JP4602298B2 - 医薬製剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＦκＢに結合するＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドを含有する医薬製剤に関するものである。

近年、ヒトゲノムの全塩基配列が解読され、種々の病気が遺伝子疾患を原因として発症することが明らかにされてきており、今後もより多くの病気と遺伝子との関係が解明されると思われる。そして、これらの情報を元に、遺伝子疾患により発症する病気を遺伝子レベルで根本的に治療する、いわゆる遺伝子治療が、難治性疾患に対する新たな治療戦略として注目されている。

例えば、喘息、癌、心臓病、動脈瘤、自己免疫疾患およびウイルス感染症などの種々の疾患は、それぞれ異なる症状を示すにもかかわらず、その大部分は、１種類または数種類のタンパク質が異常発現（過剰発現または過少発現）したことに起因することが示唆されている。一般に、これらタンパク質の発現は、種々の転写活性因子および転写抑制因子などの転写調節因子によって制御されている。

ＮＦκＢは、ｐ６５とｐ５０のヘテロダイマーからなる転写調節因子である。ＮＦκＢは、通常、その阻害因子ＩκＢが結合した形で細胞質内に存在し、その核内移行が阻止されている。ところが、何らかの原因で、サイトカイン、虚血、再灌流などの刺激が加わると、ＩκＢがリン酸化を受けて分解され、それによってＮＦκＢが活性化されて核内に移行する。核内に移行したＮＦκＢは、ゲノム上のＮＦκＢ結合領域に結合し、その下流にある遺伝子の転写を促進する。ＮＦκＢ結合部位の下流にある遺伝子として、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）などの炎症性サイトカイン類、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１などの接着因子が知られている。

また、難治性皮膚疾患の一つであるアトピー性皮膚炎の発症要因としては、アレルゲン、環境汚染、花粉、ストレス等の環境的要因や、過剰免疫システム、皮膚バリア異常等の遺伝的要因が考えられ、これらの要因が複合的に作用して皮膚角質層の水分保持機能やバリア機能が低下し、アレルゲン、刺激物質が皮膚内部へ侵入することにより刺激、痒みが発生する。また、掻爬の繰り返しにより皮膚角質層が損傷を受け、アレルゲン、刺激物質が容易に皮膚内部へ侵入するという悪循環を繰り返す。

アトピー性皮膚炎の病態あるいはアトピー性皮膚炎モデル動物においては、ＮＦκＢの活性上昇がリンパ球の浸潤あるいは活性化を伴う炎症関連遺伝子群（サイトカイン、ケモカイン、接着因子等）の発現上昇を誘導し、病態の発症、進展に重要な役割を果たしていることが知られている。また、尋常性乾癬、接触性皮膚炎などの皮膚疾患においても、ＮＦκＢの活性化が重要なメカニズムの一つであることが示唆されている。

そこで、近年、ＮＦκＢに結合して炎症を引き起こすサイトカイン等の生成を抑制するＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチド（ＮＦκＢ Decoy Oligodeoxynucleotides、以下、ＮＦκＢデコイという）を投与することにより、アトピー性皮膚炎等の疾患原因を根本的に除去する研究が盛んに行われている。

例えば特許文献１〜３には、ＮＦκＢデコイを含むアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患治療用の軟膏製剤が開示されている。また、特許文献４には、リポソームをＮＦκＢデコイのキャリア（ベクター）として用いる方法が開示されている。さらに特許文献５には、核酸医薬を葉酸修飾ナノ粒子に包含させることにより、細胞内送達性を高める方法が開示されている。

しかし、ＮＦκＢデコイは分子量が約１２，０００と極めて大きいため、特許文献１〜３の方法では、掻爬による糜爛（びらん）局面やバリア機能の比較的低い顔面以外では皮膚透過性が低く、疾患部位の細胞内部まで送達されない。そのため、バリア機能の高い部位ではＮＦκＢデコイによる十分な治療効果が得られず、更なる皮膚浸透性、及び細胞内送達性の改善が求められていた。また、特許文献４の方法では、リポソームがリン脂質であるため人体に対する安全性は高い反面、ＮＦκＢデコイの導入効率及び効果の持続性の面で十分ではなかった。さらに特許文献５の方法では、葉酸修飾ナノ粒子の原料となる葉酸−ポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンを合成する工程が別途必要となるため、製造工程数が増加して製剤のコストアップに繋がるという問題点があった。
特許第３７７８３５７号公報 特開２００５−３０６８７７号公報 特開２００６−８９４７５号公報 特再表２００３／０９９３３９号公報 特開２００６−１１１５９１号公報

本発明は、上記問題点に鑑み、バリア機能の高い部位においてもＮＦκＢデコイを皮膚内部まで効率良く送達でき、即効性に優れるとともに、安全性が高く容易に製造可能な医薬製剤を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために本発明の第１の構成は、表面がキトサンまたはキトサン誘導体で被覆され、当該表面にＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが静電的に吸着担持され、かつＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが内部にも封入されている乳酸・グリコール酸共重合体のナノ粒子を含む医薬製剤である。

また本発明の第２の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ナノ粒子を結合剤により複合化するとともに、前記結合剤で形成された外層にＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドをさらに封入したことを特徴としている。

また本発明の第３の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、以下の配列番号１で表されるＮＦκＢ結合配列を含むことを特徴としている。
[Ｇ]ｎＧＧＲＨＴＹＹＨＣ （配列番号１）
（式中、ｎは０または１を、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する。）

また本発明の第４の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、ＮＦκＢ結合配列としてＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２）、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号３）、又はＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号４）の少なくとも一つを含むことを特徴としている。

また本発明の第５の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、配列５′−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３′（配列番号５）及びこれに相補的な配列５′−ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧ−３′（配列番号６）からなる二本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴としている。

また本発明の第６の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有することを特徴としている。

また本発明の第７の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ナノ粒子表面が＋２７ｍＶ以上のゼータ電位を有することを特徴としている。

また本発明の第８の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率が３．５重量％以上であることを特徴としている。

また本発明の第９の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有し、前記ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率が３．５重量％以上３０重量％以下であることを特徴としている。

また本発明の第１０の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ナノ粒子表面が＋２７ｍＶ以上のゼータ電位を有し、前記ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率が３．５重量％以上３０重量％以下であることを特徴としている。

また本発明の第１１の構成は、上記構成の医薬製剤が皮膚疾患の治療に使用されることを特徴としている。

また本発明の第１２の構成は、上記構成の医薬製剤において、皮膚疾患がアトピー性皮膚炎であることを特徴としている。

本発明の第１の構成によれば、乳酸・グリコール酸共重合体で構成され表面がキトサンまたはキトサン誘導体で被覆されたナノ粒子の表面にＮＦκＢデコイを静電的に吸着担持させ、且つナノ粒子内部にも封入することにより、ナノ粒子の高い生体内浸透性により細胞内部へＮＦκＢデコイを効率的に導入可能であり、人体への安全性にも優れた医薬製剤を提供することができる。また、製剤中のＮＦκＢデコイ含量を高めて標的部位まで効率良く送達することができ、且つ剤形の小型化も可能な医薬製剤が提供される。また、ナノ粒子の表面に担持されたＮＦκＢデコイにより製剤の即効性を高めつつ、ナノ粒子の内部に封入されたＮＦκＢデコイを徐々に放出させることにより製剤の持続性を高めることができる。

