ES2307293T3 - Utilizacion terapeutica de señuelos de elementos en cis in vivo. - Google Patents

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Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA EL USO DE SEÑUELOS DE OLIGODEOXINUCLEOTIDO PARA EL TRATAMIENTO PROFILACTICO O TERAPEUTICO DE TRASTORNOS ASOCIADOS CON LA UNION DE FACTORES DE TRANSCRIPCION ENDOGENA A GENES IMPLICADOS EN EL CRECIMIENTO CELULAR, DIFERENCIACION Y SEÑALIZACION O A GENES VIRALES. MEDIANTE LA INHIBICION DE FACTORES DE TRANS-ACTIVACION ENDOGENOS DE REGIONES REGULADORAS DE TRANSCRIPCION DE UNION, LOS SEÑUELOS MODULAN LA EXPRESION GENETICA Y ASI REGULAN PROCESOS PATOLOGICOS QUE INCLUYEN INFLAMACION, HIPERPLASIA INTIMA, ANGIOGENESIS, NEOPLASIA, RESPUESTAS INMUNES E INFECCION VIRAL. LOS SEÑUELOS SE ADMINISTRAN EN CANTIDADES Y BAJO CONDICIONES DONDE LA UNION DEL FACTOR DE TRANSCRIPCION ENDOGENA AL GEN ENDOGENO ES INHIBIDA COMPETITIVAMENTE DE FORMA EFECTIVA SIN TOXICIDAD DEL HUESPED SIGNIFICATIVA. LAS COMPOSICIONES OBJETO COMPRENDEN LAS MOLECULAS DE SEÑUELO EN UN CONTEXTO QUE PROPORCIONA FARMACOCINETICOS SUFICIENTES PARA USO TERAPEUTICO EFECTIVO.

Description

Utilización terapéutica de señuelos de elementos en cis in vivo.
Introducción Campo técnico
El campo de la presente invención se encuentra en el tratamiento terapéutico de enfermedades con ácidos nucleicos de doble cadena que unen factores de transcripción.
Antecedentes
Una amplia variedad de enfermedades son el resultado de la sobreexpresión o la subexpresión de uno o más genes. Determinadas células pueden producir cantidades insuficientes de una proteína (por ejemplo, la insulina) o demasiadas de otras proteínas, siendo una proteína normal (por ejemplo, el TNF), una proteína mutante (por ejemplo, un oncogén), o una proteína no huésped (por ejemplo, el HIV-TAT). La última meta de la intervención terapéutica en dichas enfermedades es una modulación selectiva de la expresión génica.
Varios procedimientos de modulación transcripcional in vitro se han divulgado incluyendo la utilización de ácidos nucleicos antisentido capaces de unir mensajes nacientes, la inmunización intracelular con mutantes negativos dominantes.
Con las amplias aplicaciones terapéuticas potenciales, se han extendido enormes esfuerzos por parte de destacados laboratorios y clínicas por todo el mundo para extender estos procedimientos in vivo. Hasta el momento, la estrategia del señuelo del factor de transcripción nunca se ha adoptado satisfactoriamente in vivo.
Literatura relevante
La descripción de los roles de los factores de transcripción se pueden encontrar en Nevins, Science 258, 424-429 (1992); Dalton, EMBO J. 11, 11797 (1992); Yee et al. ibid. 6, 2061 (1987), Weintraub et al., Nature 358, 259-261 (1992), Pagano et al., Science 255, 1144-1147 (1992). La proteína de envoltura vírica - liposoma mediada por transfección se describe en Kaneda et al., Science 243, 375 (1989). Ritzenthaler et al. (1991) Biochem. J. 280, 157-162; Ritzenthaler et al (1993) J. Biol. Chem. 268, 13625-13631; Bielinska et al., Science 16, 997-1000 (1990) y Sullenger et al., Cell 63, 601-608 (1990) describen la inhibición de la transcripción con ácidos nucleicos de doble cadena.
Se puede encontrar una discusión general referente al mecanismo de la restenosis en Libby et al., Circulation 86, III-47 (1992) y en Clowes et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 14, S12-15 (1989).
Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona señuelos de ADN de doble cadena para el tratamiento terapéutico de enfermedades asociadas con la unión de factores de transcripción endógenos a genes implicados en la proliferación, diferenciación y señalización celulares, bloqueando la capacidad de los factores de transactivación endógenos para modular la expresión génica y, de ese modo, regular los procesos patológicos que incluyen la restenosis, la hiperplasia intimal, la hiperplasia neoíntimal o la neoplasia, en el que el factor de transcripción se selecciona a partir de los grupos E2F, AP-I, SSRE y TRE.
