PT824918E - Tratamento e prevenção para doenças causadas pelo nf-kb - Google Patents

Description

ΡΕ0824918 1

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO E PREVENÇÃO PARA DOENÇAS CAUSADAS PELO NF-KB"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção relaciona-se com a utilização de um isco NF-κΒ especifico para a produção de um medicamento para a terapia e profilaxia de várias doenças associadas com o NF-κΒ como definido na reivindicação 1. 0 NF-κΒ é conhecido por ser um factor regulador na transcrição de citoquinas e de factores de adesão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma variedade de doenças incluindo asma, cancros, doenças cardiacas, doenças autoimunes e infecções virais manifestam sintomas e sinais variados e foi ainda sugerido que quer uma sobre-expressão ou uma sub-expressão de uma ou de algumas proteínas é em muitos casos um factor etiológico principal. Além disso, uma variedade de factores reguladores transcricionais tais como os activadores transcricionais e os inibidores transcricionais estão envolvidos na expressão de proteínas. 0 NF-κΒ, uma substância conhecida por ser um dos tais factores reguladores transcricionais, é um heterodímero de proteínas p65 e p50. No citoplasma, o NF-κΒ está normalmente presente 2 ΡΕ0824918 como substância de ligação ao IkB, um factor de inibição, e prevenindo assim a migração para o núcleo No entanto, quando as células são estimuladas pelas citoquinas, isquemia, ou reperfusão por qualquer razão, o IkB é fosforilado e decomposto tal que o NF-κΒ seja activado e penetre no núcleo. 0 NF-κΒ acopla-se ao sitio de ligação do NF-κΒ no cromossoma promovendo seguidamente a transcrição do gene localizado a jusante. O gene controlado pelo NF-kB inclui citoquinas tais como a IL-1, IL-6, IL-8, etc. e factores de adesão tais como VCAM-1, ICAM-1, etc...

Foram já descritos oligonucleótidos iscos compreendendo o sítio KR do NF-κΒ no tratamento de várias doenças tais como inflamação, reestenoses, cancros e metástases em WO-A-95/12415. Além disso, WO-A-95/11687 descreve o envolvimento de NF-κΒ na inflamação, respostas imunes, rejeição ao transplante, lesão de reperfusão, enfarte de miocárdio, dermatite e glomerulonefrites, e sugere a utilização de oligonucleótidos isco de forma a tratar as ditas afecções.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Prevendo que a estimulação da produção destas citoquinas e de factores de adesão é causativa de várias morbidezes tais como doenças isquémicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, metástases e invasões cancerosas e caquexia, os inventores desta invenção efectuaram muita pesquisa e descobriram que é uma abordagem tera- 3 ΡΕ0824918 pêutica recompensadora para suprimir a expressão desses genes que são activados pelo NF-κΒ administrando um isco do sitio de ligação do NF-κΒ no cromossoma, isto é um composto que antagoniza especificamente o sitio de ligação do cromossoma ao qual o NF-κΒ está conjugado. A presente invenção desenvolveu-se com base nas descobertas acima. A presente invenção fornece, por isso, a utilização de um isco NF-κΒ para a produção de um medicamento para a terapia e profilaxia de uma doença associada ao NF-kB como definido na reivindicação 1.

As doenças nas quais a composição terapêu-tica/profilática da invenção é indicada são doenças associadas especificamente ao NF-κΒ, isto é, doenças causadas pela activação não desejada de genes sob controlo do factor regulador transcricional NF-κΒ, e estas doenças são doenças isquémicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, metástases e invasões cancerosas, e caquexia. As doenças isquémicas incluem doenças isquémicas de órgãos (por exemplo, doenças isquémicas cardiacas tais como o enfarte de miocárdio, a insuficiência cardíaca aguda, a insuficiência cardíaca crónica, etc., doenças isquémicas cerebrais tais como o enfarte cerebral, e doenças isquémicas do pulmão tais como o enfarte pulmonar).

