、ＩＬ−２リボザイムはＴＮＦ−αリボザイムのように細胞内で安定ではなく、このような結合現象を示さない。この様に、こうした結合がＴＮＦ−αリボザイム類のin vivo安定性に関係する可能性がある。ＴＮＦ−αリボザィムは他のリボザイムに対して安定性を与えるＴＮＦ−αを分解から保護するという本ＲＮＡ要素の特徴付けを行う前にも、本ＲＮＡ要素が他のＲＮＡに付加されてれてそれを安定化するのではないかという可能性がテストされた。ＴＮＦ−αリボザイムは、単独では不安定なＩＬ− ２リボザイム（図９）に結合した。図１０ＡおよびＢに示されるように、我々の条件においては、ＩＬ−２リボザイム単独ではどの細胞要素とも自身との複合体を形成しなかった。下記に示すように、ＩＬ−２リボザイムに結合したＴＮＦ− αリボザイムは複合体を形成し、安定化された。保護または無保護ＩＬ−２リボザイムのin vivo活性アンテイセンスまたはリボザイムによるＴＮＦ−α遺伝子発現が阻害されても、ＩＬ−２の遺伝子の発現には著しい影響を与えないことはわかっている。そこでＩＬ−２遺伝子発現に対する二重リボザイム（ＴＮＦ−αリボザイムに結合したＩＬ−２リボザイム）の効果が正確に調査できる。ＴＮＦ−αリボザイムに対抗するリボザイムは、蛋白等の或る細胞質因子によって保護された。これらの因子は、構造的安定性を超えて、リボザイムの安定性および／または活性を高め得る。このような因子または関連化合物は、遺伝子治療アプローチによってリボザイムと結合させることができる。移動性シフト実験を使用して、蛋白がＴＮＦ−αリボザイムに結合することをうまく実証できる（図８、７および９参照）。電気泳動の前に該複合体をプロテナーゼＫで前処理して複合体（図１１Ａ、レーン４および５）を排除し、コファクターが蛋白性であることが確認された。レーン４に見られるリボザイムの分解は、この特殊細胞質抽出物（ＣＥ）中に存在する過剰のリボヌクレアーゼによっておこる。さらに、ＴＮＦ−αリボザイム結合蛋白のＵＶ架橋分析では、図１１Ｃ；レーン１に見られるような主要なリボザイム結合蛋白を明らかにした。同様の複合体形成は、インテグレースリボザイムでは観察されなかった。この様に蛋白は、ＴＮＦ−αリボザイムに特異的であり、インテグレースリボザイムとＴＮＦ−αリボザイム間のin vivo安定性の相違は該蛋白に起因するのではないかと示唆される。ＴＮＦ−αリボザイムと他のＲＮＡ分子とのリンクが蛋白質結合をもたらし、 in vitoroおよびin vivo安定性を授与するのかどうかについて見るために、下記のミニ遺伝子を構築した。１）ＴＮＦ−αリボザイム５′リンクしたＩＬ−２リボザイムＴＮＦ−αリボザイムおよびインテグレースまたはＩＬ−２リボザイムは、それらのＲＮＡターゲットと相補的なヌクレオチド配列が僅かに異なるだけなので、そのＲＮＡ領域が複合体形成に関与していると思われる。２）アンチセンスＴＮＦ−αＲＮＡ（図９参照）にリンクしたＩＬ−２リボザイムこれらの分子をコードしている遺伝子をクローンし、in ｖitroで転写し、放射活性標識されたＲＮＡ分子をゲル遅延分析で使用した。幾つかの実験で複合体の弱い検出が見られたが、我々のデータでは、ＴＮＦ− αリボザイムの５′にリンクしたＩＬ−２も、アンテイセンスにリンクしたＩＬ −２リボザイムもどちらも蛋白と結合しなかった事を示している（図９の構造参照）（図１２Ａ、レーン４、５、７、および８、および図１２Ｂ：レーン２および３）。図１２Ａに見られるように、ＣＥ存在下でのＩＬ−２リボザイムのおよび該キメラ分子の分解が全レーンで見られた。これは、複合体形成が分解からリボザイムを保護していることを示している。このデータは蛋白質が結合して二次構造を取らなければならないことを示唆している。ＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクしたＴ７ターミネータは該結合に影響していないので、リボザイム結合部位が、ＴＮＦ−αリボザイムの５′フランキング配列とその触媒ドメインの間に形成された可能性が考えられた。更に、Ｔ７ターミネータにリンクしたＴＮＦ−αリボザイムの二次構造を模倣する試みがなされた（図１３Ａ）。ＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクしたＴＮＦ−αアンチセンスアンチセンスに対するＴＮＦ−αリボザイムの３′末端は、ＴＮＦ−α上の異なるターゲットに向かった（図１３Ｂ）。選ばれたアンチセンスはヘアピン構造（キージング・ループ（keesing loop））持つ。両遺伝子がクローンされ、in vitroで転写され、そして放射性標識されたＲＮＡ分子を使用してゲル遅延分析が行なわれた。結果（図１４Ａ：レーン５および６）は、ＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクしたアンテイセンスが蛋白に結合した事を示す。更に競合実験では、無標識ＴＮＦ−αリボザイムが複合体形成に対して該キメラリボザイムと競合したことから、同じ蛋白が複合体形成に関与していることが実証された（図１４Ｂ：レーン３および４）。二番目の実験では、ＩＬ−２リボザイムが、ＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクした（図１５Ｂ）。ＩＬ−２リボザイムフランキング配列は、分子内相互作用を防御するために構築物中で拡張された。キメラリボザイムから生じたＲＮＡは、ＴＮＦ−αリボザイムとして蛋白と結合した（図１６；レーン４）。これらの実験データは、ＴＮＦ−αリボザイムの５′フランキング配列がこの結合に関与することを示唆している。不完全ＴＮＦ−αリボザイムフランキング配列の関与を調べるため、その５′または３′のフランキング配列で先端切除したＴＮＦ−αリボザイム（夫々、図１７Ａおよび１７Ｂ）を構築した。