Los tratamientos comprenden la administración a un paciente de "señuelos" de ácidos nucleicos de doble cadena de manera que los señuelos sean capaces de entrar en las células diana del paciente y unir específicamente un factor de transcripción endógeno, inhibiendo de ese modo de manera competitiva el factor de transcripción desde la unión hasta un gen endógeno. Los señuelos se administran en cantidades y bajo condiciones con los que la unión del factor de transcripción endógeno hacia el gen endógeno se inhibe de manera competitiva con eficacia sin toxicidad significativa para el huésped. Las composiciones sometidas comprenden las moléculas del señuelo en un contexto en el que mantiene la suficiente farmacocinética para su eficaz utilización terapéutica.
Descripción de las realizaciones específicas
Las composiciones se proporcionan para modular la expresión génica in vivo mediante la administración de la composición a un paciente para introducir en una célula diana los señuelos moleculares que comprenden ADN de doble cadena, para que los factores de transcripción endógenos se unan a la célula diana. Son empleados varios procedimientos para la administración in vivo de los señuelos de manera que entren señuelos suficientes en las células dianas para inhibir de manera competitiva el factor de transcripción unido a una zona reguladora génica endógena.
Las composiciones que se emplean comprenden los "señuelos": moléculas de ácido nucleico de doble cadena con una alta afinidad de unión para los factores de transcripción orientados. Los factores de transcripción orientados son proteínas ligadoras de ADN de doble cadena de secuencia específica, endógenas, que modulan (aumentan o disminuyen) el ratio de transcripción de uno o más genes específicos en la célula diana. Esencialmente cualquier dicho factor de transcripción (de ahora en adelante, "factor de transcripción") se puede dirigir siempre que se pueda identificar un señuelo específico capaz de inhibir de manera competitiva la unión hacia el gen endógeno. Son conocidos por la técnica numerosos factores de transcripción y sus secuencias de unión, como también lo son los procedimientos para la identificación de dichos complementos; por ejemplo, ver Wang y Reed (1993) Nature 364, 121 y Wilson et al. (1991) Science 252, 1296. Tal y como se utiliza en la presente invención, endógeno quiere decir que el factor génico o de transcripción está presente en la célula diana a la vez que se introduce el señuelo. Los factores de transcripción y los elementos en cis relacionados, los procesos celulares impactados y la indicación terapéutica incluyen:
1
La longitud, la estructura y la secuencia nucleótida del señuelo variará dependiendo del factor de transcripción orientado, la indicación, la vía de administración, etc. Por ejemplo, los factores de transcripción orientados se unen con frecuencia con diferentes grados de afinidad a varias secuencias, normalmente compartiendo un alto grado de homología. Por lo tanto, uno puede decidir por utilizar una secuencia relacionada con un gen diana particular o por utilizar una secuencia de consenso basada en el nucleótido en cada lugar en que sucede más frecuentemente en las secuencias de unión para que se una el factor de transcripción particular.
Además de la afinidad de la unión, los señuelos también se seleccionan para específicar uniones. Idealmente, los señuelos serán muy específicos para el(los) factor(es) de transcripción tales que se minimizan sus efectos en las células no diana y los procesos metabólicos no orientados de las células diana. Dicha selección se lleva a cabo in vitro mediante uniones comparativas para conocer los factores de transcripción y los fragmentos nucleares y en cultivo e in vivo mediante el ensayo de la función de células no orientadas y los efectos en modelos de células no orientadas.
Los señuelos contienen suficiente secuencia nucleótida para garantizar una especificidad y afinidad suficientes de la unión del factor de transcripción orientado para una eficacia terapéutica. Para la mayor parte, los factores de transcripción orientados requerirán al menos seis pares de bases, habitualmente al menos aproximadamente ocho pares de bases para una especificidad y afinidad de unión suficientes. Con frecuencia, el proporcionar los señuelos con secuencias flanqueantes (comprendidas entre aproximadamente 5 y 50 pares de bases) junto al lugar de unión aumentan la afinidad y/o la especificidad de la unión. En consecuencia, se pueden presentar los elementos en cis flanqueando las zonas y se pueden construir los oligonucleótidos concatenados con repeticiones consecutivas de las secuencias flanqueantes de la unión y/o los elementos en cis.