As doenças inflamatórias acima mencionadas incluem várias doenças inflamatórias tais como nefrites, hepatite, etc., insuficiência renal aguda, e insuficiência 4 ΡΕ0824918 renal crónica. A doença autoimune acima mencionada inclui mas não está limitada a esclerose múltipla, tiroidite de Hashimoto. Particularmente a composição farmacêutica contendo o isco de NF-κΒ utilizado de acordo com a presente invenção como um ingrediente activo é bastante adequada para terapia e profilaxia de distúrbios de reperfusão em doenças isquémicas, metástases e invasões cancerosas, e caquexia tais como perda de peso seguido de acometimento de um cancro. 0 isco de NF-κΒ que é utilizado a presente invenção é um composto que antagoniza especificamente o sitio de ligação de NF-κΒ no cromossoma. 0 dito isco de NF-κΒ é a sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 1 na lista de sequências. O isco de NF-κΒ preferencial inclui oligonu-cleótidos de cadeia dupla da sequência de nucleótidos acima. 0 oligonucleótido que pode ser utilizado na presente invenção inclui oligonucleótidos modificados para que sejam menos susceptiveis de se biodegradarem, tais cornos aqueles oligonucleótidos contendo a ligação do diéster tiofosfórico disponível após a substituição do enxofre pelo oxigénio da parte diéster fosfórico (S-oligo) e aqueles oligonucleótidos disponíveis após a substituição de um grupo metil fosfato sem carga eléctrica pela parte diéster fosfórico.

No que diz respeito à tecnologia para a produção do isco de NF-κΒ para utilização na presente invenção, 5 ΡΕ0824918 podem ser utilizados métodos químicos ou bioquímicos convencionais para a síntese.

Podem ser empregues os métodos para a síntese do ácido nucleico que são normalmente utilizados em engenharia genética. Por exemplo, o isco oligonucleótido especifico pode ser sintetizado directamente num sintetizador de DNA. Ou um ácido nucleico ou os seus fragmentos, todos antecipadamente sintetizados, podem ser amplificados por PCR ou utilizando um vector de clonagem ou outros. Além disso, o ácido nucleico desejado pode ser obtido por procedimentos tais como clivagem com enzimas de restrição ou outras e/ou ligação por meio da DNA ligase ou outras. De forma a obter um nucleótido isco que é mais estável dentro das células, a base, açúcar e/ou partes de ácido fosfórico do ácido nucleico podem ser alquiladas, aciladas, ou de outra forma modificadas quimicamente. A composição farmacêutica contendo o isco NF-kB como um ingrediente activo utilizado de acordo com a presente invenção não é limitado na forma apenas se o composto activo seja absorvido pelas células no sítio afectado ou pelas células do tecido alvo. Assim, o isco NF-kB, pode ser administrado quer sozinho quer em mistura com o veículo farmacêutico comum, oralmente, parenteralmente, topicamente ou externamente. A composição farmacêutica pode ser fornecida em formas de dosagem líquida tal como soluções, suspensões, xaropes, lipossomas, loções, etc. ou 6 ΡΕ0824918 em formas de dosagem sólida tal como pastilhas, granulados, pós, e cápsulas. Quando necessário, aquelas composições farmacêuticas podem ser suplementadas com vários veículos, excipientes, estabilizantes, lubrificantes, e/ou outros aditivos farmacêuticos convencionais, tais como a lactose, o ácido cítrico, o ácido tartárico, o ácido esteárico, estearato de magnésio, terra alba, sacarose, amido de milho, talco, gelatina, agar, pectina, óleo de amendoim, azeite, manteiga de cacau, etilenoglicol, e outros.