これらのリボザイムをコードした遺伝子をクローンし、in vitroで転写し、そして放射性標識ＲＮＡ分子を使用して、ゲル遅延分析を行なった。図１８Ａ、レーン４に見られるように、３′末端切除リボザイムは蛋白と結合している。対照的に、５′末端切除ＴＮＦ−αリボザイムは蛋白と複合体を形成していない（図１８Ａ：レーン６）。＊で示されたバンドはリボザイム細胞内形成によるものと思われる。３′末端切除リボザイムが他のタイプの細胞由来の蛋白と結合するか否かについて見るために、ゲル遅延分析が使用された。図１８Ｄ、レーン２、３、および４に見られるように、不完全リボザイムはＰＢＭＮ、ＨＬ６０およびＷＨ１６４由来の蛋白と結合した。我々の実験データを総合すると、多くの細胞タイプ起源の内在性蛋白が３′末端切除ＴＮＦ−αリボザイムと結合することが示される。この様に蛋白と結合するどのリボザイムの能力も、その５′末端およびたぶん３ ′塩基組成に依存する。ＴＮＦ−αリボザイムＢおよびＩＩの考えられる二次構造および該蛋白の推定結合部位を図１９に提示する。本分析中、in vitro複合体形成がリボザイムを分解から守ることが観察された（図２１Ａ参照）。内在性蛋白は、ＴＮＦ−αリボザイム類の予期せざる安定性に関与し得る。更にこの様な内在性蛋白が、リボザイムの折りたたみの誤りを防御し、かつ分解を助長して、in vivoでのリボザイム活性を高めるのかもしれない。ＩＬ−２およびＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクしたＩＬ−２のin vivo安定性ＩＬ−２およびＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクしたＩＬ−２のin vivo安定性を、先に報告した様に調査した。つまり、２０％子牛胎児血清を供給したＰＲＭＩにおいて対数成長期に成長したＨＬ−６０細胞を、ＤＯＴＡＰをトランスフェクション剤として使用して、ＩＬ−２リボザイムまたはＴＮＦ−α リンクしたＩＬ−２でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３回ハンクス緩衝塩類溶液で洗浄し、２０％子牛胎児血清を供給したＰＲＭＩのインキュベーターに戻した。１ｍｌ培養物に含まれる細胞を種々の機会に採集した。全ＲＮＡを調製し、７Ｍ尿素配合１５％ポリアクリルアドゲルで分析した。リボザイムバンド中の放射活性を測定し、トランスフェクション直後に存在する放射活性に対するパーセントとして表した（図２０）。データはキメラリボザイムがＩＬ−２リボザイム単独よりもより安定であることを示す。ＴＮＦ−αリボザイムおよびＴＮＦ−αリボザイムにリンクしたＴＮＦ−αアンチセンスの in vivo活性および細胞障害性ＴＮＦ−αリボザイム、アンチセンスおよびＴＮＦ−αリボザイムにリンクしたアンチセンスのin vivo性を、細胞障害性分析およびラジオイムノアッセイを使用して調査した。これらの実験では、リボザイム類の細胞インターナリゼーションがカチオン性リポソームによって（ＤＯＴＡＰ）によって行なわれた。５６から９１番のＴＮＦ−α配列（Pennica et al.，1984，Nature312:724）と相補的な、長さ３６ｎｔのアンチセンスがＴＮＦ−αリボザイムにリンクした。約100,000ＰＢＭＮ細胞がリボザイムで６時間から１２時間でトランスフェクトされた。ＴＮＦ−αの発現は１０μｇのＰＨＡで１６時間にわたって誘導され、培地中に分泌されたＴＮＦ−αは、Ｌ９２９細胞を使用した細胞障害分析によって測定された。ＴＮＦ−αは、Ｌ９２９細胞の成長を阻害する。高い放射活性計測数（取り込まれた３Ｈチミジンが高レベルである）は、ＴＮＦ−αが低レベルである事を示し、つまりＰＢＭＮ細胞中でリボザイムが効果的であることを示す。末梢血にリボザイムがトランスフェクトすると、ＴＮＦ−αのレベルはかなり減少する。更にラジオイムノアッセイを使用して、培養培地中のＴＮＦ−αを測定した。このシステムはＴＮＦ−αに特異的である点でバイオアッセイを凌ぐ利点を持つ。図２１に提示するデータは、全分子がin vivoで活性であることを示す。予想し得たように、ＴＮＦ−αリボザイムにリンクしているアンチセンスは相乗効果をもつ。治療方法を考案するにあたっての主要な問題の一つは、特異性および細胞障害性である。この様に、ＴＮＦ−αリボザイム、ＴＮＦ−αリボザイムにリンクしたＴＮＦ−αアンチセンスのインターロイキン２遺伝子の発現における効果を調査し、特異性および細胞障害性をチェックした。分子がカチオン性リポソームによって細胞内に送達された。約100,000末梢血単核細胞がテスト分子によって５時間でトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞を５μｇ／ｍｌのＰＨＡで１６時間刺激し、培地中に分泌されたインターロイキン２の定性を、ＣＴＬＬ２分析を使用して行った。この分析で、対照およびテスト分子でトランスフェクトされた細胞から得られた上澄液から一連の希釈（１／４から１／１２８）を行った。各々の希釈物（３重で行った）から１００μｌを２０μｌの培地中の５０００ＣＴＬＬ２細胞に加えた。２０時間後、細胞に３Ｈチミジンを４時間でパルス（与え）し、採集し、ＤＮＡに付加した放射活性を測定する。インターロイキン２は、ＣＴＬＬ２細胞の成長を促進し、高い放射活性計測は、高レベルのＩＬ−２を示し、つまりＰＢＭＮ細胞中ではＩＬ−２は効果的でない事を示す。図２２は、インターロイキン２の発現が、ＴＮＦ−αリボザイムによって行われない事を実証している。図２２はまた、リボザイムが該細胞に対して細胞障害性でないことを示し、ＩＬ−２遺伝子発現が、ＴＮＦ−α遺伝子発現のレベルによって規制されないことを示す。ＩＬ−２リボザイム、ＴＮＦ−αリボザイムの３′末端にリンクしたＩＬ−２リボザイムの in vivo活性がＣＴＬＬ２分析によって調査された。