HU215187B - Eljárás az RNS funkcióját gátló genetikai egységek előállítására, és eljárás sejtekbe való bevitelükre - Google Patents

Eljárás az RNS funkcióját gátló genetikai egységek előállítására, és eljárás sejtekbe való bevitelükre Download PDF

Info

Publication number
HU215187B
HU215187B HU901584A HU158490A HU215187B HU 215187 B HU215187 B HU 215187B HU 901584 A HU901584 A HU 901584A HU 158490 A HU158490 A HU 158490A HU 215187 B HU215187 B HU 215187B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
rna
ribozyme
dna
gene
ligated
Prior art date
Application number
HU901584A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT54206A (en
HU901584D0 (en
Inventor
Hartmut Beug
Max L. Birnstiel
Matthew Cotten
Harald Kandolf
Ernst Wagner
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh. filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Publication of HU901584D0 publication Critical patent/HU901584D0/hu
Publication of HUT54206A publication Critical patent/HUT54206A/hu
Publication of HU215187B publication Critical patent/HU215187B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás az RNS-fűnkció gátlására szőlgáló, adőttesetben sők másőlatban előfőrdűló, genetikai egységek előállítására.Az egység a pőlimeráz III-mal végbemenő transzkripc óhőz szükségestranszkripciós egységeket tartalmazza és a gátló RNS-t kódőló DNS-t,amely az egységen belül úgy helyezkedik el, hőgy az átírt RNS apőlimeráz III átirat része. Ezen egységek segítségé el a gátló RNS-nek, amely ribőzimők vagy antiszensz RNS-ek főrmájában főrdűl elő,nagyőbb stabilitást és űgyanakkőr nem csökkent aktivitástbiztősítanak. A találmány tárgya tővábbá egy őlyan eljárás is,amellyel a genetikai egységnek a sejtekbe való bevitelét tesziklehetővé, valamint ezen genetikai egységeket tartalmazógyógyszerkészítmények. ŕ