Particularmente quando um ácido nucleico ou um produto daí modificado é utilizado como o isco NF-κΒ, a forma de dosagem preferida inclui aquelas que são geralmente utilizadas na terapia de genes, tais como os lipossomas inclusive os lipossomas de fusão de membrana utilizando vírus Sendai e lipossomas utilizando a endocitose, preparações contendo lípidos catiónicos tais como a Lipofectamina (Life Tech Oriental) ou virossomas utilizando um vector retroviral, um vector adenoviral, ou outros. Particularmente preferenciais são os lipossomas de fusão de membrana A estrutura de uma preparação lipossomal pode ser qualquer uma de entre vesículas unilamelares grandes (LUV), vesículas multilamelares (MLV), e vesículas unilamelares pequenas (SUV). 0 tamanho aproximado das vesículas pode variar entre 200 a 1000 nm para as LUV, entre 400 e 3500 nm para as MLV, e entre 20 a 50 nm para as SUV mas no caso de 7 ΡΕ0824918 uma preparação lipossomal de fusão de membrana utilizando o vírus Sendai, por exemplo, a MLV com um sistema vesicular de 200-1000 nm de diâmetro é preferencialmente empregue. Não existe limitação na tecnologia para a produção de lipossomas apenas se o isco puder ser armadilhado com sucesso nas vesículas. Assim, tais lipossomas podem ser produzidos pelas técnicas convencionais tais como o método de evaporação de fase reversa (Szoka, F., et al: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 (1980)), o método de injecção de éter (Deamer, D. w.: Ann. N. Y. Acad. Sei., Vol. 308 250 (1978)) e o método do surfactante (Brunner, J., et al: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 455 322 (1976)), para citar apenas alguns exemplos.

Os lípidos que podem ser utilizados para a construção de uma estrutura lipossomal incluem os fosfolípidos, o colesterol e seus derivados, e os lípidos contendo azoto mas os fosfolípidos são geralmente preferidos. Os fosfolípidos que podem ser utilizados incluem os fosfolípidos que ocorrem naturalmente na natureza tais como o fosfati-dilcolina, o fosfatidilserina, o fosfatidilglicerol, o fosfatidilinositol, o fosfatidiletanolamina, o ácido fosfa-tídico, a cardiolipina, a esfingomielina, a lecitina da gema do ovo, a lecitina da soja, a lisolecitina, etc., os fosfolípidos hidrogenados pelo método convencional, e os fosfolípidos sintéticos tais como o fosfato de diacetilo, a distearoilfosfatidileolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidil- ΡΕ0824918 serina, eleostearoilfosfatidilcolina), eleostearoilfosfa-tidiletanolamina, eleostearoilfosfatidilserina, e outros.

Os lípidos inclusive os fosfolipidos podem ser utilizados quer sozinhos quer numa combinação adequada. Através da utilização de um lipido contendo um grupo atómico positivamente carregado tal como a etanolamina ou a colina dentro da molécula, a taxa de ligação de um nucleótido isco electricamente negativo pode ser aumentada. Adicionalmente ao fosfolipido principal, vários compostos tais como o colesterol e os seus derivados, a estearil-amina, o α-tocoferol, etc., que são conhecidos como aditivos lipossomais, podem ser adicionados na produção de lipossomas.

Aos lipossomas resultantes pode ser adicionado um promotor de fusão de membrana tal como o vírus Sendai, o vírus Sendai inactivado, uma proteína que promova a fusão da membrana purificada a partir do vírus Sendai, o polietilenoglicol, ou outros podem ser adicionados para assistir na absorção intracelular pelas células no sítio afectado ou no tecido alvo.

