CN109069527B - 纳米颗粒、控释剂型和用于递送免疫治疗剂的方法 - Google Patents

纳米颗粒、控释剂型和用于递送免疫治疗剂的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及纳米颗粒、控释剂型和用于施用免疫治疗剂的方法。

Description

纳米颗粒、控释剂型和用于递送免疫治疗剂的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月15日提交的美国临时专利申请序列号62/308,513和2016年8月29日提交的62/380,711的权益，所述专利的公开内容明确地以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及纳米颗粒、控释剂型和用于施用免疫治疗剂的方法。
背景技术
手术治疗通常是用于实体瘤的最有效的治疗方法。然而，许多患者在手术后发展再发性疾病，这可能导致癌症患者的显著发病率和死亡率(Paik,S.等人New EnglandJournal of Medicine 2004,351,2817)。还提出，在肿瘤切除术后伤口愈合期间的炎症过程可能促进癌症进展(Vakkila,J.；Lotze,M.T.Nat.Rev.Immunol.2004,4,641；Coffey,J.C.等人Lancet Oncol.2003,4,760；Demicheli,R.等人Ann.Oncol.2008,mdn386；Grivennikov,S.I.等人Cell 2010,140,883)。越来越多的证据表明，创伤引起的围手术期炎症可能引起发展肿瘤复现、加速局部剩余肿瘤复发以及促进肿瘤侵袭和转移的高风险(Vakkila,J.；Lotze,M.T.Nat.Rev.Immunol.2004,4,641；Ceelen,W.等人Crit.Rev.Oncol.Hematol.2014,89,16；Segatto,I.等人Oncotarget 2014,5,6267；Antonio,N.等人EMBO J.2015,34,2219；Baker,D.等人Surgery 1989,106,525)。
人们对开发预防手术后癌症再发的策略有浓厚的兴趣。目前的方法依赖于已建立的治疗方法，包括全身化学疗法和放射疗法，它们具有高毒性特征(Albain,K.等人In ASCOAnnual Meeting Proceedings2005；第23卷,第7014页)。最近癌症免疫疗法的成功表明它可用于预防癌症再发(Stephan,S.B.等人Nat.Biotechnol.2015,33,97；Liu,Q.等人Molecular Therapy 2009,17,2049)。免疫调控检查点抑制剂，包括抗CTLA-4和抗PD-1，已经在治疗各种类型的癌症(诸如黑素瘤)中显示出显著的结果(Gubin,M.M.等人Nature2014,515,577；Pardoll,D.M.Nat.Rev.Cancer 2012,12,252；Wang,C.等人Adv.Mater.2014,26,8154；Curran,M.A.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,4275)。程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)由激活的T细胞表达。当激活的T细胞遇到在癌细胞上上调的程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)时，T细胞效应功能减弱(Pardoll,D.M.Nat.Rev.Cancer 2012,12,252)。因此，通过抗PD-1/PD-L1抗体抑制淋巴细胞上的PD1和肿瘤细胞上的PDL1的相互作用可以增强对癌细胞的免疫响应(Pardoll,D.M.Nat.Rev.Cancer2012,12,252；Ribas,A.N.Engl.J.Med.2015,373,1490)。
尽管抗PD-1免疫疗法具有阳性临床数据，但并非没有限制。可以解释抗PD-1抗体的有限治疗功效的一种机制是当静脉内输注到体内时抗体的短循环时间(Mitragotri,S.等人Nat.Rev.Drug Discovery 2014,13,655；Patnaik,A.等人In ASCO Annual MeetingProceedings 2012；第30卷,第2512页；Topalian,S.L.等人N.Engl.J.Med.2012,366,2443)。此外，在树突状细胞(DC)遇到肿瘤细胞和T细胞的环境中，有限的功效也可能继发于共刺激的缺乏(Sabado,R.L.；Bhardwaj,N.Nature 2015,519,300)。此外，由于需要的抑制剂量，治疗成本也无法维持地高。副作用，诸如来自这些药剂的自身免疫性病症也可能是显著的(Naidoo,J.等人Ann.Oncol.2015,mdv383；Hamid,O.等人N.Engl.J.Med.2013,369,134；Mellati,M.等人Diabetes Care 2015,38,e137)。此外，响应率具有显著的改善潜力(Topalian,S.L.等人Journal of Clinical Oncology 2014,32,1020)。抗PD-1疗法在转移性黑素瘤中的客观响应率仅为40％(Sharma,P.和J.P.Allison.Science 2015年4月3日,348(6230):56-61)。此外，甚至将抗PD-1与抗CTLA-4组合仅在约50％的患者中产生了响应(Robert,C.等人NEJM 2015,372(26):2521-2532)。因此，目前的检查点阻断疗法的方法可能限制这些免疫治疗剂在许多患者中的有益效果。因此，需要新的方法来改善这些免疫调节疗法的临床益处，同时避免它们的不良自身免疫作用。
发明内容
本文公开了纳米颗粒、控释药物剂型和用于递送免疫治疗剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括预防手术后肿瘤复发。
在一方面，本文公开了一种控释药物剂型，其包含：CpG寡脱氧核苷酸纳米茧(nano-cocoon)，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶。
癌症手术后肿瘤负荷最低。此外，局部促炎环境有利于免疫治疗。因此，本发明人开发了一种用于响应于炎症条件控释负载的免疫治疗剂和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的创新性递送载体(自组装DNA纳米茧(DNC))。CpG ODN触发表达Toll样受体9的细胞(包括人浆细胞样树突细胞(pDC))，具有有效的免疫刺激作用，并且可以增强多种癌症治疗的抗癌活性。
自组装DNA纳米茧可以通过特别地基于目标模板的酶促滚环扩增(RCA)方法制备。在一个实施方案中，DNA纳米茧用CpG序列编码。载体(指定为DNA“纳米茧”，DNC)可以通过长链的单链DNA(ssDNA)组装。DNA含有重复的间隔CpG序列和限制性酶的切割位点。在一个实施方案中，限制性酶是HhaI，其能够消化DNC并随后产生CpG ODN片段。