約100,000ＰＢＭＮ細胞に異なる分子（最終濃度２５μｌ）を、ＤＯＴＡＰをカチオン性リポソームとして使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、細胞をＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）で１６時間刺激し、培地中のＩＬ−２をＣＴＬＬ２分析で、図２２に示すように分析した。図２３に提示されたデータは、両リボザイムが活性であることを示している。ＴＮＦ−αリボザイムの３′にリンクしたＩＬ−２リボザイムの活性は、ＩＬ− ２単独よりも遥かに高い。これは、蛋白がリボザイムの安定性および活性の両方を高め得ることを示唆している。インターロイキン２遺伝子発現を測定するもう一つの方法は、ＰＢＭＮ細胞に直接３Ｈチミジンをパルスする事である。トランスフェクション後、細胞をＰＨＡで４８時間刺激し、３Ｈチミジンをパルスし、１８時間後に収穫した。この分析で、ＩＬ−２はＴ細胞の成長を刺激し、高い放射活性計測は高レベルのＩＬ−２を示し、つまり無効果分子であることを示す。３つの実験結果を下に提示する。上記表に提示された結果は、両リボザイムがin vivoで活性であることを示す。ＴＮＦ−αリボザイムにリンクしたＩＬ−２リボザイムがＩＬ−２単独よりも、より活性であった。上記で実証されたように、３′不完全リボザイムがＴＮＦ−αリボザイムである蛋白と結合する。この様に、不完全リボザイムは蛋白を通じて安定化剤として使用可能である。更にこの不完全リボザイムは、３′末端フランキング配列を欠いているので、活性ではないだろう。ＴＮＦ−αリボザイムおよび３′不完全リボザイムのin vivo活性が、様々なトランスフェクション時に調査された（下記参照）。上記の様に、ＤＯＴＡＰ使用して細胞にＴＮＦ−αリボザイムおよび３′不完全リボザイムをトランスフェクトした。これらの実験において、細胞はトランスフェクション時以降６、２０、４２、７２時間後にＬＰＳ（１００ｍｇ／ｍｌ）で刺激された。培地に含まれるＴＮＦ−αを、キット（Amersham）記載の様にラジオイムノアッセイで測定した。これらのデータはfmol/mlで表される。これらのデータは、ＴＮＦ−αリボザイムと比較して不完全リボザイムは、活性でないことを示し、ＴＮＦ−αリボザイムはトランスフェクション後７２時間経っても活性であることを実証している。４２時間後に見られるように、無刺激細胞は、刺激された対照と同量のＴＮＦ −αを分泌した。これは多分、細胞がプラスチックと接触によって刺激されたという事実によるものであろう（細胞をプラスチックに長時間接触させると幾つかのリンフォカイン遺伝子の発現が刺激され得る事が知られている）。この様にリボザイム活性の崩壊がトランスフェクション後４８時間して起こるのは、プラスチックに長時間接触されてＴＮＦ−α遺伝子が過剰発現に起因するか、および／またはリボザイム自身の崩壊に起因するのかもしれない。〈結論〉我々は、ＴＮＦ−αリボザイムがヒト細胞中では非常に安定である事をこの様に実証した。この現象は、リボザイムが細胞中に分布しているように見える（図６）ので、細胞内にあっては簡単に説明されない。リボザイムの重篤な分画が、電気泳動移動度低下をもつ複合体として回収された。リボヌクレアーゼをＲＮＡｓｉｎで抑制すると、細胞抽出物からの複合体の回収は増加した。ｔＲＮＡの添加は競合的効果をもたらさなかった。複合体の形成阻害は、無標識のリボザイムにおいてのみ得られた。インテグレースもＩＬ−２リボザイムも検出可能な複合体を形成しなかった。この様に、結合はＴＮＦ−αリボザイムに特異的である。ＩＬ−２リボザイムは、ＴＮＦ−αリボザイムと比較すると、細胞内安定性低下を示したことは、複合体形成が安定性に関連するとの可能性を高めた。ＴＮＦ−αリボザイムとＩＬ−２リボザイムとのリンクはお互いに安定性を高め、二重リボザイムに複合体を形成する能力を与えた。更に、リンクしたリボザイムは活性であった。この様、に、３′末端の不完全なリボザイムは蛋白に結合する。対照的に、５′末端の不完全なＴＮＦ−αリボザイムは蛋白複合体を形成しない。蛋白に結合するいかなるリボザイムの能力も、その５′末端および、多分、長さを含めた３′ベースの組成に依存するであろう。我々のデータは、リボザイム結合内在性蛋白を考案する一助となろう。配列表（1）一般的情報（i）出願人：Ｓｌｏｕｄ，Ｍｏｕｌｄｙ（ii）発明の名称：ＴＮＦ−アルファリボザイムおよびＴＮＦ−アルファリボザイムに結合した分解抵抗性ｍＲＮＡ誘導体（iii）配列の数：32 （iv）通信宛先：（A）名宛人：ＪｏｈｎＭ．Ｓｌａｔｔｅｒｙ−デービスコリソンケーブ（B）通り：リトルコリンズストリート１（C）市：メルボルン（D）州：ビクトリア（E）国：オーストラリア（F）郵便番号：3000 （v）コンピュータ読取り可能な形態：（A）媒体タイプ：フロッピーディスク（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル（C）オペレーテイングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（D）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎリリース＃1．24 （vi）現在の出願データ：（A）出願番号：（B）出願日：１９９３年１１月３日（C）分類：（vii）先の出願データ（A）出願番号：ＵＳ０７／９７１，０５８（B）出願日：１９９２年１１月３日（viii）アトニー／エージェント情報（A）氏名：ＪｏｈｎＭ．