Um procedimento comum para a produção de lipossomas farmacêutico está descrito seguidamente em detalhe. A substância formadora de lipossomas acima mencionada bem como o colesterol ou outros é dissolvida num solvente orgânico tal como o tetra-hidrofurano, o clorofórmio, o etanol, ou outros. Num recipiente adequado, o solvente é destilado sob pressão reduzida para deixar um filme da 9 ΡΕ0824918 substância formadora de lipossomas na parede interna do recipiente. Assim, um tampão contendo o isco NF-κΒ é adicionado e a mistura é agitada. Após a adição óptima do dito promotor de fusão de membrana, os lipossomas são isolados. Os lipossomas nos quais o isco NF-κΒ tenha assim sido aprisionado são suspensos num meio adequado ou um liofilizado dai resultante é redisperso num meio adequado para utilização em terapia. 0 promotor de fusão de membrana pode ser adicionado no período interino após o isolamento dos lipossomas e antes da sua utilização. Não existe limitação no conteúdo do isco da composição farmacêutica que compreende o isco NF-κΒ como um composto activo apenas se o isco estiver presente em quantidades efectivas para controlar doenças associadas ao NF-κΒ. Assim, o conteúdo do isco pode ser seleccionado livremente de acordo com a doença a ser controlada, o sitio alvo, a forma de dosagem, e o calendário de dosagem. A composição farmacêutica contendo o isco NF-kB como um composto activo como fornecida da maneira acima mencionada pode ser administrada por vários métodos de acordo com o tipo de doença e o tipo de isco presente. Tomando em linha de conta as doenças isquémicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoimunes, as metástases e invasões cancerosas, e a caquexia como exemplos, a composição pode ser infundida intravascularmente, aplicada directamente na área afectada, injectada na lesão, ou administrada no vaso sanguíneo da região afectada. Como um exemplo específico adicional, quando a PTCA é realizada 10 ΡΕ0824918 para o enfarte de um órgão, a composição farmacêutica pode ser administrada no vaso sanguíneo local paralelamente com a operação ou pré- e pós-operativamente. Para a transplantação de órgãos o material de enxerto pode ser previamente tratado com a composição da invenção. Além disso, a composição pode ser injectada directamente na costura. A dosagem do isco de NF-κΒ é seleccionada tendo em linha de conta a idade do paciente e outros factores, o tipo de doença, o tipo de isco utilizado, etc. mas para a administração intravascular, intramuscular, ou intrarti-cular, por exemplo, uma unidade de dosagem de 10-10,000 nmoles pode normalmente ser administrada uma a várias vezes ao dia.

MELHOR MÉTODO PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO

Os seguintes exemplos pretendem descrever a presente invenção em maior detalhe.

Exemplo 1 Síntese de um isco NF-κΒ (isco oligonucleótido)

Num sintetizador de DNA, um isco oligonucleótido de NF-κΒ e um isco oligonucleótido manipulado (um oligonucleótido contendo a mesma composição de base do isco oligonucleótido de NF-κΒ mas contendo uma sequência aleatórias), as sequências de nucleótidos destes estão 11 ΡΕ0824918 apresentadas abaixo, foram respectivamente sintetizados a partir de S-oligonucleótidos. Estes oligonucleótidos foram aquecidos a 80 °C durante 30 minutos e seguidamente arrefecidos à temperatura ambiente durante 2 horas para produzir DNA's de cadeia dupla.

Isco oligonucleótido de NF-kB

CCTTGAAGGGATTTCCCTCC

GGAACTTCCCTAAAGGGAGG

Isco oligonucleótido manipulado TTGCCGTACCTGACTTAGCC AACGGCATGGACTGAATCGG Exemplo 2