为了使释放事件具有生物响应性，可以将限制性酶(例如，HhaI)笼蔽到炎症响应性纳米颗粒，例如三甘油单硬脂酸酯(TGMS)纳米颗粒(TGMS NP)中，并附接至DNA纳米茧(DNC)。TGMS是一种两亲物，其酯键能够通过酯酶和基质金属蛋白酶(MMP)进行裂解，所述酯酶和基质金属蛋白酶在发展组织重塑的伤口部位高度表达。由肿瘤切除术切口的伤口部位中出现的炎症状态触发，TGMS可以酶促裂解，从而拆解三甘油单硬脂酸酯纳米颗粒笼并释放限制性酶，所述限制性酶也可以进一步依序将DNA纳米茧(DNC)转化为CpG寡脱氧核苷酸(ODN)并且释放免疫治疗剂(例如，aPD1)。控释型CpG ODN和免疫治疗剂的组合作用可以有利于在黑素瘤模型中诱导持久且特异性的抗肿瘤T细胞响应，同时避免体内毒性峰值水平。
在另一方面，本文公开了一种化学预防方法，所述方法包括：向宿主施用足以预防癌症再发的量的控释药物剂型；其中控释药物剂型包含CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶。
在一个实施方案中，免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是尼沃鲁单抗(nivolumab)。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)。
在另一个实施方案中，免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体与抗CTLA4抗体的组合。
在进一步的实施方案中，炎症响应性纳米颗粒包括三甘油单硬脂酸酯(TGMS)。在另外的实施方案中，限制性酶是HhaI。
在一个实施方案中，化学预防方法是用于预防癌症的再发，其中癌症是实体瘤。在一个实施方案中，癌症是黑素瘤。
在又其他方面，免疫治疗剂可以在纳米颗粒中递送，所述纳米颗粒包含与为IDO抑制剂的1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸。
在另一方面，本文公开了一种纳米颗粒，其包含：与1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸，其中纳米颗粒包封免疫治疗剂。
在另一方面，本文公开了一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：
向受试者提供微针贴剂，其中微针贴剂包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基材，微针的基端与所述基材附接或整合；
纳米颗粒，其中纳米颗粒包含与1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸，并且其中纳米颗粒包封免疫治疗剂；
将微针插入生物屏障中，其中免疫治疗剂以控释方式释放到受试者中。
在一个实施方案中，免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是尼沃鲁单抗。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗。
在一个实施方案中，疾病是癌症。在一个实施方案中，癌症是黑素瘤。在一个实施方案中，生物屏障是皮肤。
附图说明
并入本说明书且构成其一部分的附图示出下文所述的若干个方面。
图1A-1C.在炎症条件下通过DNA纳米茧递送CpG和抗PD1抗体(aPD1)的示意图。(图1A)含有CpG序列的DNA纳米茧(DNC)，其负载有抗PD1抗体和笼蔽限制性酶，所述限制性酶用于DNC的炎症触发分裂以释放CpG DNA和aPD1。(图1B)原发性肿瘤切除、局部注射和基于DNC的递送系统治疗后的体内免疫疗法的示意图。(图1C)释放的CpG DNA激活树突细胞(DC)以用aPD1驱动T细胞响应以进行PD1阻断。
图2A-2J.对负载有aPD1和笼蔽酶的CpG DNA纳米茧(DNC)和酶响应性药物释放的表征。(图2A)HhaI-TGMS-DNC-aPD1纳米复合物的TEM成像(比例尺＝500nm)。插图：放大图像(比例尺＝200nm)。(图2B)HhaI-TGMS-DNC-aPD1纳米复合物的动态光散射表征。(图2C)用于模拟炎症状态的RAW264.7巨噬细胞的LPS激活的示意图。(图2D)与来自激活的和未激活的巨噬细胞的细胞培养物上清液一起温育的HhaI-TGMS-DNC-aPD1纳米复合物在不同时间点的凝胶电泳(泳道0，0min；泳道1，30min；泳道2，1h；泳道3，2h；泳道4，4h；泳道5，6h；泳道M，DNA梯状条带)。(图2E-2F)当与来自激活和未激活的巨噬细胞的细胞培养上清液一起温育时，在不同时间点从TGMS-DNC纳米复合物释放的DNA和aPD1的百分比。(图2G-2H)当与来自未激活的巨噬细胞的细胞培养上清液一起温育时，HhaI-TGMS-DNC-aPD1纳米复合物的AFM图像和流体动力学尺寸。(图2I-2J)当与来自激活的巨噬细胞的细胞培养上清液一起温育时，HhaI-TGMS-DNC-aPD1纳米复合物的AFM图像和流体动力学尺寸(比例尺＝500nm)。误差棒是基于三重样品的标准偏差(SD)。
图3A-3H.用于通过CpG DNA纳米茧(DNC)递送系统减少手术后肿瘤复发的体内肿瘤疗法。(图3A)除去原发性肿瘤后不同组的B16F10肿瘤的体内生物发光成像。(G1，PBS对照；G2，HhaI-TGMS-DNC；G3，HhaI-TGMS-cDNC-aPD1；G4，游离aPD1/游离CpG核苷酸；G5，HhaI-TGMS-DNC-aPD1)(图3B)定量肿瘤信号和(图3C)在指出的各种治疗后不同组小鼠的平均肿瘤生长。饼图示出CR率百分比(橙色)(n＝10)。黑色箭头指示手术时间。(图3D)通过流式细胞术分析的复发性肿瘤中T细胞的代表性绘图。(对CD3+T细胞进行门控)。(图3E)通过流式细胞术(对CD8+T细胞进行门控)分析的复发性肿瘤中激活的CD8T细胞(CD44+CD62L-)的代表性绘图。(图3F)复发性肿瘤的免疫荧光显示出CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润(比例尺＝100μm)。(图3G)用于C&D中所示研究的肿瘤中存在的激活CD8细胞的绝对数量。(图3H)在各种治疗后，复发性肿瘤中的肿瘤浸润性CD8+T细胞和效应CD4+T细胞相对于调控性T细胞的比率。使用Tukey事后测试通过双向ANOVA计算统计学显著性。P值：*,P<0.05；**,P<0.01；***P<0.005。
图4A-4F.通过在手术部位局部注射DNC递送系统可以获得全身抗肿瘤功效。(图4A)除去原发性肿瘤后不同组的B16F10转移瘤在不同时间点的体内生物发光成像。(G1，PBS对照；G2，HhaI-TGMS-DNC；G3，HhaI-TGMS-cDNC-aPD1；G4，游离aPD1/游离CpG核苷酸；G5，HhaI-TGMS-DNC-aPD1)。(图4B)根据A的定量肿瘤信号。每条线代表一只动物，并且每个点示出整个动物光子数。(图4C)治疗小鼠和对照小鼠的卡普兰迈耶(Kaplan Meier)存活曲线。示出的是每个治疗组10只小鼠。(图4D)具有A中指出的各种治疗的小鼠的脾细胞中的IFN-γCD8CTL T细胞。(图4E)来自三个独立实验的脾细胞中的定量IFN-γCD8CTL T细胞。(图4F)通过将再刺激的脾细胞与B16肿瘤细胞一起温育测量的CTL介导的免疫响应。误差棒是基于三只小鼠的平均值(SEM)的标准误差。