また、本発明の第２の構成によれば、上記第１の構成の医薬製剤において、結合剤によってナノ粒子を複合化するとともに、ナノ粒子表面に形成される結合剤層にもＮＦκＢデコイを封入することにより、ナノ粒子表面へのＮＦκＢデコイの担持量を増加することができる。さらに、複合化によってナノ粒子の取り扱い性も向上する。

また、本発明の第３の構成によれば、上記第１又は第２の構成の医薬製剤において、一般式（１）で表されるＮＦκＢ結合配列を含むＮＦκＢデコイを用いることにより、ゲノム上の本来の結合部位へのＮＦκＢの結合を防止してサイトカイン等の生成及びそれに伴う炎症の発生を効果的に抑制する医薬製剤となる。

また、本発明の第４の構成によれば、上記第３の構成の医薬製剤において、ＮＦκＢ結合配列としてＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２）、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号３）、又はＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号４）の少なくとも１つを含むＮＦκＢデコイを用いることにより、ＮＦκＢがより良好に結合する好適な医薬製剤となる。

また、本発明の第５の構成によれば、上記第４の構成の医薬製剤において、配列５′−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３′（配列番号５）及び５′−ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧ−３′（配列番号６）の相補的二本鎖からなるＮＦκＢデコイを用いることにより、ＮＦκＢが特に良好に結合する好適な医薬製剤となる。

また、本発明の第６の構成によれば、上記第１乃至第５のいずれかの構成の医薬製剤において、ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有することにより、負帯電した細胞壁へのナノ粒子の吸着性が高まるため、表面に担持されたＮＦκＢデコイの細胞内への到達効率を向上させることができる。

また、本発明の第７の構成によれば、上記第６の構成の医薬製剤において、ナノ粒子表面が＋２７ｍＶ以上のゼータ電位を有することにより、負帯電した細胞壁へのナノ粒子の吸着性がさらに向上する。

また、本発明の第８の構成によれば、上記第１乃至第５のいずれかの構成の医薬製剤において、ナノ粒子中のＮＦκＢデコイの含有率を３．５重量％以上とすることにより、ナノ粒子中のＮＦκＢデコイの含有率を高めて製剤中へのナノ粒子の配合量を抑制することができる。

また、本発明の第９の構成によれば、上記第１乃至第５のいずれかの構成の医薬製剤において、ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有し、ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率を３．５重量％以上３０重量％以下とすることにより、負帯電した細胞壁へのナノ粒子の吸着性を高め、且つ製剤中へのナノ粒子の配合量を抑えつつ粒子径の増大も抑制する適度な含有率となる。

また、本発明の第１０の構成によれば、上記第９の構成の医薬製剤において、ナノ粒子表面が＋２７ｍＶ以上のゼータ電位を有し、ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率を３．５重量％以上３０重量％以下とすることにより、負帯電した細胞壁へのナノ粒子の吸着性をより高めることができる。

また、本発明の第１１の構成によれば、上記第１乃至第１０のいずれかの医薬製剤を皮膚疾患治療用に用いることにより、ナノ粒子の皮膚浸透効果及び細胞壁への吸着効果により皮膚疾患に対し優れた治療効果を発現する。

また、本発明の第１２の構成によれば、上記第１１の構成において、対象とする皮膚疾患をアトピー性皮膚炎とすることにより、難治性の皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎に対し優れた治療方法を提供する。

本発明の医薬製剤に用いられる生体適合性ナノ粒子は、生体適合性高分子をナノ単位の大きさの粒子（ナノスフェア）とし、核酸化合物であるＮＦκＢデコイをナノ粒子表面に担持させたものである。このナノ粒子を生体内部に浸透させることにより、ＮＦκＢデコイを疾患部位にまで到達させるとともに、ナノ粒子表面からＮＦκＢデコイを放出させることができるため、医薬製剤の材料として好適に用いることができる。

本発明の医薬製剤の薬効成分であるＮＦκＢデコイは、ＮＦκＢが結合するゲノム上の結合領域と競合して、ＮＦκＢと選択的に結合するデコイとして作用する。

本明細書中において「デコイ」とは、本来転写因子が結合すべきゲノム上の結合領域に似せた構造を有する、いわゆる「おとり分子」を指す。デコイの共存下では、転写因子の一部は、本来結合すべきゲノム上の結合領域に結合せず、結合領域の「おとり」として機能するデコイに結合する。このため、本来の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、転写因子の活性が低下することになる。

デコイとしては、前記、配列番号１で表される結合配列の両端に任意のヌクレオチドが連結されたオリゴヌクレオチドが一般的である。この結合配列両端のヌクレオチド部分は付加配列とも呼ばれ、１以上の塩基から成り、好ましくは１〜２０ヌクレオチド、より好ましくは１〜１０ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜７ヌクレオチドから成る。またデコイの全鎖長は限定されず通常は１５〜３５ヌクレオチドであるが、好ましくは１６〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１７〜２５ヌクレオチドである。

またＮＦκＢデコイは、ＮＦκＢの結合配列を１つ以上含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、この二本鎖は完全に相補的な配列であることが好ましい。即ち、５′−５′末端付加配列−結合配列−３′末端付加配列−３′という構成のセンス鎖オリゴヌクレオチドと、それに相補的なアンチセンス鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドが典型的なＮＦκＢデコイの構成として挙げられる。

なお、１以上（通常は１又は２組）の非相補的な塩基対を含んでいても、ＮＦκＢと結合し得る限り本明細書中のＮＦκＢデコイに包含される。さらに、５′末端付加配列と３′末端付加配列との間に複数の結合配列がタンデムに直接、または１〜数個のヌクレオチドを挟んで連結されている複数の転写因子結合部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドも、他のＮＦκＢデコイの構成として挙げられる。

さらにまた、一本鎖のオリゴヌクレオチドであっても、分子内に結合配列とその相補的配列とを有し、これらが分子内で二本鎖を形成しているような、いわゆるリボン型デコイ又はステイプル型デコイと呼ばれるものも、ＮＦκＢが結合する限り本明細書にいうＮＦκＢデコイに含まれる。

ＮＦκＢの結合配列は、種々の文献（例えば非特許文献１）に記載されており、具体的な結合配列としては、以下の配列番号１で表される。
[Ｇ]ｎＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（配列番号１）
（式中、ｎは０または１を、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する。）
具体的には、例えばＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２）、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号３）またはＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号４）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「分子細胞生物学辞典」（東京化学同人 1997年発行）891頁

本発明に用いられる好ましいＮＦκＢデコイの具体例としては、５′−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３′（配列番号５）及びその相補体である５′−ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧ−３′（配列番号６）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、５′−ＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣ−３′（配列番号７）及びその相補体である５′−ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＣＡＡＣＴ−３′（配列番号８）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、及び５′−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３′（配列番号９）及びその相補体である５′−ＧＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴ−３′（配列番号１０）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド等が挙げられる。

