PT93440B

PT93440B - Processo para a preparacao de unidades geneticas que inibem a funcao do arn e de composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT93440B
Application number: PT93440A
Authority: PT
Inventors: Hartmut Beug; Max L Birnstiel; Matthew Cotten; Ernst Wagner; Harald Kandolf
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1989-03-16
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 2001-07-31
Also published as: HU901584D0; HU211868A9; ES2090049T3; PT93440A; FI901296A0; NO306623B1; KR900014591A; JP3330930B2; AU637354B2; DE59010432D1; IE74850B1; IE900931L; ATE140961T1; CA2012312A1; AU5130190A; FI105103B; HU215187B; IL93754A0; EP0387775B1; RU2136751C1

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se ã inibição específica de ARN por meio de uma acção de permuta com ARN.

A inibição específica de genes por oligo nucleótidos, por exemplo em relação a um bloqueio com fins terapêuticos de oncogenes desregulados ou de genes virais, dependente da capacidade de sequências complementares de ARN ou de ADN, os chamados oiigonucleõtidos anti-sentido [anti-sense], com ARNm's, sinais de processamento ou pré-ARNm's, de hibridar e de^ te modo interromper p transporte de informação entre os genes e as proteínas.

A utilização de ADN anti-sentido provoca uma destruição de ARN alvo complementar por meio de corte H por ARNase do híbrido resultante, dando como resultado a destruição utruw.)

irreversível de todo o ARN complementar.

No caso da utilização de ARN anti-senti^ do resulta um efeito conhecido como de detenção de híbridos de tradução ou de processamento, no qual o híbrido ARN/ARN representa o obstáculo estrutural. Pensa-se que estes híbridos se acumulam nas células; não foi ainda estudado o seu destino. De acordo com os conhecimentos actuais deve tratar-se neste mecanismo essencialmente de um acontecimento reversível. A utilização de moléculas de ARN anti-sentido tem a vantagem de que estas moléculas tanto podem ser sintetizadas in vitro e introduzi, das nas células como é possível introduzir nas células os genes que codificam para estas moléculas, podendo deste modo o ARN inibidor ser produzido no interior das células. Não se conseguiu ainda no entanto levar os genes a uma forma tal que possibilite a produção de quantidades importantes de ARN anti-sentido nas células.

Anteriormente tinha sido descoberto um terceiro princípio da inibição de ARN e a utilização in vitro tornou este princípio acessível em função da capacidade de molé cuias de ARN, as denominadas ribozimas, de reconhecer determ_i nadas sequências de ARN, de se ligarem a estas sequências e de as cindir. Este princípio foi derivado das reacções de corte au tocatalíticas observadas in vivo de moléculas de ARN em viróides de plantas e em ARN satélite.

Por montagem a partir de determinadas exigências estruturais para a cisão de ARN catalisada por ribozimas ê possível agora construir de novo ribozimas que apresentam uma actividade de endonuclease dirigida in trans para uma determinada sequência alvo. Uma vez que estas ribozimas, das quais as até agora mais minuciosamente investigadas são denominadas por ribozimas hammer-head” por causa da sua estrutura, podem actuar sobre numerosas sequências diferentes, ê possível praticamente talhar-se a feitio uma ribozima correspondente para qualquer substrato de ARN que se queira. Este facto faz com que as ribozimas constituam instrumentos interessantes e além disso flexiveis para a inibição de genes específicos e uma alternativa prometedora para as construções anti-sentido, as quais já demonstraram possuir uma utilidade terapêutica potenci.

al.

Um dos modelos de ribozimas conhecidos actualmente e investigados mais em pormenor abrange três domínios estruturais; já se construíram ribozimas eficazes contra o ARNm-CAT com base neste modelo (Haseloff et al., 1988; Uhlenbeck et al., 1987):

Os três domínios incluem:

a) uma região altamente conservativa de nucleótidos que está situada no flanco do local de corte na direcção 5'. Neste caso trata-se habitualmente da sequência GUC, se bem que uma modificação para GUA ou GUU apresente também uma activi^ dade hidrolítica embora consideravelmente reduzida. Também ocorre uma cisão depois da sequência CUC e, em escala reduzida, também depois de AUC e de UUC (não foram ainda compl£ tamente esclarecidas as condições necessárias para uma cisão eficaz).

b) as sequências altamente conservativas contidas em domínios de corte de ocorrência natural em ribozimas que formam um tipo de hastes de bases emparelhadas;

c) as regiões de flanco em ambos os lados do local de corte que garantem a localização exacta da ribozima em relação ao local de corte e em ligação com o substrato e a enzima (nas investigações até agora efectuadas tomaram-se 8 bases de ca da lado).

Foi possível construir enzimas de ARN de acordo com este modelo e estas enzimas demonstrarem ser apro priadas para a cisão específica de sequências de ARN de modo eficaz (Haseloff et al., 1988).

Anteriormente jã tinham sido descobertos outros tipos de actividade de cisão de ARN autocatalítica que podem ser considerados para a inibição dirigida de ARN. Um destes modelos é a denominada ribozima hairpin, cujo local ac tivo é derivado da cadeia negativa do ARN satélite do vírus da mancha em anel do tabaco (Hampel e Tritz, 1989). Outros exemplos de actividade hidrolítica dc ARN estão associados com o vírus delta da hepatite (Kuo et al., 1988; Sharmeen et al., 1988; Wu

et al., 1989) e com ARNaseP (Altmann et al., 1988). As investigações prévias para a presente invenção estiveram relacionadas com a comparação da acção do ARN anti-sentido, do ADN anti-sentido e de ribozimas. Estas investigações foram levadas a efeito com o auxílio da reacção de processamento de pré-ARNm de histões dependentes de snRPN U7 e num sistema in vitro que processa de facto o pré-ARNm de histões dependente de U7 (Mowry et al., 1987, Soldati et al., 1988). Nestas investigações verificou-se que o ARN anti-sentido constitui o inibidor mais forte, sendo a inibição reversível. As actividades inibidoras do ADN anti-sentido e de ribozimas do tipo hammer-head, ambas irreversíveis, são da mesma ordem de grandeza, sendo em qualquer dos casos necessário um excesso de 1000 vezes para uma inibição completa.

Enquanto que as investigações sobre ribozimas tinham sido até agora efectuadas com ARN nu em sistemas isentos de proteínas, as investigações para a presente invenção foram as primeiras experiências que mostraram que ribozimas pre paradas por via sintética dirigidas para uma sequência específi^ ca apresentam também uma actividade hidrólitica em meios que contêm proteínas. Este facto fornece uma primeira informação pa ra uma potencial utilização in vivo.

Um dos factores limitantes na utilização de ribozimas para a inibição da expressão de genes específi cos está relacionado com a necessidade de ser apropriado para a formação de uma concentração de ribozima que seja suficiente pa ra provocar a exclusão eficaz de uma determinada reacção biológica; as causas para isso devem, de modo semelhante ao que se passa na utilização de ARN anti-sentido, basear-se entre outras circunstâncias na estabilidade reduzida do ARN.

A presente invenção tem o objectivo de proporcionar um sistema para a utilização de ARNm como inibidor in vivo de ARNm que permite ultrapassar a limitação existente até agora na utilização de ARN ao permitir alcançar nas células uma concentração activa de ARN inibidor.

Este objectivo foi alcançado de acordo com a presente invenção por meio de uma entidade genética dissolvida que contém as unidades de transcrição necessárias para

a transcrição pela polimerase III e de um ADN que codifica para a função de ARN que inibe o ARN, o qual se encontra situado de tal modo no interior da unidade genética que é a fracção de ARN inibidor do produto da transcrição da polimerase III.

Na resolução deste objectivo partiu-se do raciocínio de que por introdução de um gene da produção do ARN inibidor contra a importação do ARN como tal se garantia uma amplificação considerável do ARN e deste modo uma reserva de ARN suficiente para a inibição da reacção biológica.

ARN inibidor pode ser uma ribozima qualquer ou um outro ARN que iniba o ARNm, por exemplo um ARN anti-sentido.

Essencialmente era prevísivel a realiza ção de um transporte eficaz de ARN ou da sequência de ADN que codifica para esse ARN por meio de vírus ou de vectores virais, por exemplo por retrovírus.

Este sistema apresenta no entanto alguns inconvenientes, como a mobilização de vírus endógenos, a recombinação com retrovírus endógenos, a activação de genes endógenos por integração e restrição com respeito ao organismo hospedeiro e ao tipo de tecido.

Ao contrário desta situação, a presente invenção proporciona genes de transporte que não apresentam estes inconvenientes.

Os genes descritos no âmbito da presente invenção que podem servir de genes de transporte para os genes de ARN possuem as seguintes vantagens: apresentam uma estru tura compacta, podem ser transportados facilmente para o interior das células em virtude da sua pequena dimensão, apresentam uma taxa de transcrição elevada e não são limitados na sua expressão por determinados tecidos, sendo, pelo contrário, expres sos de modo universal, isto é, praticamente em todos os tipos de células.

Uma outra vantagem do gene da polimerase III reside na disponibilidade de um sinal de transcrição-ter minação muito forte. Deste modo reduz-se consideravelmente a probabilidade de que seja activado de forma indesejável um gene celular situado na proximidade.

Os genes transcritos pela polimerase III possuem as seguintes propriedades: trata-se de genes cujo promotor não se encontra a montante antes do gene, mas sim no interior do gene (Geiduschek et al., 1988). Estas regiões de re gulação internas essenciais para a ligação da polimerase III apresentam uma estrutura descontínua; são constituídas por duas fracções chamadas blocos (o bloco A e o bloco Β), que são essenciais para o reconhecimento por meio dos factores de transcrição, bem como por uma fracção genica intermediária que é cr_i tica em relação ao seu comprimento (Hofstetter et al., 1981). O comprimento desta sequência é nos genes de ARNt de 31 a 74 pares de bases (Clarkson).

Os genes de ARNt, 5S-ARN e uma série de outros pequenos genes de ARN do núcleo e do citoplasma são subs^ titutos destes genes transcritos pela polimerase III: ARN de 7SK, 7SL, M, U6 e 4,5S, bem como os genes VAI e VA2 do adenovírus (Geiduschek et al., 1988). São características comuns destes genes uma dimensão reduzida, uma estrutura compacta, uma al ta taxa de transcrição e uma transcrição universal.