图5A-5C.DNA纳米茧(DNC)的图像和尺寸分析。(图5A)DNC的AFM图像。比例尺是500nm。(图5B)DNC的TEM图像。比例尺是200nm。(图5C)通过动态光散射(DLS)测定的DNC的流体动力学尺寸。
图6A-6B.通过限制性酶HhaI进行的DNA纳米茧(DNC)降解。(图6A)DNC(1)的凝胶电泳和用HhaI处理后(2)的凝胶电泳。(图6B)通过ELISA测定的RAW 264.7巨噬细胞的IL-6和TNF-α分泌。
图7.用HhaI处理后的两个对照DNC的凝胶电泳。在用HhaI处理时，一个cDNC(切割位点+CpG-)可以容易地切成较小的均匀片段，而其他cDNC(切割位点-CpG+)对HhaI裂解具有抗性。
图8A-8B.三甘油单硬脂酸酯的图像和尺寸分析(TGMS_纳米颗粒TEM(图8A)和TGMS纳米颗粒的DLS(图8B))。(比例尺＝500nm)
图9.在不同aPD-1浓度下aPD-1的负载能力。
图10.用(1)HhaI和(2)TGMS@HhaI处理的DNA纳米茧(DNC)的凝胶电泳。
图11A-11C.游离酶(图11A)、HhaI@TGMS NP(图11B)和在炎症条件下温育2h后的HhaI@TGMS NP(图11C)的TEM图像。(比例尺＝50nm)
图12A-12C.(图12A)与PBS中的MMP9(200ng/mL)一起温育的HhaI-TGMS-DNC-aPD1纳米复合物在不同时间点的凝胶电泳。(图12B和图12C)当与MMP9、脂肪酶或PBS对照一起温育时，在不同时间点从TGMS-DNC纳米复合物释放的DNA和aPD1的百分比。
图13A-13B.通过ELISA测定的RAW 264.7巨噬细胞的IL-6(图13A)和TNF-α(图13B)分泌。
图14.所述方法的实施方式。1，原发性肿瘤；2，通过手术移出肿瘤；3，切除肿瘤，留下～1％的残余组织(不完全切除)；4，肿瘤周围注射DNC药物递送系统。
图15.通过ELISA测试受伤后1-4天时来自伤口组织的上清液的MMP9活性。
图16.在指出的各种治疗后60天中小鼠的存活曲线(G1，PBS对照；G2，HhaI-TGMS-DNC；G3，HhaI-TGMS-cDNC-aPD1；G4，游离aPD1/游离CpG核苷酸；G5，HhaI-TGMS-DNC-aPD1)。
图17.代表性流式细胞术绘图，其示出了在指出的各种治疗后复发性肿瘤中CD4+FoxP3+T细胞的百分比(在CD4+细胞上的门控)。
图18A-18E.基于微针的经皮平台的示意图，其负载有自组装免疫治疗纳米载体。(图18A)(上图)自组装的m-HA纳米颗粒(NP)对IDO抑制剂1-MT和aPD1的包封和从所述纳米颗粒的释放的示意图(i)m-HA的自组装。(ii)HA酶对HA-NP的解离。(下图)使用微针的治疗剂递送和皮肤肿瘤部位的增强免疫响应的示意图。(图18B)自组装HA-NP的平均流体动力学尺寸(左图)和TEM成像(右图)。(图18C)解离的HA-NP的平均流体动力学尺寸(左图)和TEM成像(右图)(比例尺：200nm)。(图18D)在添加和不添加HA酶的情况下从NP释放的aPD1的百分比。(图18E)在添加和不添加HA酶的情况下从NP释放的1-MT的百分比。误差棒是基于三重样品的标准偏差(SD)。
图19A-19I.对负载aPD1/1-MT的微针的表征。(图19A)代表性MN贴剂的照片(比例尺：1mm)。(图19B)MN贴剂的SEM图像(比例尺：400μm)。(图19C)含有负载有FITC-aPD1的NP的代表性MN贴剂的荧光成像(比例尺：400μm)。(图19D)用一个MN贴剂经皮处理小鼠背部皮肤(红线内的区域)。(图19E)台盼蓝染色的小鼠皮肤的图像，其示出MN贴剂向皮肤中的穿透(比例尺：1mm)。(图19F)MN治疗的具有黑素瘤的小鼠在不同时间点的体内生物发光成像。发光显示负载有aPD1和自组装成HA-NP的Cy5.5标记的1-MT-HA(上图)或游离的Cy5.5标记的1-MT(下图)的MN贴剂。(图19G)在施用用aPD1和1-MT-HA(上图)或游离1-MT(下图)配制的MN后3天，主要器官中Cy5.5标记的1-MT的分布。(图19H)Cy5.5标记的1-MT的定量生物分布。与负载游离1-MT的MN(下图)相比，在用负载1-MT-HA的MN(上图)治疗的肿瘤中检测到持续时间更长的显著更高(两个群体t检验，P<0.01)的Cy5.5量。误差棒是基于三重样品的标准偏差(SD)。(图19I)与负载游离aPD1/1-MT的MN(下图)相比，用负载aPD1/1-MT-HA的MN(上图)治疗3天后肿瘤的免疫荧光染色(红色：aPD1，蓝色：细胞核)(比例尺：100μm)。
图20A-20E.协同疗法引起B16F10黑素瘤小鼠模型的稳健肿瘤消退。(图20A)MN治疗后不同组的B16F10黑色素瘤在不同时间点的体内生物发光成像。将具有黑色素瘤的小鼠分组并通过单次施用至肿瘤部位经皮暴露于不同样品，即空白MN贴剂(G1)、aPD1(G2)的i.v.注射、aPD1和1-MT(G3)的i.t.注射、负载aPD1的MN贴剂(G4)、负载1-MT的MN贴剂(G5)和负载NP的MN贴剂(G6)。(图20B)指出了在各种治疗后不同组小鼠的定量个体肿瘤尺寸。(图20C)治疗小鼠的平均肿瘤面积。(图20D)治疗小鼠和对照小鼠的存活曲线。(图20E)治疗小鼠和对照小鼠的平均体重。示出的是每个治疗组8只小鼠。误差棒是基于八个样品的标准偏差(SD)。
图21A-21D.与微针整合的协同疗法触发增强的抗肿瘤免疫响应。(图21A)在临收集肿瘤浸润淋巴细胞之前来自小鼠的代表性黑素瘤图像。将具有黑色素瘤的小鼠分组并通过单次施用至肿瘤部位经皮暴露于不同样品，即空白MN贴剂(G1)、aPD1(G2)的i.v.注射、aPD1和1-MT(G3)的i.t.注射、负载aPD1的MN贴剂(G4)、负载1-MT的MN贴剂(G5)和负载NP的MN贴剂(G6)(从底部到顶部)。(图21B)残余肿瘤的免疫荧光示出G6(上图)或G1(下图)组中的CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润(比例尺：100μm)。(图21C)收集肿瘤浸润淋巴细胞时代表性黑素瘤的H&E染色。(图21D)肿瘤重量、每毫克肿瘤的CD3+细胞的绝对数量、每毫克肿瘤的CD8+细胞的绝对数量、CD4+调控性T细胞的百分比、总调控性T细胞的CD8+T细胞百分比和总调控性T细胞的CD8+T细胞的百分比。使用Tukey事后测试通过单因素方差分析计算统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005)。
图22.m-HA的缀合机制