本発明で用いられるＮＦκＢデコイの製造方法としては、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができ、例えばＤＮＡ合成装置を用いて直接合成しても良いし、オリゴヌクレオチド又はその一部を合成した後、ＰＣＲ法又はクローニングベクター法等を用いて増幅しても良い。さらに、これらの方法により得られたオリゴヌクレオチドを制限酵素等を用いて切断するか、或いはＤＮＡリガーゼ等を用いて結合等を行い、ＮＦκＢデコイを製造しても良い。

また、本発明に用いられるＮＦκＢデコイは１つ以上の修飾された結合や核酸を含有していても良い。このような修飾された結合としては、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、メトキシエチルホスホエート、モルホリノホスホロアミデート等を、修飾された核酸としてはペプチド核酸（peptide nucleic acid：ＰＮＡ）、ロックド核酸（locked nucleic acid：ＬＮＡ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）化およびＯ−メチル化等で修飾された塩基を有する核酸等が挙げられる。前記結合の中でもホスホロチオエートがより好ましい。

ＤＮＰ化およびＯ−メチル化等は、通常はリボヌクレオシド（ＲＮＡ）に対する修飾であるが、本発明においては、オリゴヌクレオチド中の修飾するデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を、ＲＮＡの場合と同様にしてオリゴヌクレオチドを合成し、該塩基を修飾することが可能である。

また、デコイ又はデコイ候補となるオリゴヌクレオチドが転写因子に結合するか否かは結合活性試験により確認することができる。ＮＦκＢデコイの場合、ＮＦκＢに対する結合活性試験は、例えば、TransAM ＮＦκＢ p65 Transcription Factor Assay Kit（商品名、ACTIVE MOTIF 社）を用いて、当該キットに添付の資料に基づいて、又は当業者が日常的に行う程度のプロトコルの改変により、容易に実施することができる。

本発明に用いられるナノ粒子の製造方法としては、ＮＦκＢデコイおよび生体適合性高分子を１，０００ｎｍ未満の平均粒径を有する粒子に加工することができる方法であれば特に限定されるものではないが、球形晶析法を好適に用いることができる。球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法である。この球形晶析法の一つに、エマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。

ＥＳＤ法は、次に示すような原理によって、ナノスフェア（ナノ粒子）を製造する技術である。本法には、薬物を封入する基剤ポリマーとなる乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を溶解できる良溶媒と、これとは逆にＰＬＧＡを溶解しない貧溶媒の二種類の溶媒が用いられる。この良溶媒には、ＰＬＧＡを溶解し、且つ貧溶媒へ混和するアセトン等の有機溶媒を用いる。そして、貧溶媒には、通常、ポリビニルアルコール水溶液等を用いる。

操作手順としては、まず、良溶媒中にＰＬＧＡを溶解後、このＰＬＧＡが析出しないように、薬物溶解液を良溶媒中へ添加混合する。このＰＬＧＡと薬物を含む混合液を、貧溶媒中に攪拌下、滴下すると、混合液中の良溶媒（有機溶媒）が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の自己乳化が起き、サブミクロンサイズの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内のＰＬＧＡ並びに薬物の溶解度が低下し、最終的に、薬物を包含した球形結晶粒子のＰＬＧＡナノスフェアが生成する（以上、ナノ粒子形成工程）。

上記球形晶析法では、物理化学的な手法でナノ粒子を形成でき、しかも得られるナノ粒子が略球形であるため、均質なナノ粒子を、触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要なく、容易に形成することができる。その後、良溶媒である有機溶媒を減圧留去し（溶媒留去工程）、ナノ粒子粉末を得る。そして、得られた粉末をそのまま、或いは必要に応じて凍結乾燥等により複合化し（複合化工程）、複合粒子とする。

上記良溶媒および貧溶媒の種類は、目的となる薬物の種類等に応じて決定されるものであり特に限定されるものではないが、ナノ粒子は人体へ直接投与する医薬製剤の原料として用いられるため、人体に対して安全性が高く、且つ環境負荷の少ないものを用いる必要がある。このような貧溶媒としては、例えばポリビニルアルコール水溶液が好適に用いられ、ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

良溶媒としては、低沸点の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等が挙げられるが、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみ、若しくはアセトンとエタノールの混合液が好適に用いられる。なお、余剰のポリビニルアルコールが残存している場合は、溶媒留去工程の後に、遠心分離等によりポリビニルアルコールを除去する工程（除去工程）を設けても良い。

ポリビニルアルコール水溶液の濃度についても、球形造粒結晶の粒径（本発明の場合ナノオーダー）等に応じて適宜決定すればよいが、ポリビニルアルコール水溶液の濃度が高いほどナノ粒子表面へのポリビニルアルコールの付着が良好となり、乾燥後の水への再分散性が向上する反面、ポリビニルアルコール水溶液の濃度が所定以上になると、貧溶媒の粘度が上昇して良溶媒の拡散性に悪影響を与える。そのため、ポリビニルアルコールの重合度やけん化度によっても異なるが、ナノ粒子形成工程後に除去工程を設ける場合は０．１重量％以上１０重量％以下が好ましく、２％程度がより好ましい。なお、除去工程を設けない場合は０．５重量％以下とすることが好ましい。

以上のようにして得られたナノ粒子は、凍結乾燥等により粉末化させる際に再分散可能な凝集粒子（ナノコンポジット）に複合化できる。このとき、有機または無機の物質を結合剤として用いて再分散可能に複合化させ、ナノ粒子と共に乾燥させることもできる。例えば、糖アルコールや糖と共に複合化することにより、封入率のばらつきを効果的に防止するとともに、糖アルコール等が賦形剤（結合剤）となりナノ粒子の取り扱い性を高めることができる。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール等が、糖としては、トレハロース、マルチトース、キシリトース等が挙げられ、この中でも特にトレハロースが好ましい。

この複合化により、使用前まではナノ粒子が集まった、取り扱いやすい凝集粒子となっており、使用時に水分に触れることでナノ粒子に戻って高反応性等の特性を復元する複合粒子となる。ナノ粒子の複合化方法としては、凍結乾燥法が好適に用いられる。また、流動層乾燥造粒法により複合化しても良い。特に、流動層乾燥造粒法の中でも粒子化する材料を含む混合物を流動ガス中に噴霧する噴霧乾燥式流動層造粒法を用いた場合、時間と手間のかかる凍結乾燥工程を省略可能となり、複合粒子を容易に且つ短時間で製造できるため工業化にも有利となる。

なお、噴霧乾燥式流動層造粒法においては、結合剤として結晶性の弱い糖や糖アルコールを用いると、複合化の際に非晶質（アモルファス）化してしまい良好に粒子化できなくなる。そのため、結晶性の強いマンニトールを用いることが好ましい。

次に、ナノ粒子表面にＮＦκＢデコイを付着させる方法について説明する。ここでは、凍結乾燥によりナノ粒子を複合化する際、ナノ粒子表面へＮＦκＢデコイを静電気的に担持させる静電気的付着法を用いる。水溶液中でアニオン分子として存在するＮＦκＢデコイをナノ粒子表面へ静電気的に担持させるためには、ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有するように帯電させておく必要がある。

一般に、液体中に分散された粒子の多くは正又は負に帯電しており、逆の電荷を有するイオンが粒子表面に強く引き寄せられ固定された層（固定層）と、その外側に存在する層（拡散層）とで、いわゆる拡散電気二重層が形成されており、拡散層の内側の一部と固定層とが粒子と共に移動するものと推定される。