Surpreendentemente verificou-se que com o auxílio das unidades genéticas de acordo com a presente inven ção é possivel conseguir uma elevada estabilidade do ARN inibidor, sem que se torne inevitável uma redução no espectro de actividade .

Já anteriormente tinha sido descrito por Jennings e Molloy, 1987, que um promotor de reconhecimento especifico da polimerase III é apropriado para conduzir a sinte^ se dp ARN anti-sentido. Para este fim o fragmento Xbal/BamHl do gene VAI, que contém o promotor, foi clonado em direcção 5' antes do ADN anti-sentido, que corresponde ao princípio tradicional na utilização de promotores de polimerase II. 0 objectivo era obter um produto de transcrição curto em comparação com os produtos de transcrição da polimerase II. O produto da transcri ção apresenta apenas uma variação insignificante, que possibili^ ta um emparelhamento de basesdas extremidades, a fim de proteger as extremidades da digestão por exonucleases de cadeia simples .

Ao contrário desta proposta, na qual é utilizada apenas a sequência do promotor do gene de uma polimerase III específica (o domínio entre as posições 30 e 73, enquan to que o gene VA 1 do tipo selvagem se prolonga até ã sequência do terminador nas posições +160 a +200), de acordo com a presen te invenção são adicionalmente consideradas as sequências utili. zadas do gene da polimerase III, as quais são de significado de cisivo para a estrutura secundária do produto da transcrição, a fim de aproveitar estas para a estabilização das sequências ini_ bidoras de ARN. Ao contrário do processo anteriormente descrito, a sequência do gene que codifica para o ARN inibidor encontra-se situada de tal modo no interior do gene transcrito da polimerase III que se pode considerar, de acordo com a presente invenção, como um bloco integrado génico” (cassette genica). Em consequência os genes de transporte utilizados de acordo com a presente invenção não são tóxicos, ao contrário com o que se pas sa com os genes VAI virais.

Os genes transcritos pela polimerase III têm possibilidades de utilização muito flexíveis no âmbito da presente invenção. No que se refere ã sua função como genes de transporte para sequências inibidoras de ARN devem ser tomados em consideração os critérios seguintes para a selecção ou modificação de genes naturais ou para a construção de genes sin téticos:

1) Os blocos A e B são altamente conservativos.

2) Um sector de 5 a 7 resíduos T a jusante do bloco B é respon sável pela terminação da transcrição.

3) A distância entre o bloco A e o bloco B não pode ser aumentada indefinidamente, sendo o máximo actualmente determinado de cerca de 90 pb.

4) Em alguns sistemas a sequência de flanco 5’ tem uma influên cia sobre a transcrição.

5) Existem indicações de que uma região da haste do anticodão é essencial para a estabilidade do produto transcrito.

Os genes de ARNt são especialmente apro priados para genes de transporte para a preparação das unidades genéticas da presente invenção. Para além disso é previsível que os ARNs codificados por estes genes sejam especialmente ade

quados em virtude da sua estrutura em trevo para conferir estabilidade ao ARN inibidor. Com o seu auxílio é possível preparar unidades genéticas que produzem ARN compacto, nas quais se introduziu a sequência que codifica para o ARN inibidor entre o bloco A e o bloco Β (A Figura 1 apresenta uma representação esquemática de um gene de ARNt-ribozima).

As investigações relativas ã presente invenção foram levadas a efeito com o ARNt da metionina de início, o qual apresenta um local de restrição Apa I na região da haste e da ansa do anticodão situado entre o bloco A e o bloco B (os ARNt¹s da metionina de início de todos os eucariontes superiores apresentam este local de restrição na ansa do anticodão) .

Perto da região situada entre o bloco A e o bloco B são possíveis também outros locais de inserção no interior das sequências do ADN de transporte (gene do ARNt ou outros genes de polimerase III), desde que se garanta que a actividade de transcrição da polimerase III e a estabilidade do produto transcrito são conservados.

As unidades genéticas de acordo com a presente invenção podem no entanto ser preparadas basicamente com todos os ARNt's; em caso de necessidade é possível construir um local de restrição apropriado no qual em seguida se insere a sequência que codifica para o ARN inibidor. Para a inserção deve-se ter em conta simplesmente que na região da haste do anticodão não se proceda a qualquer permuta de bases que prejudique a taxa de transcrição do gene ou a estabilidade do ARNt resultante (Folk et al., 1983). Para além disso deve-se prestar aten ção ã circunstância de que inserções maiores do que 60 pb podem prejudicar a transcrição (Ciliberto et al., 1982).

Com respeito à escolha de genes de trans porte apropriados é basicamente desejável utilizar genes de ARNt específicos ou outros genes transcritos por polimerase III que não são tóxicos.

As investigações relativas à presente invenção foram levadas a efeito introduzindo sequências de ribo zimas em genes normais de ARNt. Quando a ARNt-ribozima que é transcrita por este gene estã localizada predominantemente no

citoplasma, mas no entanto se pretende uma utilização determina da, por exemplo para inibir ARNs específicos do núcleo, por exemplo os de partículas de snRNP, a fim de localizar no núcleo a ARNt-ribozima ou a ARNt-ribozima ou o ARN antisentido de ARNt é possível usar mutantes que de preferência se encontram locali. zados no núcleo, por exemplo o gene met i ARNt descrito por Zas loff et al., 1982, e por Zasloff, 1983, que apresenta uma única permuta de bases.

As unidades genéticas de acordo com a presente invenção podem por exemplo ser preparadas do seguinte modo:

Cinde-se uma cópia do gene transcrito pela polimerase III, por exemplo um gene de ARNt que é contido por um plasmideo bactéria no, com uma enzima de restrição apropriada no local previsto pa ra a inserção, por exemplo entre o bloco A e o bloco B, e intro duz-se nesse local o ADN de dupla cádeia preparado de acordo com técnicas normais que codifica para o ARN inibidor. Com o ma terial obtido transformam-se organismos hospedeiros adequados, seleccionam-se os transformantes, multiplicam-se e recupera-se o ADN plasmideo amplificado. Confirma-se a presença nos plasmideos da unidade genética da presente invenção prevista; esta confirmação pode ser efectuada por digestão com uma enzima de restrição, por análise de sequência ou pela detecção de um produto transcrito funcional in vitro do ADN plasmídico.

As unidades genéticas obtidas deste modo podem apresentar-se para utilização sob a forma do plasmideo circular ou também sob a forma da unidade genética separada do plasmideo, desde que contenha toda a informação necessária para a transcrição pela polimerase III.

A forma que é escolhida depende em geral do domínio de utilização e do sistema de transporte escolhi do para a introdução da unidade nas células.

As unidades genéticas de acordo com a presente invenção podem também apresentar-se em várias cópias (neste caso trata-se de estruturas em série, nas quais as unida des genéticas se encontram ordenadas umas a seguir ãs outras em várias cópias, podendo neste caso as inserções inibidoras serem iguais ou diferentes).

A transcrição de uma série como a referida dá origem a unidades de ARN separadas umas das outras em virtude dos sinais de promotor e de terminação presentes em cada unidade. Com base nesta propriedade dos fragmentos, como se trata sempre de unidades de transcrição completas, a orientação de cada unidade em relação ãs outras ê também irrelevante. Na preparação destas séries parte-se de plasmídeos que contêm cópias multímeras da região que codifica para as unidades inibido ras. É possível preparar por exemplo genes de ribozimas de ARNt multímeros que contêm vectores, partindo da série do sector erbE descrito no Exemplo 1, no qual se ligam fragmentos isolados para formar polímeros usando ligase de ADN T4 e se pratica a reclonagem de genes poliméricos num local de restrição correspondente de um vector plasmídico apropriado. A preparação destas séries é possibilitada pela reduzida dimensão das unidades da presente invenção, que é de preferência de 200 a 350 pb. Com o auxílio de um inibidor em série como os descritos é possível após a preparação de um complexo heterómero de ARNs anti-sentido ou de ribozimas numa única experiência determinar a activida de de um conjunto de inibidores. Por exemplo é possível deste mo do introduzir-se uma mistura de 5 a 10 ribozimas num sistema ce lular. Depois de se ter verificado uma inibição pela mistura, é possível investigar cada uma das ribozimas para verificar a res pectiva actividade. Esta técnica é especialmente vantajosa devi, do ao facto de que os critérios para a selecção das sequências alvo de ARN que se pretendem inibir ainda não foi completamente investigada.

Prevê-se que sejam boas sequências alvo por exemplo as regiões que não apresentam qualquer estrutura se cundária, as regiões perto dos sinais de corte, as regiões depois do codão de início, as regiões sem local de ligação para proteí. nas especificas (como por exemplo o local de libação Sm em molé cuias de ARNsn). Com o auxílio da presente invenção, especialmente quando se utilizam sob a forma de série, ê possível obter o esclarecimento destas sequências alvo e em consequência a sua eficiente inibição.

A utilização destas unidades em série é também vantajosa quando é necessário, para a inactivação de pro

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cessos biológicos, cindir em vários locais o ARN, por exemplo ARN virai. É possível conseguir uma cisão em vários locais por exemplo por construção de um grande número de diferentes ribozã. mas e por introdução nas células de um vector que contém as uni. dades genéticas com cada sequência de ADN que codifica para estas ribozimas. Por transcrição destas sequências as unidades de ribozimas são acumuladas nas sequências alvo correspondentes, tendo lugar a cisão do ARNm em fragmentos.

É então possível usar cópias multímeras quando são necessárias quantidades superiores de uma ribozima de baixo peso molecular para ter uma actividade suficiente para determinadas utilizações, por exemplo na utilização do sistema de transporte de transferrina-policatião. Os plasmídeos que pos suem cópias multímeras da unidade genética que contêm a sequência de ADN que codifica para esta ribozima melhoram a produção do fragmento por elevação do rendimento de várias ordens de grandeza.

As unidades em série podem também com vantagem ser utilizadas quando se pretende simultaneamente preparar ARNs inibidores que são dirigidos contra diversos tipos de ARN.

Na utilização da presente invenção no que se refere a ARN anti-sentido deve ter-se em atenção que nos genes de ARNt a dimensão da inserção é limitada. Para uma trans crição eficaz a ordem de grandeza da dimensão situa-se em cerca de 60 pb; por consequência para a utilização de construções de ARN anti-sentido maiores devem ser considerados outros genes transcritos pela polimerase III que apresentam uma maior capaci^ dade no que se refere à transcrição de sequências mais longas.