图23.Boc-MT的1H NMR。1H NMR(d6-CD2Cl2,300MHz,δppm)：δ7.49-7.43(d,1H,Ar-H),7.32-7.25(d,1H,Ar-H),7.08-7.01(m,1H,Ar-H),6.97-6.89(m,1H,Ar-H),6.85-6.78(s,1H,C-HN-甲基吲哚),4.07(s,1H,NH),3.64(s,2H,CH2),2.81(s,1H,CH),2.41(s,3H,N-CH3),1.25(s,9H,C(CH3)3)。
图24.m-HA的1H NMR。m-HA：1H NMR(D2O,300MHz,δppm):δ7.49-6.78(m,1.17H,1-MT),1.82-1.63(m,8H,NH2CH2(CH2)4)。
图25.IDO酶活性测量为游离1-MT和m-HA治疗后对犬尿氨酸产生的抑制。误差棒指示SD(n＝3)。
图26.负载aPD1的HA-NP在PBS和10％FBS中的体外稳定性。误差棒指示SD(n＝3)。
图27.在aPD1与m-HA之间的不同重量比下aPD1的负载能力。误差棒指示SD(n＝3)。
图28.使用共聚焦显微镜通过aPD1(绿色)和1-MT(红色)的共定位来可视化aPD1在NP内的包封。
图29.通过TEM表征4h HA酶处理后的NP的形态(比例尺：200nm)。
图30.从在pH 6.5或pH 7.4缓冲溶液中温育的NP释放的aPD1的累积百分比。误差棒指示SD(n＝3)。
图31.IDO酶活性测量为游离1-MT和NP处理后对色氨酸消耗和犬尿氨酸产生的抑制。误差棒指示SD(n＝3)。
图32.在微针制造期间，NP(左，比例尺：200nm)和HA基质内的NP(右，比例尺5μm)的CryoSEM图像。
图33.被负载1-MT替代物罗丹明的MN穿透的小鼠皮肤的合并荧光和明场图像(比例尺：200μm)。
图34.被一根MN穿透的横截面小鼠皮肤区域的H&E染色切片(比例尺：200μm)。
图35.MN的机械特性。所需MN的失效力定量测量为0.41N/针。
图36.通过ELISA测定测试来自微针贴剂的aPD1的释放。误差棒指示SD(n＝3)。
图37.用负载1-MT-HA/aPD1的MN治疗的肿瘤在不同时间点的免疫荧光染色(红色：aPD1，蓝色：细胞核)(比例尺：100μm)。
图38.通过HPLC测量微针施用后1-MT的血浆水平。误差棒指示SD(n＝3)。
图39.通过细胞周期相关蛋白Ki67的表达测量小鼠肿瘤内的CD4+Foxp3+调控性T细胞、CD4+Foxp3效应T细胞和CD8+增殖。误差棒指示SD(n＝3)。
图40.示出了针对用每组中5只小鼠残余肿瘤进行的两次独立实验的代表性FACS图。
图41.与B16F10细胞一起温育24h后，游离1-MT和m-HA NP的细胞毒性。误差棒指示SD(n＝6)。
图42.用PBS(上图)和微针贴剂(下图)施用后2天对主要器官切片进行H&E染色(比例尺：200μm)。
具体实施方式
手术切除后的癌症再发仍然是癌症控制中的重大挑战。本文公开了控释药物剂型和用于递送CpG寡脱氧核苷酸和免疫治疗剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括预防手术后肿瘤复发。
现将详细参考本发明的实施方案，其实例以附图和实施例来说明。然而，本发明可以按照许多不同形式加以实施，并且不应被解释为只局限于本文所阐述的实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。提供以下定义是为了完全理解本说明书中使用的术语。
术语
贯穿本申请使用的术语应被解释为具有对于本领域普通技术人员而言普通且典型的含义。然而，申请人希望将如下文定义的具体定义赋予以下术语。
除非上下文另外明确规定，否则如在说明书和权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个提及物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“可以”、“任选地”和“可任选地”可互换使用，并且意指包括病状发生的情况以及病状不发生的情况。因此，例如，制剂“可包含赋形剂”的陈述意指包括制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
如本领域普通技术人员所理解的，术语“约”和“大约”被定义为“接近”。在一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在10％以内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在5％以内。在还另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在1％以内。
蛋白质的“活性”(包括与“生物活性”相关的那些)包括例如转录、翻译、细胞内易位、分泌、激酶磷酸化、蛋白酶裂解和/或与其他蛋白质的同嗜性和异嗜性结合。
术语“施用”是指口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入或经由植入型药盒(implanted reservoir)的施用。可以使用透皮微针阵列贴剂进行施用。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
“生物相容的”通常是指通常对接受者无毒并且不会对受试者造成任何显著的副作用的材料及其任何代谢物或其降解产物。
“组合物”旨在包括活性剂与另一惰性(例如可检测的试剂或标记)或活性(诸如助剂)化合物或组合物的组合。
如本文所用，术语“包含”旨在意指组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要素。“基本上由……组成”在用于定义组合物和方法时将意指排除对于组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的要素构成的组合物应当不排除来自分离和纯化方法的痕量杂质和药物上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等等。“由…组成”将意指排除对于施用本发明组合物的超过痕量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语的各者定义的实施方案在本发明的范围内。
“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。
如本文所用，“缀合的”是指不可逆的结合相互作用。
如本文所用，“置换”是指通过与被置换的肽、化学品或核酸相比对特定蛋白质结构域具有亲和力的肽、化学品或核酸中断例如所述蛋白质结构域与肽、所述蛋白质结构域与化学品、所述蛋白质结构域与核酸序列之间的分子或化学相互作用。
如本文所用，“接头”是指联接相邻分子的分子。一般来说，接头除了联接相邻分子或保持其间一定程度的最小距离或其他空间关系外，将不具有特定生物活性。在一些情况下，可以选择接头以影响或稳定相邻分子的某些性质，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换用于指包含两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述两个或更多个氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接。