Description

A találmány az RNS specifikus funkcióját RNS-sel való kölcsönhatás révén gátló genetikai egységek előállítására és ezeknek sejtekbe való bevitelére szolgáló eljárásra vonatkozik.
Gének specifikus gátlása oligonukleotidokkal - például deregulált onkogéneknek vagy virális géneknek terápiás hatású blokkolása céljából - bizonyos komplementer RNS- vagy DNS-szekvenciáknak, az úgynevezett „antiszensz oligonukleotidoknak” azon a képességén alapszik, hogy mRNS-ekkel, feldolgozószignálokkal vagy pre-mRNS-ekkel hibridizálnak, és ilyen módon meg tudják szakítani a géninformációknak proteinekre történő átvitelét.
Az antiszensz-DNS alkalmazása a komplementer cél-RNS lebomlását okozza azzal, hogy a keletkezett hibrideket az RNÁz-H elhasítja, és ez az adott komplementer RNS lebomlását eredményezi.
Antiszensz-RNS alkalmazása esetén a transzlációnál vagy a feldolgozásnál egy úgynevezett „hibridzárlat” keletkezik, amikoris RNS/RNS hibridek alkotják a strukturális gátat. Feltételezhető, hogy az ilyen hibridek a sejtben akkumulálódnak; további sorsukat még nem vizsgálták. Jelenlegi tudásunk szerint ennél a mechanizmusnál lényegében egy reverzibilis történésről van szó. Az antiszensz-RNS-molekulák alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy ezeket a molekulákat vagy in vitro szintetizáljuk és bevisszük a sejtekbe, vagy pedig az ezeket kódoló géneket visszük be sejtekbe, s így a gátló RNS-t a sejten belül állíthatjuk elő. Eddig azonban nem sikerült egy ilyen gént olyan formává alakítani, amely lehetővé tette volna hatékony mennyiségű antiszenszRNS termelését a sejtben.
Nemrég fedezték fel az RNS-gátlás egy harmadik elvét, amely hozzáférhetővé tette az in vitro alkalmazást. Ez az elv az RNS-molekuláknak, az úgynevezett „ribozimek”-nek azon a képességén alapszik, hogy felismernek bizonyos RNS-szekvenciákat, ezekhez hozzákötődnek, majd e szekvenciákat elhasítják. Erre lehetett következtetni az RNS-molekuláknak in vivő megfigyelt autokatalitikus hasadási reakcióiból, amelyek növényi viroidokban és szatellita-RNS-ekben mentek végbe.
A ribozim által katalizált RNS-hasadás bizonyos szerkezeti követelményeire alapozva most már de novo lehet olyan ribozimeket szerkeszteni, amelyek egy meghatározott célszekvenciára irányuló in trans endonukleáz hatást fejtenek ki. Minthogy az ilyen ribozimek, amelyeket az eddig legbehatóbban vizsgált ribozimek szerkezete ismeretében „hammer-head”ribozimeknek neveztek el, számos különböző szekvenciára tudnak hatni, gyakorlatilag minden tetszőleges RNS-szubsztrátumhoz megfelelő ribozimet lehet „méretre szabni”. Ennek következtében a ribozimek a specifikus gének gátlásának előnyös és rendkívül flexibilis eszközei lehetnek, amelyek máris bizonyították potenciális terápiás hasznosságukat.
A már ismertek közül az eddig leginkább tanulmányozott ribozimmodell három strukturális domént tartalmaz; erre a modellre alapozva már sikerült a CATmRNS ellen ribozimet szerkeszteni [Haseloff et al.,
Natúré 334, 585-591 (1988); Uhlenbeck et al., Natúré 328, 596-600 (1987)].
A három dómén a következőket foglalja magába:
a) egy nagymértékben állandó nukleotid szakaszt, amelyben a hasítási hely az 5’-irányában helyezkedik el. Ez általában egy GUC szekvencia, bár egy GUA vagy GUU módosulat lényegében nem mutatkozott csökkent hasítási aktivitást. Hasítás mutatkozott a CUC szekvenciánál, kisebb mértékben az AUC és UUC szekvenciánál is (a legeredményesebb hasításhoz szükséges követelmények még nem teljesen tisztázottak).
b) a hasítási hely mindkét oldalával szomszédos szakaszok, amelyek a ribozim egzakt kapcsolódását biztosítják a hasítási hely vonatkozásában, és biztosítják a szubsztrátum és az enzim összetartását (az eddig lefolytatott kísérletekben mindkét oldalon 8-8 bázist választottak ki).
c) a ribozimek természetben előforduló hasítási doménjeiben lévő nagymértékben állandó szekvenciákat, amelyek egyfajta bázispárosodással létrejött szárat képeznek.
Az RNS-enzimek eszerint a modell szerint szerkeszthetők meg, és in vitro máris alkalmasnak bizonyultak RNS-szekvenciák hatásos és specifikus hasítására (Haseloff et al., Natúré 334, 585-591 (1988)].
Legutóbb az autokatalitikus RNS-hasító aktivitás további olyan típusait fedezték fel, amelyek a célzott RNS-gátlásnál számításba jönnek. Az egyik ilyen modell az úgynevezett „hairpin”-ribozim (hairpin = hajtű), amelynek az aktív helyeit a dohánymozaik-vírus szatellita-RNS negatív szálából vezették le [Hampel und Tritz, Biochemistry 28, 4929-4933 (1989)]. A további önhasító RNS-aktivitások a hepatitis delta-vírussal [Kuo et al., J.Virol. 62, 4439-4444 (1988); Sharmeen et al., J. Virol. 62, 2674-2679 (1988); Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 1831-1835 (1989)] és az RNáz P-vel [Altmann et al., Structure and Function of Major and Minor Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles, kiadó: Himstiel, Springer Verlag, Berlin, 183-195 (1988)] kapcsolatosak.
A jelen találmányt megelőző kísérleti munkák arra szolgáltak, hogy összehasonlítsák az antiszensz-RNS, az antiszensz-DNS és a ribozimok hatását. Ezeket a kísérleteket az snRNP U7-függő hiszton-pre-mRNSfeldolgozó reakció segítségével végezték el, mégpedig egy olyan in vitro rendszerben, amely U7-függő hiszton-pre-mRNS-t dolgoz fel [Mowry et al., Science 238, 1682-1687 (1987); Soldati et al., Mól. Cell. Bioi. B, 1518-1524 (1988)]. Ekkor azt találták, hogy az antiszensz-RNS a legerősebb inhibitor, s gátlás reverzibilis. Az antiszensz-RNS és a „hammerhead” típusú ribozimek gátló hatása egyaránt irreverzibilis és azonos nagyságrenden belüliek, s a teljes gátláshoz mindkét esetben a szubsztrátum-RNS-hez viszonyítva 1000-szeres túlsúly szükséges belőlük.
Amíg az eddigi ribozimkísérleteket csupasz RNSsel, proteinmentes rendszerekben végezték, a jelen találmány előkísérletei voltak az első olyan vizsgálatok, amelyek bebizonyították, hogy a szintetikus úton előállított, egy specifikus szekvenciára irányuló ribozimek
HU 215 187 Β protein tartalmú közegben is hasító hatást mutatnak. Ez a tény szolgáltatta az első olyan adatot, ami egy in vivő alkalmazás lehetőségére utalt.
A ribozimek specifikus gének expressziója gátlására történő felhasználásánál a korlátozó faktorok egyike lehet az olyan ribozimkoncentráció megteremtése, amely egy bizonyos biológiai reakció hatékony kikapcsolásához elegendőnek bizonyul; az okok - hasonlóan, mint az antiszensz-RNS alkalmazásánál - az RNS csekély stabilitásában keresendők.
A találmány tárgyát egy olyan feladat megoldása képezi, amely a mRNS-nek, a mRNS in vivő inhibitoraként való alkalmazásának olyan rendszerét teremti meg, amely az RNS alkalmazásának eddigi korlátáit úgy küszöböli ki, hogy biztosítja a gátló RNS hatásos koncentrációját a sejten belül.
A találmány ezt a feladatot egy olyan genetikai egység révén oldja meg, amely a polimeráz III segítségével végbemenő transzkripcióhoz szükséges transzkripciós egységeket tartalmazza, tartalmaz továbbá egy RNSfunkciót gátló RNS-t kódoló DNS-t, amely a genetikai egységen belül úgy helyezkedik el, hogy a gátló RNS része a polimeráz III-átiratnak.
A feladat megoldásánál abból a meggondolásból indultunk ki, hogy a gátló RNS-t termelő gén bevezetése ezen RNS importja helyett az RNS jelentős megsokszorozását jelentené, és ezzel a biológiai reakció gátlásához elégséges RNS-készlet állna rendelkezésre.
A gátló RNS lehet egy tetszőleges ribozim vagy egy más, mRNS-t gátló RNS, például egy antiszensz-RNS.
Alapjában véve elképzelhető lenne az RNS, illetve az ezt kódoló DNS-szekvenciának a hatékony átvitelét vírusok vagy vírusvektorok - például retrovírusok révén elvégezni.
Ezeknek a rendszereknek azonban néhány döntő hátránya van, ilyen például az endogén vírusok mobilizálódása, a retrovírusokkal való rekombináció, az endogén gének aktiválódása integráció révén, korlátozottság a gazdaszervezet és szövetféleség vonatkozásában.
Ezzel szemben a találmány olyan carrier-géneket szolgáltat, amelyek nem járnak ilyen hátrányokkal.
A találmány keretében javasolt gének - mint az RNS-gének számára javasolt carrier-gének - a következő előnyökkel rendelkeznek: szerkezetük kompakt, kis terjedelmük miatt könnyebben vihetők be a sejtekbe, transzkripciós sebességük nagy és expressziójuk nem korlátozódik meghatározott szövetekre, hanem ubiquiterek, azaz majdnem minden sejttípusban kifejeződnek.
A polimeráz III gének egy további előnye abból származik, hogy igen erős transzkripció-terminátor szignáljuk van. Ennek következtében annak a valószínűsége, hogy egy közelben lévő celluláris gén nem kívánatos módon aktiválódik, lényegesen kisebb.
A polimeráz III révén átírt géneknek a következő sajátosságaik vannak: itt olyan génekről van szó, amelyeknek a promótere nem a gén előtt upstream helyezkedik el, hanem a génen belül [Geiduschek et al., Ann. Rév. Biochem. 57, 873-914 (1988)]. A polimeráz III kötődése szempontjából ezen lényeges belső szabályozó szakaszoknak a szerkezete nem folytonos; két úgynevezett boxból (A-box és B-box) állnak, amelyek a transzkripciós faktorok általi felismerés szempontjából lényegesek, valamint egy közbülső géndarabból, amelynek a hossza döntő fontosságú [Hofstette et al., Cell 24, 573-585 (1981)]. Ennek a szekvenciának a hossza tRNS-géneknél 31-74 bázispár [Clarkson, Eukaryotic Genes, Their Structure, Activity and Regulation, kiadó: McLean et al., Butterworth, 239-261 (1983)].
A polimeráz III által átírt gének közé tartoznak például a tRNS-gének, az 5S-RNS és egy sor más kis mag- és citoplazma-RNS gén: 7SK, 7SL, M, U6 és a 4,55 RNS, valamint a VA1 és VA2 adenovírus gén [Geiduschek et al., Ann. Rév. Biochem. 57, 873-914 (1988)]. Ezek a gének abban hasonlítanak egymáshoz, hogy nem nagyok, kompakt szerkezetűek, magas a transzkripciós sebességük és transzkripciójuk ubiquiter.
Megállapítottuk, és ez meglepő volt, hogy a találmány szerinti genetikai egységek segítségével a gátló RNS nagyobb stabilitása érhető el anélkül, hogy ez aktivitás szempontjából hatékonyságuk csökkenésével járna.
Jennings és Molloy már 1987-ben megállapították [EMBO J„ Vol. 6, 10, 3034-3047 (1987)], hogy egy specifikus, a polimeráz III által felismert promoter alkalmas arra, hogy az antiszensz-RNS szintézisét vezérelje. Erre a célra a VA1 gén Xbal/BamHI fragmentumát, amely a promotert tartalmazza, beklónozták az antiszensz-DNS 5’ irányba, ami a polimeráz II promoterek alkalmazásánál a szokásos elvnek felel meg. Arra törekedtek, hogy a polimeráz II-átiratokhoz hasonló rövid átiratot állítsanak elő. Az átiratban csak jelentéktelen módosulás található, amely lehetővé teszi a végek bázispárosodását, és ez megvédi a végeket attól, hogy az egyszálú exonukleázok megemésszék őket.
Ezzel a javaslattal szemben, amelyben csak egy specifikus polimeráz III gén promoterszekvencia kerül alkalmazásra (a 30-73 helyzet közötti szakasz; ugyanakkor a vad típusú VA1 gén a +160-+200 helyzetben lévő terminátorszekvenciáig terjed), a találmány szerint célzatosan ezenkívül még a polimeráz III gén azon szekvenciáit is felhasználjuk, amelyek az átirat szekunder szerkezete szempontjából mértékadóak, hogy így ezeket a gátló RNS-szekvenciák stabilizálása érdekében kihasználjuk. Az előbb leírt javaslattal ellentétben a gátló RNS-t kódoló génszekvencia a polimeráz III által átírt génen belül úgy helyezkedik el, hogy egy találmány szerinti „génkazetta” keletkezzék. Ennek következtében a találmány szerint alkalmazott carrier-gének a virális VA1-génnel szemben nem toxikusak.
A polimeráz által átírt gének a találmány szerint flexibilisen alkalmazhatók. Arra való tekintettel, hogy mint carrier-gének funkcionálnak az RNS-gátló szekvenciáknál, a természetes gének kiválasztásánál, illetve módosításánál, illetve a mesterséges gének szerkesztésénél a következő kritériumokat kell fontolóra venni: 1) Az A- és a B-box nagymértékben állandó; 2) Az 5-7 T-csoportból álló darab - az A-boxtól downstream
HU 215 187 Β
- felelős a transzkripció leállításáért; 3) az A- és a Bbox közötti távolságot nem lehet tetszés szerint meghosszabbítani, itt a maximum jelenleg körülbelül 90 bpra tehető; 4) Néhány rendszerben az 5’-nél lévő szekvenciának befolyása van a transzkripcióra; 5) Adatok vannak arra vonatkozóan, hogy egy érintetlen antikodon törzsszakasz lényeges az átirat stabilitása szempontjából.
A találmány szerinti genetikai egység előállításához különösen alkalmas carrier-gének a tRNS-gének. Az ezen gének által kódolt RNS-ek lóherelevél-szerkezetük alapján különösen alkalmasak arra, hogy a gátló RNS stabilitását biztosítsák. Segítségükkel kompakt RNS-termelő génegységeket állíthatunk elő, amelyekbe a gátló RNS-t kódoló szekvenciát az A- és a B-blokk közé visszük be (az 1. ábra sematikusan ábrázol egy tRNS-ribozim gént).
A jelen találmánnyal kapcsolatosan kísérleteket végeztünk a start metionin-tRNS-sel, amely az A- és a B-blokk között lévő antikodon törzs- és hurokszakaszban egy Apai restrikciós helyet tartalmaz (minden magasabbrendű eukarióta start metionin-tRNS-e ezt a restrikciós helyet tartalmazza az antikodon hurok szakaszban).
Az A- és B-blokk közt elterülő szakaszon kívül más inszerciós helyek is lehetnek a carrier-DNS-szekvenciákban (a tRNS-génekben vagy más polimeráz III génekben), amennyiben biztosítható, hogy a polimeráz III transzkripciós aktivitása és az átirat stabilitása megmarad.
A találmány szerinti genetikai egységeket alapjában véve elő lehet állítani valamennyi tRNS-sel; ha szükséges, megszerkeszthető egy alkalmas restrikciós hely, ahová azután be lehet építeni a gátló RNS-t kódoló szekvenciát. A beépítésnél csupán azt kell figyelembe venni, hogy az antikodon törzsszakaszban nem végezhető olyan báziscsere, ami a gén transzkripciós sebességét vagy a kapott tRNS stabilitását csökkenti [Főik et al., Cell 33, 585-593 (1983)]. Ezenkívül azzal a következménnyel is számolni kell, hogy a 60 bpnál nagyobb inszertumok befolyásolhatják a transzkripciót [Ciliberto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 1921-1925 (1982)].
Az alkalmas carrier-gének kiválasztását illetően alapvetően kívánatos, hogy faj-azonos tRNS-géneket vagy olyan - polimeráz által átírt - géneket alkalmazzunk, amelyek nem toxikusak.
A jelen találmánnyal összefüggésben olyan kísérleteket végeztünk, amikor ribozim szekvenciákat vezettünk be normál tRNS-génekbe. Ha a tRNS-ribozim amelyet ez a gén ír át - túlnyomóan a citoplazmában lokalizálódik, viszont bizonyos alkalmazások esetén például magspecifikus RNS-ek gátlásához, például snRPN partikulák által - kívánatos lenne a tRNS ribozimnek, illetve a tRNS antiszensz RNS-nek a magban való lokalizálása, úgy ez esetben olyan mutánsok alkalmazhatók, amelyek túlnyomóan a magban helyezkednek el. Például a Zasloff és munkatársai által 1982ben [Zasloff et al., Natúré 300, 81-84 (1982)] és a Zasloff által 1983-ban leírt met i tRNS-gén [Proc. Natl.