Ｓｌａｔｔｅｒｙ（B）登録番号：（C）参照／ドケット番号：（ix）電信情報：（A）電話：６１３−２５４−２７７７（B）テレファックス：６１３−２５４−２７７０（C）テレックス：ＡＡ３１７８７（2）配列認識番号１のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４３塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：他の核酸（A）説明：（混合ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマー詳細は、明細書および図面を参照）（xi）配列の記載：配列認識番号１：（2）配列認識番号２のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：１６塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：他の核酸（A）説明：（混合ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマー詳細は、明細書および図面を参照）（xi）配列の記載：配列認識番号２：（2）配列認識番号３のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４２塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：他の核酸（A）説明（混合ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマー詳細は、明細書および図面を参照）（xi）配列の記載：配列認識番号３：（2）配列認識番号４のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４２塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号４：（2）配列認識番号５のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４３塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：他の核酸（A）説明（混合ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマー詳細は、明細書および図面を参照）（xi）配列の記載：配列認識番号５：（2）配列認識番号６のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：２２塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号６：（2）配列認識番号７のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：１９塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号７：（2）配列認識番号８のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：２６塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号８：（2）配列認識番号９のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：８８塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号９：（2）配列認識番号１０のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：８７塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xｉ）配列の記載：配列認識番号１０：（2）配列認識番号１１のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：６７塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１１：（2）配列認識番号１２のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：６７塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１２：（2）配列認識番号１３のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：１５塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１３：（2）配列認識番号１４のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：８３塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１４：（2）配列認識番号１５のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：９７塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xｉ）配列の記載：配列認識番号１５：（2）配列認識番号１６のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：３３塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１６：（2）配列認識番号１７のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：５３塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１７：（2）配列認識番号１８のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