术语“载体”或“药学上可接受的载体”意指可用于制备药物或治疗性组合物的载体或赋形剂，其通常是安全且无毒的并且包括为兽医和/或人类药物学或治疗性用途可接受的载体。如本文所用，术语“载体”或“药学上可接受的载体”涵盖可以包括磷酸盐缓冲液、水、乳剂(诸如水包油或油包水型乳剂)以及各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物制剂或如下文进一步所述的其他物质。
如本文所用，术语“聚合物”是指天然或合成的相对高分子量有机化合物，其结构可以由重复的小单元即单体(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)表示。合成的聚合物通常通过添加或缩聚单体来形成。如本文所用，术语“共聚物”是指由两种或更多种不同重复单元(单体残基)形成的聚合物。作为实例而非限制，共聚物可以是交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还预期，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。
在本文中，范围可表达为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表示这样一个范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应了解具体值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端值相对于另一个端值以及独立于另一个端值都是有意义的。还应理解，本文公开了多个值，并且本文中每个值除所述值本身之外还公开为“约”所述具体值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指在泛化时间段内将引起由研究者、兽医、医师或其他临床医生所寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的化合物(诸如免疫治疗剂)的量。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间内向受试者施用多剂量的组合物后，实现了所需的生物学或医学响应。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”及其语法变化形式包括部分或完全延迟、减轻、缓和或降低病症或病状的一种或多种伴随症状的强度和/或减轻、缓和或阻止病症或病状的一种或多种起因。根据本发明的治疗可以防止性、预防性、缓解性(pallatively)或改善性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在明显的癌症征象之前)、在发病早期(例如，在癌症的最初迹征象和症状时)或在癌症确定发展后施用至受试者。预防性施用可以在显现感染症状之前的数天至数年发生。
如本文所用，术语“特异性结合”在提及多肽(包括抗体)或受体时是指对蛋白质和其他生物制剂的异质群体中蛋白质或多肽或受体的存在具有决定作用的结合反应。因此，在指定条件(例如在抗体情况下的免疫测定条件)下，当指定的配体或抗体不以显著量结合样品中存在的其他蛋白质或结合所述配体或抗体可能在生物体中接触的其他蛋白质时，则所述指定的配体或抗体“特异性结合”其特定“靶标”(例如抗体特异性结合内皮抗原)。一般来讲，“特异性结合”第二分子的第一分子与第二分子具有大于约105M–1(例如，106M–1、107M–1、108M–1、109M–1、1010M–1、1011M–1和1012M–1或更多)的亲和常数(Ka)。
术语“免疫检查点抑制剂”或“免疫治疗剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调控T细胞激活或功能。已知许多检查点蛋白，诸如CTLA-4及其配体CD80和CD86；和PD1及其配体PDL1和PDL2(Pardoll,NatureReviews Cancer 12:252-264,2012)。这些蛋白质负责T细胞响应的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调控和维持自身耐受性和生理免疫响应的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。
术语治疗剂的“有效量”意指无毒但足够量的有益剂以提供所需效果。“有效”的有益药剂的量将因受试者而异，这取决于受试者的年龄和一般状况、具体的一种或多种有益剂等。因此，并不总是能够指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员可以使用常规实验确定任何主题情况下的适当“有效”量。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，有益的“有效量”也可以是指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。
实现治疗效果所必需的药物的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可以调整给药方案以提供最佳的治疗响应。例如，可每日施用若干分开剂量或可如治疗情况的紧急程度所示按比例减少所述剂量。
如本文所用，治疗剂的“治疗有效量”是指有效实现所需治疗结果的量，并且治疗剂的“预防有效量”是指有效预防不需要的生理病状的量。给定治疗剂的治疗有效量和预防有效量通常会根据诸如所治疗的病症或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。
术语“治疗有效量”还可以是指有效促进所需治疗效果的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间的量)。精确的所需治疗效果将根据待治疗的病状、受试者的耐受性、待施用的药物和/或药物制剂(例如，治疗剂(药物)的效价、药物的浓度等)以及本领域普通技术人员所理解的多种其他因素而变化。
如本文所用，术语“药学上可接受的”组分可以是指不是生物学上或其他方面不合需要的组分，即所述组分可以掺入到本发明的药物制剂中并如本文所述那样施用至受试者而不会引起任何显著的不希望的生物效应或以有害的方式与含有其的制剂的任何其他组分相互作用。当术语“药学上可接受的”是用于指赋形剂时，它通常意味着所述组分符合毒理学和生产测试所要求的标准或包括在由美国食品药品监督管理局制定的非活性成分指南中。
另外，如本文所用，术语“药理学活性的”(或简称“活性的”)，如在“药理学活性”的衍生物或类似物中，可以是指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相当的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