Os genes de transporte utilizáveis de acordo com a presente invenção podem também ser obtidos por sin tese desde que preencham a condição de apresentarem unidades de transcrição necessárias para a transcrição pela polimerase III. A utilização destes genes sintéticos pode acarretar as seguintes vantagens;

a) Estes genes não são reconhecidos pelas aminoacilsintetases e pelos ribossomas, evitando-se deste modo uma intervenção

£^í-^V^igea-.au^_MS[,.

no aparelho de tradução das células.

b) Existe a possibilidade de preparar ARNs inibidores com maior estabilidade e mais alta taxa de transcrição por meio de construções sintéticas tanto quanto com um gene natural.

c) 0 processo de clonagem pode ser tornado mais flexível por meio de sequências sintéticas.

Verificou-se de acordo com a presente invenção que a estabilidade da molécula ribozima-ARNt pode ser aumentada por prolongamento da região de haste do anticodão da molécula de ADNt de transporte. Foi possível demonstrar que por meio do prolongamento da região da haste do anticodão que apresentava 5 pares de bases para 9 pares de bases é possível conse guir uma elevação de 6 vezes do produto transcrito em relação ao gene de ARNt de tipo selvagem mais curto, o que pode ter a sua razão de ser num aumento da estabilidade e em consequência da facilidade de processamento.

Verificou-se para além disso que também se pode obter uma elevação da estabilidade das unidades genéticas da presente invenção sob a forma de genes de ribozimas de ARNt ou de genes de ARNt anti-sentido quando as sequências de ADN que codificam para a função de ARN inibidor se encontram sob a forma de partes intrões (no caso de ribozimas designados por ribintrões). Neste caso partiu-se da consideração de que os intrões de ocorrência natural da estrutura secundária de moléculas precursoras de ARNt não se modificam e que os intrões de ARNt não apresentam qualquer conservação de sequências, sendo possível minimizar deste modo por clonagem de sequências de ribozimas ou de sequências anti-sentido como partes de intrões a alteração estrutural do precursor de ARNt resultante e maximi zar deste modo a respectiva estabilidade. Por meio dos genes de tyrARNt utilizados de acordo com a presente invenção, nos quais o corte da molécula precursora de ARNt apenas se dá lentamente, foi possível demonstrar que por meio da utilização de moléculas de ADNt que contêm sequências de ribintrões ê possível elevar consideravelmente a actividade de ribARNt. Deste modo é possível atacar ARNs amplificados localizados no citoplasma. Este sistema possibilita de um modo simples a construção de elementos ™S5«nMUJTi-. ._______ jyrt»wffnnsffiEnffl&ti Itotit J.p-vuu^,.

estruturais apropriados para a elevação da estabilidade dos r_i bintrões em comparação com a destruição por meio das exonuclea ses. É possível conseguir este efeito por exemplo por emparelha mento adicional de bases ou por um maior domínio de hairpin limitado nas sequências do ribozima. Nas modificações deste tipo deve-sè ter em atenção que as estruturas de especial interes se para a separação dos intrões devem ser conservadas.

As sequências naturais de intrões podem ser modificadas, por exemplo por introdução de locais de corte por restrição apropriados, a fim de possibilitar a clonagem de oligonucleótidos ou, quando não contidas em genes de ocorrência natural, por introdução de nucleótidos que possibilitam um empa relhamento de bases com o tripleto do anticodão a fim de dispor de uma marca estrutural estabilizadora adicional.

Foi possível demonstrar de acordo com a presente invenção que a expressão de ribozimas como componentes dos intrões não implica essencialmente qualquer prejuízo para a estrutura secundária do ARNt, sendo o produto transcrito resultante acumulado numa concentração mais elevada e podendo ser processado de forma correcta. No caso de o intrão libertado durante o processamento não parecer ser suficientemente estável, ê possível prever marcas estruturais apropriadas que provocam uma elevação da estabilidade em comparação com a destruição pelas exonucleases.

A fim de introduzir as unidades genéticas nas células podem ser utilizados vários métodos:

O método normal para a introdução de ADN nas células de culturas de tecidos utiliza a formação de um coprecipitado entre o ADN e fosfato de cálcio (Graham et al., 1973) . 0 precipitado é fornecido ãs células que absorvem uma des terminada quantidade possivelmente por um processo de pinocitose. Um método semelhante utiliza um material carregado positiva mente, DEAE-dextrano, que facilita a absorção de ADN pelas célu las. Também foram desenvolvidos métodos de introduzir ADN em cé lulas por meio de electroporação (sendo neste método provocado o alargamento dos poros por meio de um campo eléctrico pulsante) (Langridge et al., 1987, Fromm et al., 1987). São igualmente utilizáveis técnicas de microinjecção em células de grandes di13 mensões (Kressmann et al., 1980) e em células de culturas de te eidos (Pepperkok et al., 1988). Estes métodos no entanto apenas são utilizáveis um laboratório ou para utilizações in vitro. Re centemente foi desenvolvido um peptídeo sintético catiõnico (DOTMA) que forma espontaneamente com ADN lipossomas e facilita deste modo o transporte para o interior das células (Felgner et al., 1987). Basicamente são também apropriados para a transferência de material genético para o interior das células vectores retrovirais, conforme anteriormente referido (Stewart et al., 1986, 1987); este sistema apresenta no entanto os inconvenientes já mencionados.

Um outro mecanismo de transporte está relacionado com a utilização de toxinas de desarmamento como veículos de transporte.

Os processos de transporte utilizados até agora têm todos o defeito de não fornecer ãs células suficiente ácido nucleico inibidor. Com o auxílio da presente inven ção é agora possível conseguir um aumento do número de unidades inibidoras activas em relação ã capacidade de transporte em vir tude da reduzida dimensão e do carácter compacto das moléculas. Como consequência desta dimensão reduzida e desta estrutura com pacta das unidades genéticas da presente invenção é possível por meio de modificações insignificantes, por exemplo por conju gação com colesterol, contraiões lipõfilos ou peptídeos de loca lização nuclear, prescindir também completamente de um sistema de transporte.

Utiliza-se de preferência no âmbito da presente invenção para o transporte um sistema solúvel que decorre através da endocitose mediada por receptores. É especialmente preferido para este fim um conjugado de transferrina-poli^ catião complexado com a unidade genética da presente invenção; o complexo é estabelecido por meio do receptor da transferrina, que existe em praticamente todas as células.

Os domínios de aplicação para a presente invenção são numerosos: por exemplo é possível preparar animais transgénicos que apresentam, em virtude da ocorrência das unidades genéticas de acordo com a presente invenção no material genético, uma imunidade intracelular contra vírus, por exem14

pio contra o vírus da doença da boca e dos pés, contra o vírus da doença de Newcastle, contra a pseudo-raiva ou contra a gastroenterite infecciosa. De modo semelhante é possível também conseguir imunidade intracelular em plantas transgénicas, por exemplo contra o vírus PVX da batateira.

Para além disso é possível introduzir as unidades genéticas da presente invenção em células somáticas a fim de introduzir ribo zimas ou ARNs anti-sentido dirigidos contra vírus patogénicos, como o HIV ou retrovírus aparentados, para o combate a estes agentes virais.

Um outro domínio de aplicação é a terapia genética por utilização de construções de ADN com complemen taridade para com oncogenes ou outros genes chave que controlam o crescimento e/ou a diferenciação celular. Nestas aplicações usa-se a alta especificidade de actividade de inibição do ARN obtenível por meio da presente invenção com o auxílio da qual é possível por exemplo uma distinção entre protooncogenes e produ tos de transcrição de oncogenes.

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Para alem disso as unidades geneticas da presente invenção podem ser usadas a fim de inibir em plan-/ tas ou em animais _a__expressão de genes específicos de modo a

A acçao inibidora do ARN pode também ser utilizada para o combate a doenças de modo a que se impeça a produção de produtos génicos indesejáveis, por exemplo a produção da proteína principal de placas (major plaque protein) que ocorre na doença de Alzheimer ou de proteínas que causam do enças autoimunes.

A presente invenção pode também ser uti lizada nos casos em que se quer pôr fora de acção por acumulação de ARN uma proteína de regulação que apresenta uma acção re cíproca com o ARN.

Consideram-se também compreendido no âm bito da presente invenção um processo para a preparação de composições farmacêuticas por incorporação das unidades genéticas da presente invenção possivelmente sob a forma de liofilizados. A aplicação destas composições farmacêuticas abrange o domínio de indicações referido.

Por meio das investigações levadas a efeito no quadro da presente invenção foi possível detectar a actividade de transcrição do gene da ADNt-ribozima. Para este fim preparou-se uma construção genica de uma ribozima de ADNt por inserção de uma sequência de ADN que codifica para a ribozi. ma dirigida contra a sequência snARN U7 no local de restrição Apal entre o bloco A e o bloco B do ADNt da metionina de início (o bloco A e o bloco B são as duas sequências de reconhecimento para a polimerase; a transcrição começa a 15 pb a montante do bloco A e termina numa sequência oligo-T a jusante do bloco B). Após microinjecção deste gene detectou-se a transcrição; a concentração do híbrido ARNt/ribozima tem uma concentração de 10 a 20% em ARNt da que foi produzida por um gene de ARNt de tipo selvagem co-injectado.

As moléculas de ARN sintetizadas in vivo pelo gene de tRNA-ribozima cindem o ARN alvo no local previ£ to. A adição da estrutura de ARNt ã sequência da ribozima não bloqueia a actividade da ribozima. As moléculas de ARNt-ribozima sintetizadas por genes que foram injectados em oõcitos cindem o ARN alvo igualmente no local previsto e com a mesma eficá cia que as ribozimas sintetizadas in vitro sem a estrutura de ARNt adicional. Este facto demonstra que a síntese e o processa mento in vitro de uma ARNt-ribozima não implicam modificações que prejudiquem a actividade da ribozima.