En una realización, los señuelos son oligonucleótidos no replicativos de menos de 100 pares de bases, habitualmente de menos de 50 pares de bases y habitualmente libres de secuencia codificante, ante todo siendo desde la zona 5' no codificante de un gen. Alternativamente, los señuelos pueden comprender una parte de un gran plásmido, incluyendo los vectores virales, capaces del mantenimiento episomal o la replicación constitutiva en la célula diana para proporcionar términos más largos o exposición intracelular mejorada para la secuencia del señuelo. Los plásmidos se seleccionan en base a la compatibilidad con la célula diana, el tamaño y los lugares de restricción, la frecuencia replicativa, el mantenimiento del número de copias, etc. Por ejemplo, se prefieren los plásmidos con vida media relativamente corta en la célula diana en situaciones donde se desea mantener la modulación transcripcional terapéutica durante menos tiempo que la vida de la célula diana. Ejemplares de plásmidos incluyen vectores de expresión pUC conducidos por un promotor beta-actin y un potenciador CMV, conteniendo los vectores elementos derivados a partir de los potenciadores RVS o SV40, etc. El vector adenoviral se integra de forma preferente en el cromosoma 19 y se puede utilizar la expresión a largo plazo.
Los oligonucleótidos que se emplean pueden estar presentes de forma natural o de una forma diferente a la natural, donde los nucleótidos sintéticos se pueden modificar en una amplia variedad de formas; ver, por ejemplo, Bielinska et al (1990) Science 250, 997. De ese modo, los oxígenos se pueden sustituir por el nitrógeno, el azufre o el carbono; el fósforo se puede sustituir por el carbono; la desoxirribosa se puede sustituir por otros azúcares, o las bases individuales se pueden sustituir por una base no natural. En cada caso, cualquier cambio será evaluado respecto al efecto de la modificación en el enlace del oligonucleótido al factor de transcripción orientado, así como cualquier deterioro de los efectos fisiológicos. Estas modificaciones han encontrado una amplia aplicación para los oligonucleótidos "antisentido", tal y como su seguridad y su mantenimiento de la afinidad de la unión, que se encuentra bien comprobada en la literatura. Ver, por ejemplo, Wagner et al., Science 260, 1510-1513 (1993). Las cadenas se pueden sintetizar según medios convencionales utilizando la síntesis de la fosforamidita, sintetizados automáticos disponibles comercialmente, y similares.
Las composiciones administradas pueden comprender señuelos en forma individual o mezclas de señuelos. Habitualmente, la mezcla no excederá de 4 señuelos diferentes, habitualmente no excederá de 2. Los señuelos se administrarán al huésped en una forma que permita la internalización celular de los señuelos en una cantidad suficiente para inhibir de manera competitiva la unión del factor de transcripción orientado hacia un gen endógeno. El huésped es normalmente un mamífero, habitualmente un humano. El procedimiento de administración seleccionado depende principalmente de la célula diana, la naturaleza del señuelo, el huésped, el tamaño del señuelo. Procedimientos ejemplares se describen en los ejemplos de la presente invención; los procedimientos adicionales que incluyen la transfección con un retrovirus, la proteína - liposoma mediada por transfección de la envoltura vírica, la lipofectina, etc., se describen en Dzau et al., Trends in Biotech 11, 205-210 (1993).
Cuando se administran en liposomas, la concentración de señuelo en el lumen se encontrará generalmente en el rango entre aproximadamente 0,1 \muM y 50 \muM por señuelo, más habitualmente entre aproximadamente 1 \muM y 10 \muM, y mucho más habitualmente a aproximadamente 3 \muM. Mediante otras técnicas, habitualmente uno determinará empíricamente la velocidad de aplicación, utilizando técnicas convencionales para determinar los rangos deseados.
En algunas situaciones se puede desear el proporcionar la fuente del señuelo con un agente que oriente las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana superficial en la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc.
Además, cuando los liposomas están implicados, uno puede desear el incluir proteínas asociadas con la endocitosis, donde las proteínas se unen a una proteína de membrana externa relacionada con la endocitosis. De ese modo, uno puede utilizar proteínas o fragmentos de la cápside del mismo trópico para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en el ciclo, proteínas que orientan la localización intracelular y la mejora de la vida media intracelular.
Las aplicaciones de las terapéuticas sometidas son preferentemente locales, para restringirse a un lugar histológico de interés.
Se pueden utilizar diversas técnicas para proporcionar las composiciones sometidas en el lugar de interés, tal como la inyección, la utilización de catéteres, trocares, proyectiles, gel de pluronic, endoprótesis vasculares, polímeros para la liberación controlada de fármacos u otro dispositivo que proporcione un acceso interno, o similares. Cuando esté accesible un órgano o un tejido debido a que se ha extraído de un paciente, dicho órgano o tejido se puede bañar en un medio que contenga las composiciones sometidas, las composiciones sometidas se pueden pintar sobre el órgano, o se pueden aplicar de cualquier manera conveniente. Alternativamente, se puede practicar la administración sistémica del señuelo utilizando, por ejemplo, la lipofección, los liposomas con orientación de tejido (por ejemplo, un anticuerpo), etc. La administración sistémica es la más aplicable cuando la distribución del factor de transcripción orientado se limita sobre todo a los tipos de célula orientadas.
