WO2006043722A1 - キメラ（ダブル）デコイ - Google Patents

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WO2006043722A1
WO2006043722A1 PCT/JP2005/019742 JP2005019742W WO2006043722A1 WO 2006043722 A1 WO2006043722 A1 WO 2006043722A1 JP 2005019742 W JP2005019742 W JP 2005019742W WO 2006043722 A1 WO2006043722 A1 WO 2006043722A1
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Ryuichi Morishita
Toshio Ogihara
Motokuni Aoki
Takashi Miyake
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    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid

Definitions

  • the present invention relates to a decoy comprising an oligonucleotide having a plurality of sequences to which a transcriptional regulatory factor binds and a method for using the decoy. More specifically, the present invention relates to a chimeric (double) decoy oligonucleotide and a method of using the same.
  • vascular occlusion may occur after one month after surgery. This occlusion is mainly due to the thickening of the vascular intima at the anastomosis. By suppressing the thickening, it becomes possible to use artificial blood vessels for long-term preservation of the graft and for revascularization of the lower knee.
  • the main cause of the thickening of the intima of the artificial blood vessel anastomosis is that cell proliferation is activated by an inflammatory reaction occurring in the anastomosis. Therefore, it is considered that thickening can be suppressed by inhibiting this cell growth.
  • Gene therapy methods that control cell proliferation have also been developed. For example, by suppressing the function of E2F, a transcriptional regulator that plays an important role in cell proliferation, with decoy nucleic acid, proliferation of the vascular media can be suppressed.
  • JP-B 3392143 discloses an anticancer agent using an E2F decoy nucleic acid.
  • W095 / 11687 discloses that cell growth can be suppressed using E2F decoy nucleic acid.
  • JP-A (W) 2002-515514 discloses a method of using ICAM-1 antisense as a skin external preparation, which may be a DNA: RNA or RNA: RNA chimera structure. There are no specific examples of chimera decoys, including cited examples. It also discloses an invention relating to the transdermal delivery of antisense.
  • US-A 2003-176376 shows that bcl-2 antisense and CRE decoy hypermolecules can treat diseases caused by abnormal cell proliferation such as cancer.
  • JP-A 2002-193813 shows that the chimera decoy of NF-/ c B and Ets suppresses the increase of the aortic area in the aortic aneurysm model. Disclosure of the invention
  • JP-A (W) 2002-515514 did not describe any specific therapeutic effect, and its applicability to various diseases was completely unknown.
  • JP-A 2002-193813 was unclear as to its usefulness in diseases other than the above.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a drug containing decoy nucleic acid as an active ingredient and simultaneously suppressing inflammation and cell proliferation.
  • the present inventors Since the thickening of the intima of the anastomosis is caused by inflammatory cell infiltration, smooth muscle cell proliferation, and migration due to inflammation of the blood vessel wall, the present inventors have developed a drug that simultaneously controls them with a single molecule. Was considered effective.
  • a decoy is a double-stranded oligonucleotide having a nucleic acid sequence to which a transcriptional regulatory factor binds, and competes with other nucleic acid sequences to which the transcriptional regulatory factor binds and acts as a decoy.
  • the decoy may be DNA or RNA, but DNA is more preferred. In this specification, decoy, decoy oligonucleotide, and decoy 0DN are used interchangeably.
  • the gist is
  • the chimeric decoy comprises DNA or RNA oligonucleotides
  • At least one transcription factor binding sequence of the chimeric decoy is a binding sequence of NF- ⁇ , E2F, GATA-3, STAT-1, STAT-6, Ets, AP-1 (1) to (4)
  • GGGRHTYYHC (wherein R represents A or G, Y represents C or T, and H represents A, C or T) (1) ⁇
  • the E2F binding sequence in the chimeric decoy is TTTSSCGS (where S is G or C Decoy according to any one of (1) to (5),
  • the GATA-3 binding sequence in the chimeric decoy is WGATAR (W is A or T and R is A or G, respectively).
  • the AP-1 binding sequence in the chimeric decoy is TGASTMA (wherein S represents G or C, and M represents A or C, respectively) (1) to (5) Decoy,
  • N (m) is the 5 'end additional sequence
  • N (s) is the spacer
  • N (n) is the 3' end additional sequence
  • consensus 2 is the transcription regulator binding sequence.
  • m, s, n are independently from, respectively therewith an integer of 0 or. 1 to 20.
  • n denotes G, T or C n nucleotides.
  • Consensus 1 and / or Consensus 2 is GGGRHTYYHC (where R means A or G, Y means C or T, H means A, C or T), TTTSSCGS (where S is WGATAR (W means A or T, R means A or G), TTCNNNGAA (where N means A, G, T or C), TTCNNNNGAA (Where N means A, G, T or C), MGGAW (where M means A or C, W means A or T, respectively), TGASTMA (where S is G or C) , M means A or C respectively) Force is a selected sequence (1) to
  • Consensus 1 hopping / or consensus 2 is GGGATTTCCC
  • GGGACTTTCC a sequence selected from TTTCCCGC, AGATAG, TTCCGGGAA, TTCCCAAGAA, CGGAA, TGAGTCA (1) to (22)
  • a pharmaceutical composition comprising the decoy according to any one of (1) to (36),
  • Vascular restenosis comprising the decoy according to any one of (1) to (37), acute coronary syndrome, cerebral ischemia, myocardial infarction, reperfusion injury of ischemic disease, complete topy dermatitis, vulgaris Psoriasis, contact dermatitis, keloid, sores, ulcerative colitis, Crohn's disease, nephropathy, glomerulosclerosis, albuminuria, nephritis, renal failure, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, asthma, chronic Prevention, improvement, treatment of obstructive pulmonary disease (C0PD),
  • C0PD obstructive pulmonary disease
  • PTCA percutaneous coronary angioplasty
  • acupuncture percutaneous angioplasty
  • bypass surgery organ transplant or storage device
  • organ transplant or storage device comprising the decoy according to any one of (1) to (37)
  • Prevention, improvement, treatment of vascular restenosis that occurs after surgery (41)
  • Prevention or improvement comprising the decoy according to any one of (1) to (37), wherein the restenosis of the blood vessel is restenosis caused by the use of an artificial blood vessel, a catheter, a stent, or a vein graft
  • the therapeutic agent
  • the decoy according to any one of (1) to (3 7) is added to ischemic disease, allergic disease, inflammatory disease, autoimmune disease, cancer metastasis or invasion (cancer metastasis / invasion) Or use for the manufacture of a preventive, ameliorating or therapeutic agent for cachexia,
  • the chimeric decoy of the present invention is a nucleic acid drug characterized by simultaneously inhibiting a plurality of transcriptional regulatory factors with one molecule.
  • This chimeric decoy can be used for, for example, ischemic disease, allergic disease, inflammatory disease, autoimmune disease, cancer metastasis or invasion (cancer metastasis / invasion) or cachexia. More preferably, PTCA (percutaneous coronary angioplasty), PTA (percutaneous angioplasty) used for surgical treatment for obstructive arteriosclerosis, aneurysm, aortic divergence, Marfan syndrome, and Praburacia Can be used for restenosis after bypass surgery.