No quadro da presente invenção foi pela primeira vez detectada in vivo a actividade de uma ribizima. Pa ra este fim injectaram-se genes de ADNt/ribozima em conjunto com GTP marcado por isótopos radioactivos no núcleo de oõcitos. Após incubação durante oito horas, que é o período indicado para a síntese da ribozima, injectou-se o ARN substrato marcado (U7 ARN) no citoplasma dos oõcitos. Após mais duas horas extraiu-se o ácido nucleico dos oõcitos. Nos oõcitos em que teve lugar a síntese de ribozimas não se detectou qualquer ARN de substrato restante. Pelo contrário, nos oõcitos que não tinham sido inje£ tados com genes de ADNt/ribozima ou nos quais o gene falhou o núcleo o ARN de substrato estava estável.

Foi possivel também mostrar no quadro da presente invenção que as ADNt-ribozimas de acordo com a pre16

sente invenção podem inibir a actividade de transformação de um oncogene. Por meio de células eritóides de galinha transformadas com o oncogene erbB detectou-se a actividade de uma ARNt-ri^ bozima sobre a diferenciação das células em eritrócitos provoca da por meio da inibição da expressão do gene erbB.

A actividade das unidades genéticas da presente invenção também pode ser verificada por observação da resistência de células de rato contra infecções, por exemplo in fecções de polioma, após utilização das unidades genéticas da presente invenção, que são dirigidas contra o vírus (eventualmente contra várias regiões), por exemplo contra o vírus do papiloma.

EXEMPLO 1

Construção de genes de ARNt ribozima

a) Construção de pSPT18metl

Isolou-se por digestão com EcoRI do vec tor pBR322 o gene do iniciador de metionina 1-ARNt de Xenopus, existente num fragmento EcoRI de 284 pb que foi clonado em pBR322 (o fragmento H-G Hinfl (Hofstetter et al., 1981, tellford et al., 1979)), purificou-se por electoforese em gel (2% de aga rose/TBE) e ligou-se no local EcoRI do plasmídeo bacteriano pSPTl8 (Boehringer Mannheim) de modo a que se obteve um ARNt transcrito em sentido quando da transcrição do plasmídeo com po limerase SP6. Para este fim utilizaram-se métodos de clonagem normais, descritos em (Maniatis). A principal vantagem da reclo nagem do gene de ARNt em pSPT18 reside na existência dos promotores de polimerase SP6 e T7-ARN em posição oposta um em relação ao outro no plasmídeo. A partir daí foi possível obter por transcrição in vitro produtos transcritos de ARN específicos que contêm a sequência da ARNt-ribozima ou a sequência complementar desta (Melton et al., 1984). Estes produtos transcritos são úteis a fim de experimentar a actividade hidrolítica da molécula de ARN ou a fim de verificar por meio de um RNase Protection Mapping a ausência de ARNt-ribozimas em extractos celu

lares que expressam a ARNt-ribozima.

b) Construção de genes de ARNt-ribozima

Cindiu-se o gene de ARNt de pSPT18metl no local Apal único na região da haste do anticodão e na região da ansa (ver Fig. 2). Nesta figura representam-se plasmídeos que contêm sequências que codificam para a ARNt-ribozima. O vec tor pSPT18 meti contém o fragmento EcoRI de 284 pb que possui o gene de ARNt de início de Xenopus laevis. Trata-se do fragmento G-H (Hofstetter et al., 1981) clonado no local EcoRI do poliadag tador de pSPT18. Representam-se os oiigonucleõtidos complementa res que codificam para ribozimas que são dirigidos contra U7snARN (CD33 e as duas sequências do erbB-ARNm (ES13 e ES53)) . A estratégia de clonagem utilizada nesta operação provoca o afastamento das extremidades salientes do local Apal no gene de ARNt. A fracção da inserção, que codifica para a ribozima e as regiões complementares do ARN alvo são caracterizadas, bem como os blocos A e B, a fracção do resíduo 5 T (sinal de terminação) e os locais de início da transcrição. O plasmideo contém a origem de replicação de ColEI, um marcador de resistência ã ampici. lina e os promotores para a polimerase de ARN T7 e SP6.

A fim de preparar oiigonucleõtidos de ADN sintético de dupla cadeia que codificam para a sequência de corte de virõides (Haseloff et al., 1988) flanqueada pelas sequências complementares ao ARNm alvo, prepararam-se em primeiro lugar oiigonucleõtidos de cadeia simples de acordo com métodos normais (sintetizador de ADN da Applied Biosystems). Fosforilaram-se oiigonucleõtidos complementares, temperaram-se e integra ram-se no vector pSPT18metl cindido por Apal usando métodos nor mais (Maniatis). Utilizou-se a mistura de ligação para a transformação de E. coli HP101, isolaram-se os clones bacterianos que contêm o novo plasmideo e confirmou-se a presença de sequên cias de ribozima activo no plasmideo bacteriano de dois modos:

1) Incubaram-se moléculas de ARN, que derivam do plasmideo de

ADN clonado pela transcrição in vitro de SP6, com um ARN marcado por isótopos radioactivos que contém a sequência al_ vo para a ribozima e ensaiaram-se para verificar a cisão eg

pecífica do ARN alvo (ver Fig. 4).

2) Confirmou-se a presença de sequências de ADN correctamente inseridas por meio de sequenciação de ADN pelo método de d_i desoxi no local de inserção.

A Figura 4 apresenta a actividade de r_i bozima in vitro da ARNt-ribozima. As moléculas de ADN plasmideo que continham as sequências ES13 e ES53 do sector erbB da ARNt-ribozima foram digeridas com PvuII e transcritas com polimerase de ARN de SP6. Esta transcrição dá origem a uma molécula de ARN com um comprimento de 230 nucleótidos que contém a sequência ARNt-ribozima e adicionalmente as sequências de flanco 5' e 3' que derivam das sequências de flanco de Xenopus e das sequên cias plasmídicas bacterianas de flanco (ver Fig. 2). Os produtos transcritos de ribozimas foram incubados com 20 000 cpm (20 fM) de uma molécula de ARN com a região do erbB-ARNm que abrange o codão de início. A molécula de ARN possui a sequência alvo tanto para ES13 como para ES53 (ver Fig. 3) . Após uma incubação de duas horas da ribozima com ARN alvo a 37QC na presença de MgCl₂ 10 mM, tris.HCl 20 mM a pH 7,5 e NaCl 150 mM, adicionou-se EDTA até uma concentração de 15 mM, secou-se a amostra, dissolveu-se em formamida a 80%/TBE, aqueceu-se durante 30 s a 955C e separou-se num gel de acrilamida a 9,5%/ureia 8,3 M. Após a elec_ troforese detectaram-se as moléculas de ARN marcadas por meio de auto-radiografia.

Pista M: marcadores de peso molecular: ADN de pBR322 cortado com Hpall e marcado com alfa ^^^-CTP usan do o fragmento de Klenow da polimerase de ADN (Maniatis) . Os marcadores de peso molecular foram dissolvidos em formamida a

80%/TBE e aquecidos durante 3 min a 95QC imediatamente antes da separação no gel. Na margem esquerda são indicados os pesos moleculares de alguns fragmentos (em nucleótidos).

	Pista	1: erbB-ARNm	alvo	(20 000	cpm,	20
fM)	sem incubação.
	Pista	3: erbB-ARNm	alvo	(20 000	cpm.	20
fM)	incubado com MgCl₂ a 37QC	sem ribozima.
	Pista	4: erbB-ARNm	alvo	(20 000	cpm,	20
fM)	incubado com ARN de ESI3	(1 fM) .
	Pista	5: erbB-ARNm	alvo	(20 000	cpm,	20

fM) incubado com ARN de ES53.

À direita da Figura são dados os pesos moleculares (em nucleótidos) de erbB-ARNm alvo e dos produtos de corte em 5' e em 3' de ambas as reacções de corte de ribozimas (ver também Fig. 3).

A Figura 3 apresenta a complementaridade entre as ribozimas e os ARNs alvo: CD33 (A) contra U7snARN (Cotten et al., 1988), ES13 (C) e ES53 (B) contra sequências do erbB-ARNm (Venustrom et al., 1980).

A fracção de ARNt da ARNt-ribozima estã na base da diferença não representada. Os locais de corte para a ribozima estão caracterizados bem como os codões de início do erbB-ARNm.

EXEMPLO 2

Transcrição de ARNt-ribozima em oócitos de Xenopus.

A transcrição dos genes de ARNt-ribozima, microinjectados em oócitos de Xenopus, foi levada a efeito de acordo com o método descrito em (Kressmann et al., 1978, Hofstetter et al., 1981, Kressmann et al., 1980) para ADNt. Para este fim seguiu-se o seguinte procedimento: Retiraram-se oócitos no estádio VI a partir de Xenopus laevis fêmeas estimuladas por HCG (Gonadotropina de cório humano). Os oócitos foram centrifugados durante um curto período a fim de levar os núcleos para a periferia. Em cada núcleo injectaram-se cerca de 50 nl de uma solução que continha 0,3 pg/jil de ADN plasmídico super-enrolado (contendo o gene da ARNt-ribozima de acordo com o Exem pio 1) e 2 pCi/pl ^^^-GTP. Após 5 a 8 horas de incubação a 20QC digeriram-se os oócitos injectados a 379C durante 45 min em SDS a 1%, 1 mg/ml de proteinase K, NaCl 300 mM, tris 20 mM a pH 8 e EDTA 20 mM (400 pl/oõcito), extraiu-se uma vez com fenol e uma vez com fenol/clorofórmio e precipitou-se com etanol. Dissolveram-se os precipitados por etanol reunidos em formamida a 80%/ /TDE, aqueceu-se durante um curto período a 952C para desnaturar, separou-se por electroforese em gel de acrilamida a 10%/

/ureia 8,3 M/TBE e visualizou-se por auto-radiografia. Em todas as experiências com genes de ARNt-ribozima as soluções injectadas continham o gene metARN do tipo selvagem com uma concentração de 1/6 da concentração do gene de ARNt-ribozima. 0 tampão TBE (tris, borato, EDTA) foi preparado de acordo com o procedimento descrito em (Maniatis).

Os resultados desta experiência são apre sentados na Figura 5:

Pista m: marcadores de peso molecular: como na Fig. 4. Na margem esquerda são indicados os pesos moleculares de alguns fragmentos (em nucleótidos).

Pistas 1, 2 e 3: Os ácidos nucleicos de oócitos isolados injectados com o gene Met-ARNt e com o gene Met-ARNt-ribozima metribo 33. Ã direita na figura são dadas as posições do Met-ARNt (met,77 nucleótidos de comprimento) e da ARNt-ribozima (met ribo), 128 nucleótidos de comprimento).