Los parámetros óptimos del tratamiento variarán con la indicación, el señuelo, el estado clínico, etc., y generalmente se determinan empíricamente, utilizando la orientación que se proporciona en la presente invención.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Experimental Ejemplo 1 Transfección de señuelo del grupo E2F en Células Cultivadas
Para los extractos nucleares, las células musculares lisas vasculares ("VSMCs") se estimularon con suero hasta el confluente. Después del confluente, las células se hicieron quiescentes mediante la colocación en un medio libre de suero durante 48 horas. Después de la transfección con los oligodeoxinucleotidos del señuelo ("ODN"; 14 bases de pares, (números de identificación de la secuencia: 01 y 02)) esencialmente tal y como se describieron en Morishita et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 90, 8474-8479, las células se estimularon mediante un 5% de suero. Después de 6 horas, se extrajo ARN mediante ARNzol (Tel-Test Inc, Texas - USA) Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159. Los niveles de PCNA, cdc2 y beta-actin mARNs se midieron mediante la RT-PCR (Morishita et al. (1993) supra). El iniciador del PCNA (nucleótidos 150-177 de cADN del PCNA de rata) y el iniciador 5' del cdc2 (nucleótidos 54-75 de cADN del cdc2 de humanos) se describieron anteriormente (Morishita et al. (1993) supra). Los iniciadores complementarios para el gen beta-actin de rata se obtuvieron a partir de Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, California - USA). Las alícuotas de ARN se amplificaron de manera simultánea mediante la PCR (30 ciclos) y se compararon con un control negativo (iniciadores sin ARN). Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio. Se realizó un ensayo de retardo en gel tal y como se describió anteriormente (Horiuchi et al., J. Biol. Chem. 266. 16247-16254
(1991).
El ODN de doble cadena de 14 pares de bases (números de identificación de la secuencia: 01 y 02) suprimieron con eficacia la unión del factor de transcripción del grupo E2F hacia un lugar de unión específica en el VSMCs estimulado con suero. Ver también Hiebert et al. (1989) PNAS 86, 3594. La transfección con el señuelo ODN del grupo E2F inhibió notablemente la inducción de c-myc, cdc2 y la expresión mARN del PCNA en respuesta a la estimulación del suero. El señuelo ODN del grupo E2F no tenía efecto en la expresión beta-actin mARN. Además, el elemento ODN del grupo E2F de sentido erróneo de control que contiene dos sustituciones de pares de bases que eliminan el enlace del grupo E2F no inhibió la inducción de la expresión del ARN de c-myc, cdc2 y PCNA en respuesta a la estimulación del suero. En relación con la inhibición eficaz de la expresión génica reguladora del ciclo celular, la transfección con el señuelo del grupo E2F de 14 pares de bases también suprimió la proliferación del VSMC estimulado con suero. En contraste, el elemento ODN del grupo E2F de sentido erróneo (números de identificación de la secuencia: 3 y 4) no tienen efecto en la mitogenesis inducida por el suero.
Para confirmar además la especificidad de esta respuesta al señuelo del grupo E2F, se empleó un ODN de doble cadena de 30 pares de bases (números de identificación de la secuencia: 05 y 06) que contenían dos elementos en cis del grupo E2F de 8 pares de bases capaces de la unión específica al grupo E2F (Weintraub et al., Nature 358, 259-261 (1992)). En el señuelo del grupo E2F de 30 pares de bases del quinto nucleótido de los elementos en cis del grupo E2F de 8 pares de bases se cambiaron desde C hasta G. A pesar de estas diferencias en las secuencias flanqueantes y la composición del nucleótido, ambos señuelos del grupo E2F unen con eficacia el grupo E2F e inhiben la proliferación de la célula muscular lisa vascular (VSMC) estimulada por suero. Además, un elemento ODN del grupo E2F de sentido erróneo de 30 pares de bases (números de identificación de la secuencia: 07 y 08) con substituciones de 5 pares de bases con los elementos de consenso del grupo E2F de 8 pares de bases no pudo unir el grupo E2F y también no pudo inhibir la proliferación de la VSMC estimulada por suero. De ese modo, estos estudios in vitro documentaron que la transfección con el señuelo ODN del elemento en cis del grupo E2F une el factor de la transcripción del grupo E2F, bloqueado la inducción de la expresión génica reguladora del ciclo celular e inhibiendo la proliferación VSMC de una forma específica de la secuencia.