Acad. Sci. 80, 6426-6440 (1983)], amelyben egyetlen báziscsere fordul elő.
A találmány szerinti genetikai egységeket például a következőképpen lehet előállítani:
A polimeráz III által átírt gént, például egy tRNSgén egy másolatát, amelyet egy bakteriális plazmid tartalmaz, alkalmas restrikciós enzimmel elhasítunk a beépítéshez kiszemelt helynél, például az A- és B-blokk között, és a gátló tRNS-t kódoló kétszálú DNS-t, amelyet standard módszerekkel állítottunk elő, ide bekötjük. Ezzel megfelelő gazdaszervezeteket transzformálunk, elvégezzük a szelekciót és szaporítást, majd a sokszorozott plazmid DNS-t izoláljuk. A plazmidokat a találmány szerinti genetikai egységek jelenlétére vizsgáljuk, és ezt restrikciós enzimes emésztéssel, szekvenciaanalízissel vagy a plazmid DNS egy funkcionális átiratának in vitro kimutatásával végezzük el.
Az így kapott genetikai egységeket vagy cirkuláris plazmid formájában vagy a plazmidból kimetszett, olyan génegység formájában használjuk fel, amely a transzkripcióhoz a polimeráz III által megkövetelt valamennyi információt tartalmazza.
Hogy melyik formát választjuk, általában a felhasználási terület szabja meg és a génegységnek a sejtbe való bevezetéséhez választott transzportrendszer.
A találmány szerinti genetikai egységek többszörös másolatban is előfordulhatnak (itt tandem szerkezetekről van szó, amelyekben a genetikai egységek többször egymás után sorakoznak, és amelyekben a gátló inszertumok azonosak vagy különbözőek lehetnek).
Egy ilyen tandem szerkezet transzkripciója, mivel minden egyes egység promoter- és terminátorszignált tartalmaz, egymástól különálló RNS-egységeket hoz létre. A fragmentumoknak ezen tulajdonsága alapján, minthogy minden esetben komplett transzkripciós egységekről van szó, az egyes egységek egymással szembeni orientációjának nincs jelentősége. E tandemek előállításánál olyan plazmidokból indulunk ki, amelyek a gátló egységeket kódoló szakaszból sok másolatot tartalmaznak. Multimer tRNS-ribozim géneket tartalmazó vektorokat például úgy állítunk elő, hogy az 1. példában leírt erbB-szakasz sorozatból indulunk ki, az egyes fragmentumokat T4 DNS ligáz alkalmazásával polimerekké ligáljuk és a polimer géneket egy alkalmas plazmid vektor megfelelő restrikciós helyére beklónozzuk. Az ilyen tandemek előállítását az teszi lehetővé, hogy a találmány szerinti egységek nem nagyok, előnyösen 200-350 bp hosszúak. Antiszensz-RNS vagy ribozim heteromer komplex előállítása után egy ilyen „tandem-inhibitor” segítségével egyetlen vizsgálatban tesztelhetjük egy inhibitor tétel hatékonyságát. Ilyen módon például 5-10 ribozim keveréket vihetünk be egy sejtrendszerbe. Ha a keverék gátlást idéz elő, akkor megvizsgáljuk az egyes ribozimek hatékonyságát. Ez különösen annak a ténynek megfelelően előnyös, hogy a gátláshoz kiszemelt cél-RNS-szekvenciák kiválasztásának kritériumai még nincsenek teljesen tisztázva.
Jó célszekvenciáknak tekinthetők például azok a szakaszok, amelyeknek nincs szekunder szerkezetük, a hasítási szignálokhoz közeli szakaszok, az iniciációs
HU 215 187 Β kodon utáni szakaszok, olyan szakaszok, amelyekben nincsenek kötőhelyek specifikus proteinek számára (mint például Sm-kötőhely az snRNS-molekulákban). Ennek a találmánynak a segítségével, különösen a tandem forma alkalmazásával, lehetővé válik, hogy felvilágosítást kapjunk az ilyen célszekvenciákról, hogy ezeket hatékonyan gátolhassuk.
A tandem-egységek alkalmazása akkor is előnyös, ha biológiai folyamatok gátlása érdekében az RNS-t, például virális RNS-t, több helyen kell elhasitani. Többszörös hasítást például úgy érhetünk el, ha nagyobb számú különböző ribozimet szerkesztünk és a genetikai egységeket - az ezeket kódoló DNS-szekvenciákkal együtt - tartalmazó vektort bevezetjük a sejtekbe, ezeknek a szekvenciáknak az átírásánál a ribozim egységek a megfelelő célszekvenciákra telepednek, miáltal a mRNS darabokra hasad.
Multimer másolatok akkor alkalmazhatók, ha bizonyos alkalmazásoknál a hatékonyság érdekében - például transzferrin-polikation transzport rendszer alkalmazásakor - nagyobb mennyiségű alacsony molekulasúlyú ribozimre van szükség. A genetikai egységet multimer másolatban tartalmazó plazmidok, amelyek ezt a ribozimet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazzák, a fragmentumprodukciót a többszörösére emelt kihozatallal javítják.
A tandem egységeket akkor használhatjuk előnyösen, ha egyidejűleg különböző RNS-féleségek ellen irányuló gátló RNS-ekkel kell rendelkeznünk.
Az antiszensz-RNS találmány szerinti alkalmazásánál figyelembe kell venni, hogy tRNS-géneknél az inszertum nagysága behatárolt. Hatékony transzkripcióra vonatkozóan a nagyságrend körülbelül 60 bp-t tesz ki; ezért nagyobb antiszensz-RNS szerkezetek használata esetén más - polimeráz III által átírt - olyan géneket kell számba venni, amelyek hosszabb szekvenciák transzkripcióját illetően nagyobb kapacitással rendelkeznek.
A találmány szerint alkalmazható carrier-géneket szintetikus úton is elő lehet állítani, ha eleget tesznek azoknak a követelményeknek, amelyeknek a polimeráz III által történő transzkripcióhoz szükséges transzkripciós egységek is megfelelnek. Az ilyen szintetikus gének alkalmazása a következő előnyökkel járhat:
a) Ezeket a géneket az amino-acil-szintetázok és a riboszómák nem ismerik fel, s így a sejt transzlációs mechanizmusába való beavatkozásuk gátolt.
b) A szintetikus szerkezetek révén fennáll annak a lehetősége, hogy olyan gátló RNS-eket állítsunk elő, amelyeknek nagyobb a stabilitása és magasabb a transzkripciós sebessége, mint egy természetes géné.
c) Szintetikus szekvenciák előállítása révén a klónozási eljárást flexibilissé tehetjük.
A jelen találmány keretében megállapítottuk, hogy a ribozim-tRNS-molekulák stabilitását megnövelhetjük, amennyiben a carrier-tDNS molekula antikodon-törzs kódoló szakaszát meghosszabbítjuk. Megállapítottuk továbbá, hogy ha a vad típusú tRNS-gén 5 bázispárból álló antikodon-törzsszakaszt 9 bázispárra növeljük, a megrövidített vad típusú tRNS-génnel szemben hatszorosan nagyobb mennyiségű átiratot érhetünk el, ami a megnövekedett stabilitásra és az ezzel elérhető feldolgozhatóságra vezethető vissza.
Megállapítottuk továbbá, hogy a tRNS-ribozim gén vagy tRNS-antiszensz gén formájú, találmány szerinti genetikai egységek stabilitásának növelését úgy is elérhetjük, ha a gátló RNS-fúnkciót kódoló DNS-szekvenciák, mint intron-részek fordulnak elő (a ribozimek esetében „ribintron” elnevezést viselnek). Itt abból a meggondolásból indultunk ki, hogy a természetben előforduló intronok nem változtatják meg a tRNS-prekurzor molekulák szekunder szerkezetét, és hogy a tRNSintronok szekvenciái nem mutatnak állandóságot, miáltal a ribozim- vagy antiszensz szekvenciáknak, mint intron részeknek a klónozása esetén, a kapott tRNSprekurzorok szerkezeti változása minimálisra csökkenthető és stabilitásuk ezzel maximálisra növelhető. A jelen találmány alapján alkalmazott tyrtRNS-génnél, amelynél a tRNS-prekurzor molekula szétesése csak lassan megy végbe, megállapítottuk, hogy a „ribintron” szekvenciákat tartalmazó tDNS-molekulák alkalmazásával a ribtRNS aktivitását hatásosan megnövelhetjük, így válik lehetővé a citoplazmában erősen lokalizált RNS-ek megtámadása. Ez a rendszer egyszerű módon teszi lehetővé a megfelelő szerkezeti elemek beépítését a „ribintronok” stabilitásának a növelése céljából az exonukleázok által történő lebontás kivédéséhez. Ezt pótlólagos bázispárosodással vagy a ribozim szekvenciákat határoló nagyobb hajtűszakaszokkal érhetjük el. Az ilyenfajta módosításoknál vigyázni kell arra, hogy az intron-splicing részére megfelelő szerkezetek változatlanok maradjanak.
A természetes intron szekvenciákat például megfelelő restrikciós hasítási helyek beépítésével módosíthatjuk, hogy lehetővé tegyük oligonukleotidok beklónozását, vagy - ha a természetben előforduló gén ezt nem tartalmazza - olyan nukleotidok beépítésével, amelyek az antikodon-triplettel való bázispárosodást lehetővé teszik, hogy a szekvencia egy további stabilizáló szerkezeti jelleggel rendelkezzék.
A találmány keretében bemutattuk, hogy a ribozimeknek intron részek gyanánt történő expressziója nem vonja maga után a tRNS szekunder szerkezetének a károsodását, s így a keletkezett átirat nagy koncentrációban halmozódhat fel és korrekt módon dolgozható fel. Amennyiben a folyamatban szabaddá vált intronok nem bizonyulnak eléggé stabilnak, olyan alkalmas szerkezeti jegyekről gondoskodhatunk, amelyek az exonukleáz által történő lebontás ellen nagyobb stabilitást biztosítanak.
A találmány szerinti genetikai egységeknek a sejtekbe való bevitelére több módszer alkalmazható.
A DNS-nek szövettenyészet sejtjeibe való bevezetésére szolgáló standard módszer a DNS és kalcium-foszfát koprecipitátumát használja fel [Graham et al., Virology 52, 456-467 (1973)]. A precipitátumot hozzáadják a sejtekhez, amelyek - feltehetően pinocitózis révén - ennek egy részét felveszik. Egy hasonló módszer szerint pozitív töltésű anyagot, DEAE-dextránt használnak, ami megkönnyíti a sejtnek a DNS felvételét. Kidolgoztak olyan módszereket is, amikor a DNS-t elektroporációval viszik
HU 215 187 Β be a sejtbe (ez esetben egy pulzáló elektromos tér átmeneti pórusokat képez; [Langridge et al., Methods Enzymol. 153, 336-351 (1987); Fromm et al., Methods in Enzymol. 153, 351-366 (1987)]. Nagy sejtek esetén [Kressmann et al., Series 31, 383—407 (1980)] és szövettenyészetek sejtjei esetén [Pepperkok et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6748-6752 (1988)] mikroinjekciós technikák szintén használatosak. Ezek a módszerek azonban csak laboratóriumi, illetve in vitro alkalmazásnál használhatók. Nemrég kidolgoztak egy szintetikus kationos peptidet (DOIMA), ami a DNS-sel spontán liposzómákat képez, és így megkönnyíti a sejtekbe való átvitelt [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 7413-7417 (1987)]. Mint már említettük, elvileg retrovirális vektorok is alkalmasak genetikai anyagoknak a sejtbe való átvitelére [Stewart et al., EMBO J. 6, 383-388 (1987)]; ezek a rendszerek azonban a már említett hátrányokkal járnak.
Egy további transzportmechanizmus a „lefegyverzett” toxinoknak, mint transzport vivőanyagoknak a használatán alapszik.
Az eddig használt transzporteljárásoknak mind az a hiányosságuk, hogy nem tudnak elég gátló nukleinsavat a sejtekbe bejuttatni. A jelen találmány segítségével, a molekulák kis mérete és kompakt volta következtében a transzportkapacitás vonatkozásában el lehetett érni az aktív gátló egységek számának a növelését. A találmány szerinti genetikai egységek kis mérete és kompakt szerkezete következtében, csekély módosítások után, például koleszterinnel, lipofd ionokkal vagy maglokalizáló peptidekkel való konjugálás után, teljesen le lehet mondani transzportrendszer alkalmazásáról.
A jelen találmány szerint a transzporthoz olyan szolubilis rendszer használata az előnyös, ami receptor közvetítette endocitózis révén zajlik le. Ennél különösen előnyös egy olyan transzferrin-polikation-konjugátum, amely a találmány szerinti genetikai egységgel komplexet alkot; a komplex felvétele a transzferrin receptor - amely gyakorlatilag minden növekedő sejtben jelen van - révén megy végbe.
A találmánynak számos felhasználási területe van. Például: elő lehet állítani átvitt gént (transgene) hordozó állatokat, amelyek a találmány szerinti genetikai egységek jelenléte következtében genetikai anyagukban vírusok elleni - például száj- és körömfájás vírus, Newcastle-disease vírus, bovin papilloma vírus, pseudorabies vagy fertőző gastroenteritis - intracelluláris immunitással rendelkeznek. Ennek megfelelően az átvett gént hordozó növényekben szintén létre lehet hozni intracelluráris immunitást például a PVX burgonyavírus ellen.
A találmány szerinti genetikai egységeket ezenkívül szomatikus sejtekbe is bevezethetjük, hogy a patogén vírusok, mint a HÍV vagy az ezzel rokon retrovírusok elleni ribozimeket, illetve antiszensz-DNS-eket ezen virális kórokozók ellen be lehessen vetni.
Egy további felhasználási területet a génterápia jelent, amikor is onkogénekkel vagy más kulcsgénekkel amelyek a sejtek növekedését és/vagy differenciálódását szabályozzák - komplementer RNS-szerkezetek kerülnek alkalmazásra. Az ilyen alkalmazások esetén a találmány segítségével az RNS-gátlás eredményesen elérhető nagy specificitása jön számításba, minek következtében például lehetővé válik a proto-onkogén- és onkogén-átiratok megkülönböztetése.
A találmány szerinti genetikai egységeket továbbá arra használhatjuk fel, hogy növényekben vagy állatokban specifikus gének expresszióját gátoljuk meg, hogy ilyen módon kívánt tulajdonságokhoz jussanak.
Az RNS gátló tulajdonságát betegségek leküzdésénél úgy lehet kihasználni, hogy a nem kívánt géntermékek termelését megakadályozzuk, például az Alzheimer-betegségnél fellépő fő plakk proteinek („major plaque protein”) vagy az autoimmunbetegségek okozta proteinek termelését.
A jelen találmányt olyan esetekben is felhasználhatjuk, amelyekben egy szabályozó proteint, amely az RNS-sel kölcsönhatást mutat, az RNS-sel való addíció révén ki tudjunk kapcsolni.
Azok a gyógyszerkészítmények, amelyek a találmány szerinti genetikai egységeket hatóanyagokként tartalmazzák - például liofilizált formában - szintén a találmány tárgyát képezik. Alkalmazásuk az adott indikációs területeken történik.
A jelen találmány keretében végzett kísérletekkel ki lehetett mutatni a tDNS-ribozim gén transzkripciós aktivitását. Ezesetben egy tDNS-ribozim génszerkezetet állítottunk elő úgy, hogy egy 53 bp hosszú, az snRNS U7 szekvencia ellen irányuló ribozimet kódoló DNSszekvenciát építettünk be a startmetionin-tDNS-ben lévő A-box és B-box közti Apai restrikciós helyre (az Aés a B-box a polimerázok felismerőhelyei; a transzkripció 15 bp-al az A-boxtól upstream kezdődik és egy oligo-T-szekvenciánál, a B-boxtól downstream fejeződik be). Ennek a génnek a mikroinjekciója után transzkripció volt kimutatható; a tRNS/ribozim-hibrid koncentrációja egy olyan tRNS koncentrációjának a 10-20%-át tette ki, amelyet egy koinjiciált, vad típusú tRNS-gén termelt.