EXEMPLO 3

Determinação da actividade ribozimãtica de ARNt-ribozima sintetizado por oócitos em comparação com uma ribozima sintetizada in vivo que não apresenta qualquer sequência de ARNt

Separou-se por meio de electroforese uma ARNt-ribozima dirigida contra U7 sintetizada em oócitos microinjectados, visualizou-se por auto-radiografia, recortou-se do gel de poliacrilamida e eluiu-se por incubação de um dia para o outro num vibrador de Eppendorf em HEP (Heidelberg Extraktionspuffer = [tampão de extracção de Heidelberg]: acetato de amónio 0,75 M, acetato de magnésio 10 mM, fenol a 1% (vol./vol.) SDS a 0,1% (peso/vol.), EDTA 0,1 M). Extraiu-se o ARN eluído uma vez com fenol/clorofõrmio e uma vez com clorofórmio e preci. pitou-se com etanol na presença de 10 pg de ARNt de E. coli como suporte. Retomou-se o precipitado e determinou-se quantitati.

vamente por meio de contagem de Cerenkov da marcaçao de p usan do os valores para a actividade específica (Kressmann et al., 1982). Incubaram-se amostras da ARNt-ribozima com ARN marcado

com 32P g_Ue continha a sequência U7 (10 000 cpm/amostra, 10 fM mais a quantidade dada de ARN U7 não marcado) durante 2 h a 37Q C na presença de NaCl 150 mM, MgC^ 10 mM e tris.HCl 20 mM a pH 7,5. Fizeram-se parar as reacções por adição de EDTA até 15 mM, secaram-se as amostras, dissolveram-se em formamida a 80%/TBE, aqueceu-se a 95QC durante 30 segundos e separou-se num gel de acrilamida a 9,5%/ureia 8,3 M/TBE. Visualizaram-se os tipos de ARN radioactivo por auto-radiografia a -80QC com uma película de ampliação do tipo Dr. Goos especial.

Preparou-se a ribozima CD32 por transcrição por polimerase T7 de um plasmideo que continha a inserção de CD33 (ver Fig. 2) e clonou-se nos locais Hind III/Sal I do plasmideo pSPTl9 (Boehringer Mannheim). Este produto transcrito contém apenas a sequência da ribozima mais as sequências complementares de U7 flanqueadas de sectores curtos da sequência do vector. A actividade hidrolítica desta ribozima foi toma da como comparação com a actividade hidrolítica da ARNt-ribozima CD 33 sintetizada pelos oócitos, a fim de apreciar a influên cia da estrutura secundária do ARNt bem como a síntese e a mod_i ficação in vivo sobre a actividade ribozimática. Verificou-se que as duas ribozimas (CD 32 e CD 33) cortam o ARN que contém a sequência U7 (de 94 nucleótidos de comprimento) num produto de

corte 5'	de	25 nucleótidos e num produto	de corte 3’ de 69 nu-
cleótidos.
		Os resultados desta experiência são a-
presentados	na Figura 6:
		Pista m: marcadores de peso molecular
análogos	aos	ι da Fig. 5
		Pista 1: U7-ARN	(10 000 cpm, 10 fM) in-
cubação	sem	ribozima.
		Pista 2: U7-ARN	(10 000 cpm, 100 fM) in
cubação	com	10 fM da ARNt-ribozima CD33	sintetizada pelos oóci-
tos.
		Pista 3: U7-ARN	(10 000 cpm, 1 pM) incu
bado com	10	fM da ARNt-ribozima CD33 sintetizada pelos oócitos.
		Pista 4: U7-ARN	(10 000 cpm, 100 fM) in

cubado com 10 fM de ribozima CD32 sintetizada in vitro por poli, merase T7.

Pista 5; U7-ARN (10 000 cpm, 100 fM) in cubado com 1 fM de ribozima CD32 sintetizada in vitro por polimerase T7,

EXEMPLO 4

Determinação da hidrólise do substrato da ribozima em oócitos

Injectou-se em núcleos de oócitos uma mistura de gene anti U7-ARNt-ribozima e o gene de Met-ARNt. Incubaram-se os oócitos injectados a 20SC durante 8 h co mo descrito no Exemplo 2 e deixou-se prosseguir a transcrição. Injectou-se em seguida U7-ARN marcado com radioisótopo (50 nl, 100 000 cpm/pl, 100 fM/μΙ) no citoplasma dos oócitos. Em seguida incubaram-se os oócitos durante 2 h. Efectuou-se a preparação dos ácidos nucleicos dos oócitos isolados e a sua separação por meio de electoforese em gel conforme descrito anteriormente.

Os resultados desta, experiência são apresentados na Figura 7:

Pista m: Marcadores de peso molecular como na Figura 5.

Pista 1: Ácidos nucleicos de um oócito injectados com Os genes Met e Metribo.

Pistas 2 e 3: Oócitos injectados com Met e Metribo, seguidos de injecção de U7-ARN.

Pistas 4 e 5: Oócitos injectados apenas com U7-ARN.

Pista 6: Uma alíquota de U7-ARN utiliza do para a injecção.

Pista 7: U7-ARN (10 fM) incubado com a ribozima CD33 (10 fM) durante 2 h a 37QC na presença de NaCl 150 mM, MgCl₂ 10 mM e tris.HCl 20 mM a pH 7,5. Em virtude das condições do gel apenas se visualiza o produto de hidrólise 3' (69 nucleõtidos).

EXEMPLO 5

Actividade de transcrição de ARNt-ribozima em células de galinha

Introduziram-se em células de galinha moléculas de ADN plasmídico que continham os genes de ARNt-ribo zima a fim de determinar a actividade de transcrição dos genes. Verificou-se que o gene de ARNt-ribozima (derivado de um gene de ARNt de Xenopus) se transcreve de modo eficaz em células de galinha. Para este fim procedeu-se do seguinte modo: Inocularam -se 10^ células de fibroblastos de embriões de galinha (Zenke et al., 1988) por placa de 10 cm de acordo com métodos normais e deixaram-se crescer de um dia para o outro. Na manhã seguinte transfectou-se cada placa com 10 pg de ADN plasmídico (contendo a fracção erbB 13 ou a fracção erbB 53) usando o método de copreciopitação do fosfato de cálcio (Graham et al., 1973). As cê lulas foram expostas ao precipitado de um dia para o outro e na manhã seguinte foram lavadas com meio fresco e foram incubadas durante mais 48 horas em meio fresco. Em seguida retirou-se o meio, retomaram-se as células em tampão PK/SDS (ver acima) e se pararam-se os ácidos nucleicos. Em seguida submeteu-se o ácido nucleico a um mapeamento de protecção de ARNase usando sondas de ARN da fracção erbB 13 ou erbB 53 anti-sentido marcadas com 32P a fim de detectar a presença de produtos da transcrição de ARNt-ribozima. Adicionou-se ao precipitado seco obtido por adição de etanol ARN marcado (10 000 cpm/ 10 fM de ARN anti-sentido por amostra), secaram-se as amostras novamente e dissolveram -se em 10 μΐ de formamida a 80% desionizada, NaCl 400 mM, PIPES 20 mM a pH 6,5 e EDTA 10 mM. Cobriram-se as amostras com uma ca mada de óleo de parafina estéril, aqueceu-se durante 3 min a 95QC e transferiu-se rapidamente para um banho de ãgua a 45QC em que se deixou em incubação de um dia para o outro. Na manhã seguinte adicionaram-se com agitação rápida e cuidadosa 0,3 ml de NaCl gelado (300 mM), tris 30 mM de pH 7,5, EDTA 1 mM, 0,05 mg/ml de ARNase A e 80 unidades/ml de ARNase Tl. Incubaram-se as amostras ã temperatura ambiente durante 45 min. Adicionaram—se proteinase K e SDS até 1 mg/ml e 0,5%, prosseguiu-se a incu • bação ã temperatura ambiente e em seguida a 56QC durante 20 min

Após adição de 10 ug de ARNt precipitaram-se as amostras com etanol. Retomou-se o precipitado obtido em formamida a 80%/TBE e separou-se num gel de acrilamida a 9,5%/ureia a 8,3 M/TBE pré -aquecido.

Os resultados são apresentados na Figura 8:

Pista m: Marcadores de peso molecular como nos exemplos anteriores.

Pista 1: Sonda de ES 13 anti-sentido h_i bridada com ARNt de E. coli.

Pistas 3 e 4: Mapeamento dos ãcidos nucleicos de 10 000 e 100 000 células que não tinham sido transfectadas com ADN plasmídico hibridado com a sonda de ES 13.

Pistas 5 e 6: Mapeamento dos ácidos nu-

cleicos	de	10	000	e	100	000 células	transfeçtadas	com ES	13	hi-
bridado	com	. a	sonda	de	ES 13.
						Pistas 7 e	8: Mapeamento	dos ãcidos	nu-
cleicos	de	10	000	e	100	000 células	transfeçtadas	com ES	53	que

tinha sido hibridado com a sonda de ES 53.

EXEMPLO 6

Enfraquecimento da actividade do oncogene v-erb B por um gene de ARNt-ribozima que foi introduzido em eritroblastos transformados por v-erb B com o auxílio de conjugados de polilisina-transferrina.

Por meio deste exemplo foi possível demonstrar que as ADNt-ribozimas que são dirigidas contra o oncogene erb B introduzidas com o auxilio de conjugados de polilisi^ na-transferrina em eritroblastos de galinha transformados por erb B podem enfraquecer a actividade de transformação do oncoge ne.

Experiência preliminar 1

Preparação de conjugados transferrina - polilisina

O acoplamento foi levado a efeito de

acordo com um método análogo ao referido na literatura (comparar com G. Jung, W. Kõhnlein e G. Líiders, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101 (1981), 599) por introdução de pontes de dissulfure to após modificação com piridilditiopropionato de succinimidilo.