ゼータ電位は、粒子から十分に離れた電気的に中性な領域の電位を基準とした場合の、上記移動が生じる面（滑り面）の電位である。ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなって粒子の安定性は高くなり、逆にゼータ電位が０に近づくにつれて粒子は凝集を起こしやすくなる。そのため、ゼータ電位は粒子の分散状態の指標として用いられている。

上記ナノ粒子形成工程においてカチオン性高分子を貧溶媒中に添加すると、形成されたナノ粒子の表面がカチオン性高分子により修飾（被覆）され、粒子表面のゼータ電位が正となる。そして、凍結乾燥によりナノ粒子を複合化する際にＮＦκＢデコイを添加することにより、水溶液中で負の電荷を持つアニオン分子となったＮＦκＢデコイが静電気的相互効果によりナノ粒子表面に所定量担持される。

また、生体内の細胞壁は負に帯電しているが、従来の球形晶析法で製造されたナノ粒子の表面は、一般的に負のゼータ電位を有しているため、電気的反発力によりナノ粒子の細胞接着性が悪くなるという問題点があった。従って、本発明のようにカチオン性高分子を用いてナノ粒子表面が正のゼータ電位を有するように帯電させることは、負帯電の細胞壁に対するナノ粒子の接着性を増大させ、ＮＦκＢデコイの細胞内移行性を向上させる観点からも好ましい。

ＮＦκＢデコイが粒子表面に静電気的に担持されたナノ粒子の構造を図１に示す。生体適合性ナノ粒子１の表面はポリビニルアルコール２で被覆され、さらにその外側をカチオン性高分子３で被覆されており、カチオン性高分子３により正のゼータ電位を有している。ＮＦκＢデコイ４は、ナノ粒子１表面に静電気的に担持されている。

なお、凍結乾燥の前に、遠心分離等により余剰のポリビニルアルコールを除去する除去工程を設ける場合は、ポリビニルアルコールと共に粒子表面のカチオン性高分子も一部除去されてしまう可能性がある。そのため、除去工程の後に再度ナノ粒子をカチオン性高分子溶液に浸漬する工程を設けることが好ましい。

カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）、細胞膜（生体膜）の構成成分であるリン脂質極性基（ホスホリルコリン基）と重合性に優れたメタクリロイル基とを併せ持つ２−メタクリロイルオキシエチルホスホルコリン（ＭＰＣ）を構成単位とする高分子に第４級アンモニウム塩等のカチオン基を結合させたカチオン性高分子（例えばＭＰＣと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとのコポリマー）等が挙げられるが、特にキトサン或いはその誘導体が好適に用いられる。

キトサンは、エビやカニ、昆虫の外殻に含まれる、アミノ基を有する糖の１種であるグルコサミンが多数結合した天然高分子であり、乳化安定性、保形性、生分解性、生体適合性、抗菌性等の特徴を有するため、化粧品や食品、衣料品、医薬品等の原料として広く用いられている。このキトサンを貧溶媒中に添加することにより、正のゼータ電位を有するとともに、生体への悪影響がなく安全性の高いナノ粒子を製造することができる。

なお、カチオン性高分子の中でもカチオン性のより強いものを用いることにより、ゼータ電位がより大きな正の値となるため、粒子表面により多くのＮＦκＢデコイを担持可能になるとともに、粒子間の反発力が強くなって粒子の安定性も高くなる。例えば、元来カチオン性であるキトサンの一部を第四級化することで、さらにカチオン性を高めた塩化Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］キトサン等のキトサン誘導体（カチオニックキトサン）を用いることが好ましい。

ところで、従来の球形晶析法を用いてＮＦκＢデコイを封入したナノ粒子を製造しようとすると、良溶媒中に分散混合した水溶性のＮＦκＢデコイが貧溶媒中に漏出、溶解してしまい、ナノ粒子を形成する高分子だけが沈積するため、ＮＦκＢデコイがほとんど封入されなかった。しかし、ナノ粒子形成工程において貧溶媒中にカチオン性高分子を添加すると、ナノ粒子内部にもＮＦκＢデコイを封入できるようになる。これは、ナノ粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルジョン滴表面に存在するＮＦκＢデコイと相互作用し、貧溶媒中へのＮＦκＢデコイの漏出を抑制するためであると考えられる。

ＮＦκＢデコイが粒子表面に静電気的に担持され、さらに粒子内部にも封入されたナノ粒子の構造を図２に示す。ＮＦκＢデコイ４は、カチオン性高分子３で被覆されたナノ粒子１の表面に静電気的に担持されるとともに、ナノ粒子１の内部にも封入されている。従って、ナノ粒子内部への封入が極めて困難であったＮＦκＢデコイの、ナノ粒子内部及び表面を合わせたトータルの含有率を高めることができる。また、投与直後にナノ粒子の表面から溶け出すＮＦκＢデコイとは別に、ナノ粒子内部から徐放的に放出されるＮＦκＢデコイを作用させることで、医薬製剤に即効性と持続性の両方を付与することができる。

このとき、良溶媒中にＮＦκＢデコイと効能や作用機序の異なる他の薬効成分を溶解して、ナノ粒子内部に１種又は複数種封入しても良い。この場合、ＮＦκＢデコイと他の薬効成分との相乗効果により薬効の促進が期待できる。

また、良溶媒中でのＮＦκＢデコイの親和性及び分散安定性を向上させるため、良溶媒中にN-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium salts（ＤＯＴＡＰ）等のカチオン性脂質を添加し、ＮＦκＢデコイと複合体を形成させても良い。但し、細胞内において放出されたカチオン性脂質により細胞障害性を示すおそれがあるため、添加量には注意が必要である。

また、ナノ粒子を結合剤と共に複合化する際、結合剤により形成される外層にＮＦκＢデコイをさらに封入しても良い。これにより、ナノ粒子表面へのＮＦκＢデコイ担持量を一層増加させることができる。

本発明に用いられる生体適合性高分子は、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが望ましい。また、表面に担持或いは内包するＮＦκＢデコイを持続して徐々に放出する粒子であることが好ましい。このような素材としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができ、特にＰＬＧＡを好適に用いることができる。ＰＬＧＡナノ粒子はＮＦκＢデコイを内包可能であり、ＮＦκＢデコイの効力を保持したまま長期間保存可能である。

また、薬物を目標組織／器官に効率的に到達させる技術、いわゆるDrug Delivery System（以下、ＤＤＳという）のキャリアとしての評価は、細胞への到達率、細胞内への取り込み性、及び細胞内での効果の発現性によって決まる。細胞内への取り込み率は膜融合リポソームが最も高いが、ＰＬＧＡナノ粒子の表面をカチオン性高分子で修飾することにより取り込み率をリポソームと同等のレベルまで引き上げることが可能である。アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患を対象とした経皮製剤への適用には、脂質二重膜で覆われた液体分散型粒子であるリポソームはその構造、形態を維持しつつ皮膚バリアを通過することが困難であるとともに、多様な成分より成る製剤中でその構造を安定的に保持し難い。一方、ＰＬＧＡナノ粒子は固体分散型粒子であり、上記アプリケーションの使用においてもその構造を維持しつつ皮膚深部へ薬剤を効率良く送達することが可能である。さらに、ＰＬＧＡの加水分解・長期半減期の特徴から、数日から１ヶ月単位の徐放ができると考えられる。これらの特徴から、ＰＬＧＡナノ粒子はＤＤＳの優れたキャリアとなる。