  • PTCA percutaneous coronary angioplasty
  • PTA percutaneous angioplasty
  • the present invention provides a decoy nucleic acid [chimeric (double) decoy] having a plurality of transcription regulatory factor binding sequences in one molecule and a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient.
  • a chimeric decoy is a decoy having two or more transcriptional regulatory factor binding sequences
  • a double decoy is a decoy having two transcriptional regulatory factor binding sequences. Therefore, double decoy is included in the concept of chimeric decoy.
  • the decoy of the present invention has a power that can give decoys such as NF- ⁇ B STAT-1, GATA-3, STAT_6, AP-1, Ets, E2F, etc. It is a suitable target.
  • NF- / c B binding sequence is selected from consensus sequence GGGRHTYYHC (R (A, G); Y (C, T); H (A, C, T)) (SEQ ID NO: 2), and E2F binding sequence is consensus sequence
  • a chimeric decoy can be created by selecting from TTTSSCGS (S (G, C)) (SEQ ID NO: 3) and combining them.
  • chimera decoys include GAGATTTCCC (SEQ ID NO: 9) of NF- ⁇ and GAAGGGATTTCCCTCCATTTCCCGCGGA (SEQ ID NO: 1) (NF- ⁇ , E2F chimera decoy) using TTTCCCGC (SEQ ID NO: 11) of E2F as a core sequence. Power to be mentioned Not limited to this.
  • GATA-3 consensus sequence WGATAR W (A, T); R (A, G)) (SEQ ID NO: 4), STAT-1 consensus sequence TTCNNNGAA (N (A, G, T, 0) (SEQ ID NO: 5), STAT-6 consensus sequence TTCNNNNGAA (N (A, G, T, C)) (SEQ ID NO: 6), Ets consensus sequence MGGAW ((M (A, C); W (A, T)) (sequence No. 7), AP-1 consensus sequence TGASTMA
  • S (G, C); M (A ; 0) SEQ ID NO: 8
  • GGGACTTTCC SEQ ID NO: 10
  • GATA- 3 binding sequence AGATAG SEQ ID NO: 12
  • Ets binding sequence CGGM SEQ ID NO: 15
  • AP -1 binding sequence TGAGTCA SEQ ID NO: 16
  • the chimeric decoy according to the present invention can also be defined by the following formula.
  • N (m) is the 5 'end additional sequence
  • N (s) is the spacer
  • N (n) is the 3' end additional sequence.
  • Consensus 2 is the transcription factor binding sequence.
  • M, s, and n each independently represent 0 or an integer of 1 to 20.
  • N represents nucleotide A, G, T, or C.
  • DNA or RNA oligonucleotide can be usually used, but double-stranded DNA is more preferable.
  • oligonucleotides containing these complements, mutants thereof, or compounds containing these in the molecule can also be used. These oligonucleotides may contain a modified nucleic acid and / or a pseudo-nucleic acid.
  • nucleic acid drugs include double-stranded oligonucleotides containing two or more of the above nucleic acid sequences or variants thereof.
  • the chimeric decoy according to the present invention can be produced by a conventional method such as a DNA synthesizer.
  • the dose of the chimeric decoy according to the present invention varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, etc., but is generally 0.1 to 1000. Preferably 1 ⁇
  • decoy solution is introduced into the treatment site by, for example, cannulation.
  • cannulation it is possible to administer usually 0.1 to 10, OOOnmoL, preferably 1 to 1,000 nmol, more preferably 10 to 100 nmol per adult day.
  • the decoy nucleic acid solution is usually introduced under a pressure of 25 to 250 mmHg. It is preferably introduced under a pressure of 50 to 200 mmHg, more preferably 100 to 175 mmHg.
  • Vascular restenosis based on the inhibitory action of multiple transcriptional regulators, ischemic disease, allergic disease, inflammatory disease, autoimmune disease, cancer metastasis or invasion (cancer metastasis or infiltration) or cachexia prevention, Provide improvement and therapeutic drugs.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of vascular smooth muscle cell proliferation assay. (In the figure, one PDGF means normal (no PDGF stimulation). The same shall apply hereinafter.)
  • FIG. 2 is a graph showing the results of the vascular endothelial cell proliferation assay.
  • FIG. 3 is a photomicrograph of cells after vascular smooth muscle cell migration assembly. (Magnification X 4 0 0)
  • FIG. 4 is a graph showing the results of vascular smooth muscle cell migration assay.
  • Fig. 5 is a graph comparing the efficiency of decoy 0DN introduction into the rabbit wall.
  • Fig. 6 is a photomicrograph of the distal anastomosis of the Usagi vessel subjected to bypass surgery (magnification X I 0 0). The upper part of the figure is the blood vessel lumen side. An artificial blood vessel anastomosis is shown at the tip of the arrow. Compared to control and scrambled decoys, it can be seen that the chimera decoy suppresses the thickening of the anastomosis.
  • Fig. 7 is a graph showing the thickness of the intima and media of the distal anastomosis of the Usagi vessel subjected to bypass surgery.
  • Fig. 8 is a graph showing the ratio of the thickness of the intima and media of the distal anastomosis of the Usagi vessel subjected to bypass surgery.
  • Figure 9 is a photomicrograph of the proximal anastomosis of the Usagi vessel undergoing bypass surgery (magnification X I 0 0). The upper part of the figure is the blood vessel lumen side. An artificial blood vessel anastomosis is shown at the tip of the arrow. It can be seen that the chimera decoy suppresses the thickening of the anastomosis, compared to the control line and scrambled decoy.
  • FIG. 10 is a graph showing the thickness of the intima and media of the proximal anastomosis of the Usagi vessel subjected to bypass surgery.
  • Fig. 11 is a graph showing the ratio of the thickness of the intima and media in the proximal anastomosis of the Usagi vessel subjected to bypass surgery.
  • Fig. 12 is a micrograph (magnification X 400) of the immunohistochemical staining for the macrophage of the grafted anastomosis extracted from the Usagi bypass model and a graph showing the ratio of macrophages in all cells .
  • Fig. 13 is a photomicrograph of immunohistochemical staining of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) positive cells in the graft anastomosis extracted from the Usagi bypass model
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • vascular smooth muscle cells (VSMC) (Sanko Junyaku cryo AOSMC, Cat # CC-2571) of 9-6 well plates with 5 X 1 0 3 cells Z 4 Cultured in serum-free medium for 8 hours. Oligofuectamine
  • Decoy ODN (20 nM or 600 nM) was introduced into the cells using (Oligofectamine Reagent, Invitrogen, Cat # 12252-011), and further cultured in serum-free medium for 24 hours.
  • the sequence of decoy 0DN is shown below.
  • E2F decoy 5 '-CTAGATTTCCCGCG-3' (SEQ ID NO: 1 9)
  • PDGF Platelet-derived growth factor
  • Endotherial cells (EC) (Sanko Junyaku cryo HAEC, Cat # CC-2535) of passage number 5-6 were seeded in 96-well well plates at 1 x 10 cells Zwell for 48 hours, 0. Cultured in 5% serum medium. After decoy 0DN (600 nM) was introduced into the cells using oligofectamine, the cells were further cultured in 0.5% serum medium for 24 hours. After stimulation with 5% serum medium for 24 hours, 0.5. /. The serum medium was replaced, and 24 hours later, the cell number was counted with the W ST-1 cell count kit.