Piridilditiopropionato - transferrina modificada 1:

Trataram-se 6 ml de uma solução de 120 mg (1,5 pmol) de transferrina (de clara de ovo de galinha, Sigma, Conalbumin Tipo I, isenta de ferro) filtrada através de um gel de Sephadex G-25 em 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,8) com boa agitação com 200 Pi de uma solução etanólica 15 mM de piridilditiopropionato de succinimidilo (SPDP, Pharmacia) e deixou-se reagir durante 1 h ã temperatura ambiente e com agita ção ocasional. Eliminaram-se os produtos da reacção e os resíduos de reagentes de baixo peso molecular através de uma coluna de gel (Sephadex G-25, 14 x 180 mm, tampão de fosfato de sódio 0,lMapH7,8) e obtiveram-se 7 ml de uma fracção que continha o produto; o conteúdo de resíduos de piridilditiopropionato ligado a transferrina foi avaliado numa alíquota por determinação fotomêtrica da quantidade de piridina-2-tiona libertada e era de cerca de 2,6 jumol.

Mercaptopropionato - polilisina modificada 2:

Filtrou-se através de Sephadex G-25 uma solução de 18 mg (cerca de 1,0 pmol) de bromidrato de poli (L) l_i sina (Sigma, marcado com isotiocianato de fluoresceína ( = FITC), peso molecular de cerca de 18000 / correspondente a um grau médio de polimerização de cerca de 90) em 3 ml de fosfato de sõdic 0,1 M (pH 7,8). Diluiu-se a solução de polilisina com ãgua até 7 ml, tratou-se com boa agitação com 270 P¹ de uma solução etanólica 15 mM de SPDP e deixou-se reagir durante 1 h ao abrigo da luz ã temperatura ambiente e com agitação ocasional. Após adição de 0,5 ml de tampão de acetato de sõdio 1 M (pH 5,0) fil. trou-se através de Sephadex G-25 para eliminação das substâncias de baixo peso molecular (eluente : tampão de acetato de sódio • 20 mM, pH 5,0). Concentrou-se sob vãcuo a fracção que continha . o produto (coloração com ninidrina, fluorescência), ajustou-se

a pH 7 aproximadamente com tampão, adicionou-se uma solução de 23 mg (150 pmol) de ditiotreitol em 200 pl de água e deixou-se em repouso durante 1 h à temperatura ambiente sob atmosfera de argon e ao abrigo da luz. Por meio de nova filtração em gel (Se phadex G-25, coluna de 14 x 130 mm, tampão de acetato de sódio 10 mM de pH 5,0) eliminou-se o redutor em excesso e obtiveram-se 3,5 ml de solução do produto de polilisina marcada com fluo rescência com um conteúdo de 3,8 Mol de grupos mercapto (determinação fotométrica por meio de reagente de Ellman's, ãcido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzóico)).

Conjugado de transferrina - polilisina 3:

Purgou-se com argon a solução obtida co mo descrito acima de transferrina modificada 1 (7 ml em tampão de fosfato de sódio 0,1 M de pH 7,8, transferrina cerca de 1,5 umol com resíduos de piridilditiopropionato cerca de 2,6 μΜοΙ); adicionaram-se 2,0 ml da solução acima descrita de polilisina modificada por mercapto 2 (em tampão de acetato de sódio 10 mM de pH 5,0 que corresponde a 0,6 pmol de polilisina com cerca de 2,2 jumol de grupos mercapto), purgou-se com argon, agitou-se e deixou-se reagir durante 18 h ã temperatura ambiente ao abrigo da luz sob atmosfera de argon. Diluiu-se a mistura reaccional com ãgua até 14 ml e separou-se em fracções por cromatografia de permuta iónica (coluna Mono S HR 10/10, Pharmacia, eluição com gradiente, tampão A; HEPES 50 mM de pH 7,9, tampão Β: A + cloreto de sódio 3 M, 0,5 ml/min). A transferrina não conjugada foi eluida no início e as fracções que continham o produto a cerca de 0,66 a 1,5 M de cloreto de sódio. Reuniram-se os produ tos conjugados (coloração de ninidrina em UV a 280 nm de absorção da proteína e fluorescência) em 6 fracções com um conteúdo de 10 mg cada de transferrina. Dialisaram-se as fracções em pri. meiro lugar contra uma solução de citrato de ferro (III) 100 mM (ajustada com hidrogenocarbonato de sódio a pH 7,8) e em seguida mais duas vezes contra tampão HEPES 1 mM (pH 7,5).

Por electoforese em gel de dodecilsulfato de sódio (10% de SDS sm pol iacril amida a 8%) verificou-se com tratamento prévio com • 2-mercaptoetanol em todas as 6 fracções um conteúdo aproximada27

mente igual de transferrina, enquanto que nas amostras não redu zidas não eram visíveis quaisquer bandas de transferrina livre mas apenas uma pequena quantidade de conjugado.

Experiência preliminar 2

Transporte dos conjugados transferrina-polilisina em células v_i vas

A fim de verificar se os conjugados transferrina-polilisina descritos na Experiência preliminar 1 eram absorvidos eficazmente em eritroblastos vivos, marcaram-se estes conjugados com FITC. É sabido (Schmidt et al., 1986) que a transferrina marcada com FITC após algumas horas de incubação com eritroblastos, cuja transferrina tenha sido retirada, é detectável em vesículas no interior das células (observação ao mi croscópio electrónico).

No presente exemplo incubaram-se eritro blastos (transformados por meio de um retrovírus receptor de EGF, Kahazaie et al., 1988) durante 18 horas em meio de diferen ciação isento de transferrina (composição em Zenke et al., 1988) a 37QC (concentração celular 1,5 x 10^/ml). Após adição dos diferentes conjugados transferrina-polilisina (ou, para amostra de comparação, duma quantidade correspondente de água bidestila da estéril) incubaram-se as células a 37QC na presença de 10 ng/ml de EGF (a fim de conservar as condições de transformação).

Apos 24 e 48 horas colheu-se uma amostra de 5 x 10 células, la vou-se uma vez em solução salina fisiológica tamponizada com fosfato (PBS; pH 7,2), fixou-se com um volume de 50 vezes de uma mistura de formaldeído a 3,7% e glutaraldeído a 0,02% em PBS (10 min, 40QC), lavou-se 1 vez em PBS, incorporou-se em elvanol e observou-se num microscópio de fluorescência (Zeiss Axi.o phot, FITC de banda estreita e estimulação com TRITC). simultaneamente determinaram-se numa outra aliquota os diferentes para, metros da velocidade de crescimento das células. Para este fim colheram-se 100 pi da suspensão das células e determinou-se a incorporação de ^JH-timidina (8 pCi/ml, 2 horas), conforme descrito em Leutz et al., 1984. A partir da Figura 10 verifica-se que os eritroblastos incubados com transferrina-polilisina após

horas apresentam 2 a 10 vesículas com uma fluorescência forte que não são visíveis na amostra de comparação. O Quadro A mostra que com excepção da fracção 6 todos os conjugados de pra ticamente todas as células foram incorporados.

O facto de que as células em todas as amostras crescem com a mesma velocidade (como se determinou por 3 meio da integração de timidina tritiada ( H TdR); Quadro A), de monstra que as células não são prejudicadas pelas construções de polilisina e deste modo é de excluir uma absorção inespecífi ca (por exemplo através da membrana celular tornada permeável).

Experiência preliminar 3

As construções de polilisina-transferrji na podem substituir funcionalmente o complexo transferrina-ferre nativo na maturação induzida de eritroblastos de galinha para dar eritrócitos.

O objectivo desta experiência era mostrar que o conjugado transferrina-polilisina aqui usado pode ser usado pelas células como a transferrina nativa, isto é, estas podem efectuar o ciclo normal da transferrina com eficiência análoga. Para sistema de ensaio nesta experiência são especialmente apropriados eritroblastos que podem ser induzidos desligando o oncogene de transformação para darem eritrócitos normais (Beug et al., 1982). A partir da literatura sabe-se que es tas células necessitam para a maturação normal de altas concentrações do complexo transferrina-ferro (100 a 200 pg/ml, concen trações 3 vezes mais baixas inibem a maturação das células e provocam após alguns dias a morte das células (Kowenz et al., 1986). Também foi demonstrado (Schmidt et al., 1986) que a recycling, isto é a recirculação, dos receptores de transferrina θ como consequência um ciclo de transferrina que decorre com uma velocidade óptima é indispensável para uma diferenciação in vitro normal.

Induziu-se a diferenciação dos eritroblastos (transformados por meio do retrovírus do receptor de EGF) por eliminação do EGF e adição de uma quantidade óptima de eritropoietina de qalinha parcialmente purificada (Kowenz et al.

1986, isenta de transferrina). A incubação teve lugar a uma con centração celular de 1 x 10 /ml em meio de diferenciação isento de transferrina a 42QC e 5% de ^No início da incubação adicionou-se complexo transferrina-ferro nativo (Sigma, 100 pl) ou o conjugado transferrina-polilisina saturado de ferro (concentração igualmente 100 pl). Analisaram-se o crescimento e o esta do de maturação das células do modo seguinte após 24 e 48 h:

1. Determinação do número de células (num Coulter Counter, Modelo ZM, Beug et al., 1984)

2. Registo da distribuição dimensional das células (num Coulter-Channelyzer Mod. 256) e

3. Medida fotométrica do conteúdo em hemoglobina das células (Kowenz et al., 1986)

Para além do descrito centrifugaram-se alíquotas da amostra após 72 horas numa citocentrífuga (Shandon) no suporte de amostras e levou-se a efeito uma detecção histoquímica da hemologina (coloração com benzidina neutra e coloração rápida Diff-Quik para células sanguíneas, Beug et al., 1982).

Os resultados do Quadro B mostram nitidamente que as células cuja diferenciação foi induzida na presença da fracção 1 a 5 do conjugado de polilisina-transferrina amadurecem de modo igualmente eficaz e com velocidade igual das que foram incubadas com transferrina-ferro nativo. As células nas amostras de comparação isentas de transferrina mostram pelo contrário um crescimento celular fortemente retardado e acumulam apenas quantidades reduzidas de hemoglobina. A investigação do fenótipo das células em preparados de citospina coloridos mostrou que as células incubadas com o conjugado polilisina-transferrina se tinham tornado durante a maturação em reticulócitos tardios (late reticulocytes, Beug et al., 1982) como as células tratadas com transferrina, enquanto que as células incubadas sem transferrina apresentavam uma mistura de células semelhantes a eritroblastos desintegradas e não amadurecidas (Schmidt et al. , 1986) . Apenas as células tratadas com a fracção 6 de transferrà. na-polilisina apresentam um conteúdo mais reduzido em hemoglobi^ na e uma percentagem mais elevada em células não amadurecidas

(Quadro Β). Este facto mostra que a fracção 6 conjugada com uma quantidade especialmente elevada de polilisina funciona menos bem no ciclo da transferrina. Simultaneamente este resultado in dica a sensibilidade do método de ensaio.