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Ejemplo 2 Señuelos del grupo E2F In Vivo
Los liposomas se prepararon como sigue: la fosfatidilserina, la fosfatidilcolina, y el colesterol se mezclaron con una relación de peso (1:4,8:2) para crear una mezcla de lípido. El lípido se hidrató en una solución de sal equilibrada que contenía ODN (números de identificación de la secuencia: 01 y 02) (110 nmol). El HVJ (cepa Z) purificado se inactivó mediante radiación ultravioleta momentos antes de su utilización. La suspensión del liposoma se mezcló con el HVJ (cepa Z) (20.000 unidades hemaglutinantes), se incubó, y después se eliminó el HVJ libre mediante la centrifugación por gradiente de densidad de la sucrosa. La concentración final del ADN encapsulado se calculó según lo divulgado anteriormente (Morishita et al. (1993) supra). Este procedimiento da lugar a una absorción celular y a una concentración nuclear más rápida, llevando a una eficacia de la transfección con el ODN cien veces más alta que la lipofección o procedimientos pasivos de absorción.
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Las secuencias del ODN fosforotioato utilizaron:
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También examinamos otro juego de señuelos ODNs que contenían dos lugares de unión:
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El VSMC de la aorta de rata (paso 4 - 10) se estudió en un estado confluente y quiescente en un medio libre de suero (Morishita et al, J. Clin. Invest. 91, 2580-2585 (1993)). Las células se incubaron con los liposomas del virus hemaglutinante de liposoma de Japón (HVJ) (3 \muM) a 4ºC durante 5 minutos y a 37ºC durante 30 minutos. Tres días después de la transfección en el suero bovino (CS) o en el medio libre de suero, se determinó el número de células mediante un Contador Hematológico Coulter (Coulter, Florida - USA).
Ejemplo 3 Efecto del señuelo ODN en la expresión génica in vivo
Un catéter Fogarty de 2 French se utilizó para inducir la lesión vascular en las ratas Sprague-Dawley macho (400 - 500 g; Laboratorios Charles River Breeding) (Hanke et al., Circ. Res. 67, 651-659 (1990)). Estas ratas se anestesiaron, y se introdujo una cánula en la carótida común izquierda mediante la arteria carótida externa. Después de la lesión vascular de la carótida común, el segmento distal dañado se aisló transitoriamente mediante ligaduras temporales. El complejo del HVJ se infundió en el segmento y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. No se observaron efectos neurológicos o vasculares adversos en ningún animal que experimentaba este procedimiento.
Para el análisis del ARN, los vasos se cultivaron durante 6 horas (c-myc y beta-actin) y un día (cdc2 quinasa, PCNA y beta-actin) después de la transfección. Se extrajo el ARN de los vasos intactos dañados o no tratados con el señuelo ODN mal apareado o del señuelo ODN del grupo E2F (3 \muM) mediante ARNzol (Tel-Test Inc., Texas - USA). Se llevó a cabo la RT-PCR tal y como se describió anteriormente. Para la tinción con BrdU, se inyectó la BrdU en las ratas (100 mg/kg subcutáneamente y 30 mg/kg intraperitonealmente en las 18 horas previas, y entonces 30 mg/kg intraperitonealmente en las 12 horas previas al sacrificio (Hanke et al., supra)). Las ratas se sacrificaron después del día cuatro después de la transfección. Se eliminó la arteria carótida después de la perfusión - fijación con paraformaldehido al 4%, y se procesó mediante inmunohistoquímica de una manera estándar utilizando anticuerpos anti-BrdU (Amersham). La proporción de células positivas de la BrdU se determinó mediante recuento celular bajo microscopia óptica en un diseño experimental ciego.
Los procedimientos de transfección se describieron anteriormente. El complejo HVJ - ODN (3 \muM) se administró en las arterias carótidas dañadas de rata. Dos semanas después de la transfección, se sacrificaron las ratas y se fijaron los vasos por perfusión con paraformaldehido al 4%. Se analizaron tres secciones individuales del centro de los segmentos transfectados. Además, también se analizaron tres secciones de la sección central de la zona no transfectada dañada. Los animales se codificaron para que la operación y el análisis se realizaran sin conocer el tratamiento que recibieron cada uno de los animales. Se midieron las áreas íntimal y medial en una tabla de digitalización (Southern Micro Instruments, Georgia - USA). Se utilizó el análisis de la varianza con la posterior prueba de Duncan para determinar las diferencias significativas en múltiples comparaciones. Un P < 0,05 se consideró significativo.