Produção de preparações lipossomais A fosfatidilserina, a fosfatidilcolina, e o colesterol, fornecidos numa proporção em massa de 1:4,8:2 (um total de 10 mg) foram dissolvidos em tetra-hidrofurano. Utilizando um evaporador rotativo, o tetra-hidrofurano foi removido da solução lipidica para deixar o lipido sob a forma de um filme aderente à parede do balão de vidro. A isto foi adicionado 200 ml de salino (BSS; NaCl a 139 mM, 12 ΡΕ0824918 KC1 a 5,4 mM, Tris-HCl a 10 mM, pH 7,6) contendo o isco oligonucleótido de NF-kB (0,7 mg) preparado no Exemplo 1 e a mistura foi agitada e sonicada sob condições normais para fornecer uma suspensão de lipossomas contendo o isco oligonucleótido de NF-κΒ. Esta suspensão de vesículas lipossomais (0,5 ml, conteúdo lipídico 10 mg) foi misturada com virus Sendai purificado (estirpe Z, 10000 unidades hemaglutinadas) exposta à radiação de UV (110 erg/mm2/seg) 3 minutos antes da utilização e a mistura foi preparada para 4 ml com BSS. Esta mistura foi mantida a 4 °C durante 5 minutos e, então, sujeita a uma agitação suave a 37 °C durante 30 minutos. Após o virus Sendai não ligado aos lipossomas ser removido por centrifugação em gradiente de densidades de sacarose, a camada superior foi separada e a sua concentração foi ajustada com BSS para fornecer uma preparação lipossomal contendo o isco oligonucleótido de NF-κΒ a 8 μΜ como armadilha. Uma preparação lipossomal foi similarmente produzida utilizando o isco oligonucleótido manipulado do Exemplo 1 em vez do isco oligonucleótido de NF-kB.

Exemplo 3

Um modelo de reperfusão experimental (1) Método

Após se terem anestesiado ratazanas SD de 9—10 semanas de idade com pentobarbital, foi inserida uma cânula na artéria carótida esquerda adjacente à via aérea 13 ΡΕ0824918 respiratória e situada perto da válvula aórtica do coração (junto ao orifício da artéria coronária). Adicionalmente, a traqueia foi canulada e o animal foi colocado sob suporte respiratório por ligação da cânula traqueal a um respirador artificial. Por conseguinte, foi efectuada uma incisão intercostal esquerda e a ramificação anterior descendente esquerda do coração da ratazana foi ligada para produzir isquemia. Após 30 minutos, a sutura ligada foi cortada para começar a reperfusão. Imediatamente a seguir, foram administrados 1,5 ml/ratazana do isco oligonucleótido de NF-κΒ ou manipulado armadilhado lipossomalmente preparado no Exemplo 2 via a cânula situada perto do orifício da artéria coronária. Após o peito ser fechado, a traqueia foi também suturada e o animal foi mantido vivo. Após 24 horas a ratazana foi anestesiada novamente e o coração foi enucleado e lavado com salino. O ventrículo do coração da ratazana foi dividido em seis secções que foram coradas com cloreto de tetrazólio (TTC) . As seis secções foram respectivamente fotografadas e sujeitas a análise de imagem. As áreas de enfarte foram calculadas segundo a seguinte equação.

Taxa de enfarte (%) = a soma das áreas de enfarte das seis secções/a soma das áreas das seis secções x 100 A análise estatística foi feita por comparação múltipla (ANOVA). 14 ΡΕ0824918 (2) Resultados

Os resultados estão apresentados na Tabela 1. No grupo de controlo não tratado e no grupo de tratamento do isco manipulado, os enfartes de miocárdio apresentaram graus igualmente aproximados. No grupo do isco nucleótido de NF-kB dado, o enfarte foi suprimido a 19% com uma diferença significativa (p < 0,01) relativamente ao grupo não tratado e ao grupo do isco manipulado.

Tabela 1

Grupo do isco nucleótido de NF-kB Grupo do isco manipulado Grupo não tratado Área de enfarte de miocárdio/ 19,2% 28,1% 28,1% área total

Foi observado um efeito inibidor similar quando os lipossomas foram administrados imediatamente antes da indução do enfarte.