Experiência preliminar 4

Os conjugados de polilisina-transferrina possibilitam a absorção de ADN em eritroblastos de galinha.

Na presente experiência investigou-se se o ADN com uma dimensão correspondente â das ADNt-ribozimas (ver Exemplo 1) pode ser transportado de modo eficaz para o interior das células pelos conjugados de transferrina-polilisina. No presente exemplo usou-se ADNt com uma inserção com a sequência

CGTTAACAAGCTAACGTTGAGGGGCATGATATCGGGCC

CCGGGCAATTGTTCGATTGCAACTCCCCGTACTATAGC;

com um peso molecular de cerca de 300 000 marcado na extremidade com ³²P-ATP (Maniatis). Misturaram-se amostras de cerca de 0,3 pg deste ADN dissolvido em 20 pl de tampão TE com 10 pg de transferrina nativa ou com 10 pg da fracção 3 de conjugado trans ferrina-polilisina em qualquer caso dissolvidos em 50 pl de agua bidestilada mais 400 pg/ml de albumina de soro de bovino (Beug et al., 1982) ou com 50 pl deste solvente sem transferrina. As misturas ADN-proteína foram adicionadas a 2 ml de cada vez de meio de diferenciação isento de transferrina, adicionaram-se 4 x 10^ eritroblastos de galinha, (que tinham sido transformados com um retrovírus de receptor de EGF e foram pré-incubados durante 18 h em meio isento de transferrina na presença de EGF, (Kahazaie et al., 1988) e incubou-se a mistura durante 8 horas a 37QC e 5% de CO₂· Em seguida separaram-se as células por centrifugação, desprezou-se o sobrenadante e lavaram-se as células 3 vezes em meio isento de transferrina. Retomaram-se o sedimento celular e o meio de cultura em SDS a 1%, 1 mg/ml de proteina se K, NaCl 300 mM, tris 20 mM a pH 8,0, EDTA 10 mM (tampão PK/ /SDS), incubou-se durante 30 min a 37SC, extraiu-se com fenol/ /clorofórmio e isolou-se o ADN por precipitação com etanol. Iso

lou-se o ADN isolado com uma radioactividade de 2000 cpm no total num gel de acrilamida a 3,5% não desnaturante (TBE, Maniatis) e detectou-se o ADN por meio de auto-radiografia. A Figura mostra a absorção de fluorescência de eritroblastos de galinha que foram incubados durante 24 h sem (A) ou com conjugado de transferrina-polilisina marcado com FITC (B,C). Por excitação com luz azul (B, para detecção de FITC) é possível reconhecer nitidamente várias vesículas fluorescentes em cada célula. A es pecificidade desta fluorescência foi demonstrada pelo facto de não se verificar fluorescência (C) das vesículas por excitação com luz verde (com a qual se verifica uma fluorescência inespecífica nas células tratadas como em A).

Esta Figura mostra que nas amostras de células tratadas com transferrina-polilisina tinha sido absorvi, do cerca de 5 a 10 vezes mais de ADN das células do que nas amos^ tras de comparação com transferrina nativa ou sem transferrina.

Construiram-se dois genes de ARNt-ribozima, dirigidos contra a região de inicio de tradução de erbB (ver Figs. 2 e 3, Exemplo 1). Digeriram-se com EcoRI cerca de 100 |ig de cada plasmideo que contém cada gene a fim de libertar o gene de ARNt-ribozima de um fragmento de 225 pb. Marcaram-se nas extremidades os produtos da digestão por meio do fragmento de Klenow e purificaram-se por meio de electoforese através de um gel de agarose a 2%/TBE. Localizaram-se por coloração com brometo de etídio o fragmento vector e os fragmentos de gene de ARNt-ribozima, recortaram-se do gel e recuperaram-se por extrac ção com clorofórmio e precipitação com etanol. Utilizaram-se por consequência os fragmentos de ADN marcado por isótopos radioactivos com emprego do sistema de transporte de transferrina -polilisina a fim de determinar a absorção e a inibição do erbB -ARN. Como ADN de comparação usou-se o vector pSPT 18.

Como sistema celular de ensaio escolheu -se uma linha de células de eritroblastos de galinha que é trans_ formada por meio de um mutante sensível à temperatura (ts 34, Graf et al., 1978) do vírus da eritroblastose das aves AEV (Beug et al., 1982 b). (0 oncogene A igualmente expresso nas células pode ser inibido por meio de um inibidor específico da quinase de proteína (H 7). Verificou-se que o oncogene v-erbA é fosfori

lado in vivo e in vitro (isto é, como proteína expressa em bactérias) em dois locais, nomeadamente Ser 28 e Ser29, por meio da quinase de proteína C ou por a quinase de proteína dependente de cAMP. Uma mutação destas serinas para alanina impede a fosforilação e prejudica a actividade do oncogene v-erbA. O in_i bidor H7 é um inibidor específico destas duas quinases e pode suprimir de modo selectivo nos eritroblastos que contêm v-erbA-v-erbB a diferenciação causada por v-erbA (por exemplo bloquea mento da diferenciação)).

É sabido que os eritroblastos cujo onco gene erbB foi inactivado - por exemplo por elevação da temperatura no caso de um mutante erbB sensível ã temperatura - são in duzidos a sofrerem maturação para eritrõcitos. Um dos indícios deste processo é uma indução da síntese de hemoglobina que pode ser detectada por um método sensível (coloração por benzidina em ácido, Orkin et al., 1975, Graf et al., 1978) ao nível das células isoladas. Era portanto de esperar como acção fenotípica de uma ribozima dirigida contra erbB uma elevação específica do número de células positivas em relação ã benzidina.

A série de experiências que serviram de base a este exemplo foi realizada do modo seguinte: Misturaram-se os diferentes preparados de ADN (ver acima e no Quadro C, dissolvidos em 30 P¹ de tampão TE com 10 pg de cada vez de complexo transferrina-ferro do conjugado transferrina-polilisina (dissolvido em 50 Ri de água bidestilada) e incubaram-se durante 30 min a 3 7 SC.

No caso do ADN do vector (10 pg) utilizou-se de modo correspondente uma quantidade superior (100 pg) de preparado de transferrina. Adicionaram-se as misturas ADN-transferrina-ADN a quantidades de 1 ml de meio de diferenciação isento de transferrina (Zenke et al., 1988). Incubaram-se as células de ensaio (por cada ensaio uma quantidade de 3 x 10°) antes da experiência durante 60 min em meio de diferenciação isento de transferrina a 42°C, (com o que se incrementou a absorção de transferrina) e adicionaram-se ãs amostras que continham ADN-transferrina. Após 6 h, 18 h e 68 horas (ver anteriormente tratamento das células) colheram-se amostras conforme dejs crito, separou-se o sobrenadante e o sedimento das células, re33

tomou-se em tampão PK/SDS e analizou-se o ADN (Fig. 9).

Após terminar a incubação (6 h) separaram-se as células por centrifugação e incubaram-se durante mais 72 horas num meio de diferenciação contendo transferrina com eritropeietina e insulina (kowenz et al., 1986, Zenke et al., 1988) , 2 ml por amostra e a 37QC isto ê na ausência de uma v-erb-B-proteína activa.

Obtiveram-se os seguintes resultados:

1. De modo semelhante ao da experiência preliminar 4 foi possjl vel observar uma absorção mais intensa de ADN na dimensão dos sectores ADN’s herdados nas amostras de células tratadas com transferrina-polilisina (cerca de 5 vezes).

2. Por transfecção de fibroblastos de galinha com ADN herdado foi possível demonstrar que nas células de galinha.se expressa o sector ribozima-ADNt herdado (ver Exemplo 5).

3. O Quadro C mostra que em todos os casos em que se introduziu o sector herdado de ribozima-ADNt com o auxílio de cons truções de polilisina-transferrina em eritroblastos transformados por erb B, a percentagem de células positivas em relação à benzidina era significativamente (atê cerca do do bro) mais elevada (para referência serviram as amostras que tinham sido tratadas com vector-ADN e em que a utilização de conjugados polilisina-transferrina não tinha conduzido de modo notável para uma elevação do número de células pos_i tivas em relação ã benzidina).

EXEMPLO 7

O prolongamento da região de haste anticodão faz aumentar o ren dimento em ribARNt

Cortou-se o gene met ARNt (clonado sob a forma de um fragmento BamHI/Rsal, completado por um adaptador EcoRI, no local de corte EcoRI do vector Bluescript) no seu úni. co local Apal na região de haste do aticodão. Eliminou-se a sa. liência em cadeia simples por tratamento com polimerase de ADN 1 T4 e inseriram-se oligonucleótidos que continham as sequências

da ribozima. A inserção da ribozima utilizada nos exemplos ante riores tem como resultado uma molécula de ribARNt que contém uma haste de 3 bases (A Figura 11 mostra o ARNtmet de tipo selvagem e a ARNtrib com a haste do anticodão encurtada). Na segun da construção utilizou-se um oligonucleõtido que se distinguia do primeiro pela sequência GGTTAT complementar da sequência do tipo selvagem na extremidade 5'. Neste caso preparou-se novamen te a haste do tipo selvagem e prolongou-se por meio de 4 pares de bases adicionais (A Figura 12 mostra a construção da ARNtrib com a haste do anticodão reforçada. A sequência das ribozimas é apresentada na Figura 13; na extremidade esquerda (5') encontram -se marcadas as diferenças na sequência nucleotídica entre a re gião que codifica para a haste encurtada e a que codifica para a haste encurtada e a que codifica para a haste prolongada. Na Figura 13 reproduz-se também a. sequência do gene met ARNt).Trans formou-se E. coli HB 101 com os dois produtos de ligação de acoa? do com o método normal descrito por Maniatis, seleccionaram-se clones adequados, isolou-se o plasmídeo e sequenciou-se para de terminação da estrutura correcta. Investigaram-se os dois genes ribARNt resultantes por meio de microinjecção do ADN cionado em oócitos de Xenopus conforme descrito nos Exemplos 2 e 3 na presença de p_ara investigação da respectiva actividade de transcrição e acumulação da molécula de ribARNt. O gene de ARNt de tipo selvagem foi conjugado a uma concentração 10 vezes mais baixa. Incubaram-se os oócitos injectados durante 7 horas a 2QQ C, recolheu-se o ARN resultante (comparar com Exemplo 2) e procedeu-se â separação por electroforese (gel de acrilamida a 10% /ureia 8,3 M/TBE) e visualizou-se a molécula de ADN por auto-ra diografia (2 dias exposta a -70QC) (Figura 14). 0 gene ribARNt encurtado deu cerca de 1/10 da quantidade de ARN que é transcri^ ta pelo gene de tipo selvagem; em comparação o gene que codifica para a molécula de ribARNt com a haste prolongada deu uma quantidade 6 vezes superior de ARN.