Las secuencias de señuelos se secuencia aleatoria y del elemento de respuesta a progestágenos (PRE) utilizados como control de los ODNs son tal y como sigue:
5
Un día después de la lesión con balón, los niveles de mARN de c-myc, cdc2 y PCNA se elevaron en los vasos carotídeos transfectados con el elemento ODN del grupo E2F de sentido erróneo de control tal y como se detectó mediante la RT-PCR. Sin embargo, la transfección in vivo del señuelo ODN del elemento en cis del grupo E2F dio lugar a una disminución marcada en niveles de mARN de c-myc, cdc2 y PCNA hasta unos niveles apenas perceptibles similares a los de los vasos ilesos. Además, los señuelos del elemento en cis del grupo E2F inhibieron significativamente la incorporación de la bromodeoxiuridina (BrdU) (un marcador de la síntesis del ADN) dentro de la pared del vaso 4 días después de la lesión tal y como se comparó con el material del ODN del grupo E2F de sentido erróneo. Además, la transfección con el señuelo ODN del grupo E2F (n = 8) dio lugar a una marcada supresión de la formación de neoíntima dos semanas después de la angioplastia en comparación con los vasos tratados sólo con el complejo
HVJ - liposoma (n = 5) o los vasos tratados con el señuelo ODN de control de secuencia aleatoria (n = 8). La selectividad del efecto del señuelo ODN se confirmó además por el hecho de que la inhibición de la formación de neoíntima se limitó al área de la transfección intraluminal (ratio neoíntima/medial; lesiones transfectadas = 0,291 \pm 0,061 frente a lesiones no transfectadas = 1,117 \pm 0,138, P < 0,01). En cambio, los segmentos carotídeos dañados adyacentes fuera del área de transfección con el señuelo exhibieron lesiones neoíntimales similares al control tratado con ODN mal apareado. Además, en la inhibición de la formación de neoíntima no se produjo ni la transfección de los señuelos de secuencia aleatoria (14 pares de bases) ni los señuelos del elemento de respuesta a progestágenos (27 pares de bases) (Klein-Hitpass et al., Cell 60, 247-257 (1990)).
La especificidad del efecto inhibitorio del señuelo ODN contra el grupo E2F sobre la formación de neoíntima se sostiene mediante varias líneas de evidencia: (1) los dos señuelos ODN del grupo E2F diferentes se unen al factor de transcripción del grupo E2F de una forma específica de la secuencia y la transfección con el señuelo ODN del grupo E2F inhibió totalmente la proliferación de la VSMC in vitro, mientras que el ODN mal apareado no lo hizo; (2) los experimentos in vitro e in vivo documentaron que el señuelo ODN del grupo E2F inhibió selectivamente la expresión de los genes reguladores del ciclo celular orientado (c-myc, PCNA y cdc2 quinasa) transactivado mediante el grupo E2F, pero no mediante beta-actin (probablemente, se pudieron inhibir otros genes transactivados del grupo E2F tales como el c-myb); (3) el señuelo ODN del grupo E2F redujo específicamente un marcador cuantitativo de la progresión del ciclo celular in vivo (marcaje con BrdU); (4) la administración del señuelo ODN, pero no el mal apareado, del grupo E2F inhibió notablemente la formación de neoíntima; (5) la prevención de la formación de neoíntima se limitó al área transfectada con el señuelo ODN; y (6) ni los señuelos de secuencia aleatoria ni los señuelos del elemento en cis del PRE inhibieron la formación de neoíntima.
Ejemplo 4 Expresión de Renina en Glándula Submandibular (SMG) Cultivada Línea Celular
Para evaluar los mecanismos moleculares que regulan la expresión génica de la renina específica del tejido, empleamos una línea celular (SCA-9) derivada de un tumor de la SMG. Esta línea, derivada a partir de un gen de ratón de dos reninas (Swiss Webster) se ha divulgado por contener renina. Utilizando la inmunohistoquímica y el análisis por extensión con iniciadores, confirmamos mediante la inmunohistoquímica que esta línea celular expresa la renina. Además, como consecuencia del origen de la SMG de esta línea celular, solamente se transcribe el gen Ren2. Para aclarar el mecanismo detrás del silenciamiento del gen Ren1 en esta línea celular, examinamos si el elemento de la respuesta negativa, el NRE, la proteína ligadora estaba presente en estas células. Los extractos nucleares se prepararon a partir de las células cultivadas de la SMG y el ensayo de retardo en gel se realizó utilizando el oligonucleótido ^{32}P-NRE como prueba. Una proteína específica: el complejo de ADN se observó que se podría competir específicamente con el oligonucleótido del NRE no marcado.