A tRNS-ribozim gén által in vivő szintetizált RNSmolekulák a cél-RNS-t az előre meghatározott helyen hasítják. A ribozimszekvenciához kapcsolt tRNS-szerkezet nem blokkolja a ribozimaktivitást. Az oocitákba injiciált gének által szintetizált tRNS-ribozim molekulák a cél-RNS-t szintén a várt helyen hasítják ugyanolyan hatékonysággal, mint az in vitro szintetizált ribozimek, hozzáadott tRNS-szerkezet nélkül. Ez azt bizonyítja, hogy egy tRNS-ribozim in vivő szintézise és feldolgozása nem jár olyan módosulásokkal, amelyek a ribozim hatását gátolnák.
A találmány segítségével sikerült először in vivő egy ribozim aktivitását kimutatni. Erre a célra tDNSribozim géneket injiciáltunk radioizotóppal jelzett GTP-vel együtt oocitamagokba. Nyolcórás inkubáció után, amelyet a ribozim szintéziséhez biztosítottunk, a jelzett RNS-szubsztrátumot (U7 RNS) az oociták citroplazmájába inficiáltuk. További két óra múlva az oocitákból izoláltuk a nukleinsavakat: azokban az oocitákban, amelyekben ribozimszintézis történt, nem volt kimutatható maradék RNS-szubsztrátum. Ezzel
HU215 187Β szemben azokban az oocitákban, amelyeket nem oltottunk be tDNS/ribozim génnel, illetve amelyeknél a gén a magot elhibázta, stabil maradt az RNS-szubsztrátum.
A találmány keretében azt is bemutatjuk, hogy a találmány szerinti tDNS-ribozimek egy onkogén transzformáló hatását meg tudják gátolni. Az erbB-onkogénnel transzformált eritroid baromfisejtek esetén kimutattunk egy tRNS-ribozim aktivitást azáltal, hogy az erbB expressziójának gátlása következtében a sejtek differenciálódása következett be.
A találmány szerinti genetikai egységek hatékonyságát úgy is ellenőrizhetjük, hogy megfigyeljük az egér sejtek fertőzésekkel, például poliomafertőzésekkel szembeni rezisztenciáját, miután vírus ellen irányuló (adott esetben a vírus több szakasza ellen irányuló), például papillomavírus ellen irányuló genetikai egységeket alkalmaztunk.
1. példa tRNS-ribozim gének szerkesztése.
a) A pSPT18metl szerkesztése.
A Xenopus eredetű start-metioninl-tRNS-gént, amelyet egy pBF322-be klónozott 284 bp EcoRI fragmentum [HinfI H-G fragmentum; Hofstetter et al., Cell 24, 573-585 (1981); Tellford et al., Proc Natl. Acad. Sci. 76, 2590-2594 (1979)] tartalmaz, EcoRI-gyel való emésztéssel izoláljuk a pBR322 vektorból. A fragmentumot gélelektroforézissel (2% agaróz/TBE) tisztítjuk, és oly módon ligáljuk a pSPT18 bakteriális plazmid (Boehringer-Mannheim) EcoRI helyére, hogy a plazmid SP6 polimerázzal való transzkripciójánál egy szensz-tRNS átiratot kapjunk. Itt standard klónozó módszereket alkalmazunk (leírásukat lásd Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). A tRNS-génnek pSPT18-ba való klónozásának az a fő előnye, hogy a plazmidban egymással szemben helyezkedik el az SP6- és a T7-RNS polimeráz promoter. Ennélfogva in vitro transzkripcióval olyan specifikus RNS-átiratokat kapunk, amelyek vagy a tRNS-ribozim szekvenciát vagy az ezzel komplementer szekvenciát tartalmazzák [Méltón et al., Nucleic Acids Rés. 12, 7035-7056 (1989)]. Ezek az átiratok az RNS-molekulák hasító aktivitásának tesztelésére használhatók vagy arra, hogy sejtkivonatokban, amelyek a tRNS-ribozimet kifejezik, „RNase Protection Mapping” segítségével a tRN S-ribozimek j elenlétét kimutassuk.
b) tRNS-ribozim gének szerkesztése.
A pSPT18metl tRNS-génjét az antikodon törzs- és hurokszakaszban lévő egyetlen Apai helyen hasítjuk. Lásd a 2. ábrát. Ez az ábra olyan plazmidokat mutat be, amelyek tRNS-ribozim kódoló szekvenciákat tartalmaznak. A pSPT18metl tartalmazza a 284 bp EcoRI fragmentumot, amely a Xenopus laevis eredetű iniciátor-tRNS-gént hordozza. Itt a G-H fragmentumról [Hofstetter et al., Cell 24, 573-585 (1981)] van szó, amely a pSPT18 polilinker EcoRI helyére van beklónozva. Az ábra bemutatja az U7 snRNS ellen irányuló (CD33) és a két erbB-mRNS-szekvencia ellen irányuló (ES13 és ES53) ribozimokat kódoló komplementer oligonukleotidokat. Az itt alkalmazott klónozó stratégia azzal jár, hogy a tRNS-gén Apai helyének kiálló végei eltávolodnak egymástól. Az inszertumok azon részeit, amelyek a ribozimot kódolják és a cél-RNS-sel komplementer szakaszokat (anti-U7, anti-erbB) bejelöltük, továbbá az A- és B-boxot, az öt T csoportból álló darabot (terminációs szignál) és a transzkripcióindító helyeket. A plazmid tartalmazza a ColEl replikációs kezdőpontot (a 2. ábrán ŐRI), ezenkívül egy ampicillin rezisztencia markert és a T7- és SP6-RNS polimeráz promotereit.
Azon kétszálú szintetikus DNS-oligonukleotidok előállítása érdekében, amelyek a cél-mRNS-sel komplementer szekvenciákkal határolt viroid hasító szekvenciát kódolják [Haseloff et al., Natúré 334, 585-591 (1988)], először egyszálú oligonukleotidokat állítunk elő standard módszerek szerint (Applied Biosystem-féle DNS-szintetizátor). A komplementer oligonukleotidokat foszforiláljuk, egymáshoz kapcsoljuk, és az Apai-gyei hasított pSPT18metl plazmidba ligáljuk standard módszerek [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)] használatával. A ligációs keveréket az E. coli HP 101 transzformálására használjuk fel, majd az új plazmidot tartalmazó baktériumklónokat izoláljuk, és a bakteriális plazmidban lévő aktív ribozimszekvenciák jelenlétét kétféle módszerrel igazoljuk.
1) Az in vitro SP6 transzkripció révén klónozott DNS-plazmidokból származó RNS-molekulákat olyan radioaktív RNS-sel inkubáljuk, amelyek a ribozim célszekvenciáját tartalmazzák, és a cél-RNS specifikus hasítását teszteljük (lásd a 4. ábrát).
2) A beépítés helyénél didezoxi-DNS szekvenálással igazoljuk a korrekt módon beépült DNS-szekvenciák jelenlétét.
A 4. ábrán a tRNS-ribozimek in vitro ribozimaktivitását mutatjuk be. Az ES13 és ES53 erbB-hasító tRNS-ribozimeket hordozó plazmid-DNS molekulákat PvuII-vel emésztjük, és SP6-RNS polimerázzal átíratjuk. E transzkripció révén 230 nukleotid hosszú RNS-molekulák keletkeznek, amelyek a tRNS-ribozimszekvenciát és ezenkívül azokat az 5’- és 3’-szekvenciákat tartalmazzák, amelyek a határos Xenopus-szekvenciákból és a határos bakteriális plazmidszekvenciákból származnak (lásd a 2. ábrát). A ribozimátiratokat egy olyan 20000 cpm (20 fM) RNS-molekulával inkubáljuk, amely az erbB-mRNS-t - az indítókodonnal együtt - tartalmazza. Az RNS-molekula mind az ES13 mind az ES53 számára tartalmazza a célszekvenciákat (lásd a 3. ábrát). A ribozimet plusz a cél-RNS-t 2 órán át inkubáljuk 37 °C-on 10 mM MgCl2, 20 mM trisz · HCI mM (pH=7,5) és 150 mM NaCl jelenlétében, majd hozzáadunk EDTA-t 15 mM koncentrációig, ezután az anyagot szárítjuk, 80%-os formamid/TBE-ben feloldjuk, 30 másodpercig 95 °C-on hevítjük, és 9,5% akrilamid/8,3 mól karbamid/TBE gélben elválasztjuk. Az elektroforézis után a jelzett RNS-molekulákat autoradiográfiával mutatjuk ki.
m sáv: molekulatömeg-markerek: Hpall-vel hasított pBR322 DNS DNS-polimeráz Klenow7
HU 215 187 Β fragmentje alkalmazásával alfa-32p---CTPvel jelezve [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)]. A molekulatömeg-markereket közvetlenül a gélre való felvitel előtt 80% formamid/TBE-ben oldjuk, és 3 percig 95 °C-on hevítjük. Néhány fragmentum molekulatömegét (mint nukleotidot) a bal oldalon feltüntettük.
1- es sáv: erbB-cél-mRNS (20000 cpm, 20 fM) inkubálás nélkül.
2- es sáv: erbB-cél-mRNS (20000 cpm, 20 fM) 37 °Con ribozim nélkül, MgCl2-vel inkubálva.
3- as sáv: erbB-cél-mRNS (20000 cpm, 20 fM) ES13RNS-sel (1 fM) inkubálva.
4- es sáv: erbB-cél-mRNS (20000 cpm, 20 fM) ES53RNS-sel inkubálva.
A 3. ábra a ribozimek és a cél-RNS-ek közötti komplementaritást mutatja be. CD33 (A) az U7 snRNS ellen irányul [Cotten et al. EMBO J., 7, 801-808 (1988)]. ES13 (C) és ES53 (B) az erbB-mRNS-szekvenciák ellen irányul [Vennstrom et al., J. Virol. 36, 575-585 (1980)].
A tRNS-ribozimok tRNS-részét az áttekinthetőség kedvéért nem jelöltük. A ribozimnek megfelelő hasítási helyeket, valamint az erbB-mRNS indítókodonjait bejelöltük.
2. példa tRNS-ribozim transzkripció Xenopus oocitákban.
A xenopus oocitákba injiciált tRNS-ribozim gének transzkripcióját a tDNS-re leírt módszerrel végezzük [Kressmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1176-1180 (1978); Hofstetter et al., Cell 24, 573-585 (1981); Kressmann et al., Series 31, 383-407 (1980)].
A következőképpen járunk el: HCG-vel (humán koriogonadotropin; Sigma cégtől) stimulált kifejlett nőstény Xenopus laevisből VI. fázisú oocitákat veszünk le. Az oocitákat rövid ideig centrifugáljuk, hogy a sejtmag a petesejt oldalához kerüljön. Minden sejtmagot 50 ni 0,3 pg/μί szuperspiralizált plazmid DNS-t (ez tartalmazza az 1. példa szerinti ribozim gént) és 2 pCi/pl 32p-GTP-t tartalmazó oldatot injiciálunk. Az egyes oocitákat 20 °C-on 5-8 órás inkubálás után, oocitánként 400 pl 1% SDS, 1 mg/ml proteináz K, 300 mM NaCl, 20 mM trisz (pH=8) és 20 mM EDTA tartalmú oldattal emésztjük, majd egyszer fenollal és egyszer fenol/kloroform (1:1) elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az összegyűjtött etanolos csapadékot 80% formamid/TBE-ben oldjuk, rövid ideig 95 °Con hevítjük denaturálás céljából, majd elektroforézissel, 10% akril-amid/8,3 M karbamid/TBE gélben választjuk el, végül autoradiográfiával tesszük láthatóvá. A tRNSribozim génekkel végzett összes kísérletben az injekciós oldatokban a vad típusú metRNS-gén koncentrációja a tRNS-ribozim gén koncentrációjának 1/6-a volt. A TBE puffért (trisz, borát, EDTA) Maniatis előírása szerint [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)] készítjük.
Ezeknek a kísérleteknek az eredményét az 5. ábra mutatja be:
m sáv: molekulatömeg-markerek (mint a 4. ábrán). Néhány fragmentum molekulatömegét (nukleotidokban) feltüntettük az ábrán jobboldalt.
1., 2., 3. sáv: a met-tRNS-génnel és a met ribo 33 mettRNS-ribozim génnel oltott egyes oociták nukleinsavai.
Az ábrán jobb oldalt feltüntettük a met-tRNS (met, nukleotid hosszú) és a tRNS-ribozim (met ribo, 128 nukleotid hosszú) helyét.
3. példa
Oociták által szintetizált tRNS-ribozim aktivitásának meghatározása, összehasonlítva az in vitro szintetizált riboziméval, amelyben nincsenek tRNS-szekvenciák.
Mikroinjiciált oociták által szintetizált U7 ellen irányuló tRNS-ribozimot állítunk elő. Az elektroforetikus elválasztással kapott anyagot autoradiográfiával tesszük láthatóvá, a poliakril-amid gélből kivágjuk, majd Eppendorf vibrátorban egy éjszakán át HEP pufferrel [„Heidelberg extraháló puffer”: 0,75 M ammóniumacetát, 10 mM magnézium-acetát, 1% (térf/térf) fenol, 0,1% (tömeg/térf) SDS, 0,1 mM EDTA] eluáljuk. A kioldott RDS-t egyszer fenol/kloroform (1:1) eleggyel és egyszer kloroformmal extraháljuk, és 10 pg E. colitRNS, mint hordozó jelenlétében, etanollal kicsapjuk. A csapadékot felvesszük, és a 32P-jelzés kvantitatív meghatározását Cerenkov-számlálással végezzük el, a specifikus aktivitás értékének felhasználásával [Kressmann et al., Series 31, 383-407 (1982)]. A tRNS-ribozim mintáit az U7-szekvenciát tartalmazó 32P-vel jelzett RNS-sel (10000 cpm/minta, 10 fM plusz a jelzetlen U7-RNS adott mennyiségei) 2 órán át 37 °Con inkubáljuk 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 és 20 mM trisz · HCI (pH=7,5) jelenlétében. A reakciót 15 mM EDTA hozzáadásával állítjuk le, a mintákat szárítjuk, 80% formamid/TBE-ben oldjuk, 95 °C-on 30 másodpercig hevítjük, és egy előmelegített 9,5% akrilamid (8,3 M karbamid) TBE gélben elválasztjuk. A radioizotóppal jelzett RNS-féleségeket -80 °C-on autoradiográfiával - dr. Goos-féle „speciál” erősítőfólia alkalmazásával - tesszük láthatóvá.
A CD 33 inszertumot (lásd a 2. ábrát) tartalmazó plazmid T7-polimerázzal való transzkripciója révén kapjuk a CD32 ribozimet, amelyet beklónozunk a pSPT19 (Boehringer-Mannheim) HindlII/Sall helyére. Ez az átirat csak a ribozimszekvenciát tartalmazza, plusz az U7-el komplementer szekvenciákat, amelyeket a vektorszekvencia rövid darabjai határolnak. Ennek a ribozimnek a hasító aktivitását összehasonlításul használtuk az oociták által szintetizált CD33 tRNS-ribozim hasító aktivitásához viszonyítva, hogy megítéljük a tRNS szekunder szerkezetének, valamint az in vivő szintézisnek és módosításnak a befolyását a ribozim aktivitásra. Kitűnt, hogy mindkét ribozim (CD32 és CD33) az U7-szekvenciát tartalmazó RNS-t (94 nukleotid hosszú) úgy hasítja, hogy egy 25 nukleotidból álló 5’-hasítási termék és egy 69 nukleotidból álló 3’hasítási termék keletkezik.
Ennek a kísérletnek az eredményét a 6. ábra mutatja be.
HU 215 187 Β m sávok: molekulatömeg-markerek (az 5. ábrán lévőkkel azonosak)
1- es sáv: U7-RNS (10000 cpm, 10 fM), ribozim nélkül inkubálva.
2- es sáv: U7-RNS (10000 cpm, 10 fM) 10 fM oocitaszintetizált CD33 tRNS-ribozimmel inkubálva.
3- as sáv: U7-RNS (10000 cpm, lpM), 10 fM oocitaszintetizált CD33 tRNS-ribozimmel inkubálva.
4- es sáv: U7-RNS (10000 cpm, 100 fM), 10 fM
T7 polimeráz-szintetizált — in vitro CD32 ribozimmel inkubálva.
5- ös sáv: U7-RNS (10000 cpm, 100 fM), 1 fM
T7 polimeráz-szintetizált - in vitro CD32 ribozimmel inkubálva.
4. példa
A ribozimszubsztrátum-hasítás meghatározása oocitákban.
Egy 32P-GTP-ből, U7-tRNS-ribozim génből és mettRNS-génből álló keveréket oocita sejtmagokba injiciálunk. A beoltott oocitákat, mint a 2. példában leírtuk, 20 °C-on 8 órán át inkubáljuk, hogy végbemenjen a transzkripció. Ezután radioizotóppal jelzett U7-RNS-t (50 ni, 100000 cpm/pl, 100 fM/pl) injiciálunk az oociták citoplazmájába, majd az oocitákat 2 órán át inkubáljuk. Az egyes oocitákból izoláljuk a nukleinsavakat, s ezeket gélelektroforézissel választjuk el, mint fent leírtuk.
Ennek a kísérletnek az eredménye a 7. ábrán látható, m sávok: molekulasúly-markerek (az 5. ábrán lévőkkel azonosak).
1- es sáv: met- és met ribo génnel oldott oocitákból származó nukleinsavak.
2- es és 3-as sáv: met és met ribo génnel, majd
U7-RNS-sel oltott oociták.
4-es és 5-ös sáv: egyedül U7-RNS-sel oltott oociták.
6- os sáv: az injekcióhoz használt U7RNS alikvot mennyisége.
7- es sáv: U7-RNS (10 fM), CD32 ribozimmel (10 fM) órán át 37 °C-on inkubálva 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 és 20 mM trisz · HCI (pH=7,5) jelenlétében. A gél adottságai miatt csak a 3’hasítási termék (69 nukleotid) látható.
5. példa t-RNS-ribozimek transzkripciós aktivitása baromfisejtekben.