４６塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１８：（2）配列認識番号１９のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：６９塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号１９：（2）配列認識番号２０のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：７２塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２０：（2）配列認識番号２１のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：５７塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２１：（2）配列認識番号２２のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：６２塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２２：（2）配列認識番号２３のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４９塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２３：（2）配列認識番号２４のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：１０６塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２４：（2）配列認識番号２５のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：９０塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２５：（2）配列認識番号２６のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：９２塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２６：（2）配列認識番号２７のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：９４塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２７：（2）配列認識番号２８のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：５５塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載:配列認識番号２８：（2）配列認識番号２９のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：１０８塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号２９：（2）配列認識番号３０のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４１塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号３０：（2）配列認識番号３１のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：３９塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号３１：（2）配列認識番号３２のための情報：（i）配列特性：（A）長さ：４９塩基対（B）型：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ＲＮＡ（ゲノム）（xi）配列の記載：配列認識番号３２：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/09 //(Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の構造を有する化合物。ここで、夫々のＸは、同一または異なるリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々はリボヌクレオチドを表し、またａ，ｃ，ｕ（ｔ）およびｇの夫々は、その糖、リン酸または塩基が修飾もしくは非修飾、または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′の夫々は、所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｎおよびｎ′の夫々は整数を表し；夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａは、リボヌクレオチドの数を定義する整数［但し、ａは０または１であり得、ａが０のときには、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＸと結合する］を表し；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；夫々の断続線（dashed line）は独立に、その両側に位置するヌクレオチドの間に共有結合を与える化学的結合、或いはこのような化学的結合の不存在を表し；（Ｘ）_bは存在し又は不存在であり得るオリゴヌクレオチド［但し、（Ｘ）_bが存在するときは、ｂは２以上の整数を表す］を表す。