如本文所用，术语“混合物”可以包括其中混合物的组分可完全混溶的溶液以及其中混合物的组分不是完全混溶的悬浮液和乳液。
如本文所用，术语“受试者”可以是指活的生物体，诸如哺乳动物，包括但不限于人、牲畜、狗、猫和其他哺乳动物。治疗剂的施用可以以有效治疗受试者的剂量和时间段进行。在一些实施方案中，受试者为人。
如本文所用，术语“控释”或“控释药物递送”或“持续释放”是指以受控方式从给定剂型释放或施用药物，以在体内实现所需的药代动力学特征。“受控”药物递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药物释放动力学的能力。
如本文所用，短语“并行施用”、“组合施用”、“同时施用(simultaneousadministration)”或“同时施用(administered simultaneously)”意指化合物在同一时间点施用或彼此紧密相继施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间足够接近以使得所观察到的结果与在同一时间点施用化合物时所实现的结果没有区别。
如本文所用，术语“纳米茧“或”DNA纳米茧(DNC)“是指由DNA制成的纳米颗粒。DNA纳米茧可用于控释治疗剂，例如免疫治疗剂。在一个实施方案中，DNA纳米茧是自组装的并且可以通过基于感兴趣的DNA模板的酶促滚环扩增(RCA)方法制备，并且由长链单链DNA(ssDNA)组装。
如本文所用，术语“CpG寡脱氧核苷酸“是指包含至少一个CpG基序的寡脱氧核苷酸。CpG基序含有通过磷酸键连接的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，并且CpG基序激活免疫响应。
免疫治疗剂的递送：使用DNA纳米茧的控释剂型
本发明人开发了一种新的癌症免疫治疗剂，其可用于预防手术后肿瘤复发。癌症手术后肿瘤负荷最低。此外，局部促炎环境有利于免疫治疗。因此，本发明人开发了一种用于响应于炎症条件控释负载的免疫治疗剂和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的创新性递送载体。CpGODN触发表达Toll样受体9的细胞(包括人浆细胞样树突细胞(pDC))，具有有效的免疫刺激作用，并且可以增强多种癌症治疗的抗癌活性。
自组装DNA纳米茧可以通过特别地基于目标模板的酶促滚环扩增(RCA)方法制备。在一个实施方案中，DNA纳米茧用CpG序列编码。载体(指定为DNA“纳米茧”，DNC)通过长链的单链DNA(ssDNA)组装。DNA含有重复的间隔CpG序列和限制性酶的切割位点。在一个实施方案中，限制性酶是HhaI，其能够消化DNC并随后产生CpGODN片段。
为了使释放事件具有生物响应性，可以将限制性酶(例如，HhaI)笼蔽到炎症响应性纳米颗粒，例如三甘油单硬脂酸酯(TGMS)纳米颗粒(TGMS NP)中，并附接至DNC。TGMS是一种两亲物，其酯键能够通过酯酶和基质金属蛋白酶(MMP)进行裂解，所述酯酶和基质金属蛋白酶在发展组织重塑的伤口部位高度表达。由肿瘤切除术切口的伤口部位中出现的炎症状态触发，TGMS可以酶促裂解，从而拆解笼并释放限制性酶，所述限制性酶也可以进一步依序将DNC转化为CpG ODN并且释放免疫治疗剂(例如，aPD1)。
在一方面，本文公开了一种控释药物剂型，其包含：CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶。
在一个实施方案中，免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是尼沃鲁单抗。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗。
在另一个实施方案中，免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体与抗CTLA4抗体的组合。在一个实施方案中，限制性酶是HhaI。在一些实施方案中，限制性酶裂解单链DNA。可裂解单链DNA的限制性酶的实例包括但不限于HhaI、HinpII、MnlI、HaeIII、HpaII、MboII、HinfI、HgaI、BstNI、DdeI和TaqI。
在一个实施方案中，炎症响应性纳米颗粒包括三甘油单硬脂酸酯(TGMS)。可构成炎症响应性纳米颗粒的另外三甘油单链烷酸酯可包括，例如，三甘油单棕榈酸酯、三甘油单癸酸酯、三甘油单月桂酸酯、三甘油单硬脂酸酯、三甘油单辛酸酯、三甘油单肉豆蔻酸酯、三甘油单油酸酯和/或其任何组合。
自组装DNA纳米结构可以开发为具有精确控制尺寸和架构。由于DNA的内在生物相容性和可降解性，DNA纳米结构可用于药物递送。许多载物，例如小分子药物、小干扰RNA(siRNA)、免疫刺激性寡核苷酸CpG、光敏剂和蛋白质，可以通过DNA纳米载体进行细胞内递送。此外，基于DNA的载体可以通过将靶向部分杂交到纳米结构上或将靶向适配子编程到用于靶向药物递送的DNA链中来官能化。
在本发明的一个方面，本文公开了一种化学预防方法，所述方法包括：向宿主施用足以预防癌症再发的量的控释药物剂型；其中控释药物剂型包含CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶。
在本发明的一个方面，本文公开了一种化学预防方法，所述方法包括：
向受试者提供微针贴剂，其中微针贴剂包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基材，微针的基端与所述基材附接或整合；
CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶；以及
将微针插入生物屏障中，其中免疫治疗剂以控释方式释放到受试者中。
在另一方面，本文公开了一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：
向受试者提供微针贴剂，其中微针贴剂包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基材，微针的基端与所述基材附接或整合；
CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶；以及
将微针插入生物屏障中，其中免疫治疗剂以控释方式释放到受试者中。
在一个实施方案中，免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是尼沃鲁单抗。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗。
在另一个实施方案中，免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体与抗CTLA4抗体的组合。
在进一步的实施方案中，炎症响应性纳米颗粒包括三甘油单硬脂酸酯(TGMS)。在另外的实施方案中，限制性酶是HhaI。
在另外的实施方案中，本文公开了一种化学预防方法，所述方法包括：向宿主施用足以抑制癌前病变进展至癌症的量的控释药物剂型；其中控释药物剂型包含CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中纳米茧包封免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中纳米颗粒包封限制性酶。