  • EC Endotherial cells
  • Passage number 5-6 VSMCs were seeded in 6-well tool plates to 50% confluence and cultured in serum-free medium for 48 hours. After decoy 0DN (600 nM) was introduced into the cells using oligoligamine, the cells were further cultured in a serum-free medium for 24 hours. 2 4 Seed VSMC 2.5 x 10 4 cells in the upper chamber of the Matrigel Invasion Chamber and PDGF-BB (50 ng / m 1) in the lower chamber And stimulate the cells for 48 hours, then Diff Quick
  • decoy ODN 40 ⁇ mol / L
  • ePTFE 2mm expanded polytetrafluoroethylene
  • EMG Elastics Van Gieson
  • the chimera decoy significantly suppressed the thickening of the intima and media of the anastomosis compared to the scrambled decoy.
  • the chimera decoy showed similar inhibitory activity whether the anastomosis was distal (a position far from the center of the body) or proximal (a position close to the center of the body).
  • the proportion of macrophages and PCNA positive cells in the graft anastomotic cells extracted from the Usagi bypass model used in 4 was examined. Immunohistochemical staining was performed using a peroxidase and avidin-biotin complex system.
  • Vectastain Elits ABC kit (Vector Laboratories) was used and the method attached to the kit was followed.
  • the immune complex is 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB, Vector

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Abstract

本発明は、複数の転写調節因子の阻害作用に基づく血管再狭窄、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防､改善、治療薬を提供する。本発明のキメラ（ダブル）デコイ（おとり分子）は、一分子内に複数の転写調節因子の結合配列を持つ。従って、一分子で複数の転写調節因子活性を阻害することが出来る。例えば人工血管吻合部の狭窄は、血管内膜が肥厚することによっておこるが、この主な原因は、吻合部に起こる炎症反応により細胞増殖が活発化するためである。従って、本発明のキメラデコイを用いて、炎症と細胞増殖に関わる二つの転写因子を同時に阻害することにより、血管壁の肥厚を抑制することができる。

Description

明細書 キメラ (ダブル) デコイ 技術分野
本発明は、 転写調節因子が結合する配列を複数有するオリゴヌクレオチドから なるデコイおよびその使用方法に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 キメラ (ダブル） デコイオリゴヌクレオチドおよびその使用方法に関する。 背景技術
閉塞性動脈硬化症や、 大動脈瘤、 大動脈乖離などの治療に対して行われる外科 的血行再建術には人工血管がよく用いられる。 また、 閉塞した血管を拡張するた めには、 バルーンカテーテルゃステントなどが用いられることも多い。 しかし、 これらの器具を用いた術後にはしばしば血管の再閉塞が起こり、 再度同様の施術 を必要とすることもあり、 これが問題となっている。
例えば、 閉塞性動脈硬化症の患者に対しては、 下肢切断を回避するために外科 的血行再建術を用いるが、 膝上部の病変については人工血管を用いたバイパス手 術が第一選択肢となっている。 しかし、 術後一ヶ月以降に人工血管閉塞が起こる ことがある。 この閉塞は吻合部の血管内膜の肥厚が主な原因である。 肥厚を抑制 することで、 グラフトの長期保存、 さらには膝下部の血行再建に人工血管を使用 することが可能となる。
人工血管吻合部の血管内膜の肥厚の主な原因は、 吻合部に起こる炎症反応によ 'り細胞増殖が活発化するためである。 従って、 この細胞増殖を阻害することで肥 厚を抑制することができると考えられる。
近年、 炎症反応を阻害することを目的とした遺伝子治療法が開発されている。 炎症反応に関わる転写調節因子である NF- κ Bの働きをデコイ核酸で抑えること によって消炎効果を期待する研究がなされている。
特再表（W0-A1) 96/035430号公報は、 NF- /c Bデコイ核酸が炎症性疾患に対する治 療剤となりうることを開示している。
また、 細胞増殖をコント口ールする遺伝子治療法も開発されている。 例えば、 細胞増殖に重要な役割を果たす転写調節因子である E2Fの働きをデコイ核酸で抑 えることで血管中膜の増殖を抑制することができる。
JP-B 3392143は、 E2Fデコイ核酸を用いた制ガン剤を開示している。
W095/11687は E2Fデコイ核酸を用いて細胞増殖を抑えられることを開示してい る。
今までに、 一分子内に二つの異なった機能を持つオリゴヌクレオチドには、 以 下のようなものが開示されている。
JP-A (W) 2002-515514は、 ICAM- 1のアンチセンスを皮膚外用剤として用いる方 法を開示しており、 それは DNA : RNAや RNA : RNAキメラ構造であってもよいとして いるが、 引用例を含め、 キメラデコイの具体例を挙げていない。 またこれは、 ァ ンチセンスの経皮送達に関わる発明を開示している。
US - A 2003-176376は、 bcl- 2のアンチセンスと CREデコイのハイプリッド分子 が、 ガンなどの異常な細胞増殖に起因する疾患を治療できる可能性を示している。
JP-A 2002 - 193813は NF - / c Bと Etsのキメラデコイが大動脈瘤モデルにおいて大 動脈面積の増大を抑制することを示している。 発明の開示
血管再狭窄をより有効に防止するためには、 炎症と細胞増殖を同時に抑える必 要がある。 従って、 两者をバランスよく抑制し、 かつより薬効 '安全性に優れた 薬剤の開発が望まれている。
JP-A (W) 2002-515514は、 具体的な治療効果は全く記載されておらず、 各種疾患 への応用可能性は全く不明であつた。
US- A 2003-176376は上記以外の疾患への有用性については言及していない。
JP-A 2002-193813は上記以外の疾患への有用性については不明であった。
本発明が解決しょうとする課題は、 デコイ核酸を有効成分とし、 炎症と細胞增 殖を同時に抑える薬剤を提供することである。 TJP2005/019742