２．請求項１の化合物であって、夫々のＸはリボヌクレオチドを表し；Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々はリボヌクレオチドを表し、またａ，ｃ，ｕ（ｔ）およびｇの夫々はリボヌクレオチドを表す化合物。３．下記の構造を有する請求項１の化合物。ここで、夫々のＸは、同一または異なるリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々はリボヌクレオチドを表し、またａ，ｃ，ｕ（ｔ）およびｇの夫々は、その糖、リン酸または塩基が修飾もしくは非修飾、または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nは、所定の配列を有するｎが整数のオリゴヌクレオチドを表し；夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；夫々の断続線（dashed line）は独立に、その両側に位置するヌクレオチドの間に共有結合を与える化学的結合、或いはこのような化学的結合の不存在を表し；（Ｘ）_bは存在し又は不存在であり得るオリゴヌクレオチド［但し、（Ｘ）_bが存在するときは、ｂは２以上の整数を表す］を表す。４．下記の構造を有する請求項３の化合物。ここで、夫々のＸは、同一または異なるリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々はリボヌクレオチドを表し、またａ，ｃ，ｕ（ｔ）およびｇの夫々は、その糖、リン酸または塩基が修飾もしくは非修飾、または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nは、所定の配列を有するｎが整数のオリゴヌクレオチドを表し；夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表す。５．下記の構造を有する請求項４の化合物。ここで、夫々のＸは、同一または異なるリボヌクレオチドを表し；Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々はリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nは、所定の配列を有するオリゴヌクレオチド（ｎは整数を表す）を表し；夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表す。ここで（Ｘ）ⁿはオリゴヌクレオチドを表す。６．下記の構造を有する化合物。３′−［−（Ｚ）_r−Ｑ−（Ｚ）_s−］_z−５′ ここで、夫々のＱは、同一または異なり得る請求項１の化合物を表し；夫々のＺは、同一または異なり得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであって、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換され得るリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを表し；ｒおよびｓの夫々は、０以上の整数を表し；ｚは、１以上の整数を表す。７．薬学的、獣医学的または農業的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組合せて、請求項１の化合物を含有する組成物。８．請求項２の化合物の製造方法であって、（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせからなる導入ベクター中に、前記化合物に対応するヌクレオチド配列を連結する工程と；（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼを用いて、工程（ａ）のヌクレオチド配列を転写する工程と；（ｃ）前記化合物を回収する工程とを具備する方法。９．ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの組合せからなる導入ベクターであって、転写されると請求項２の化合物を生じるヌクレオチド配列を含んだベクター。１０．請求項９に記載の導入ベクターであって、バクテリア性プラスミドまたはファージＤＮＡであるベクター。１１．転写されると請求項２の化合物を生じるヌクレオチド配列を含んだ、原核細胞または真核細胞。１２．ＴＮＦ−αの過剰発現に関連した疾病を治療する方法であって、患者に対して、ＴＮＦ−αの過剰発現を低減して前記疾病を治療するように、有効量の請求項１の化合物を投与することを具備した方法。１３．請求項１２の方法であって、前記疾病がリウマチ性関節炎である方法。１４．請求項１２の方法であって、前記疾病がＡＩＤＳである方法。１５．請求項１２の方法であって、前記疾病が自己免疫疾患である方法。１６．下記構造を有するＲＮＡ分子。ここで、夫々のＸは、同一または異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｘ）_nおよび（Ｘ）_n′の夫々は、所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｎおよびｎ′の夫々は整数を表し；夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａは、リボヌクレオチドの数を定義する整数［但し、ａは０または１であり得、ａが０のときには、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＸと結合する］を表し；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［ｂは２以上の整数を表す］を表す。１７．