Exemplo 4

Inibição da metástase cancerosa (1) Método

Foram administradas intravenosamente a ratos 15 ΡΕ0824918 fêmeas da estirpe C57BL/6 com 7 semanas de idade, células M5076 de sarcoma reticular de células de murino a lxlO4 e 24 horas depois foram administrados intravenosamente 0,2 ml (6 nmoles) de um isco nucleótido de NF-κΒ preparado do mesmo modo que o do Exemplo 2. Um grupo controlo recebeu 0,2 ml de salino na mesma forma. No dia 14 após a administração intravenosa de M5076, o animal foi autopsiado e o número de nódulos tumorais na superfície do fígado foi contado com um microscópio estereoscópico. Cada grupo consistia em 10 ratos. Para a análise estatística, foram utilizados o teste Kruskal-Wallis e a comparação múltipla de Dunnett. (2) Resultados

Enquanto que o número médio de nódulos tumorais no grupo de controlo era de 166 com um valor mediano de 173

(116-198), o grupo de tratamento com o isco de NF-kB apresentou um número médio de 29 e um número mediano de 27 (19-54). Assim, entre o grupo de tratamento com o isco NF-kB e o grupo controlo, foi observada uma diferença significativa ao nível de 1%.

Exemplo 5

Inibição da caquexia (1) Método

Utilizando ratos machos BALB/c com 7 semanas de ΡΕ0824918 idade, foi transplantada subdermicamente uma massa tumoral da linha Colon 26 do cancro do cólon de murino com 2 mm cúbicos. Começando no 7o dia após a transplantação, foram administrados 0,2 ml (6 nmoles) do isco de NF-κΒ ou do isco manipulado na massa tumoral e foi determinado em série o peso do corpo e o peso do tumor. O animal foi autopsiado no 13° dia e a gordura epididimal e o músculo gastrocnêmios foram isolados e pesados. Além disso, foi determinado o peso da carcaça molhada exclusiva de todos os restantes órgãos e tumores. O peso tumoral foi calculado a partir dos diâmetros maior e menor de cada massa tumoral seguindo a seguinte equação.

Peso Tumoral (mg) = diâmetro maior x diâmetro menor2/2

Cada grupo consistia em 10 ratos. Foi efectuada análise estatística por ANOVA num método unidireccional e a comparação múltipla de Dunnett. (2) Resultados

No grupo que alberga o tumor, o crescimento de tumor resultou num decréscimo significativo do peso corporal, do peso da gordura epididimal, do peso do músculo gastrocnêmios, e do peso da carcaça molhada. No grupo do isco NF-κΒ, foram obtidos progressos, chegando aos 47% para o peso corporal, 42% para o peso da gordura epididimal, 60% para o peso do gastrocnêmios, e 52% para o peso da carcaça 17 ΡΕ0824918 molhada. No entanto, não foram observadas melhorias no grupo do isco manipulado. Não existe nenhum efeito definitivo no peso do tumor.

Listagem de Sequências (1) SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: cadeia dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético

(iii) SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 CCTTGAAGGG ATTTCCCTCC (1) SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases 18 ΡΕ0824918 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: cadeia dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético (iii) SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2

TTGCCGTACC TGACTTAGCC

Lisboa, 8 de Junho de 2007

Claims (5)

1. ΡΕ0824918 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um isco NF-κΒ para o fabrico de um medicamento para a terapia e profilaxia de doença associada ao NF-κΒ, em que o isco de NF-κΒ é a sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 1, em que a doença associada ao NF-κΒ é uma doença seleccionada a partir do grupo constituído por doença inflamatória, doença isquémica, doença autoimune, metástase ou invasão cancerosa e caquexia.
2. 2. A utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a doença associada ao NF-κΒ é uma doença seleccionada a partir do grupo constituído por doença isquémica cardíaca, doença isquémica cerebral, doença isquémica pulmonar, nefrite, hepatite, insuficiência renal aguda, esclerose múltipla e tiroidite de Hashimoto.
3. 3. A utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a doença associada ao NF-κΒ é um distúrbio de reperfusão na doença isquémica seleccionada a partir do grupo constituído por, doença isquémica cerebral e doença isquémica pulmonar.
4. 4. A utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a doença associada ao NF-κΒ é um distúrbio de reperfusão na doença isquémica cardíaca. 2 ΡΕ0824918
5. 5. A utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a doença associada ao NF-κΒ é uma metástase ou invasão cancerosa ou caquexia. Lisboa, 8 de Junho de 2007