本発明者らは、 吻合部内膜の肥厚は、 血管壁の炎症による炎症細胞浸潤、 平滑 筋細胞の増殖、 遊走に起因しているため、 一分子でこれらを同時にコントロール する薬剤を開発することが有効であると考えた。
本発明者らは、 鋭意検討の結果、 例えば NF -/ cB に制御される炎症作用、 そして E2Fに制御される細胞増殖作用を同時に抑えることができる分子を設計した。 すな わち、 一分子内に NF -/ c B、 E2Fの DNA結合配列を両方有するデコイ [キメラ （ダブ ル） デコイ]が、 両転写因子をより効果的に抑制することを見いだしたものである。 デコイとは、 転写調節因子が結合する核酸配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチ ドであり、 該転写調節因子が結合する他の核酸配列と競合し、 おとり （デコイ） 作用をするものである。 デコイは DNAでも RNAでもよいが、 DNAがより好ましい。 また本明細書において、 デコイ、 デコイオリゴヌクレオチド、 デコイ 0DNは同義 に用いられる。
その要旨は、
(1 ) 一分子中に複数の転写調節因子結合配列を含むキメラ （ダブル） デコイ、
(2) キメラデコイが DNAまたは RNAオリゴヌクレオチドからなる （1 ) 記載の デコイ、
(3) キメラデコイが DNAオリゴヌクレオチドからなる （1) または （2) 記載 のデコイ、 '
(4) キメラデコイが転写因子阻害作用を有する、 （1 ) 〜 (3) 記載のデコイ、
(5) キメラデコイの少なくとも一つの転写調節因子結合配列が、 NF- κΒ、 E2F、 GATA- 3、 STAT- 1、 STAT- 6、 Ets、 AP- 1の結合配列である （1) 〜 （4) 記載のデコ ィ、
(6) 前記キメラデコイ中の NF- /cB結合配列が GGGRHTYYHC (式中、 Rは Aまたは Gを、 Yは Cまたは Tを、 Hは A、 Cまたは Tをそれぞれ意味する） である （1) 〜
(5) のいずれかに記載のデコイ、
( 7 ) 前記キメラデコイ中の NF- / B結合配列が GGGATTTCCCまたは GGGACTTTCCで ある （6) に記載のデコイ、
(8) 前記キメラデコイ中の E2F結合配列が TTTSSCGS (式中、 Sは Gまたは Cを 意味する） である （1) 〜 （5) のいずれかに記載のデコイ、
(9) 前記キメラデコイ中の E2F結合配列が TTTCCCGCである （8) に記載のデコ ィ、
(1 0) 前記キメラデコイ中の GATA-3結合配列が WGATAR (式中 Wは Aまたは Tを Rは Aまたは Gをそれぞれ意味する）である （1) 〜 （5) のいずれかに記載のデ コィ、
(1 1) 前記キメラデコイ中の GATA- 3結合配列が AGATAGである （1 0) に記載 のデコイ、
(1 2) 前記キメラデコイ中の STAT - 1結合配列が TTCNNNGAA (式中 Nは A, G， Tまた は Cを意味する）である （1) 〜 （5) のいずれかに記載のデコイ、
(1 3) 前記キメラデコイ中の STAT-1結合配列が TTCCGGGAAである （1 2) に記 載のデコイ、
(14) 前記キメラデコイ中の STAT- 6結合配列が TTCNNNNGAA (式中 Nは A, G, Tま たは Cを意味する） である （1) ~ (5) のいずれかに記載のデコイ、
(1 5) 前記キメラデコイ中の STAT - 6結合配列が TTCCCAAGAAである （14) に 記載のデコイ、
(1 6) 前記キメラデコイ中の Ets結合配列が MGGAW (式中 Mは Aまたは Cを、 W は Aまたは Tをそれぞれ意味する） である （1) 〜 （5) のいずれかに記载のデ コィ、
(1 7) 前記キメラデコイ中の Ets結合配列が CGGAAである （16) に記載のデ コィ、
(1 8) 前記キメラデコイ中の AP - 1結合配列が TGASTMA (式中 Sは Gまたは Cを、 Mは Aまたは Cをそれぞれ意味する） である （1) 〜 （5) のいずれかに記載のデ コィ、
(1 9) 前記キメラデコイ中の AP- 1結合配列が TGAGTCAである （18) に記載の デコイ、 .
(20) キメラデコイが一分子中に二つの転写調節因子結合配列を含むデコイで ある （1) 〜 （1 9) のいずれかに記載のデコイ、 (2 1) キメラデコイが次式に示されるオリゴヌクレオチドから成る (1) 〜 (2 0) のいずれかに記載のデコイ、
5 ' — N (ra) —コンセンサス 1一 N(s)—コンセンサス 2— N(n)— 3'
(式中、 N (m) は 5' 端の付加配列、 N(s)はスぺーサ一、 N(n)は 3' 端の付加配 列を表す、 コンセンサス 2は転写調節因子結合配列を示す。 m, s, nはそれ ぞれ独立して 0または 1〜 20の整数を意味する。 Nはヌクレオチドん G,Tまたは Cを意味する。 ）
(22) コンセンサス 1および/またはコンセンサス 2が GGGRHTYYHC (式中、 R は Aまたは Gを、 Yは Cまたは Tを、 Hは A、 Cまたは Tをそれぞれ意味する） 、 TTTSSCGS (式中、 Sは Gまたは Cを意味する） 、 WGATAR (式中 Wは Aまたは Tを、 Rは Aまたは Gをそれぞれ意味する） 、 TTCNNNGAA (式中 Nは A, G, Tまたは Cを意 味する） 、 TTCNNNNGAA (式中 Nは A, G, Tまたは Cを意味する） 、 MGGAW (式中 Mは Aまたは Cを、 Wは Aまたは Tをそれぞれ意味する） 、 TGASTMA (式中 Sは Gまた は Cを、 Mは Aまたは Cをそれぞれ意味する） 力 選ばれた配列である （1) 〜
(21) のいずれかに記載のデコイ、
(23) コンセンサス 1ぉょぴ /またはコンセンサス 2が GGGATTTCCC、
GGGACTTTCC；、 TTTCCCGC、 AGATAG、 TTCCGGGAA, TTCCCAAGAA、 CGGAA、 TGAGTCAから選 ばれた配列である （1) 〜 （22) のいずれかに記載のデコイ、
(24) (2 1) の式中、 （m) = 0または；！〜 20の整数である （21) 〜 （2 3) のいずれかに記載のデコイ、
(25) (2 1) の式中、 （m) = 0または 1〜： I 0の整数である （21) 〜 （24) のいずれかに記載のデコイ、
(26) (2 1) の式中、 （ra) = 0または 1〜5の整数である （21) 〜 （25) の いずれかに記載のデコイ、
(27) (2 1) の式中、 （s) = 0または 1〜20の整数である （21) 〜 （26) のいずれかに記載のデコイ、 '
(28) (2 1) の式中、 （s) = 0または 1〜1◦の整数である （21) 〜 （2 7) のいずれかに記載のデコイ、 (29) (21) の式中、 （s) = 0または 1〜5の整数である （21) 〜 （28) の いずれかに記載のデコイ、
(30) (21) の式中、 （n) = 0または 1〜20の整数である （21) 〜 （29) のいずれかに記載のデコイ、
(3 1) (21) の式中、 （n) = 0または 1〜10の整数である （21) 〜 （30) のいずれかに記載のデコイ、
(32) (21) の式中、 （n) = 0または 1〜5の整数である （21) 〜 （31) の いずれかに記載のデコイ、
(33) キメラデコイ力 NF-/cBとその他の転写因子のキメラデコイである、
(1) 〜 （32) のいずれかに記載のデコイ、
(34) キメラデコイが、 NF - κΒと E2Fのキメラデコイである、 (1) 〜 (3 3) のいずれかに記載のデコイ、
(35) キメラデコイ力 配列番号 1で示されるキメラデコイである、 （1) ~ (34) のいずれかに記載のデコイ、