tRNS-ribozim géneket tartalmazó plazmid-DNS molekulákat vittünk be baromfisejtekbe e gének transzkripciós aktivitásának a meghatározása céljából. Megállapítottuk, hogy a trNS-ribozim gén (Xenopus tRNS-gén eredetű) baromfisejtekben eredményesen íródik át. A következőképpen járunk el: 106 primer baromfiembrió fibroblaszt sejtet [Zenke et al., Cell 52, 107-119 (1988)] oltunk 10 cm-es csészékre standard módszerekkel, és egy éjszakán át végezzük a tenyésztést. Reggel minden csészét 10 pg plazmid DNS-sel (amely vagy az erbB 13-szakaszt vagy az erbB 53-szakaszt tartalmazza) transzfektálunk kalcium-foszfát-koprecipitációs módszer alkalmazásával. A sejteket egy éjszakán át kezeljük a precipitátummal, majd a következő reggel kétszer mossuk friss tápoldattal, és ezután további 48 órán át inkubáljuk friss tápoldatban. Ekkor a tápoldatot eltávolítjuk, a sejteket PK/SDS pufferben (150 mM NaCl, 20 mM trisz, 0,1 mM SDS, 1 mM EDTA) vesszük fel, és a nukleinsavakat izoláljuk. Ezután a nukleinsavakat 32P-vel jelzett antiszensz erbB 13-szakasz vagy erbB 53szakasz RNS-szondák alkalmazásával „RNase Protection Mapping” vizsgálatnak vetjük alá, hogy kimutassuk a tRNS-ribozim átiratok jelenlétét. Jelzett RNS-t (10000 cpm/10 fM antiszensz-RNS mintánként) adunk a szárított etanolos csapadékhoz, a mintákat újra szárítjuk, és 10 pl 80% ionmentes formamid, 400 mM NaCl, 20 mM PIPES (pH=6,5) és 10 mM EDTA-tartalmú oldatban feloldjuk. A mintákra steril paraffinolajat rétegezünk, 3 percig 95 °C-on hevítjük, majd gyorsan áttesszük 45 °C-os vízfürdőbe, amelyben egy éjszakán át inkubáljuk. Reggel hozzáadunk 0,3 ml jéghideg NaCl-t (300 mmólos), 30 mM trisz-t (pH=7,5), 1 mM EDTA-t, 0,05 mg/ml RNáz A-t és 80 egység/ml RNáz Tl-et gyors, óvatos mozgatás mellett. A mintákat ekkor szobahőmérsékleten 45 percig inkubáljuk. Ezután hozzáadunk 1 mg/ml proteináz K-t és 0,5% SDS-t, és az inkubálást 20 percig szobahőmérsékleten, majd 20 percig 56 °C-on folytatjuk. A mintát 10 pg tRNS hozzáadása után etanollal csapjuk ki. A felvett üledéket 80% formamid/TBE oldatban vesszük fel, és előmelegített 9,5% akrilamid(8,3 M karbamid)TBE gélben választjuk el.
Ennek a kísérletnek az eredményét a 8. ábrán mutatjuk be.
m sáv: molekulatömeg-markerek (mint az előző példákban)
1-es és 2-es sáv: 10000 és 100000 sejtből származó nukleinsavak térképe - a sejtek plazmid DNSsel nem voltak transzformálva - ES 13-al hibridizálva.
3-as és 4-es sáv: 10000 és 100000 sejtből származó nukleinsavak térképe - a sejtek ESI 3-al voltak transzformálva - ESI3 szondával hibridizálva.
5-ös és 6-os sáv: 10000 és 100000 sejtből származó nukleinsavak térképe - a sejtek ES53-al voltak transzformálva - ES53 szondával hibridizálva.
6. példa
A ν-erbB onkogén [Beug et al., Cell 36, 963-972 (1984)] hatásának gyengítése tDNS-ribozim génekkel, amelyeketpolilizin-transzferrin konjugátumok segítségével viszünk be a v-erbB-transzformált eritroblasztokba.
Ezzel a példával bemutatjuk, hogy az erbB onkogén ellen irányuló tDNS-ribozimeket polilizin-transzferrin konjugátumok segítségével visszük be erbB-transzformált baromfi-eritroblasztokba, és hogy ezek az onkogén transzformáló hatását gyengíteni tudják.
1. Előkísérlet
Transzferrin-polilizin konjugátumok előállítása.
A konjugálást a szakirodalomból ismert módszerekkel [például: G. Jung, W. Kohnlein és G. Lüders,
HU 215 187 Β
Biochem. Biophys. Rés. Comm., 101, 599 (1981)] végezzük úgy, hogy szukcinimidil-piridil-ditiopropionáttal való módosítás után visszük be a diszulfid hidakat.
Piridil-ditiopropionáttal módosított transzferrin 1:
120 mg (1,5 μιηοΐ) transzferrint (baromfifehérje eredetű, Sigma Conalbumin Type I, vasmentes) 0,1 molos nátrium-foszfát pufferben (pH=7,8) feloldunk, Sephacex G-25 gélen szűrjük, és ebből 6 ml-hez állandó rázás közben hozzáadunk a szukcinimidil-piridil-ditiopropionát (SPDP, Pharmacia) 15 mmólos oldatából 200 μΐ-t, majd 1 órán át szobahőmérsékleten, időnkénti rázással, hagyjuk a reakciót végbemenni. Géloszlopon (Sephadex G-25, 14x180 mm, 0,1 mólos nátrium-foszfát puffer, pH=7,8) választjuk el az alacsony molekulatömegű reakciótermékeket és a reagensek maradékát. így 7 ml termékfrakciót kapunk. A transzferrinhez kötött piridilditiopropionát csoport tartalmat ditiotreitollal való redukálás után a termék alikvot mennyiségéből, fotometriás módszerrel határozzuk meg, amikor is a szabaddá váló piridin-2-tion mennyiségét méljük. Az eredmény körülbelül 2,6 pmol.
Merkapto-propionáttal módosított polilizin 2.
Fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelzett 18 mg (körülbelül 1,0 pmol) poli(L)lizin-hidrobromidot (Sigma, molekulatömege körülbelül 18 000, ami átlag 90-es polimerizációs foknak felel meg) feloldunk 3 ml 0,1 mólos nátrium-foszfát pufferben (pH=7,8), s az oldatot Sephadex G-25 gélen szűrjük meg. A polilizin oldatot vízzel 7 ml-re hígítjuk, hozzáadunk állandó rázás közben az SPDP 15 mmólos etanolos oldatából 270 μΐ-t, és 1 órán át sötét helyen, szobahőmérsékleten, időnként megrázva, hagyjuk a reakciót végbemenni. A reakcióelegyet 0,5 ml 1 mólos nátrium-acetát puffer (pH=5,0) hozzáadása után Sephadex G-25 gélen szűrjük az alacsony molekulatömegű anyagok elválasztása céljából (kioldó: 20 mmólos nátrium-acetát puffer, pH=5,0). A termékffakciót (ninhidrines festés, fluoreszcencia) vákuumban bekoncentráljuk, pufferrel körülbelül 7-es pH-ra állítjuk be, hozzáadunk 23 mg (150 pmol) ditiotreitolt 200 pl vízben oldva, és 1 órán át szobahőmérsékleten, argon alatt sötét helyen állni hagyjuk. Újabb gélszűréssel (Sephadex G-25, 14x130 mm-es oszlop, 10 mmólos nátrium-acetát puffer, pH=5,0) választjuk el a felesleges redukálóanyagtól, s ekkor 3,5 ml oldatban kapjuk meg a fluoreszceinnel jelzett polilizin terméket, amely 3,8 mól merkaptocsoportot tartalmaz [fotometriás meghatározás Ellman reagenssel, 5,5’-ditio-bisz(2-nitro-benzoesav)]. Transzferrin-polilizin konjugátum 3.
A fenti leírás szerint kapott módosított transzferrin 1 oldatot (7 ml 0,1 mólos nátrium-foszfát pufferben, pH=7,8; körülbelül 1,5 pmol transzferrin, körülbelül 2,6 μΜ piridil-ditiopropionát csoporttal) argonnal átöblítjük, a fent leírt merkapto-módosított polilizin 2 oldatból (10 mmólos nátrium-acetát pufferben, pH=5,0; mely körülbelül 2,2 pmol merkaptocsoportot tartalmazó körülbelül 0,6 pmol polilizinnek felel meg) hozzáadunk 2,0 ml-t, argonnal átöblítjük, rázzuk és 18 órán át szobahőmérsékleten, sötét helyen argon alatt reagáltatjuk. A reakcióelegyet vízzel 14 ml-re hígítjuk és ioncserélő kromatográfiával választjuk el (Pharmacia Mono S oszlop HR 10/10; grádiens elúció; A puffer: 50 mmólos HEPES puffer, pH=7,9; B puffer: A puffer +3 M NaCl; 0,5 ml/perc). A nem konjugált transzferrin az elején eluálódik, a terméket tartalmazó frakciók körülbelül 0,66-1,5 M NaCl-nál oldódnak le. A konjugált terméket (festés ninhidrinnel, UV fényben 280 nm protein abszorpciónál, fluoreszcencia) hat frakcióban egyenként 10 mg transzferrintartalommal - gyűjtöttük össze. A frakciókat ezután egy 100 mmólos vas(III)citrát oldattal (nátrium-hidrogén-karbonáttal pH=7,8ra beállítva) dializáljuk, és ezután még kétszer dializáljuk 1 mmólos HEPES pufferrel (pH=7,5) szemben.
Nátrium-dodecil-szulfát-gélelektroforézissel (10% SDS, 8% poliakrilamid) kimutattuk, hogy 2-merkapto-etanollal való előkezelés után mind a hat frakcióban körülbelül azonos volt a transzferrintartalom, a nem redukált mintákban szabad transzferrinre utaló sáv nem, csak kevéssel messzebbre vándorló konjugátumok voltak láthatók.
2. Előkísérlet
Transzferrin-polilizin konjugátumok bevitele élő sejtekbe.
Annak érdekében, hogy kimutassuk, miszerint az 1. előkísérletben leírt transzferrin-polilizin konjugátumokat hogyan veszik fel eredményesen az élő eritroblasztok, ezeket a konjugátumokat FITC-el jelöltük. Ismeretes [Schmidt et al., Cell 46, 41-51 (1986)], hogy a FITC-el jelzett transzferrin olyan eritroblasztokkal való néhány órás inkubálás után, amelyekből előzőleg kivonták a transzferrint, a sejten belüli vezikulumokban kimutatható (a vizsgálat fluoreszcencia-mikroszkóppal történt).
Ebben a példában eritroblasztokat (EGF-receptorretrovírussal transzformálva) [Kahazaie et al., EMBO J. 10, 3061-3071 (1988)] inkubálunk 18 órán át 37 °Con, transzferrinmentes differenciáló tápoldatban [összetételét lásd: Zenke et al., Cell 52, 107-119 (1988)]. Sejtkoncentráció: l,5x106/ml. Különböző transzferrinpolilizin konjugátumok (vagy kontrollként megfelelő mennyiségű kétszer desztillált víz) hozzáadása után a sejteket 37 °C-on 10 ng/ml EGF jelenlétében inkubáljuk (hogy fenntartsuk a transzformált állapotot). Ezután 24 és 48 óra múlva körülbelül 5χ 105 sejtet kiveszünk, egyszer mossuk PBS-ben (pH=7,2; foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat), ezután egy PBSben 3,7% formaldehidet és 0,02% glutáraldehidet tartalmazó keverék ötvenszeres térfogatában fixáljuk (10 perc, 40 °C), egyszer mossuk PBS-ben, Elvanolba ágyazzuk be, és fluoreszcencia-mikroszkóppal (Zeiss Axiophot, keskeny sávú FITC- és TRITC-gerjesztés) vizsgáljuk. Ezzel egyidejűleg a különböző tételek másik alikvotmennyiségeiben meghatározzuk a sejtek növekedési sebességét. Erre a célra 10 μΐ sejtszuszpenziót veszünk ki, és meghatározzuk a 3H-timidin (8 pCi/ml, 2 óra) beépülését Leutz és munkatársai [EMBO J. 3, 3191-3197 (1984)] leírása szerint. A 10. ábrából látható, hogy a transzferrin-polilizinnel inkubált eritroblasztok 24 óra múlva 2-10 erősen fluoreszkáló vezikulumot
HU 215 187 Β mutatnak, és ilyenek a kontrolioknál nem voltak kimutathatók. Az A táblázatból látható, hogy gyakorlatilag minden sejt felvesz minden konjugátumot, a 6-os frakciót kivéve.
Az a tény, hogy a sejtek minden mintában egyformán gyorsan növekednek [a tríciumos timidin (3H-TdR) beépülése alapján mérve] azt bizonyítja, hogy a sejteket nem károsítják a polilizinszerkezetek, és így a nem specifikus felvétel (például átjárhatóvá vált sejtmembránon át) kizárható.
3. Előkísérlet
Az in vitro indukált baromfi-eritroblasztoknak eritrocitákká érésénél a polilizin-transzferrin szerkezetek a natív transzferrin-vas komplexet funkcionálisan helyettesíthetik.
Ennek a kísérletnek a célja annak a bemutatása volt, hogy az itt alkalmazott transzferrin-polilizin konjugátumokat a sejtek natív transzferrinként használják fel, azaz a normál transzferrin-cikluson egyformán eredményesen futnak át. Az ehhez kapcsolódó teszt-rendszerhez az olyan eritroblasztok a különösen alkalmasak, amelyek a transzformáló onkogén „kikapcsolása” révén indukálhatok normál eritrocitákká érésre [Beug et al., Cell 28, 907-919 (1982)]. A szakirodalomból kitűnik, hogy az ilyen sejtek normál éréséhez a transzferrin-vas-komplex nagy koncentrációja szükséges (100-200 pg/ml; háromszor kisebb koncentrációk meggátolják a sejtek érését, és ez több nap után a sejtek elhalásához vezet [Kowenz et al., Mód. Trends in Humán Leukémia VII, Springer Verlag, 199-209 (1986)]. Azt is kimutatták [Schmidt et al., Cell 46, 41-51 (1986)], hogy a „recycling”, azaz a transzferrin receptorok újra felhasználásával optimális sebességgel lefutó transzferrinciklus a normál in vitro differenciálódáshoz elengedhetetlen.
Eritroblasztokat (EGF-receptor-retrovírussal transzformálva) EGF-elvonással és optimális mennyiségű, részlegesen tisztított baromfi-eritropoetinnel [Kowenz et al., Mód. Trends in Humán Leukémia VII, Springer Verlag, 199-209 (1986); transzferrin-mentes] differenciálódásra indukálunk. Az inkubálás 1 x 106/ml sejtkoncentráció mellett történik transzferrinmentes differenciáló tápoldatban 42 °C-on és 5% CO2 mellett. Az inkubálás megkezdésekor vagy natív transzferrin-vas komplexet (Sigma; 100 pg/ml) vagy vassal telített transzferrin-polilizin konjugátumot (koncentrációja szintén 100 pg/ml) adunk a sejtekhez. A sejtek növekedését és az érettség fokát 24 és 48 óra múlva a következőképpen analizáljuk.
1. Meghatározzuk a sejtszámot [Coulter Counter, ZM modell; Beug et al., Cell 36, 963-972 (1984)].
2. Felvesszük a sejtek nagyság szerinti megoszlását (Coulter-Channelyzer, modell 256).
3. Fotometriásan mérjük a sejtek hemoglobintartalmát [Kowenz et al., Mód. Trends in Humán Leukémia VII, Springer Verlag, 199-209 (1986)].
Ezenkívül 72 óra múlva a tételekből alikvot mennyiségeket centrifugálunk tárgylemezekre - citocentrifugában (Shandon) -, és elvégezzük a hemoglobin hisztokémiai kimutatását [festés neutrális benzidinnel plusz a vérsejtek Diff-Quik gyorsfestése; Beug et al., J. Cell Physiol. Suppl.l, 195-207 (1982)].
A B táblázatban szereplő eredmények világosan mutatják, hogy azok a sejtek, amelyeket az 1-5 polilizintranszferrin konjugátumfrakciók jelenlétében indukáltunk differenciálódásra, ugyanolyan eredményesen és azonos sebességgel érnek meg, mint azok, amelyeket natív transzferrin-vas jelenlétében inkubáltunk. A transzferrinmentes kontroliokban azonban a sejtek erősen lelassult növekedést mutattak, és csak csekély mennyiségű hemoglobint akkumuláltak. A megfestett
Cytospin-preparátumokban lévő sejtfenotípusok vizsgálata kimutatta, hogy a polilizin-transzferrin konjugátummal inkubált sejtek éppen úgy késői retikulocitákká [laté reticulocytes; Beug et al., Cell 28, 907-919 (1982)] értek, mint a natív transzferrinnel kezelt sejtek, míg a transzferrin nélkül inkubált sejtek dezintegrált és éretlen eritroblasztokhoz hasonló sejtek képét mutatták [Schmidt et al., Cell 46, 41-51 (1986)]. Csak a 6-os transzferrinpolilizin frakcióval kezelt sejtekben volt kisebb a hemoglobintartalom, és ezek közt nagyobb százalékban voltak éretlen sejtek (B táblázat). Ez azt mutatta, hogy a különösen sok polilizinnel konjugált 6-os frakció kevésbé jól funkcionált a transzferrin ciklusban. Ugyanakkor ez az eredmény a tesztmódszer érzékenységére utal.
4. Előkísérlet
A polilizin-transzferrin konjugátumok lehetővé teszik DNS felvételét baromfi-eritroblasztokba.
Ebben a kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a tDNSribozimoknak megfelelő nagyságú DNS-ek (lásd az 1. példát) transzferrin-polilizin konjugátumok révén eredményesen vihetők be a sejtek belsejébe. A példában a tDNS-t egy alábbi szekvenciájú inszertummal
CGTTAACAAGCTAACGTTGAGGGGCATGATATCGGGCC
CCGGGCAATTGTTCGATTGCAACTCCCCGTACTATAGC
- molekulatömeg körülbelül 300000, gamma32P-ATP-al végjelezve [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)] - alkalmazzuk. A DNS körülbelül 0,3 pg-ját 20 pl TE pufferben oldjuk fel, és hozzákeverünk 50-50 pl 400 pg/ml marhaszérum-albumint tartalmazó kétszer desztillált vízben [(Beug és munkatársai, (1982)] vagy 10 pg natív transzferrint vagy 10 pg transzferrin-polilizin konjugátum 3-as frakciót vagy, 50 pl-t ugyanebből az oldószerből, transzferrin nélkül. A DNS-protein keverékeket hozzáadjuk a transzferrinmentes differenciáló tápoldat 2 ml-eihez, ehhez adunk 4*106 baromfíeritroblasztot [EGF-receptor-retrovírussal transzformálva és 18 órán át transzferrinmentes tápoldatban
EGF jelenlétében előinkubálva; Kahazaie et al., EMBO J. 10, 3061-3071 (1988)], majd a reakciókeverékeket 8 órán át 37 °C-on, 5% CO2 mellett inkubáljuk. Ezután a sejteket lecentrifugáljuk, a felülúszót leválasztjuk, és a sejteket háromszor mossuk transzfer60 rinmentes tápoldatban. A sejtüledéket és a tenyészlevet
HU 215 187 Β