在一个实施方案中，化学预防方法用于预防癌症的再发。本文所述的活性化合物和方法可用于预防切除的实体瘤的再发。在一个实施方案中，待预防的癌症再发是黑素瘤。
如本文所设想的，待预防或治疗的癌症再发可以是原发性肿瘤。在一方面，本文描述的方法用于预防实体肿瘤再发，例如，黑素瘤；肺癌(包括肺腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤)；乳腺癌(包括导管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌、浆膜腔乳腺癌)；结肠直肠癌(结肠癌、直肠癌、结肠直肠腺癌)；肛门癌；胰腺癌(包括胰腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤)；前列腺癌；前列腺腺癌；卵巢癌(卵巢上皮癌或表面上皮-间质瘤，包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌、性索-间质瘤)；肝胆管癌(包括肝细胞癌、胆管癌、血管瘤)；食管癌(包括食管腺癌和鳞状细胞癌)；口腔和口咽鳞状细胞癌；涎腺腺样囊性癌；膀胱癌(bladdercancer)；膀胱癌(bladder carcinoma)；子宫癌(包括子宫内膜腺癌、眼、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤、混合苗勒氏肿瘤)；胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤和其他脑肿瘤；肾癌(包括肾细胞癌、透明细胞癌、威姆氏瘤(Wilm'stumor))；头颈癌(包括鳞状细胞癌)；胃癌(胃癌、胃腺癌、胃肠道间质瘤)；睾丸癌；生殖细胞肿瘤；神经内分泌肿瘤；宫颈癌；胃肠道、乳房和其他器官的类癌；印戒细胞癌；间叶组织肿瘤，包括肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假血管瘤样间质增生、肌纤维母细胞瘤、纤维瘤病、炎性肌纤维母细胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤(leiomysarcoma)、皮肤类包括黑色瘤、宫颈癌、视网膜母细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、脑癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、软组织癌腺体腺癌、尿道癌、阴茎癌、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴管肉瘤、间皮瘤、鳞状细胞癌；表皮样癌、恶性皮肤附属器瘤、腺癌、肝癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、胆管细胞型肝癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、间变性胶质瘤；多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、成神经管细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌、恶性副神经节瘤、黑色素瘤、默克尔细胞肿瘤(Merkel cell neoplasm)、乳腺叶状囊肉瘤(cystosarcoma phylloide)、涎腺癌、胸腺癌和阴道癌等。
免疫治疗药物的递送：1-甲基-DL-色氨酸纳米颗粒
在又其他方面，免疫治疗剂可以在纳米颗粒中递送，所述纳米颗粒包含与为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂的1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸。
在一方面，本文公开了一种纳米颗粒，其包含：与1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸，其中纳米颗粒包封免疫治疗剂。
在另一方面，本文公开了一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：
向受试者提供微针贴剂，其中微针贴剂包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基材，微针的基端与所述基材附接或整合；
纳米颗粒，其中纳米颗粒包含与1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸，并且其中纳米颗粒包封免疫治疗剂；
将微针插入生物屏障中，其中免疫治疗剂以控释方式释放到受试者中。
在本发明的一个方面，本文公开了一种化学预防方法，所述方法包括：
向受试者提供微针贴剂，其中微针贴剂包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基材，微针的基端与所述基材附接或整合；
纳米颗粒，其中纳米颗粒包含与1-甲基-DL-色氨酸共价缀合的透明质酸，并且其中纳米颗粒包封免疫治疗剂；
将微针插入生物屏障中，其中免疫治疗剂以控释方式释放到受试者中。
在一个实施方案中，免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是尼沃鲁单抗。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗。
在一个实施方案中，纳米颗粒在治疗或预防癌症的方法中施用。在一个实施方案中，疾病是癌症。在一个实施方案中，癌症是黑素瘤。在一个实施方案中，生物屏障是皮肤。
在一个实施方案中，纳米颗粒可以在用于预防癌症再发的化学预防方法中施用。本文所述的活性化合物和方法可用于预防切除的实体瘤的再发。在一个实施方案中，待预防的癌症再发是黑素瘤。上文描述了实体瘤的另外实例。
免疫治疗剂(免疫检查点抑制剂和免疫佐剂)
已知有许多抑制免疫检查点蛋白的免疫治疗剂(免疫检查点抑制剂)。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD1及其配体PD-L1和PD-L2并且还包括LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、4-1BB(CD137)、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径在本领域中被识别用于构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev Cancer 12:252-264)。