(36) キメラデコイが、 二本鎖 DNAからなる （1) 〜 （35) のいずれかに記 載のデコイ、
(37) (1) 〜 （36) のいずれかに記載のデコイを含む医薬組成物、
(38) (1) 〜 （37) のいずれかに記載のデコイからなる虚血性疾患、 ァレ ルギー性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの転 移 ·浸潤） あるいは悪液質の予防、改善、治療剤、
(39) (1) 〜 （37) のいずれかに記載のデコイからなる血管再狭窄、 急性 冠症候群、 脳虚血、 心筋梗塞、 虚血性疾患の再灌流障害、 了トピー性皮膚炎、 尋 常性乾癬、 接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 腎症、 糸 球体硬化症、アルブミン尿症、 腎炎、 腎不全、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患 （C0PD) の予防、改善、治療剤、
(40) (1) 〜 （37) のいずれかに記載のデコイからなる PTCA (経皮的冠動 脈形成術） 、 ΡΤΑ (経皮的血管形成術） 、 バイパス手術、 臓器移植または Β蔵器の手 術後におこる血管の再狭窄の予防、 改善、 治療剤、 ( 4 1 ) 前記血管の再狭窄が、 人工血管、 カテーテル、 ステントの使用または静 脈移植に起因する再狭窄である （1 ) 〜 （3 7 ) のいずれかに記載のデコイから なる予防、 改善、 治療剤、
( 4 2 ) 前記血管の再狭窄が、 閉塞性動脈硬化症、 動脈瘤、 大動脈乖離、 急性冠 症候群、 脳虚血、 マルファン症候群、 プラークラプチヤーに対する外科的治療に 起因する （1 ) 〜 （3 7 ) のいずれかに記載のデコイからなる予防、 改善、 治療 剤、
( 4 3 ) 前記 （1 ) ないし （3 7 ) のいずれかに記載のデコイを、 虚血性疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの 転移 ·浸潤） あるいは悪液質の予防、改善または治療剤の製造のために用いる用途、
( 4 4 ) 前記 （1 ) ないし （3 7 ) のいずれかに記載のデコイを用いて、 虚血性 疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤
(ガンの転移 ·浸潤） あるいは悪液質を予防、改善または治療する方法、
に関する。
本発明のキメラデコイは、 一分子で複数の転写調節因子を同時に阻害すること を特徴とする核酸系薬剤である。 このキメラデコイは、 例えば虚血性疾患、 ァレ ルギー性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの転 移 ·浸潤） あるいは悪液質に用いることができる。 より好ましくは、 閉塞性動脈 硬化症、 動脈瘤、 大動脈乖離、 マルファン症候群、 プラークラブチヤ一に対する 外科的治療に用いられる PTCA (経皮的冠動脈形成術） 、 PTA (経皮的血管形成術） 、 バイパス手術後の再狭窄に用いることができる。 発明の詳細な説明
本発明は一分子内に複数の転写調節因子結合配列をもつデコイ核酸 [キメラ （ダ ブル） デコイ]およびそれを有効成分とする医薬組成物を提供するものである。
本明細書において、 キメラデコイとは二つ以上の転写調節因子結合配列を有す るデコイであり、 ダブルデコイは二つの転写調節因子結合配列を有するデコイを 指す。 従って、 ダブルデコイはキメラデコイの概念に含まれる。 本発明のデコイには、 NF- κ B STAT - 1、 GATA- 3、 STAT_6、 AP- 1、 Ets、 E2F等の デコイを挙げることができる力 例えば NF -) Bと E2Fを組み合わせたキメラデコ ィが好適対象である。 NF- /c B結合配列をコンセンサス配列 GGGRHTYYHC (R (A, G)； Y(C，T) ; H(A, C，T)) (配列番号 2) から選択し、 E2F結合配列をコンセンサス配列 TTTSSCGS (S (G, C) ) (配列番号 3) から選択し、 組み合わせたキメラデコイを作 成することができる。 例えば、 好ましいキメラデコイの例としては、 NF - κΒの GGGATTTCCC (配列番号 9 ) 、 E2Fの TTTCCCGC (配列番号 1 1 ) をコアシーケンス とした GAAGGGATTTCCCTCCATTTCCCGCGGA (配列番号 1 ) (NF- κΒ, E2Fキメラデコ ィ） が挙げられる力 これに限定されない。
他に、 GATA-3コンセンサス配列 WGATAR (W(A, T)； R(A, G)) (配列番号 4 ) 、 STAT - 1 コンセンサス配列 TTCNNNGAA (N (A, G, T, 0 ) (配列番号 5 ) 、 STAT - 6コン センサス配列 TTCNNNNGAA (N (A, G, T, C) ) (配列番号 6 ) 、 Etsコンセンサス配列 MGGAW ((M(A, C) ; W(A, T)) (配列番号 7 ) 、 AP-1コンセンサス配列 TGASTMA
(S(G, C) ; M(A; 0) (配列番号 8) から選択した配列を適宜組み合わせて用いる こともできる。 例えば、 NF- / B結合配列 GGGACTTTCC (配列番号 1 0 ) 、 GATA-3結 合配列 AGATAG (配列番号 1 2) 、 STAT- 1結合配列 TTCCGGGAA (配列番号 1 3) 、 STAT-6結合配列 TTCCCAAGAA (配列番号 1 4 ) 、 Ets結合配列 CGGM (配列番号 1 5) 、 AP-1結合配列 TGAGTCA (配列番号 1 6 ) を適宜組み合わせて用いることが できるが、 これに限定されない。
本発明にかかるキメラデコイは次式により定義することもできる。
5 ' 一 N (m) —コンセンサス l_N(s)—コンセンサス 2— N(n)— 3 '
(式中、 N (m) は 5 ' 端の付加配列、 N(s)はスぺーサ一、 N(n)は 3 ' 端の付加配 列を表す。 コンセンサス 2は転写調節因子結合配列を示す。 m, s, nはそれ ぞれ独立して 0または 1〜 2 0の整数を意味する。 Nはヌクレオチド A, G, Tまたは Cを意味する。 ）
式中の 5 ' 付加配列については、 通常（m) = 0または 1〜2 0の整数であるが、 好ましくは（m) = 0または 1〜1 0の整数、 より好ましくは、 （m) = 0または 1〜5 の整数のものを用いる。 また、 式中のスぺーサ一部分は通常（s) = 0または:！〜 2 0の整数であるが、 好ましくは（s) = 0または 1〜1 0の整数、 より好ましくは (s) = 0または 1〜5の整数のものを用いる。 式中の 3 ' 付加配列については、 通 常（n) = 0または 1〜2◦の整数であるが、 好ましくは（n) = 0または 1〜 1 0の整 数、 より好ましくは、 （n) = 0または 1〜5の整数のものを用いる。
本発明のキメラデコイは、 通常 DNAまたは RNAオリゴヌクレオチドを用いるこ とができるが、 二本鎖 DNAがより好ましい。 加えて、 これらの相補体を含むオリ ゴヌクレオチド、 これらの変異体、 またはこれらを分子内に含む化合物も用いる ことができる。 また、 これらのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および/または 擬核酸を含むものであってもよい。 これらの核酸系薬剤は上記核酸配列を二つ以 上含む二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。