1% SDS, 1 mg/ml proteináz K, 300 mM NaCl, 20 mM trisz (pH=8,0) és 10 mM EDTA tartalmú pufferben (PK/SDS puffer) vesszük fel, 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, fenol/kloroform (1:1) eleggyel extraháljuk, és a DNS-t - összesen 2000 cpm aktivitással - nem denaturáló 3,5%-os akrilamid gélben választjuk el [(TBE; Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)], és a DNS-t autoradiográfiával mutatjuk ki. A 10. ábrán olyan baromfi-fibroblasztok fluoreszcenciás felvételei láthatók, amelyeket 24 órán át FITC-el jelzett transzferrin-polilizin konjugátummal (B, C) vagy enélkül (A) inkubáltunk. Kék fénnyel való gerjesztésnél (B, FITC kimutatására) jelentősen több fluoreszkáló vezikula látható minden sejtben. E fluoreszcencia specificitását úgy mutatjuk ki, hogy zöld fénnyel való gerjesztésnél (ez esetben a sejtekben hasonló nem specifikus fluoreszcencia látható, mint az A képen) vezikulum-fluoreszcencia nem lép fel (C). Ez az ábra bemutatja, hogy a transzferrin-polilizin konjugátummal kezelt sejtmintában körülbelül 5-10szer több DNS-t vesznek fel a sejtek, mint a natív transzferrint tartalmazó vagy transzferrin nélküli kontrollmintákban.
Két olyan tRNS-ribozim gént szerkesztünk, amelyek az erbB transzlációt indító szakasza ellen irányulnak (lásd a 2. és 3. ábrát; 1. példa). A gént tartalmazó plazmidok körülbelül 100 mg-ját EcoRI-gyel emésztjük, hogy a tRNS-ribozim gént egy 225 bp fragmentumon szabaddá tegyük. Az emésztéssel kapott termékeket Klenow-fragment segítségével végjelezzük, és gélelektroforézissel, 2%-os agaróz/TBE gélben, tisztítjuk. A vektorfragmentumot és a tRNS-ribozim génfragmentumokat etidium-bormiddal való festéssel lokalizáljuk, kivágjuk, és elektroelucióval, fenol/kloroform (1:1) eleggyel és kloroformmal végzett extrakcióval és etanolos kicsapással izoláljuk. A tisztított, radioizotóppal jelzett DNS-fragmentumokat transzferrin-polilizin transzportrendszer alkalmazásával a felvétel és az erbB-RNS gátlásának a meghatározására használjuk fel. Kontroll DNS-ként a pSPT18 vektort használjuk.
Tesztsejtrendszer gyanánt baromfi-eritroblaszt sejtvonalat választottunk, amely a madár eritroblasztozis vírus (AEV = avian erythroblastosis vírus) egy hőmérséklet-érzékeny mutánsával [ts 34; Gráf et al., Natúré 275, 496-501 (1978)] van transzformálva [Beug et al., Cell 28, 907-919 (1982)]. Az ezekben a sejtekben ugyancsak kifejeződő erbA onkogén egy specifikus proteinkináz-gátlóval (H7) gátolható. Megállapították, hogy a v-erbA-onkogént [Beug et al,, Cell 28, 907-919 (1982)] vivő és in vitro (azaz mint bakteriális úton kifejezett protein) két helyen, a Ser28 és Ser29 helyen, a proteinkináz C, illetve a cAMP-fuggő proteinkináz foszforilálja. A szerinek mutációja alaninná megakadályozza a foszforilálást, és megszünteti a v-erbAonkogén aktivitását. A H7 e két kinázspecifikus inhibitora, és a v-erbA-v-erbB-t tartalmazó eritroblasztokban szelektíven képes arra, hogy a v-erbA által okozott változásokat (például a differenciálódás blokkolása) megszüntesse.
Ismeretes, hogy az eritroblasztok, amelyekben az erbB-onkogént inaktiváljuk - például egy hőmérsékletérzékeny erbB mutáns esetében a hőmérséklet emelésével - eritrocitákká érésre indukálódnak. Ennek a folyamatnak az első jele a hemoglobinszintézis indukciója, amelyet egy érzékeny kimutatási módszerrel [savanyú benzidin festés; Orkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 98-102 (1975); Gráf et al., Natúré 275, 496-501 (1978)] egysejt szinten lehet kimutatni. Ebben a tesztrendszerben egy erbB ellen irányuló ribozim fenotípusos hatása az lenne, hogy a benzidin-pozitív sejtek számának specifikus növekedése lenne várható.
Az ennek a példának az alapját képező kísérletsorozatot a következőképpen végeztük el: a különböző DNS-készítményeket (lásd fent és a C táblázatot) 30 μΐ TE pufferben oldjuk, és hozzákeverünk mindegyikhez 10 pg natív transzferrin-vas komplexet vagy transzferrin-polilizin konjugátumot (feloldva 50 μΐ kétszer desztillált vízben), majd 30 percig 37 °C-on inkubálunk.
A vektor-DNS (10 pg) esetében megfelelően több (100 pg) transzferrin készítményt alkalmazunk. A DNS-transzferrin-DNS keverékekhez 1-1 ml transzferrin-mentes differenciáló tápoldatot [Zenke et al., Cell 52, 107—119 (1988)] adunk. A tesztsejteket (tételenként 3*106 sejt) a kísérlet előtt 60 percig 42 °C-on transzferrinmentes differenciáló oldatban inkubáljuk (ezáltal erősödik a transzferrinfelvétel), és hozzáadjuk a DNStranszferrin tartalmú tételekhez. Ezután 6, 18 és 68 óra múlva (a sejtek kezelését lásd alább) mintát veszünk, mint leírtuk, a felülúszótól a sejt üledéket elválasztjuk, és PK/SDS pufferben felvesszük, végül a DNS-t analizáljuk. (9. ábra)
A 6 órás inkubációs idő végén a sejteket lecentrifugáljuk, és tételenként 2 ml transzferrintartalmú differenciáló oldatban, eritropoetinnel és inzulinnal [Kowenz et al., Mód. Trends in Humán Leukémia VII, Springer, (1986); Zenke et al., Cell 52, 107-119 (1988)], azaz egy aktív ν-erbB protein jelenlétében 37 °C mellett további 72 órán át inkubáljuk.
A következő eredményeket kaptuk:
1) Hasonlóan, mint a 4. előkísérletben, az erb-szakasz DNS-einek megfelelő nagysága DNS intenzívebb felvételét (körülbelül ötszörös) figyeltük meg a transzferrin-polilizin konjugátummal kezelt sejtmintákban.
2) Baromfi-fibroblasztokat erb-szakasz DNS-sel transzfektáltunk, és ennek révén kimutattuk, hogy az erb-szakasz-ribozim-tDNS baromfisejtekben kifejeződik (lásd az 5. példát).
3) A C táblázatból látható, hogy minden olyan esetben, amelyben az erb-szakasz-ribozim-tDNS-t polilizin-transzferrin szerkezetekkel erbB transzformált eritroblasztokba vittük be, a benzidin-pozitív sejtek százaléka szignifikánsan megnőtt (körülbelül a duplájára). Referenciaként szolgáltak azok a minták, amelyeket vektor-DNS-sel kezeltünk, és amelyekben a polilizintranszferrin konjugátumoknak az alkalmazása nem vezetett a benzidin-pozitív sejtek számának emelkedéséhez, a várakozásnak megfelelően.
HU 215 187 Β
7. példa
Az antikodon-törzs szakasz meghosszabbítása megnöveli a ribtRNS kihozatalát.
A humán met-tRNS-gént (EcoRI linkerrel kiegészített BamHI/Rsal fragmentum gyanánt beklónozva a Bluescript vektor EcoRI hasítási helyére) az antikodontörzs szakasz egyetlen Apai hasítási helyén elhasítjuk. Az egyszálú, túlnyúló részeket T4 DNS polimeráz kezeléssel eltávolítjuk, és a ribozimszekvenciákat tartalmazó oligonukieotidokat beépítjük, az előző példákban alkalmazott ribozimbeépítés olyan ribtRNS-molekulát eredményezett, amely 3 bázisból álló törzset tartalmazott (a 11. ábrán a vad típusú tRNSmet és a tRNSrib képe látható a megrövidített antikodon-törzs szakasszal). A második szerkezetnél egy olyan oligonukíeotidot használtunk, amely az elsőtől a vad típusú szekvenciával komplementer GGTTAT szekvenciában különbözik az 5’ végen. Ezzel helyreállítottuk a vad típusos törzset és 4 bázispárral meghosszabbítottuk. (A 12. ábrán látható a tRNSrib szerkezete a megerősített antikodon-törzs szakasszal; a ribozim szekvenciáját a 13. ábra mutatja be; baloldalon (5’) megjelöltük a megrövidített törzsszekvenciát és a megerősített törzsszekvenciát kódoló szakaszok közötti nukleotid szekvenciában lévő különbségeket. A 13. ábra bemutatja a met-tRNS-gén szekvenciáját is). A két ligázreakció-termékkel E. coli HB101 sejteket transzformálunk a Maniatis által leírt standard módszerekkel, kiválasztjuk az alkalmas kiónokat, izoláljuk a plazmid DNS-t, és szekvenciaanalízist végzünk a helyes szekvencia meghatározására. A kapott két ribtRNS-gént a klónozott DNS-ek mikroinjekciója révén Xenopus oocitákba visszük be a 2., illetve a 3. példában leírt módon, és 32P-GTP jelenlétében a transzkripció aktivitását és a ribtRNS-molekula akkumulációját vizsgáljuk. A vad típusú tRNS-gént tízszer alacsonyabb koncentrációban koinjiciáljuk. A beoltott oocitákat 7 óra hosszat inkubáljuk 20 °C-on, a kapott RNS-t összegyűjtjük (lásd a 2. példát) és elektroforézissel elválasztjuk (10% akrilamid/8,3 M karbamid/TBE). Az RNS-molekulákat autoradiográfiával (2 napos expozíció -70 °C-on) tesszük láthatóvá (14. ábra). A megrövidített ribtRNSgén körülbelül 1/10-ét szolgáltatja annak az RNSmennyiségnek, amelyet a vad típusú gén ír át, ezzel szemben az a gén, amely a meghosszabbított törzsszakaszt tartalmazó ribtRNS-molekulát kódolja, hatszoros mennyiségű RNS-t szolgáltat.
8. példa
A ribozim géneknek mint intron alkotórészeknek az expressziója.
Kiindulási gén gyanánt egy Xenopus laevis tRNStyr C gént (oocita típus) választottunk, amely egy 13 nukleotidból álló intront tartalmaz. A természetes intron szekvenciát a következőképpen módosítottuk: először bevittünk egy alkalmas restrikciós hasítási helyet (Apai; GGGCCC), hogy az oligonukleotidok ezt követő klónozását lehetővé tegyük, másodszor az antikodon triplethez komplementer nukleotidokat vittük be, hogy az intron szekvencia meghosszabbítása révén kiegészítő stabilizáló szerkezeti jeggyel rendelkezzék a szekvencia. A módosított génben az intron nagyságát nukleotidról 15 nukleotidra emeltük. (15. ábra)
Az intron szekvencia módosítását a polimeráz láncreakció („polymerase chain reaction”, PCR; Ho et al., Gene 77, 51-59 (1989)] segítségével végeztük el. Erre a célra négy prímért szintetizáltunk, melyek közül kettő a megváltoztatott intron szekvenciát (egymással komplementer) tartalmazza, és kettőt a gén 5’-, illetve 3'-végéhez szántuk, hogy egy EcoRI, illetve egy Sáli restrikciós hasítási helyet vigyünk be. A vad típusú gén, mint Hhal fragmentum (258 bp), a pBR327-be klónozva hozzáférhető [Stutz et al., Genes & Development Vol.3, 8, 1190-1198 (1989)]. A kapott PCR-terméket agaróz gélben tisztítottuk, az említett restrikciós enzimekkel hasítottuk, és a PAALM vektorral [=pSP64+T7 promoter; Viera und Messing, Gene 19, 259-268 (1982)] ligáltuk. A szerkezettel E. coli HB101 sejteket transzformáltunk, és a kívánt inszertumot tartalmazó kiónokat szekvenciaanalízissel azonosítottuk.
A módosított gén (tRNStyrM) aktivitását a vad típusú gén aktivitásával hasonlítjuk össze, Xenopus oocitákba való mikroinjiciálással, amikor is mint belső standardot egy 5S-RNS gént - a pUC-10-5S plazmid tartalmazza; Caroll and Brown, Cell 7, 477-486 (1976) - (50-szer alacsonyabb koncentrációban) 32P-GTP jelenlétében koinjiciálunk. A beoltott oocitákat 20 órán át 20 °C-on inkubáljuk, az RNS-t 8% akrilamid/8,3 M karbamid/TBE gélben választjuk el, majd autoradiográfiás vizsgálatot végzünk (16. ábra).
A 120 nukleotidnál (nt) lévő 5S-RNS mellett látható a primer tRNStyr-átirat 100 (102) nt-nál, az 5’- és 3'-kialakult prekurzor forma 90 (92) nt-nál és a kész formává feldolgozott tirozin tRNS 76 nt-nál. A 90 nt prekurzor forma összeillesztése (splicing) limitálófaktomak tűnik, úgyhogy a képződött átirat nagy része (körülbelül 80%-a) ebben a formában fordul elő. Mint várható volt, a vad típusú génnel szembeni módosítás révén a biológiai aktivitás nem csökkent.
Egy további kísérletben a rendszer teljesítőképességét vizsgáltuk. Ribozim-szekvenciát tartalmazó két olyan oligo-dezoxiribonukleotidot szintetizáltunk, amelyek már tartalmaztak apai végeket és így a módosított tRNStyr gén intron szekvenciájába közvetlenül beklónozhatók voltak. Az egyik oligonukleotid mindkét végéhez 12 ntot kapcsoltunk, hogy a ribintronban stabil „hajtűkef ’ képezzünk, s hogy ez az exonukleáz lebontással szemben hasson. Az így kapott intron teljes nagysága 89 nt (ribozim HP), a védtelen ribozimszekvencia (ribozim C) 65 nt-jával szemben. A ribozimek szekvenciáit, valamint a klónozási sémát a 17. ábra mutatja be.
A Xenopus oociták fent leirt mikroinjekcióihoz analóg módon, a már leírt két szerkezeten kívül egy harmadikat is felhasználtunk, amely a ribozim HP dimer formáját tartalmazta és így az intron nagysága 163 nt-ra nőtt (ribozim D). A koinjiciált 5S-standard koncentrációja 1:20 volt a HP és D szerkezetek esetében és 1:1 a C szerkezetnél (18. ábra). A kísérlet azt mutatta, hogy a HP és C szerkezetek a lényegesen meghosszabbított intronok ellenére aktívan átíródnak, és hasonló eredményességgel történik a feldolgozásuk, mint a vad típusú
HU 215 187 Β tRNStyr-géné. A D szerkezet esetében csak minimális mennyiségű átirat volt kimutatható, mivel nyilvánvaló, hogy a Pol III transzkripciós komplex képzéséhez szükséges szekunder szerkezetet a hosszú intron szekvencia megbontotta.
Megállapítottuk, hogy a ribozimeknek tRNS-intronok formájában történő expressziója nem vezet a tRNS szekunder szerkezetének lényeges károsodásához, és így a keletkező átirat nagy koncentrációban akkumulá5 lódik és korrekten feldolgozhatóvá válik.
A. táblázat
Polilizin-transzferrin bevitele eritroblasztokba
Tétel Közeg Transzferrin- polilizin Vezikulum fluoreszcencia Életképesség (3H-TdR beépülés)
24 óra 48 óra 48 óra
1 2 ml adagolás nélkül <1% <1% 140000 cpm
2 2 ml 145 μΙΗ,Ο <1% <1% 126000 cpm
3 2 ml 145 pl TfpLFrl >90%++ >90%++ 137000 cpm
4 2 ml 145 pl TfpL Fr2 >90%+++ >90%+++ 161 000 cpm
5 2 ml 145 pl TfpL Fr3 >90%+++ >90%++ 153 000 cpm
6 2 ml 145 pl TfpL Fr4 ca. 80%+++ >90%+++ 151000 cpm
7 2 ml 145 pl TfpL Fr5 ca. 60.%+++ >90%+++ 153 000 cpm
8 2 ml 145 pl TfpL Fr6 ca. 40%+++ >90%+++ 165000 cpm
++és +++jelzi a vezikulum fluoreszcencia relatív erősségét.
B. táblázat
A polilizin-transzferrin az eritroblasztok in vitro indukált érésének stimulálásában a normál transzferrint funkcionálisan helyettesíteni képes
Sorszám Közeg Adagolás6 Sejtszám (,106/ml) Hemoglobin e492 Érési fokozat retikulocita%
24 óra 48 óra 24 óra 48 óra 72 óra
1 2 ml Fe- transzferrin 3,28 4,38 1,38 2,74 >80%
2 2 ml - 2,62 2,56 0,35 0,23 <1%
3 2 ml H2O 2,60 2,42 0,30 0,13 <1%
4 2 ml TfpL Frl 3,70 4,44 1,36 2,69 >80%
5 2 ml TfpL Fr2 3,56 4,24 1,16 2,51 n. m.a
6 2 ml TfpL Fr3 3,72 4,54 1,58 2,54 80%
7 2 ml TfpL Fr4 3,48 4,56 1,57 2,55 n. m.
8 2 ml TfpL Fr5 3,36 4,26 1,41 2,47 n. m.
9 2 ml TfpL Fr6 3,58 4,4 1,14 1,93 60-65%
a: nincs meghatározva b: Fe-transzfcrrin: 200 pg 13 μΙ-ben; TfPl frakciók: 200 pg 130 μΙ-ben; H2O: 130 pl.
HU 215 187 Β
C. táblázat
V-erbB-transzformált eritroblasztok érése (hemoglobintartalma) V-erbB-ribozim-DNS felvétele után
Sorszám DNS Transzferrin Hemoglobintartalom (savanyú benzidin festés utáni pozitivitás %-a
Típus Molekulasúly Mennyiség Típus Mennyiség 14 óra 62 óra
1 erb-szakasz 13 2*105 1 pg Tf 10 pg 15+-3* (3)b
2 erb-szakasz 13 TfpL Fr5 10 pg 37+-4 (2)
3 erb-szakasz 53 2*105 1 Pg Tf 10 pg 25+-2 (2)
4 erb-szakasz 53 TfpL Fr5 io pg 42+-1(2)
5 vektor ribozim nélkül 2*106 10 Pg Tf 100 pg 23+-3 (2)
6 vektor ribozim nélkül 10 pg TfpL Fr5 100 pg 22+-2 (2)
7 erb-szakasz 13+53 lásd fent 0,5+0,5 pg Tf 10 pg 21+-2(2)
8 erb-szakasz 13+53 0,5+0,5 pg TfpL Fr5 10 pg 38+-2 (2)
a: meghatározásonként több mint 200 sejtet számoltunk, érték ± standard eltérés b: az egymástól független meghatározások száma