Estos resultados muestran que el patrón de la expresión de renina en esta línea de células es similar al considerado en la SMG in vivo; se validan la utilización de estas células para los estudios del mecanismo por el cual se regula la expresión de renina.
Ejemplo 5 Utilización del "Señuelo" para Validar la Importancia de las Interacciones Cis - Trans
Examinamos la viabilidad del enfoque "señuelo" para ensayar si la interacción de la proteína ligadora del NRE:NRE es responsable del silenciamiento del gen Ren1 en la SMG y en la línea celular derivada de la SMG. Este ensayo se basa en la competición in vivo para los factores de actuación en trans. La competición se encuentra entre los elementos en cis endógenos que se encuentran en el gen diana y los oligonucleótidos agregados de manera exógena que se corresponden con esa secuencia cis. Esta competición atenuará la auténtica interacción cis - trans, dando lugar a la eliminación de los factores trans del elemento cis, con la posterior modulación de la expresión génica.
Un oligonucleótido de doble cadena marcadas con FITC (33 mer), que corresponde al NRE, se introdujo en la línea celular de la SMG utilizando la tecnología del HVJ - liposoma. Las células se incubaron con el HVJ - liposoma que contenía el señuelo del NRE a 4ºC durante 10 minutos y después a 37ºC durante 30 minutos. Las células aceptaron inmediatamente los oligómeros según lo evidenciado por la intensa señal fluorescente que se localizó en el núcleo (Figura 1C). Las células se cosecharon 24 horas más tarde, se preparó el ARN y se sometió al análisis por extensión con iniciadores para examinar la expresión de los genes Ren1 y Ren2. Consecuentes con nuestra hipótesis, la introducción de las secuencias del NRE en estas células dio lugar a la inducción de la expresión del gen Ren1. La expresión del gen Ren2 no se vio influenciada por la administración del oligonucleótido del NRE.
Estos resultados muestran que la interacción de la proteína ligadora del NRE:NRE es responsable de silenciar la expresión Ren1 en esta línea celular y demuestra la viabilidad de usar el enfoque del "señuelo" para examinar las interacciones cis - trans responsables de la regulación de la expresión génica de la renina.
Ejemplo 6 Transferencia Génica in vivo en la SMG
Transfectamos 10 \mug de nuestros vectores de expresión en la SMG de un ratón DBA/2J utilizando el complejo HVI - Liposoma - ADN tal y como se describió anteriormente. Ello se consiguió inyectando directamente en las zonas múltiples de la glándula con un volumen total de 100 \mul utilizando una aguja de calibre 27. Tres días después de la transfección, se eliminó la SMG, se homogeneizó, y el sobrenadante se ensayó para la actividad CAT. La transfección con el pUtk-CAT dirigió la expresión de CAT (Horiuchi et al. (1991) supra). La presencia del fragmento Ren1 Xba (que contiene la zona CRE/NRE) disminuyó la expresión CAT aproximadamente el 90%. La supresión de la secuencia del NRE mediante mutagenesis in vitro dio lugar a la recuperación de la expresión CAT. Estos resultados demuestran que es posible utilizar transferencia génica in vivo para examinar la expresión génica en la SMG in vivo.
Es evidente a partir de los anteriores resultados, que los procedimientos y las composiciones sometidas proporcionan oportunidades para prevenir la lesión a partir de las enfermedades proliferativas agudas o las enfermedades que implican la expresión de proteínas, tales como las proteínas asociadas con la división, la adhesión y/o la migración celulares. De ese modo, los procedimientos y las composiciones sometidas pueden proporcionar tratamientos profilácticos y terapéuticos seguros para un número de enfermedades asociadas con la proliferación y la inflamación celulares, que se traduce en condiciones patógenas.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción La lista de referencias citadas por el Solicitante está únicamente para comodidad del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. A pesar del gran cuidado que se ha llevado en recopilar las referencias, los errores o las omisiones no pueden ser excluidos y la Oficina de Patentes Europeas niega toda responsabilidad en esta consideración. 