なお、 本発明に係るキメラデコイは、 DNA合成機 （DNA Synthesizer) 等の常法 により製造することができる。
また、 本発明に係るキメラデコイの投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法等によって異なるが、 通常 0. 1〜1000
Figure imgf000010_0001
好ましくは 1〜
lOO /x mol/L より好ましくは 10〜80 /i mol/Lのデコイ溶液を例えばカニュレーシ ヨン等により治療部位に導入する。 これらの溶液を用い、 成人一日当たり、 通常 0. 1〜10, OOOnmoL 好ましくは 1〜1, 000nmol、 より好ましくは 10〜100nmolを投与 することができる。 デコイ核酸溶液は、 通常 25〜250mmHgの加圧で導入する。 好 ましくは 50〜200mmHg、 より好ましくは 100〜175mmHgの加圧で導入する。 産業上の利用可能性
複数の転写調節因子の阻害作用に基づく血管再狭窄、 虚血性疾患、 アレルギー 性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの転移 ·浸 潤） あるいは悪液質の予防、改善、 治療薬を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 血管平滑筋細胞増殖アツセィの結果を表したグラフである。 （図中、 一 PDGFは、 ノーマル （PDGF刺激なし） を意味する。 以下同じ。 ) 図 2は、 血管内皮細胞増殖ァッセィの結果を表したグラフである。
図 3は、 血管平滑筋細胞遊走アツセィ後の細胞の顕微鏡写真である。 （倍率 X 4 0 0 )
図 4は、 血管平滑筋細胞遊走ァッセィの結果を表したグラフである。
図 5は、 ゥサギ血管壁へのデコイ 0DNの導入効率を比較したグラフである。 図 6は、 バイパス手術を施したゥサギ血管の遠位吻合部の顕微鏡写真である (倍率 X I 0 0 ) 。 図の上部が血管内腔側である。 矢印先部に人工血管吻合部を 示す。 コントロール、 スクランブルデコイに比べて、 キメラデコイが吻合部の肥 厚を抑制していることが分かる。
図 7は、 バイパス手術を施したゥサギ血管の遠位吻合部の内膜、 中膜の厚さを 表したグラフである。
図 8は、 バイパス手術を施したゥサギ血管の遠位吻合部の内膜、 中膜の厚さの 比を表したグラフである。
図 9は、 バイパス手術を施したゥサギ血管の近位吻合部の顕微鏡写真である (倍率 X I 0 0 ) 。 図の上部が血管内腔側である。 矢印先部に人工血管吻合部を 示す。 コントローノレ、 スクランブルデコイに比べて、 キメラデコイが吻合部の肥 厚を抑制していることが分かる。
図 1 0は、 バイパス手術を施したゥサギ血管の近位吻合部の内膜、 中膜の厚さ を表したグラフである。
図 1 1は、 バイパス手術を施したゥサギ血管の近位吻合部の内膜、 中膜の厚さ の比を表したグラフである。
図 1 2は、 ゥサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部のマクロファー ジに対する免疫組織化学染色の顕微鏡写真 （倍率 X 4 0 0 ) および全細胞中にお けるマクロファージの割合を表したグラフである。
図 1 3は、 ゥサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部の Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)陽性細胞に対する免疫組織化学染色の顕微鏡写真
(倍率 X 4 0 0 ) および全細胞中における PCNA陽性細胞の割合を表したグラフで ある。 実施例
続いて本発明を具体的に説明するため、 以下に実施例を掲げるが、 本発明はこ れらに限定されない。
1. 血管平滑筋細胞増殖アツセィ
糸 ϋ代数 5〜 6の血管平滑筋細胞 （Vascular Smooth Muscle Cell ; VSMC) (三光 純薬 cryo AOSMC, Cat#CC- 2571) を 9 6ゥエルプレートに 5 X 1 0 3細胞 Zゥエル 播種し、 4 8時間、 無血清培地で培養した。 オリゴフエクタミン
(Oligofectamine Reagent, Invitrogen, Cat#12252- 011) を用いてデコイ ODN (20nM または 600 n M) を細胞に導入後、 さらに 2 4時間、 無血清培地で培養し た。 デコイ 0DNの配列を以下に示す。
キメラデコイ 5 ' - GAAGGGATTTCCCTCCATTTCCCGCGGA- 3 ' (配列番号 1 )
3， -CTTCCCTAAAGGGAGGTAAAGGGCGCCT-5 '
スクランブルデコイ 5' - CGTACCTGACTTAGCCATTTCGAGCGGA- 3' (配列番号 1 7 ) 3 ' -GCATGGACTGAATCGGTAAAGCTCGCCT-5 '
NF - / c Bデコイ 5， -CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3 ' (配列番号 1 8 )
3' -GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5 '
E2Fデコイ 5' -CTAGATTTCCCGCG-3' (配列番号 1 9 )
3' -TAAAGGGCGCCTAG-5' (配列番号 2 0 )
血小板由来成長因子 （Platelet- derived growth factor； PDGF) 一 BB ( 1 0 n g /m l ) (PeproTech EC Ltd, Cat#100-14B) で 2 4時間刺激後、 無血清培地に 交換し、 2 4時間後 W S T— 1細胞数力ゥントキット （Cell Counting Kit, 同仁 化学研究所） を用いて細胞数を計測した。
結果） キメラデコイはスクランブルデコイに比べて、有意に血管平滑筋細胞増殖を 抑制した。 （表 1、 図 1参照） 表 1 (Abs450) 20nM ODN 600nM ODN ノーマル （PDGF刺激なし） 0.21 土 0.008
コントロール （PDGF刺激あり） 0.38 ± 0.018
スクランブルデコイ 0.35 土 0.007
キメラデコイ 0.31 士 0.015 0.208 士 0.013 ,
NF - κΒデコイ 0.35 土 0.011 0.253 土 0.009
E2Fデコイ 0.33 土 0.011 0.233 土 0.009
2. 血管内皮細胞増殖アツセィ
継代数 5〜6の血管内皮細胞 （Endotherial Cell; EC) (三光純薬 cryo HAEC, Cat#CC-2535) を 96穴ゥエルプレートに 1 X 10 細胞 Zゥェル播種し、 48時 間、 0. 5%血清培地で培養した。 オリゴフエクタミンを用いてデコイ 0DN (60 0 n M) を細胞に導入後、 さらに 24時間、 0. 5 %血清培地で培養した。 5 % 血清培地で 24時間刺激後、 0. 5。/。血清培地に交換し、 24時間後 W ST- 1 細胞数力ゥントキットで細胞数を計測した。
結果） キメラデコイを含めた全ての 0DNは、 血管内皮細胞の増殖を抑制しなかつ た。 （表 2、 図 2参照）
表 2 (Abs450)
600nM ODN ノーマノレ （PDGF刺激なし） 0.28 土 0.006
コントロール （PDGF刺激あり） 0.51 土 0.016
スクランブルデコイ 0.55 土 0.022
キメラデコイ 0.54 土 0.008
NF— / Bデコイ 0.54 土 0.018 3. 血管平滑筋細胞遊走アツセィ