請求項１６のＲＮＡ分子であって、少なくとも一つの（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が少なくとも一つのリボザイムをコードするＲＮＡ分子。１８．請求項１６のＲＮＡ分子であって、前記リボザイムがヘアピン型リボザイムであるＲＮＡ分子。１９．請求項１６のＲＮＡ分子であって、前記リボザイムがＲＮＡａｓｅＰであるＲＮＡ分子。２０．請求項１６のＲＮＡ分子であって、前記リボザイムがハンマーヘッド型リボザイムであるＲＮＡ分子。２１．請求項１６のＲＮＡ分子であって、前記リボザイムが肝炎デルタリボザイムであるＲＮＡ分子。２２．請求項２０のＲＮＡ分子であって、前記（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が下記の構造を有するＲＮＡ分子。ここで、ＸおよびＹの夫々は、同一もしくは異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）_pおよび（Ｙ）_p′の夫々は、開裂されるべきＲＮＡ標的配列とハイブリダイズすることができる所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｐおよびｐ′の夫々は、前記オリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド数を定義する整数［但し、ｐ＋ｐ′の和は前記リボザイムを前記ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズさせるために十分な数である］を表し；夫々の★は、その両側に位置するリボヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａは、リボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、ａが０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＸと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［但し、ｂは２以上の整数を表す］を表す。２３．請求項２０のＲＮＡ分子であって、前記（Ｘ）_n′が下記の構造を有するＲＮＡ分子。ここで、ＸおよびＹの夫々は、同一もしくは異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）_pおよび（Ｙ）_p′の夫々は、開裂されるべきＲＮＡ標的配列とハイブリダイズすることができる所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｐおよびｐ′の夫々は、前記オリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド数を定義する整数［但し、ｐ＋ｐ′の和は前記リボザイムを前記ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズさせるために十分な数である］を表し；夫々の★は、その両側に位置するリボヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａは、リボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、ａが０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＧと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［但し、ｂは２以上の整数を表す］を表す。２４．下記の構造を有する請求項２１のＲＮＡ分子。２５．下記の構造を有する請求項２１のＲＮＡ分子。２６．請求項１６のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′がポリペプチドをコードするＲＮＡ分子。２７．請求項１６のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が哺乳類に固有のＲＮＡとハイブリダイズできるＲＮＡ分子。２８．請求項１６のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が植物に固有のＲＮＡとハイブリダイズできるＲＮＡ分子。２９．請求項１６のＲＮＡ分子と、適切なデリバリー剤とを含有する薬剤組成物。３０．請求項１６の化合物を製造する方法であって、（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせからなる導入ベクター中に、前記化合物に対応するヌクレオチド配列を連結する工程と；（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼを用いて、工程（ａ）のヌクレオチド配列を転写する工程と；（ｃ）前記化合物を回収する工程とを具備する方法。３１．ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの組合せからなる導入ベクターであって、転写されると請求項１６の化合物を生じるヌクレオチド配列を含んだベクター。３２．請求項３０に記載の導入ベクターであって、バクテリア性ブラスミドまたはファージＤＮＡであるベクター。３３．転写されると請求項１６の化合物を生じるヌクレオチド配列を含んだ、原核細胞または真核細胞。３４．特定のＲＮＡ標的配列を開裂させる方法であって、該特定の標的配列を開裂させるように、請求項１７のリボザイムを前記標的配列と反応させることを具備した方法。３５．請求項３３の方法であって、前記標的配列が哺乳動物に固有の配列である方法。３６．請求項３３の方法であって、前記標的配列が植物に固有の配列である方法。３７．