ＰＬＧＡの分子量は、５，０００〜２００，０００の範囲内であることが好ましく、１５，０００〜２５，０００の範囲内であることがより好ましい。乳酸とグリコール酸との組成比は１：９９〜９９：１であればよいが、乳酸１に対しグリコール酸０．３３３であることが好ましい。また、乳酸およびグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％の範囲内であるＰＬＧＡは、非晶質であり、かつアセトン等の有機溶媒に可溶であるから、好適に使用される。

また、ＰＬＧＡの表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾しておくと、水溶性の核酸化合物とＰＬＧＡとの親和性が向上し、封入が容易になるため好ましい。また、アミノ酸のような荷電基あるいは官能基化し得る基を有していてもよい。

上記以外の生体適合性高分子としては、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテルおよびポリビニルエステルのようなポリビニル化合物、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート、アクリル酸とメタクリル酸とのポリマー、セルロースおよび他の多糖類、ならびにペプチドまたはタンパク質、あるいはそれらのコポリマーまたは混合物が挙げられる。

また、ナノ粒子の表面への担持に加えて、ナノ粒子内部にもＮＦκＢデコイを封入する場合、表面に担持されるＮＦκＢデコイと内部に封入されるＮＦκＢデコイとの割合は、医薬製剤に要求される即効性、持続性の程度等により適宜設定することができる。即ち、投与直後より効果の発現が要求される製剤の場合は、ナノ粒子の表面への担持割合を高くすれば良い。一方、投与後長期間に亘る効果の持続性が要求される製剤の場合は、ナノ粒子内部への封入割合を高くすれば良い。

ナノ粒子中のＮＦκＢデコイ含有率が高いほど、製剤中に配合するナノ粒子量を少なくできるため好ましいが、ナノ粒子表面に担持可能なＮＦκＢデコイ量には限界がある。また、ＮＦκＢデコイをナノ粒子内部にも封入する場合は、製造上の理由から封入率に比例してナノ粒子の粒子径も大きくなるため、ナノ粒子が生体深部まで到達し難くなる。そのため、表面担持及び内包されるＮＦκＢデコイのトータルの含有率は０．５重量％以上３０重量％以下が好ましい。

ナノ粒子表面へのＮＦκＢデコイの付着量は、カチオン性高分子の種類及び添加量や凍結乾燥時に添加するＮＦκＢデコイ量の調整により変更可能である。凍結乾燥時に追加するＮＦκＢデコイ量としては、生体適合性高分子に対する重量比を０．００１以上１．０以下とすることが好ましい。生体適合性高分子に対する重量比が０．００１以下の場合、ＮＦκＢデコイの濃度が低すぎてナノ粒子表面への付着率が低くなり、１．０以上の場合、静電気的に担持可能な量を大幅に超えてしまい、ナノ粒子表面へ吸着されない余剰のＮＦκＢデコイが多くなって付着効率が悪くなる。

一方、ナノ粒子内部へのＮＦκＢデコイの封入量は、ナノ粒子形成時に添加するＮＦκＢデコイ量やカチオン性高分子の種類及び添加量の調整、ナノ粒子を形成する生体適合性高分子の種類により変更可能である。ナノ粒子形成時に有機溶媒に混合するＮＦκＢデコイ量としては、生体適合性高分子に対する重量比を０．００１以上１．０以下とすることが好ましい。生体適合性高分子に対する重量比が０．００１以下の場合、良溶媒中でのＮＦκＢデコイの濃度が低すぎてナノ粒子内部への封入率が低くなり、１．０以上の場合、良溶媒中でのＮＦκＢデコイの分散性が低下して添加量に対する封入効率が悪くなる。

本発明で製造される生体適合性ナノ粒子は、１，０００ｎｍ未満の平均粒子径を有するものであれば特に制限はないが、標的部位にＮＦκＢデコイを導入するためナノ粒子を細胞内に取り込ませる必要がある。標的細胞内への浸透効果を高めるためには、平均粒子径を５００ｎｍ以下とすることが好ましく、５０ｎｍから３００ｎｍがさらに好ましい。

特に、経皮投与用途に用いられる場合、標的部位に送達されたナノ粒子が細胞膜のエンドサイトーシスを受けて細胞内に取り込まれることにより、高い遺伝子発現効率を実現するためには１００ｎｍ以下がより好ましい。また、一般に、皮膚細胞の大きさは１５，０００ｎｍ、皮膚細胞間隔は皮膚の浅い所と深い所でバラツキがあるが、７０ｎｍ程度であると考えられているため、ナノ粒子の平均粒子径を１００ｎｍ以下とすることで、皮膚への浸透性が非常に高いナノ粒子となる。

また、貧溶媒中のカチオン性高分子の濃度が高くなるほどナノ粒子表面のゼータ電位も上昇するが、それにつれてナノ粒子の粒子径も大きくなる。アニオン性のＮＦκＢデコイを静電気的に担持させ、且つ細胞接着性を向上させるためにはゼータ電位がなるべく高い方が好ましいが、粒子径の増大は皮膚浸透性を低下させる。従って、カチオン性高分子の濃度を皮膚浸透し得る粒子径（複合化前の一次粒子径で２００〜３００ｎｍ）のナノ粒子を構築可能な濃度に設定する必要があり、例えばカチオン性高分子としてキトサンを用いる場合、貧溶媒中のキトサン濃度を２ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。

このようにして製造されたＮＦκＢデコイ担持ナノ粒子を医薬製剤の原料として用いた場合、高濃度のＮＦκＢデコイを含有するため剤形の小型化が可能となり、皮下及び静脈注射用、経肺投与用、或いは経皮、経口投与用等の種々の用途に使用することができる。特に、難治性の皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎用の経皮投与用製剤とした場合、副作用が心配されるステロイド系薬剤等を使用せざるを得ない現状の治療戦略に画期的な変化をもたらすなど、その寄与するところは非常に大きいと考えられる。

皮下または静脈内等への注射用製剤に用いる場合は、ナノ粒子を生体適合性の緩衝液、例えばハンクスの溶液、リンゲル溶液、緩衝化生理食塩水等の水溶液、或いはゴマ油等の脂肪酸、オレイン酸エチルやトリグリセリド等の合成脂肪エステルのような油性溶媒に分散して、水性または油性の注射懸濁液とすることが好ましい。

経皮製剤に用いる場合は、ワセリン、ラノリン、パラフィン、ろう、硬膏剤、樹脂、プラスチック、高級アルコール類、グリコール類、グリセリン等の基剤と共に、必要に応じて水や乳化剤、懸濁化剤等を配合して混合し、軟膏、クリーム剤、ローション、或いはゲル剤等とすることが好ましい。

また、経口製剤に用いる場合は、粒子表面に担持されたＮＦκＢデコイが消化酵素による分解を受けにくくなるように、キトサンや糖アルコール等の賦形剤を用いて錠剤化するか、カプセル内に充填してカプセル剤とすることが好ましい。