Claims (23)

1. Eljárás az RNS-funkciót gátló RNS-t kódoló, DNS-t tartalmazó, adott esetben több másolatban előforduló genetikai egység előállítására, azzal jellemezve, hogy
i) egy polimeráz III által átírt gént egy alkalmas restrikciós enzimmel az inszerció számára kiszemelt helyen elhasítunk, és ii) a gátló RNS-t kódoló kettős szálú DNS-t ide ligáljuk, és iii) ezzel alkalmas gazdaszervezeteket transzformálunk, ezeket szelektáljuk, szaporítjuk, és iv) a megsokszorozott plazmid DNS-t kinyeijük a tenyészetből.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy ribozimot kódoló kettős szálú DNS-t a hasítási helyre ligálunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre egy „hammerhead” típusú, ribozimot kódoló kettős szálú DNS-t ligálunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy met-tDNS- vagy egy tyr-tDNS-gént ligálunk a hasítási helyre.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre egy met-tDNS transzkripciós egységeit ligáljuk.
6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
35 hogy a hasítási helyre egy tyr-tDNS transzkripciós egységeit ligáljuk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimeráz III által átírt gén A-blokkja és B-blokkja közé egy ribozimot kódoló
40 DNS-t inszertálunk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre a gátló RNS-t kódoló DNS-t az intron részeként ligáljuk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 45 hogy a polimeráz III által átírt gén A-blokkja és
B-blokkja közé egy „hammerhead” típusú ribozimot kódoló DNS-t inszertálunk.
10. Az 5., 8. vagy 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gátló-RNS-t kódoló
50 DNS-t a polimerázIII által átírt gén A-blokkja és B-blokkja között levő természetes Apai hasítási helyre inszertáljuk.
11. A 4-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre a vad típusú
55 tRNS átiratához képest 80%-kal (4 bázispárral) meghosszabbított antikodon-törzs szakaszt tartalmazó DNS-t ligálunk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre egy onkogének ellen irányuló
60 ribozimot kódoló DNS-t ligálunk.
HU 215 187 Β
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre egy „hammerhead” típusú, ribozimot kódoló DNS-t ligálunk.
14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gátló RNS-t kódoló DNS-t egy Apai hasítási helyre inszertáljuk.
15. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az íntront az antikodon-törzs szakasz meghosszabbításával módosítjuk, és a gátló RNS-t kódoló oligonukleotidot a módosított intron egyik hasítási helyére ligáljuk.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre egy virális RNS ellen irányuló gátló RNS-t kódoló DNS-t ligálunk.
17. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre onkogének ellen irányuló gátló, RNS-t kódoló DNS-t ligálunk.
18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási helyre több másolatban előforduló, onkogének ellen irányuló ribozimokat kódoló DNS-t ligálunk.
19. Eljárás az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti előállított genetikai egység sejtekbe való bevitelére, azzal jellemezve, hogy a genetikai egységet egy transzferrin-polikation konjugátummal komplexbe visszük, és a komplexet a sejtekkel megfelelő körülmények között érintkezésbe hozzuk.
20. Eljárás hatóanyagként az 1-18. igénypontok bármelyike szerint előállított egy vagy több genetikai egységet tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot adott esetben a gyógyszerek készítésénél szokásosan alkalmazott hordozó, hígító, töltő és/vagy egyéb segédanyagokkal keverjük, és a keveréket ismert módon gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keveréket nem kívánt géntermékek szintézisét gátló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot egy, a genetikai egység komplex voltának kialakítására alkalmas transzferrinpolikation konjugátummal keverjük.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot egy transzferrin-polilizin konjugátummal keverjük.
HU901584A 1989-03-16 1990-03-14 Eljárás az RNS funkcióját gátló genetikai egységek előállítására, és eljárás sejtekbe való bevitelükre HU215187B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT60989 1989-03-16