\vskip1.000000\baselineskip
Documentos de la patente citados en la descripción
\bullet EP 95900450 A [0044]
\vskip1.000000\baselineskip
Literatura no patente citada en la descripción
\bulletNEVINS. Science, 1992, volumen 258, 424-429 [0005]
\bulletDALTON. EMBO J., 1992, volumen 11, 11797 [0005]
\bulletYEE et al. EMBO J., 1987, volumen 6, 2061 [0005]
\bulletWEINTRAUB et al. Nature, 1992, volumen 358, 259-261 [0005] [0026]
\bulletPAGANO et al. Science, 1992, volumen 255, 1144-1147 [0005]
\bulletKANEDA et al. Science, 1989, volumen 243, 375 [0005]
\bulletRITZENTHALER et al. Biochem. J., 1991, volumen 280, 157-162 [0005]
\bulletRITZENTHALER et al. J. BioL Chem., 1993, volumen 268, 13625-13631 [0005]
\bulletBIELINSKA et al. Science, 1990, volumen 16, 997-1000 [0005]
\bulletSULLENGER et al. Cell, 1990, volumen 63, 601-608 [0005]
\bulletLIBBY et al. Circulation, 1992, volumen 86, III-47 [0006]
\bulletCLOWES et al. J. Cardiovasc. Pharmacol., 1989, volumen 14, 12-15 [0006]
\bulletWANG; REED. Nature, 1993, volumen 364, 121 [0010]
\bulletWILSON et al. Science, 1991, volumen 252, 1296 [0010]
\bulletBIELINSKA et al. Science, 1990, volumen 250, 997 [0015]
\bulletWAGNER et al. Science, 1993, volumen 260, 1510-1513 [0015]
\bulletDZAU et al. Trends in Biotech, 1993, volumen 11, 205-210 [0016]
\bulletMORISHITA et al. Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 1993, volumen 90, 8474-8479 [0024]
\bulletCHOMCZYNSKI; SACCHI. Anal. Biochem., 1987, volumen 162, 156-159 [0024]
\bulletHORIUCHI et al. J. Biol. Chem., 1991, volumen 266, 16247-16254 [0024]
\bulletHIEBERT et al. PNAS, 1989, volumen 86, 3594 [0025]
\bulletMORISHITA et al. J. Clin. Invest., 1993, volumen 91, 2580-2585 [0030]
\bulletHANKE et al. Circ. Res., 1990, volumen 67, 651-659 [0031]
\bulletKLEIN-HITPASS et al. Cell, 1990, volumen 60, 247-257 [0035]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Dzau, Víctor J.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 110 Dudley Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Newton
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (CP): 02159
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Utilización terapéutica de señuelos de elementos en cis in vivo 
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FÓRMULA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATO DE LA SOLICITUD VIGENTE:
\vskip0.800000\baselineskip
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95900450.8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGATTTCC CGCG 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCGCGGG AAAT 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGATTTCG AGCG 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCGCTCG AAAT 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCAAAAGC GCGAATCAAA AGCGCGAATC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTCGCGCT TTTGATTCGC GCTTTTGATC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCAAAGAA CTGAATCAAA GAACTGAATC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTCAGTTC TTTGATTCAG TTCTTTGATC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCAGCTTCG TAGC 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTAGCTAGG AAG 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCTGTAC AGGATGTTCT AGCTACA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTAGCTAGA ACATCCTGTA CAGGATC 
\hfill
27

Claims (9)

1. Utilización de ADN de doble cadena que tiene una secuencia específica para la unión de un factor de transcripción que modula la transcripción de al menos un gen en la preparación de un medicamento para modular la transcripción génica in vivo dentro de células de mamíferos mediante la introducción de dicho ADN de doble cadena en el núcleo de dichas células en una cantidad suficiente para inhibir de manera competitiva la unión de dicho factor de transcripción a dicho gen y, de ese modo, tratar profilácticamente o terapéuticamente una condición que requiere la inhibición de la restenosis, la hiperplasia intimal, la hiperplasia neoíntimal o la neoplasia, en el que dicho factor de transcripción se selecciona a partir de E2F, AP-I, SSRE y TRE.
2. Utilización de la Reivindicación 1, en el que dicho ADN de doble cadena es capaz de una replicación episomal en dicha célula.
3. Utilización de la Reivindicación 1, en el que dicho ADN de doble cadena consiste en oligonucleótidos de menos de 100 pares de bases de longitud.
4. Utilización según cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2 y 3, en el que dicho medicamento comprende además liposomas, y dicho ADN de doble cadena está contenido dentro del lumen de dichos liposomas.
5. Utilización de la Reivindicación 4, en el que la concentración del ADN de doble cadena en el lumen se encuentra en el rango de 0,1 a 50 \muM.
6. Utilización de la Reivindicación 5, en el que dichos liposomas comprenden un lípido y una proteína de la envoltura vírica.
7. Utilización de la Reivindicación 6, en el que dicha envoltura vírica proviene del virus hemaglutinante del Japón.
8. Utilización según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el que dichas células son células musculares lisas vasculares en el lugar de una lesión vascular y el medicamento se encuentra para prevenir la restenosis.
9. Utilización según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el que dichas células son capaces de conducir a una restenosis como resultado de una formación de neoíntima, y es necesario el producto de transcripción de dicho gen para la proliferación celular.
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