なお、上記製剤中に、薬効成分以外の任意の成分、例えば粘性多糖類、リン酸塩、尿素、リン脂質等の浸透促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、油脂、水溶性高分子、着色料、香料、紫外線吸収剤、酸化防止剤、防腐剤等を、本発明の効果を妨げない範囲で配合することができる。

その他、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明の医薬製剤について実施例及び比較例により更に具体的に説明する。なお、以下の実施例及び比較例においては、配列５′−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３′（配列番号５）及びその相補的配列５′−ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧ−３′（配列番号６）の二本鎖オリゴヌクレオチド（二本鎖オリゴヌクレオチド中の全ての塩基間結合はホスホロチオエート結合である）から成るＮＦκＢデコイを用いた。
［ＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアの調製法］

ＮＦκＢデコイ５０ｍｇを精製水６ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬工業（株）製ＰＬＧＡ７５２０（商品名）、分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸モル比＝７５／２５）１ｇをその良溶媒であるアセトン４３ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、前記ＮＦκＢデコイの水溶液を添加、混合し混合液とした。また、２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：クラレ社製ポバール４０３（商品名）、重合度約３００、けん化度約８０ｍｏｌ％）水溶液２５ｍＬ中に２重量％カチオニックキトサン（モイスコートＰＸ（商品名）、片倉チッカリン製）水溶液５ｇを混合し貧溶媒とした。この貧溶媒中に前記混合液を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。

続いて、減圧下アセトンを留去した後、得られたナノスフェアの懸濁液にＮＦκＢデコイ２０ｍｇをさらに添加し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、ナノスフェア表面にＮＦκＢデコイが担持され、ナノスフェア内部にＮＦκＢデコイが封入された水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ内包／表面担持型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

実施例１で得られたナノスフェアの懸濁液にＮＦκＢデコイ３０ｍｇをさらに添加し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ内包／表面担持型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

ＮＦκＢデコイ６０ｍｇを用いてＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を調製する以外は、実施例１と全く同様の方法により、水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ内包／表面担持型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬工業（株）製ＰＬＧＡ７５２０（商品名））１ｇをその良溶媒であるアセトン４３ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、精製水６ｍＬを添加、混合し混合液とした。また、２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ポバール４０３（商品名）、クラレ社製）水溶液２５ｍＬ中に２重量％カチオニックキトサン（モイスコートＰＸ（商品名）、片倉チッカリン製）水溶液５ｇを混合し貧溶媒とした。この貧溶媒中に前記混合液を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。

続いて、減圧下アセトンを留去した後、得られたナノスフェアの懸濁液にＮＦκＢデコイ３０ｍｇを添加し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、ナノスフェア表面にＮＦκＢデコイが担持された水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ表面担持型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

比較例１

ＮＦκＢデコイ５０ｍｇを精製水６ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬工業（株）製ＰＬＧＡ７５２０（商品名））１ｇをその良溶媒であるアセトン４３ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、前記ＮＦκＢデコイの水溶液を添加、混合し混合液とした。また、２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ポバール４０３（商品名）、クラレ社製）水溶液２５ｍＬを貧溶媒とした。この貧溶媒中に前記混合液を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。

続いて、減圧下アセトンを留去した後、遠心分離操作（２０，０００ｒｐｍ、２０分）により余剰のポリビニルアルコールを除去し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、水への再分散性の良好なＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

比較例２

ＮＦκＢデコイ５０ｍｇを精製水６ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬工業（株）製ＰＬＧＡ７５２０（商品名））１ｇをその良溶媒であるアセトン４３ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、前記ＮＦκＢデコイの水溶液を添加、混合し混合液とした。また、２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ポバール４０３（商品名）、クラレ社製）水溶液２５ｍＬ中に２重量％カチオニックキトサン（モイスコートＰＸ（商品名）、片倉チッカリン製）水溶液５ｇを混合し貧溶媒とした。この貧溶媒中に前記混合液を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。

続いて、減圧下アセトンを留去した後、遠心分離操作（２０，０００ｒｐｍ、２０分）により余剰のポリビニルアルコールを除去し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ内包型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

比較例３

実施例４で得られたＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を−４５℃で凍結乾燥し粉末化した後、ＮＦκＢデコイ粉末をＰＬＧＡに対し２重量％の割合で均一に混合してＮＦκＢデコイとＰＬＧＡナノスフェアの混合粉末を得た。

実施例１〜４及び比較例１〜３で得られたＰＬＧＡナノスフェアを水中へ再分散させた際の平均粒子径を動的光散乱法（測定装置：ＭＩＣＲＯＴＲＡＣ ＵＰＡ（商品名）、HONEYWELL社製）により測定した。また、凍結乾燥後の粒子表面のゼータ電位をゼータ電位計（ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ Ｎａｎｏ−Ｚ（商品名）、Malvern Instruments 社製）を用いて測定した。さらに、分光光度計（Ｖ−５３０（商品名）、日本分光製、測定波長２６０ｎｍ）を用いて粒子中のＮＦκＢデコイ含有率（ＰＬＧＡナノスフェアに対するＮＦκＢデコイの重量比）を定量した。測定結果を表１に示す。また、比較例１〜３で得られたナノスフェアの構造を図３〜図５に模式的に示す。なお、実施例１〜３で得られたナノスフェアの構造は図２、実施例４で得られたナノスフェアの構造は図１で示される。

※含有率の理論値（％）＝ＰＬＧＡナノスフェアに対するＮＦκＢデコイの仕込み量 ×１００を（内包＋表面担持）に分けて示した。

表１に示すように、凍結乾燥後におけるＰＬＧＡナノスフェアの平均粒子径は、実施例１〜４、比較例１〜３の順に、それぞれ３５５ｎｍ、５３３ｎｍ、４７４ｎｍ、４１３ｎｍ、２８０ｎｍ、３６０ｎｍ、及び４６６ｎｍであり、おおよそ２８０ｎｍ〜５３０ｎｍの範囲に分布していた。

また、貧溶媒中にキトサンを添加した実施例１〜４、比較例２、３のナノスフェア表面のゼータ電位は、それぞれ＋４６．８１ｍＶ、＋２７．０７ｍＶ、＋４３．０７ｍＶ、＋５５．８３ｍＶ、＋４．８９５ｍＶ、及び＋８８．１１ｍＶであり、粒子表面はプラスに帯電されていた。なお、比較例２のゼータ電位が他に比べて低いのは、遠心分離操作によりポリビニルアルコールと共に粒子表面のキトサンが除去されたためであると推認された。一方、貧溶媒中にキトサンを添加しなかった比較例１のナノスフェア表面のゼータ電位は−３４．１６ｍＶであり、粒子表面はマイナスに帯電されていた。

さらに、実施例１〜実施例４、及び比較例２のナノスフェアでは、ＮＦκＢデコイの含有率がそれぞれ３．５％、４．２％、５．５％、２．４％、及び４．５％であり、それぞれの理論値と同等若しくはそれ以上の封入率が得られた。これは、ナノ粒子１の表面に吸着されたカチオン性高分子（キトサン）３がＮＦκＢデコイ４を静電気的に担持するとともに、貧溶媒中へのＮＦκＢデコイ４の漏出を抑制してナノスフェア内部へのＮＦκＢデコイ４の封入が可能となったため（図１、図２及び図４参照）であると推認された。