請求項３３の方法であって、前記標的配列がウイルス遺伝子である方法。３８．哺乳動物におけるウイルス疾患を治療する方法であって、哺乳動物に対して、ウイルス遺伝子を開裂することができる有効量の請求項１７のリボザイムを投与し、これによって前記ウイルス遺伝子を開裂し、前記ウイルス疾患を治療することを具備した方法。３９．請求項４２のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が下記の構造を有するＲＮＡ分子。ここで、ＸおよびＹの夫々は、同一もしくは異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）_pおよび（Ｙ）_p′の夫々は、開裂されるべきＲＮＡ標的配列とハイブリダイズすることができる所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｐおよびｐ′の夫々は、前記オリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド数を定義する整数［但し、ｐ＋ｐ′の和は前記リボザイムを前記ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズさせるために十分な数である］を表し；夫々の★は、その両側に位置するリボヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａは、リボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、ａが０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＸと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［但し、ｂは２以上の整数を表す］を表す。４０．請求項４３のＲＮＡ分子であって、前記（Ｘ）_n′が下記の構造を有するＲＮＡ分子。ここで、ＸおよびＹの夫々は、同一もしくは異なり得るリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）_pおよび（Ｙ）_p′の夫々は、開裂されるべきＲＮＡ標的配列とハイブリダイズすることができる所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；ｐおよびｐ′の夫々は、前記オリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド数を定義する整数［但し、ｐ＋ｐ′の和は前記リボザイムを前記ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズさせるために十分な数である］を表し；夫々の★は、その両側に位置するリボヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するリボヌクレオチド間に共有結合を与える化学的結合を表し；ａは、リボヌクレオチドの数を定義する整数を表し［但し、ａは０または１であり得、ａが０であるときは、（Ｘ）_aの５′側に位置するＡは（Ｘ）_aの３′側に位置するＧと結合する］；ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）_bはオリゴヌクレオチド［但し、ｂは２以上の整数を表す］を表す。４１．下記の構造を有する請求項４４のＲＮＡ分子。４２．下記の構造を有する請求項４３のＲＮＡ分子。４３．請求項３８のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′がポリペブチドをコードするＲＮＡ分子。４４．請求項３８のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が哺乳動物に固有のＲＮＡとハイブリダイズできるＲＮＡ分子。４５．請求項３８のＲＮＡ分子であって、（Ｘ）_nまたは（Ｘ）_n′が植物に固有のＲＮＡとハイブリダイズできるＲＮＡ分子。４６．請求項３８のＲＮＡ分子と、適切なデリバリー剤とを含有する薬剤組成物。４７．請求項３８の化合物を製造する方法であって、（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせからなる導入ベクター中に、前記化合物に対応するヌクレオチド配列を連結する工程と；（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼを用いて、工程（ａ）のヌクレオチド配列を転写する工程と；（ｃ）前記化合物を回収する工程とを具備する方法。４８．ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの組合せからなる導入ベクターであって、転写されると請求項５１の化合物を生じるヌクレオチド配列を含んだベクター。４９．請求項５２に記載の導入ベクターであって、バクテリア性プラスミドまたはファージＤＮＡであるベクター。５０．転写されると請求項３８の化合物を生じるヌクレオチド配列を含んだ、原核細胞または真核細胞。５１．特定のＲＮＡ標的配列を開裂させる方法であって、該特定の標的配列を開裂させるように、請求項３９のリボザイムを前記標的配列と反応させることを具備した方法。５２．請求項５４の方法であって、前記標的配列が哺乳動物に固有の配列である方法。５３．請求項５４の方法であって、前記標的配列が植物に固有の配列である方法。５４．請求項５４の方法であって、前記標的配列がウイルス遺伝子である方法。５５．哺乳動物におけるウイルス疾患を治療する方法であって、哺乳動物に対して、ウイルス遺伝子を開裂することができる有効量の請求項５８のリボザイムを投与し、これによって前記ウイルス遺伝子を開裂し、前記ウイルス疾患を治療することを具備した方法。