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU901584D0 HU901584D0 (en) 1990-06-28
HUT54206A HUT54206A (en) 1991-01-28
HU215187B true HU215187B (hu) 1998-10-28

Family

ID=3495118

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU901584A HU215187B (hu) 1989-03-16 1990-03-14 Eljárás az RNS funkcióját gátló genetikai egységek előállítására, és eljárás sejtekbe való bevitelükre
HU95P/P00692P HU211868A9 (en) 1989-03-16 1995-06-30 Genetic units for inhibiting the function of rna

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00692P HU211868A9 (en) 1989-03-16 1995-06-30 Genetic units for inhibiting the function of rna

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0387775B1 (hu)
JP (1) JP3330930B2 (hu)
KR (1) KR900014591A (hu)
AT (1) ATE140961T1 (hu)
AU (1) AU637354B2 (hu)
CA (1) CA2012312C (hu)
DD (1) DD297838A5 (hu)
DE (1) DE59010432D1 (hu)
DK (1) DK0387775T3 (hu)
ES (1) ES2090049T3 (hu)
FI (1) FI105103B (hu)
GR (1) GR3020935T3 (hu)
HU (2) HU215187B (hu)
IE (1) IE74850B1 (hu)
IL (1) IL93754A (hu)
NO (1) NO306623B1 (hu)
NZ (1) NZ232917A (hu)
PT (1) PT93440B (hu)
RU (1) RU2136751C1 (hu)
ZA (1) ZA901973B (hu)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04505261A (ja) * 1989-05-10 1992-09-17 スローン―ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ ポルｉｉｉプロモーターの制御下の転写可能な外来ｄｎａを含む安定的に形質転換された真核細胞
DE4091533T (hu) * 1989-08-31 1992-01-30
JP2507895B2 (ja) * 1989-12-19 1996-06-19 工業技術院長 リボザイムの新規合成系
CA2084790C (en) * 1990-06-19 2002-04-09 Philip Anthony Jennings Endonucleases
US6008343A (en) * 1990-06-19 1999-12-28 Gene Shears Pty. Ltd. Nucleotide based endonucleases
DE552178T1 (de) 1990-10-12 1994-02-03 Max Planck Gesellschaft Abgeänderte ribozyme.
DE4104186A1 (de) * 1991-02-12 1992-08-13 Genentech Inc Neue, ueber endozytose in hoehere eukaryotische zellen aufnehmbare, nukleinsaeure enthaltende komplexe
FR2687411A1 (fr) * 1992-02-13 1993-08-20 Nice Sophia Antipolis Universi Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn.
AU4259193A (en) * 1992-04-28 1993-11-29 Frank Andreas Harald Meyer Medicament for the gene-therapeutic treatment of human beings, animals and plants, especially to block virus multiplication and carcinogenes and process for producing the medicament
CA2135499A1 (en) * 1992-05-14 1993-11-25 James D. Thompson Method and reagent for inhibiting cancer development
US5989906A (en) * 1992-05-14 1999-11-23 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting P-glycoprotein (mdr-1-gene)
US5610052A (en) * 1992-08-26 1997-03-11 Ribozyme Pharmaceuticals Inc. Enzymatic RNA with activity to ras
US5827935A (en) * 1992-05-27 1998-10-27 City Of Hope Chimeric tRNAlys -ribozyme molecules
EP0596901B1 (en) * 1992-05-27 2000-08-09 City Of Hope CHIMERIC tRNA LYS -RIBOZYME MOLECULES
JPH08500971A (ja) * 1992-06-29 1996-02-06 ジーン・シアーズ・ピーティーワイ・リミテッド 核酸及びウイルス性病原体をコントロールするためのこれらの使用方法
WO1994013798A1 (en) * 1992-12-16 1994-06-23 Bergmann Johanna E Agents for the prevention and treatment of human alzheimer's disease
DE69333216T2 (de) * 1993-07-06 2004-06-24 Université de Nice-Sophia Antipolis Vektor, enthält ein bei ARN-Polymerase-III transcriptes Virus-Gen
US5837503A (en) * 1993-07-07 1998-11-17 Universite De Nice-Sophia-Antipolis Vector containing viral gene transcribed by RNA polymerase III and methods for use
US5817635A (en) * 1993-08-09 1998-10-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
AU692208B2 (en) * 1994-01-24 1998-06-04 City Of Hope Inhibitors and target molecule co-localization
DE4424761C1 (de) * 1994-07-04 1995-06-08 Max Planck Gesellschaft Expressionskassette für die Antisense- und die Ribozym-Expression
EP0837933A4 (en) 1995-06-07 2003-05-21 Commw Scient Ind Res Org OPTIMIZED MINIZYMES AND MINIRIBOZYMES AND THE USE THEREOF
FR2755976B1 (fr) 1996-11-15 1999-01-15 Idm Immuno Designed Molecules Nouveaux complexes d'acides nucleiques et de polymere substitue par des residus entrainant la destabilisation des membranes cellulaires
US6057156A (en) 1997-01-31 2000-05-02 Robozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of epidermal growth factor receptors
WO1999020753A2 (en) * 1997-10-21 1999-04-29 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Peptide bond formation using nucleic acid catalysts
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1555317B1 (en) 1998-03-20 2011-09-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthetic genes and genetic constructs comprising the same
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US20020132257A1 (en) 2001-01-31 2002-09-19 Tony Giordano Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4987071A (en) * 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods

Also Published As

Publication number Publication date
DK0387775T3 (da) 1996-11-04
JPH03130080A (ja) 1991-06-03
AU637354B2 (en) 1993-05-27
HUT54206A (en) 1991-01-28
ATE140961T1 (de) 1996-08-15
NO901213L (no) 1990-09-17
IE900931L (en) 1990-09-16
EP0387775A1 (de) 1990-09-19
NO901213D0 (no) 1990-03-15
IL93754A (en) 1995-12-31
IL93754A0 (en) 1990-12-23
AU5130190A (en) 1990-11-01
ZA901973B (en) 1991-11-27
PT93440A (pt) 1990-11-07
DD297838A5 (de) 1992-01-23
FI105103B (fi) 2000-06-15
NZ232917A (en) 1997-07-27
CA2012312C (en) 2001-08-14
JP3330930B2 (ja) 2002-10-07
GR3020935T3 (en) 1996-12-31
PT93440B (pt) 2001-07-31
ES2090049T3 (es) 1996-10-16
CA2012312A1 (en) 1990-09-16
RU2136751C1 (ru) 1999-09-10
EP0387775B1 (de) 1996-07-31
KR900014591A (ko) 1990-10-24
HU901584D0 (en) 1990-06-28
FI901296A0 (fi) 1990-03-15
IE74850B1 (en) 1997-08-13
DE59010432D1 (de) 1996-09-05
HU211868A9 (en) 1995-12-28
NO306623B1 (no) 1999-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215187B (hu) Eljárás az RNS funkcióját gátló genetikai egységek előállítására, és eljárás sejtekbe való bevitelükre
CA2125974C (en) Senescent cell derived inhibitors of dna synthesis
EP0748383B1 (en) Targeted cleavage of rna using ribonuclease p targeting and cleavage sequences
JP3316216B2 (ja) 安定化外部ガイド配列
US6852535B1 (en) Polymerase III-based expression of therapeutic RNAS
JP4321877B2 (ja) トランス―スプライスにより生成される治療用分子
AU687001B2 (en) Method and reagent for inhibiting cancer development
US5750390A (en) Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
MXPA06012605A (es) Composiciones y metodos para mejorar el suministro de acidos nucleicos en celulas y para modificar la expresion de genes objetivo en celulas.
JP2012080889A (ja) 多コンパートメント真核生物発現系
CA2248350A1 (en) Inhibition of proliferation of cells
JPH09504947A (ja) 標的分子の配列の改変
AU680843B2 (en) TNF-alpha ribozymes and degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-alpha ribozymes
JP2003525037A (ja) Ｃｄ２０およびｎｏｇｏ遺伝子発現の調節および診断のための方法および試薬
US5599704A (en) ErbB2/neu targeted ribozymes
US20040072783A1 (en) Nucleozymes with endonuclease activity
KR20040023596A (ko) 신규 맥시자임
US5888727A (en) Method of inhibition of nucleo-cytoplasmic transport by M protein of vesicular stomatitis virus
US6830923B1 (en) Genetics units for inhibiting the function of RNA
WO1994029452A2 (en) Enzymatic rna molecules and their application in the treatment of fibrosis and fibrous tissue disease
MX2008003380A (en) Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell
JPH09501318A (ja) ヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害するための方法および試薬