なお、実施例１〜３において、粒子に内包されるＮＦκＢデコイ含有率の理論値（３．０％及び３．６％）が、比較例２（４．８％）よりも低いのは、実施例１〜３では遠心分離操作を行わないため、比較例２に比べて粒子表面のキトサンやポリビニルアルコールの付着量が多く、含有率の算出において分母となるＰＬＧＡナノスフェアの総重量が大きくなっているためである。

一方、貧溶媒中にキトサンを添加しなかった比較例１のナノスフェアは、内部にＮＦκＢデコイがほとんど封入されていなかった。この結果より、比較例１においては水溶性であるＮＦκＢデコイが外相である貧溶媒中に漏出し、図３に示すようにＰＬＧＡのみが沈積してナノスフェアを形成したものと推認された。
［ＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアからのＮＦκＢデコイ溶出試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）］

実施例１と同様の方法により調製したＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のＰＬＧＡナノスフェア（平均粒子径４６９ｎｍ、ＮＦκＢデコイ含有率５．４％）、及び比較例２と同様の方法により調製したＮＦκＢデコイ内包型のＰＬＧＡナノスフェア（平均粒子径３１６ｎｍ、ＮＦκＢデコイ含有率３．４％）を５００ｍｇずつ秤量し、それぞれ生理食塩水５０ｍＬに分散した。分散液を３２±０．５℃の温水浴中で攪拌した。その後、所定時間毎に５ｍＬずつサンプリングを行い、１０ＮのＮａＯＨ水溶液を１００μＬ添加した後、メンブランフィルタ（０．２μｍ）でろ過した。ろ過液１ｍＬを３．３ＭのＮａＣｌ水溶液（１０ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨ１２に調整）で１０ｍＬにメスアップし、分光光度計（Ｖ−５３０（商品名）、日本分光製）を用いて測定し、得られた吸収波形のピークトップである波長２６０ｎｍにおける吸収を用いてＮＦκＢデコイ溶出量及び溶出率を計算した。結果を図６に示す。

図６から明らかなように、ＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のＰＬＧＡナノスフェアでは、分散後４時間でのＮＦκＢデコイの溶出量は約７ｍｇ、溶出率は約３０％であった。これは、粒子表面に担持されたＮＦκＢデコイが投与後４時間以内の初期に溶出し、その後粒子に内包されたＮＦκＢデコイが徐々に放出されるためであると推認された。一方、ＮＦκＢデコイ内包型のＰＬＧＡナノスフェアでは、４時間後のＮＦκＢデコイの溶出率は５％以下であった。

また、分散後４日目（９６ｈ後）においては、ＮＦκＢデコイの溶出量はＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のＰＬＧＡナノスフェアで約１９ｍｇ、ＮＦκＢデコイ内包型のＰＬＧＡナノスフェアで約１０ｍｇであり、溶出率は共に５０％を超えていた。また、７日後（１６８ｈ後）においては、ＮＦκＢデコイの溶出量はＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のＰＬＧＡナノスフェアで約２３ｍｇ、ＮＦκＢデコイ内包型のＰＬＧＡナノスフェアで約１３ｍｇであり、溶出率は共に７０％を超えていた。この結果より、ＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のＰＬＧＡナノスフェアの方がＮＦκＢデコイ内包型に比べて即効性の面で有利であることが確認された。

［オバルブミン(Ovalbumin)誘発遅延型アレルギーモデルを用いたＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアの薬効評価（ｉｎ ｖｉｖｏ）］
実施例１〜４、比較例１〜３において調製したＰＬＧＡナノスフェアを用い、感作物質としてオバルブミン（卵白アルブミン、以下ＯＶＡと略す）を用いたＯＶＡ誘発遅延型アレルギー（ＤＴＨ）モデルに対する抑制効果を調査した。試験方法を以下に説明する。

（薬剤サンプルの調製）
実施例１及び２で得られたＰＬＧＡナノスフェアを所定量秤量して少量の精製水に分散し、製剤中の水分含量が３０％となるように白色ワセリンと混合して、ＮＦκＢデコイ含有率が０．０５％、０．１５％、０．５％の３種類のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を調製した。また、比較対照として、ＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏（陽性対照）及びＮＦκＢデコイ未添加のワセリン軟膏（陰性対照）を調製した。

（ＤＴＨ反応抑制評価試験）
評価方法としては、２次感作の前日に評価サンプルを投与し、２次感作における感作物質に対する生体内の免疫システム緩和効果、即ち一旦生成した抗体によるアレルギー反応抑制効果を評価することが多いが、ここでは１次感作の前日に評価サンプルを投与することにより、アレルギー反応のさらに前段となる、受容細胞がＯＶＡを抗原と認識しないようにする作用について評価した。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌、日本クレア社）の腹部にクリーム剤又は軟膏を１匹当たり１０ｍｇ塗布した（各塗布群につきｎ＝１５）。１日後、５ｍｇ／ｍＬのＯＶＡを含む生理食塩水溶液を、腹部の２箇所に１００μＬずつ皮下注射した（１次感作）。

ＯＶＡ投与後８日目に、２ｍｇ／ｍＬのＯＶＡを含む生理食塩水溶液５０μＬを皮下注射により右後肢の足裏に投与した（２次感作）。一方、左後肢の足裏にはＰＢＳ（リン酸バッファ液）５０μＬを投与した。また、１次感作及び２次感作を行わないマウスを正常群（コントロール群）とした（ｎ＝１５）。１日後、右後肢及び左後肢の足厚をノギスにより測定し、その差をＯＶＡに対するＤＴＨ反応とした。各塗布群及び正常群について足厚の差の平均値を算出して統計処理を行い、ＤＴＨ反応に対する抑制効果を評価した。

有意差検定法としては、ＮＦκＢデコイ未添加のワセリン軟膏（陰性対照）に対するＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏（陽性対照）の有意差については２群間の検定に好適なWilcoxson検定を用い、ＮＦκＢデコイ濃度が０．０５％、０．１５％、０．５％の３段階であるＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤の有意差については、対照に対して各濃度の差を加味した有意差の検定が可能なDunnett検定を用いた。結果を図７、図８に示す。

図７から明らかなように、実施例１のＮＦκＢデコイ内包／表面担持型ＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を塗布した場合、ＮＦκＢデコイ含有率が０．０５％、０．１５％、０．５％のクリーム剤塗布群において、右後肢と左後肢の足厚の差がそれぞれ９５×１０^-3ｍｍ、７５×１０^-3ｍｍ、７０×１０^-3ｍｍとなり、いずれもＮＦκＢデコイ未含有ワセリン軟膏塗布群（１１０×１０^-3ｍｍ）と比較してＤＴＨ反応が抑制された。特に、ＮＦκＢデコイ含有率０．１５％、０．５％のクリーム剤塗布群においては、ＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏塗布群（７０×１０^-3ｍｍ）とほぼ同等に有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。