継代数 5〜6の VSMCを 6穴ゥヱルプレートに 5 0%コンフルェントになるよう 播種し、 48時間、 無血清培地で培養した。 ォリゴフヱクタミンを用いてデコイ 0DN (600 nM) を細胞に導入後、 さらに 24時間、 無血清培地で培養した。 2 4ウエノレマトリゲノレインべィジョンチャンノく一 (Matrigel Invasion Chamber) の 上部チャンバ一に VSMCを 2. 5 X 1 04細胞播種し、 下部チャンバ一に PDGF -B B (50 n g/m 1 ) を入れ、 48時間細胞を刺激した後、 ディフクイック
(Diff Quik) 染色を行い、 遊走細胞数を計測した。
結果） キメラデコイ、 NF-/cB デコイ、 E2F デコイはスクランブルデコイに比べて、 有意に細胞遊走を抑制した。 その中でもキメラデコイは、 最も活性が強かった。
(表 3、 図 3， 4参照）
表 3 (細胞数 Z視野）
600nM 0DN ノーマル （PDGF刺激なし） 8 土
スクランブルデコイ 38.4 ± 6.9
キメラデコイ 12.8 土 5.0
NF_KBデコイ 21.8 ± 5.5
E2Fデコイ 15.8 ± 2.7
4. ゥサギバイパスモデル実験
デコイ' 0DNを動脈壁に導入するのに最も適切な圧力を求めた。 FITC- 0DN
(40 mol/L) を動脈吻合部へ任意の圧力で導入し、 その導入効率を測定したとこ ろ、 1 5 OmmHgが最も適切であることが明らかとなった。 （表 4、 図 5) 表 4 圧力 （mraHg) 導入効率 （°/。)
50 39.6 ± 3.8
100 34. 1 ± 2.8
150 60.0 ± 4.7
200 51.8 ± 3.9 高脂血症家兎の総頸動脈を剥離し、 動脈内に力二ユレーシヨン後、 1 5 0 mm H gの加圧でデコイ ODN (40 μ mol/L) を動脈壁に導入した。 導入部に 2mm expanded polytetraf luoroethylene (ePTFE)クフフ卜 { 2 cm) を し、 ノヽづ ノヽ スモデノレとした。 4週間後にエラスチカ · ワンギーソン （Elastics Van Gieson; EVG) 染色を行い、 吻合部内膜肥厚を計測、 評価した。
結果） キメラデコイはスクランブルデコイに比較して、 優位に吻合部の内膜、 中 膜の肥厚を抑制した。 キメラデコイは、 吻合部が遠位 （体の中心から遠い位置） にあっても、 近位 （体の中心に近い位置） にあっても、 同様の抑制活性を示した。
(表 5、 6、 図 6〜11参照）
表 5
遠位吻合部 (μιη) 内膜 中膜 内膜ノ中膜比 コントロール 109.03 士 11.87 130.38 土 10.09 0.929 土 0. 125
スクランブルデコイ 129.49 土 15.51 161.79 土 12.69 0.822 士 0.081
キメラデコイ 52.63 土 8.57 112.58 土 5. 10 0.447 土 0.069 表 6
近位吻合部 （μπι) 内膜 中膜 内膜/中膜比 コントロール 152.41 土 10.06 136.66 士 7.42 1.17 土 0.17
スクランブルデコイ 170.92 土 17.64 146.26 土 10.53 1.21 土 0.12 キメラデコイ 89.50 土 10.06 128.26 土 7.49 0.73 士 0.09
5. マクロファージぉよび ProUferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)の染色
4で用いたゥサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部の細胞中における マクロファージと PCNA陽性細胞の割合を調べた。 ペルォキシダーゼ、 ァビジン一 ビォチン複合体システムを用いて、 免疫組織化学染色を行つた。
5μιτι厚のパラフィン切片を脱パラフィンした後、 再水和 （rehydrate) した。 3 %過酸化水素を用いて内因性ペルォキシダーゼをプロックした。 5 %ゥマ血清 添加リン酸緩衝液 （Phospate- buffered Saline, PBS) を用いて 30分間プロツキ ングを行った。 1 ： 50に希釈した一次抗体を切片に加え、 4°Cでー晚インキュ ペートした。 マクロファージの検出には RAM11抗体（DAKO, USA)、 PCNAには抗 PCNA抗体 （Clone:PC10) (DAKO, USA)を用いた。 切片を PBSで適宜洗浄しながら、 ピオチン化抗マウス IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)添カロ PBS を加えて 30分間ィンキュベートした後、アビジン一ピオチン化西洋わさびペルォ キシダーゼ添加 PBSを加えてさらに 30分間インキュベートした。 これは
Vectastain Elits ABC kit (Vector Laboratories) を用い、 キットに添付の方法 に従った。 免疫複合体は 0.05% 3,3' -diaminobenzidine (DAB, Vector
Laboratories) を用いて検出し、 その後切片をへマトキシリンでカウンター染色 した。
結果） キメラデコイはスクランブルデコイに比べて、 有意にマクロファージの浸 潤を抑制した （表 7、 図 1 2参照） 。 また、 キメラデコイは、 スクランブルデコ ィに比べて、 PCNA陽性細胞を減少させたことから、 細胞増殖を抑制することも示 された （表 8、 図 1 3参照） 。 表 7
マクロファージ （全細胞における％) コントロール 25. 88 土 4. 71
スクランブルデコイ 22. 95 土 3. 51
キメラデコイ 10. 69 土 1. 88 表 8
PCNA陽性細胞 （全細胞における％) コントローノレ 36. 09 土 6. 56
スクランブルデコイ 35. 55 土 6. 16
キメラデコイ 12. 09 土 2. 08
6. 統計解析データは全て平均値士標準誤差 （SEM) で表した。

Claims

請求の範囲
1 . 一分子中に複数の転写調節因子結合配列を含むキメラ （ダブル） デコイ。
2 . キメラデコイが DNAまたは RNAオリゴヌクレオチドからなる請求項 1記載 のデコイ。
3 . キメラデコイが DNAオリゴヌクレオチドからなる請求項 1または 2記載の デコイ。
4 . キメラデコイが転写因子阻害作用を有する、 請求項 1ないし 3のいずれか に記載のデコイ。
5 . キメラデコイの少なくとも一つの転写調節因子結合配列が、 NF - / c B、 E2F、 GATA- 3、 STAT- 1、 STAT- 6、 Ets、 AP-1の結合配列である請求項 1ないし 4のいずれ かに記載のデコイ。
6 . 前記キメラデコイ中の NF- /C B結合配列が GGGRHTYYHC (式中、 Rは Aまたは Gを、 Yは Cまたは Tを、 Hは A、 Cまたは Tをそれぞれ意味する。 ） である請求項 1ないし 5のいずれかに記載のデコイ。
7 . 前記キメラデコイ中の NF- κ B結合配列が GGGATTTCCCまたは GGGACTTTCCで ある請求項 6に記載のデコイ。
8 . 前記キメラデコイ中の E2F結合配列が TTTSSCGS (式中、 Sは Gまたは Cを 意味する。 ） である請求項 1ないし 5のいずれかに記載のデコイ。
9 . 前記キメラデコイ中の E2F結合配列が TTTCCCGCである請求項 8に記载のデ コィ。
1 0 . 前記キメラデコイ中の GATA- 3結合配列が WGATAR (式中 Wは Aまたは Tを、 Rは Aまたは Gをそれぞれ意味する）である請求項 1ないし 5のいずれかに記載の デコイ。
1 1 . 前記キメラデコイ中の GATA-3結合配列が AGATAGである請求項 1 0に記 載のデコイ。
1 2 . 前記キメラデコイ中の STAT- 1結合配列が TTCNNNGAA (式中 Nは A， G， Tまた は Cを意味する）である請求項 1ないし 5のいずれかに記載のデコイ。