EXEflPLO 8

Expressão de genes de ribozimas como componentes de intrões

Seleccionou-se para gene de partida um gene de Xenopus laevis ARNt^tyrC (tipo oócitos), o qual contém um intrão que abrange 13 nucleótidos. A sequência natural do in trão foi modificada como se segue: Em primeiro lugar introduziu -se um local de corte por restrição apropriado (Apal; GGGCCC), a fim de possibilitar uma clonagem subsequente de oligonucleótã^ dos, e em segundo lugar introduziram-se nucleótidos complementa res do tripleto do anticodão para incorporar uma marca estrutural estabilizadora adicional por meio de prolongamento da sequência do intrão. A dimensão do intrão no gene modificado é elevada de 13 nucleótidos para 15 nucleótidos (Fig. 15).

A modificação da sequência do intrão foi efectuada com o auxílio da reacção de cadeia de polimerase (Polimerase chain reaction PCR; Ho et al., 1989). Para este fim sintetizaram-se quatro iniciadores, dos quais dois continham a sequência do intrão modificada (complementar uma em rela ção ã outra) e dois eram dirigidos contra a extremidade 5' ou 3', a fim de introduzir um local de corte por restrição EcoRI ou Sall respectivamente. O gene do tipo selvagem apresenta um fragmento Hhal (258 pb) clonado em pBR327 (Stutz et al., 1989). O produto resultante da PCR foi purificado num gel de agarose, cortado com as enzimas de restrição referidas e ligado com o vec tor pAALM (= pSP64 + promotor T7; Vieira e Messing, 1982). Utilizou-se esta construção para transformar E. coli HB 101 e iden tificaram-se os clones que contêm a inserção pretendida por meio de análise de sequência.

Comparou-se a actividade do gene modifjfc cado (ARNt^tyrM) com a do gene do tipo selvagem por microinjecção em oócitos de Xenopus, tendo sido coinjectado como padrão interno um gene de ARN-5S (concentração 50 vezes mais baixa) que apresentava o plasmídeo pUC-10-5S (Carrol e Brown, 1976) na pre sença de ^32p-GTP. Incubaram-se os oócitos injectados durante 20 horas a 20QC, separou-se o ARN num gel de acrilamida a 8%/ureia 8,3 M/TBE e auto-radiografou-se (Fig. 16). São visíveis para além do ARN-5S a 120 nt o produto transcrito primário de ARNt^^yr a 100 (102) nt e a forma precursora processada 5' e 3' a 90 (92) nt bem como o ARNt processado da tirosina final a 76 nt. O factor limitante é o entrançamento da forma precursora de

nt de tal modo que a maior parte do produto transcrito forma do (cerca de 80%) ocorre nesta forma. Conforme era de esperar, a actividade biológica não foi reduzida pela modificação em com paração com a do gene do tipo selvagem.

Numa outra experiência ensaiou-se a capacidade do sistema. Foram sintetizados dois oligodesoxirribonu cleótidos que contém sequências de ribozimas, os quais contêm já extremidades Apal e deste modo podem ser clonados directamen te na sequência do intrão do gene ARNt^t^^r modificado. Num oligo nucleótido introduziram-se 12 nt em ambas as extremidades a fim de formar hairpins estáveis em ribintrões e deste modo reagir contra a destruição pelas exonucleases. A dimensão global do in trão resultante é de 89 nt (ribozima HP) contra 65 nt no caso da sequência da ribozima não protegida (ribozima C). As sequências das ribozimas bem como o esquema de clonagem são apresenta dos na Figura 17.

Para as microinjecções em oócitos de Xe nopus análogas às anteriormente descritas usou-se para além das duas construções descritas uma terceira que contém a ribozima HP sob forma dimérica e deste modo aumenta a dimensão do intrão de 163 nt (ribozima D). A concentração do padrão 5S coinjectado é de 1 : 20 para as construções HP e D e de 1 : 1 para a construção C (Fig. 18). A experiência demonstra que as construções HP e C apesar dos intrões consideravelmente aumentados são trans critas de forma activa e são processadas com igual eficácia como o gene ARNt^^²⁷ do tipo selvagem. No caso da construção D apenas é detectável uma quantidade mínima de produto transcrito porque provavelmente a estrutura secundária necessária para a formação de um complexo de transcrição de Pol III foi destruída através da longa sequência do intrão.

Foi possível demonstrar que a expressão de ribozimas como intrões de ARNt's não provoca qualquer dano considerável na estrutura secundária do ARNt, pelo que o produto transcrito resultante pode acumular-se em concentração mais elevada e pode ser processado correctamente.

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ω ο -ρ ω <ΰ ι—ι Λ Ο Μ -Ρ Η Ρ Η

d β

	•H
o	Φ
(tí	m
Q	ω
c	α
o	(0
σ	Μ

Ε-ι

I

Φ β •Η ω -Η ΡΙ •Η ι—I Ο CM

Φ

Ό

Φ

-Ρ

Ρ

Ο a

co β

π}

Ρ

Η

++ e +++ indicam a potência relativa da fluorescência das vesículas

A poliLisina-Transferrina pode substituir funcionalmente a transferrina normel na estimulação da maturação induzida in vitro de eritroblastos

Fe-Transferrina, 200 pg em 13 pl; Fracções TfpL, 200 pg em 130 pl; H-O, 130 pl

Maturação (conteúdo em hemoglobina) de eritroblastos transformados por v-erbB que absorveram o ADN de v-erbB - ribozima

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ADN, presente eventualmente sob a forma de múltiplas cópias, que contém segmentos de um gene transcrito pela polimerase III e uma sequência de ADN que codifica para uma molécula de ARN inibidora, caracterizada por conter as unidades de transcrição de um gene de ARNt que são necessárias para a transcrição pela polimerase III, incluindo as sequências determinantes para a estrutura secundária de ARNt, e por a sequência de ADN que codifica para uma molécula de ARN inibidora estar

localizada no a molécula de interior da molécula de ADN de tal modo que ARN inibidora faz parte da transcrição. 2. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a molécula de ARN inibidora ser uma ribozima. 3. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a ribozima ser do tipo hammerhead. 4. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a molécula de ARN inibidora ser um ARN antissentido. 5. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter as unidades de transcrição de um Met-ADNt de iniciação. 6. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter as unidades de transcrição de um

tyr-ADNt.

7. Molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por conter a sequência de ADN que codifica para a molécula de ARN inibidora sob a forma de uma inserção entre o bloco A e o bloco β do gene de ARNt.

8. Molécula de ADN de acordo com as reivindicações 5 ou 7, caracterizada por conter a sequência de ADN que codifica para a molécula de ARN inibidora sob a forma de uma inserção no local natural de corte para a enzima de restrição Apal entre os blocos A e B.

9. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por conter a sequência de ADN que codifica para a molécula de ARN inibidora sob a forma de uma inserção no intrão.

10. Molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizada por conter uma sequência oligonucleotidica de tal modo que a região generatriz de anticodão da transcrição de ARNt é mais longa do que a da transcrição de ARNt de tipo selvagem.

11. Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por conter a sequência de ADN que codifica para a molécula de ARN inibidora sob a forma de uma inserção num local de corte para uma enzima de restrição introduzido artificialmente.

12. Molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 9 a

11, caracterizada por o intrão ser modificado de tal modo que a estrutura secundária do ARNt inicial está estabilizada, sendo conservadas as estruturas determinantes para a ensambladura.

13. Molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 a

12, caracterizada por a molécula de ARN inibidora ser dirigida contra um ARN virai.

L·, U14. Molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada por a molécula de ARN inibidora ser dirigida contra oncogenes ou outros genes chave que controlam o crescimento e/ou a diferenciação das células.

15. Molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por estar presente sob forma de cópias múltiplas, em que subunidades idênticas ou diferentes que contêm sequências de ADN que codificam para uma molécula de ARN inibidora estão presentes sob a forma de unidades de transcrição completas.

16. Processo para a introdução de moléculas de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 a 15 em células eucarióticas superiores, caracterizado por as moléculas de ADN serem modificadas de tal modo que a sua introdução na célula é realizada por endocitose mediada por receptores e por as células serem postas em contacto com as moléculas de ADN.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se complexarem as moléculas de ADN com um conjugado transferrina-policatião e por se porem as células em contacto com este complexo.

18. Utilização das moléculas de ADN definidas numa das reivindicações 1 a 15 caracterizado por se aplicar à inibição de ARN in vivo.

19. Utilização de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se aplicar à inibição de oncogenes ou de outros genes chave que controlam o crescimento e/ou a diferenciação das células.

20. Utilização de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se aplicar à inibição de vírus patogénicos.

21. Utilização de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se aplicar à obtenção de animais transgénicos nos quais a molécula de ADN é transcrita de modo constitutivo.

22. Utilização de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se aplicar à obtenção de plantas transgénicas nas quais a molécula de ADN é expressa de modo constitutivo.

23. Preparação farmacêutica caracterizada por conter como componente activo uma ou várias moléculas de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 a 15.

24. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por se destinar a inibição de ARN virai.

25. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por se destinar a inibição de oncogenes ou de outros genes chave que controlam a velocidade de crescimento das células.

26. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por se destinar a inibição da síntese de produtos genéticos indesejáveis.

27. Preparação farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 23 a 26, caracterizada por conter ainda um conjugado transferrina-policatião que tem capacidade da complexar a molécula de ADN.

28. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por conter um conjugado transferrina-polilisina.

29. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por conter um conjugado transferrina-protamina.