また、実施例１よりもＮＦκＢデコイの表面担持量が多い実施例２のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を用いて同様に評価した図８においても、ＮＦκＢデコイ含有率が０．０５％、０．１５％、０．５％のクリーム剤塗布群において、右後肢と左後肢の足厚の差がそれぞれ１２０×１０^-3ｍｍ、１０５×１０^-3ｍｍ、１００×１０^-3ｍｍとなり、いずれもＮＦκＢデコイ未含有ワセリン軟膏塗布群（１５０×１０^-3ｍｍ）と比較してＤＴＨ反応が抑制された。特に、ＮＦκＢデコイ含有率０．１５％、０．５％のクリーム剤塗布群においては、ＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏塗布群（９０×１０^-3ｍｍ）とほぼ同等に有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。

この結果より、ＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のＰＬＧＡナノスフェアをクリーム剤に配合した場合は、ＮＦκＢデコイをそのまま配合した軟膏と比較して約１／１０の低用量での有効性が認められた。これは、ＰＬＧＡナノスフェアがキャリアとして作用することにより、ＮＦκＢデコイの細胞内への取り込み効率が約１０倍高くなったためであると推認された。

実施例３、４及び比較例１〜３で得られたＰＬＧＡナノスフェアを用いて、実施例７と同様の方法によりＮＦκＢデコイ含有率が０．５％のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を調製し、実施例７と同様の方法によりＯＶＡに対するＤＴＨ反応の抑制効果を評価した。ＮＦκＢデコイ濃度が０．５％の１段階であるため、有意差検定法としては２群間の検定に好適なWilcoxson検定を用いた。結果を図９に示す。

図９から明らかなように、ＮＦκＢデコイの表面担持量を減らし内包量を増加させた実施例３、及びＮＦκＢデコイを表面にのみ担持した実施例４のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を塗布した場合、足厚の差は共に７０×１０^-3ｍｍとなり、いずれもＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏塗布群（８０×１０^-3ｍｍ）とほぼ同等にＤＴＨ反応が有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。

一方、ＮＦκＢデコイ内包型の比較例２のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を塗布した場合、足厚の差は１１０×１０^-3ｍｍとなり、ＮＦκＢデコイ未含有ワセリン軟膏塗布群（１３０×１０^-3ｍｍ）と比較してＤＴＨ反応が抑制されたが、ＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏塗布群（８０×１０^-3ｍｍ）と比較すると抑制効果は低く、有効用量の低下は認められなかった。

実施例６において、ＮＦκＢデコイ内包／表面担持型ＰＬＧＡナノスフェアでは２４時間後のＮＦκＢデコイ溶出率が４０％に達していたのに対し、ＮＦκＢデコイ内包型ＰＬＧＡナノスフェアでは２０％未満であったことを考慮すると（図６参照）、実施例３及び４のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を塗布した場合、ナノスフェア表面に担持されたＮＦκＢデコイが投与後短時間で溶出して即効性に寄与していることが推認された。

また、ＮＦκＢデコイ未含有のＰＬＧＡナノスフェアとＮＦκＢデコイ粉末を混合した比較例３のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を塗布した場合、足厚の差は１１０×１０^-3ｍｍとなり、ＮＦκＢデコイ２％含有ワセリン軟膏塗布群（８０×１０^-3ｍｍ）と比較すると抑制効果は低かった。これは、図５に示すようにナノスフェア１表面へのＮＦκＢデコイ４の吸着力が弱いため、ＮＦκＢデコイ４がナノスフェア１と共に皮膚を透過して細胞内部まで十分に到達しないためであると推認された。

なお、ＮＦκＢデコイを含有しない比較例１のＰＬＧＡナノスフェア含有クリーム剤を塗布した場合、足厚の差は１７０×１０^-3ｍｍであり、ＤＴＨ反応の抑制効果は認められなかった。この結果より、ＰＬＧＡ自体には抑制効果は無いことが確認された。

本発明の医薬製剤によれば、キトサンまたはキトサン誘導体により表面のゼータ電位を正とし、ＮＦκＢデコイを静電気的に担持させ、且つナノ粒子の内部にもＮＦκＢデコイを封入したＰＬＧＡナノ粒子を用いたので、生体内浸透性、及び細胞内部へのＮＦκＢデコイ導入効率が共に高くなり、剤形の小型化が可能であるとともに、即効性と持続性とを兼ね備えた安全性の高い医薬製剤となる。従って、バリア機能の高い部位においてもＮＦκＢデコイが疾患部位の細胞内部まで迅速に且つ十分に送達されるため、難治性の皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎に対する有効な治療薬として期待できる。

は、粒子表面に静電気的にＮＦκＢデコイが担持されたナノスフェアの構造を示す模式図である。 は、粒子表面に静電気的にＮＦκＢデコイが担持され、粒子内部にもＮＦκＢデコイを封入したナノスフェアの構造を示す模式図である。 は、比較例１で得られたナノスフェアの構造を示す模式図である。 は、比較例２で得られたナノスフェアの構造を示す模式図である。 は、比較例３で得られたナノスフェアの構造を示す模式図である。 は、ＮＦκＢデコイ内包／表面担持型及びＮＦκＢデコイ内包型ナノスフェアからのＮＦκＢデコイの溶出挙動を示すグラフである。 は、実施例１のナノスフェアを用いた場合のＯＶＡ誘発遅延型アレルギー抑制効果を示すグラフである。 は、実施例２のナノスフェアを用いた場合のＯＶＡ誘発遅延型アレルギー抑制効果を示すグラフである。 は、実施例３、４及び比較例１〜３のナノスフェアを用いた場合のＯＶＡ誘発遅延型アレルギー抑制効果を示すグラフである。

符号の説明

１ 生体適合性ナノ粒子（ナノスフェア）
２ ポリビニルアルコール
３ カチオン性高分子
４ ＮＦκＢデコイ

Claims (12)

1. 表面がキトサンまたはキトサン誘導体で被覆され、当該表面にＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが静電的に吸着担持され、かつＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが内部にも封入されている乳酸・グリコール酸共重合体のナノ粒子を含む医薬製剤。
2. 前記ナノ粒子を結合剤により複合化するとともに、前記結合剤で形成された外層にＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドをさらに封入したことを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤。
3. 前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、以下の配列番号１で表されるＮＦκＢ結合配列を含む請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。
   [Ｇ]ｎＧＧＲＨＴＹＹＨＣ （配列番号１）
   （式中、ｎは０または１を、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する。）
4. 前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、ＮＦκＢ結合配列としてＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２）、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号３）、又はＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号４）の少なくとも一つを含む請求項３に記載の医薬製剤。
5. 前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、配列５′−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３′（配列番号５）及びこれに相補的な配列５′−ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧ−３′（配列番号６）からなる二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項４に記載の医薬製剤。
6. 前記ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
7. 前記ナノ粒子表面が＋２７ｍＶ以上のゼータ電位を有することを特徴とする請求項６に記載の医薬製剤。
8. 前記ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率が３．５重量％以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
9. 前記ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有し、前記ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率が３．５重量％以上３０重量％以下であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
10. 前記ナノ粒子表面が＋２７ｍＶ以上のゼータ電位を有し、前記ナノ粒子中のＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドの含有率が３．５重量％以上３０重量％以下であることを特徴とする請求項９に記載の医薬製剤。
11. 皮膚疾患の治療に使用されることを特徴とする請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の医薬製剤。
12. 皮膚疾患がアトピー性皮膚炎である請求項１１に記載の医薬製剤。