1 3 . 前記キメラデコイ中の STAT- 1結合配列が TTCCGGGAAである請求項 1 2に 記載のデコイ。
1 4 . 前記キメラデコイ中の STAT - 6結合配列が TTCNNNNGAA (式中 Nは A, G, Tま たは Cを意味する）である請求項 1ないし 5のいずれかに記載のデコイ。
1 5 . 前記キメラデコイ中の STAT- 6結合配列が TTCCCAAGAAである請求項 1 4 に記載のデコイ。
1 6 . 前記キメラデコイ中の Ets結合配列が MGGAW (式中 Mは Aまたは Cを、 W は Aまたは Tをそれぞれ意味する） である請求項 1ないし 5のいずれかに記載の デコイ。
1 7 . 前記キノラデコイ中の Ets結合配列が CGGAAである請求項 1 6に記載の デコイ。
1 8 . 前記キメラデコイ中の AP- 1結合配列が TGAST A (式中 Sは Gまたは Cを、 Mは Aまたは Cをそれぞれ意味する）である請求項 1ないし 5のいずれかに記載の テコィ。
1 9 . 前記キメラデコイ中の AP- 1結合配列が TGAGTCAである請求項 1 8に記載 のデコイ。
2 0 . キメラデコイが一分子中に二つの転写調節因子結合配列を含むデコイで ある請求項 1ないし 1 '9のいずれかに記載のデコイ。
2 1 . キメラデコイが次式に示されるオリゴヌクレオチドから成る請求項 1な いし 2 0のいずれかに記載のデコイ。
5 ' -N (m) 一コンセンサス 1—N (s)—コンセンサス 2— N (n)— 3 '
(式中、 N (m) は 5 ' 端の付加配列、 N (s)はスぺーサ一、 N (n)は 3 ' 端の付加配 列を表す。 コンセンサス 1、 2は同一または相異なる転写調節因子結合配列を示す。 m, s, nはそれぞれ独立して 0または 1〜 2 0の整数を意味する。 Nはヌクレオチ ド A, G, Tまたは Cを意味する。 ）
2 2 . コンセンサス 1および/またはコンセンサス 2が GGGRHTYYHC (式中、 R は Aまたは Gを、 Yは Cまたは Tを、 Hは A、 Cまたは Tをそれぞれ意味する） 、 TTTSSCGS (式中、 Sは Gまたは Cを意味する） 、 WGATAR (式中 Wは Aまたは Tを、 R は Aまたは Gをそれぞれ意味する）、 TTCNNNGM (式中 Nは A, G, Tまたは Cを意味す る）、 TTCN應 NGAA (式中 Nは A, G，Tまたは Cを意味する）、 MGGAW (式中 Mは Aまた は Cを、 Wは Aまたは Tをそれぞれ意味する） 、 TGASTMA (式中 Sは Gまたは Cを、 Mは Aまたは Cをそれぞれ意味する）から選ばれた配列である請求項 1ないし 2 1 のいずれかに記載のデコイ。
23. コンセンサス 1および/またはコンセンサス 2が GGGATTTCCC、
GGGACTT丁 CC、 TTTCCCGC、 AGATAG、 TTCCGGGAA, TTCCCAAGAA, CGGAA、 TGAGTCAから選 ばれた配列である請求項 1ないし 22のいずれかに記載のデコイ。
24. 請求項 2 1の式中、 （m)=0または 1〜20の整数である請求項 2 1ない し 2 3に記載のデコイ。
25. 請求項 2 1の式中、 （m) = 0または 1〜1 0の整数である請求項 21ないし 24のいずれかに記載のデコイ。
26. 請求項 2 1の式中、 （m) = 0または 1〜5の整数である請求項 21ないし 2 5のいずれかに記載のデコイ。
27. 請求項 2 1の式中、 （s) = 0または 1〜20の整数である請求項 21ないし 26のいずれかに記載のデコイ。
28. 請求項 2 1の式中、 （s) = 0または 1〜1 0の整数である請求項 21ないし 27のいずれかに記載のデコイ。
29. 請求項 2 1の式中、 （s) = 0または 1〜5の整数である請求項 21ないし 2 8のいずれかに記載のデコイ。
30. 請求項 2 1の式中、 （n) = 0または 1〜20の整数である請求項 21ないし 29のいずれかに記載のデコイ。
3 1. 請求項 2 1の式中、 （n) = 0または 1〜1 0の整数である請求項 21ないし 30のいずれかに記載のデコイ。
3 2. 請求項 2 1の式中、 （n) = 0または 1〜 5の整数である請求項 21ないし 3 1のいずれかに記載のデコイ。
33. キメラデコイ力 NF-z Bとその他の転写因子のキメラデコイである、 請 求項 1ないし 3 2のいずれかに記載のデコイ。
3 4 . キメラデコイが、 NF- / Bと E2Fのキメラデコイである、 請求項 1ないし 3 3のいずれかに記載のデコイ。
3 5 . キメラデコイが、 配列番号 1で示されるキメラデコイである、 請求項 1 ないし 3 4のいずれかに記載のデコイ。
3 6 . キメラデコイ力 二本鎖 DNAからなる請求項 1ないし 3 5のいずれかに 記載のデコイ。
3 7 . 請求項 1ないし 3 6のいずれかに記載のデコイを含む医薬組成物。
3 8 . 請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイからなる虚血性疾患、 了 レルギ一性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの転 移 ·浸潤） あるいは悪液質の予防、改善、治療剤。
3 9 . 請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイからなる血管再狭窄、 急 性冠症候群、 脳虚血、 心筋梗塞、 虚血性疾患の再灌流障害、 了トピー性皮膚炎、 尋常性乾癬、 接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 腎症、 糸球体硬化症、アルブミン尿症、 腎炎、 腎不全、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患 （C0PD) の予防、改善、治療剤。
4 0 . 請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイからなる PTCA (経皮的冠 動脈形成術） 、 PTA (経皮的血管形成術） 、バイパス手術、 臓器移植または臓器の 手術後におこる血管の再狭窄の予防、 改善、 治療剤。
4 1 . 前記血管の再狭窄が、 人工血管、 カテーテル、 ステントの使用または静 脈移植に起因する再狭窄である請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイ力 らなる予防、 改善、 治療剤。
4 2 . 前記血管の再狭窄が、 閉塞性動脈硬化症、 動脈瘤、 大動脈乖離、 急性冠 症候群、 脳虚血、 マルファン症候群、 プラークラブチヤ一に対する外科的治療に 起因する請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイからなる予防、 改善、 治 療剤。
4 3 . 請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイを、 虚血性疾患、 ァレル ギー性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの転移 - 浸潤） あるいは悪液質の予防、改善または治療剤の製造のために用いる用途。
4 4 . 請求項 1ないし 3 7のいずれかに記載のデコイを用いて、 虚血性疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移または浸潤 （ガンの 転移 ·浸潤） あるいは悪液質を予防、改善または治療する方法。
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