免疫检查点抑制剂是抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能减少和/或完全阻断。在一个实施方案中，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此，免疫检查点蛋白抑制剂可以是人免疫检查点蛋白的抑制剂。本领域描述了免疫检查点蛋白(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev.Cancer 12:252-264)。
优选的免疫检查点蛋白抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。许多PD1、PDL-1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、4-1BB(CD137)、TIM3和KIR抑制剂是已知的，并且这些类似的已知免疫检查点蛋白抑制剂可以使用本文公开的装置和方法施用。
PD-1抑制剂的实例包括但不限于阻断人PD-1的人源化抗体，诸如派姆单抗(以前称为兰布罗利珠单抗(lambrolizumab))，或皮地利珠单抗(pidilizumab)以及完全人抗体诸如尼沃鲁单抗(以前称为MDX-1106或BMS-936558)。伊匹单抗是一种完全人CTLA-4阻断抗体，目前以名称Yervoy(Bristol-Myers Squibb)销售。第二种CTLA-4抑制剂是特利姆单抗(tremelimumab)。在一个实施方案中，免疫治疗剂是尼沃鲁单抗。
此外，免疫检查点抑制剂可以包括但不限于阻断PD-L1的人源化或完全人抗体，诸如MEDI-4736(在WO2011066389A1中公开)、MPDL328OA(在US8217149B2中公开)和MIH1(通过eBioscience可获得的Affymetrix(16.5983.82))和目前正在探索的其他PD-L1抑制剂。PD-L1的另外抗体包括阿特珠单抗(atezolizumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在一个实施方案中，施用KIR抑制剂。利瑞单抗(Lirilumab)是一种与KIR2DL1/2L3结合的人单克隆抗体。在一个实施方案中，施用了抑制剂4-1BB(CD137)。乌瑞鲁单抗(Urelumab)靶向CD137的细胞外结构域。
在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂优选选自CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂，诸如选自上文提及的已知CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂(伊匹单抗、特利姆单抗、派姆单抗、尼沃鲁单抗、皮地利珠单抗、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、AMP-244、MEDI-4736、MPDL328OA、MIH1)或其组合。
更优选的是从PD1和PD-L1抑制剂，诸如上文提及的已知PD-1或PD-L1抑制剂中选择免疫检查点抑制剂，并且最优选地，从PD-1抑制剂，诸如上文提及的已知PD1抑制剂中进行选择。在优选的实施方案中，PD1抑制剂是尼沃鲁单抗或派姆单抗或另一种针对人PD1的拮抗剂抗体。
在一个实施方案中，免疫治疗剂可以与免疫佐剂组合施用。免疫佐剂是当与其他免疫治疗剂组合使用时起加速、延长或增强免疫响应的任何物质(例如，单磷酰脂质A(MPLA)、铝盐(明矾)、未甲基化的含CpG二核苷酸的DNA)(例如Lim,YT.Clin Exp VaccineRes.2015年1月；4(1):54–58)。
实施例
以下实施例在下文中列出以示出根据所公开主题的组合物、装置、方法和结果。这些实施例并不旨在包括本文所公开主题的所有方面，而是示出代表性方法和结果。这些实施例并不旨在排除对于本领域技术人员而言显而易见的本发明的等效方案和变型形式。
实施例1.通过程序性递送CpG和抗PD1抗体进行炎症触发的癌症免疫疗法
细胞系。
小鼠黑素瘤细胞系B16F10购自美国典型培养物保藏中心。对于生物发光体内肿瘤成像，B16F10-luc细胞是得自UNC的Leaf Huang博士的馈赠。将细胞维持在补充有10％胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)、100U/mL青霉素(Invitrogen)和100U/mL链霉素(Invitrogen)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco，Invitrogen)中。RAW 264.7鼠巨噬细胞购自美国典型培养物保藏中心并将其维持在补充有10％胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)、100U/mL青霉素(Invitrogen)和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Gibco，Invitrogen)中。
抗体。
体内使用的aPD-1(抗PD-1抗体)购自Biolegend Inc.。对于根据制造商说明书进行的FACS分析，染色抗体包括CD3、CD4、CD8、CD62L、CD44(Thermo Scientific)、细胞内IFN-γ和Foxp3(eBioscience)。在Calibur FACS仪器(BD)上分析染色细胞，并使用flowjo软件(版本10)进行分析。
酶/TGMS-PD1/DNA纳米茧纳米复合物的制备。
为了制备DNA纳米茧，根据先前的报道，使用滚环扩增(RCA)来制备DNA纳米茧。根据制造商说明书，用CircLigase II ssDNA连接酶(Epicenter)将5'-磷酸化的ssDNA模板(Integrated DNA Technologies Inc.)环化成环状ssDNA模板。简而言之，将10pmol ssDNA模板添加到含有2.5mM MnCl2、1M甜菜碱和5U/μLCircLigase II ssDNA连接酶的20μL反应混合物中。在60℃温育1h后，将环化模板用核酸外切酶I(1U/μL)在37℃下处理45min，然后在80℃下热灭活15min。将所得的环化ssDNA模板与0.5μM引物在含有0.2mM dNTP的1×等温扩增缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.8、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Tween20)中在95℃下杂交5min。将模板-引物杂交溶液冷却至室温后，加入Bst 2.0DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.)至终浓度为0.2U/μL，并且在60℃下将RCA进行17h，然后在80℃下热灭活20min。将获得的DNA纳米茧在室温下在透析单元(20K MWCO)(Slide-A-Lyzer，Thermo Scientific)中用TE缓冲液(10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA)透析48h。用Nanodrop2000C光谱仪(Thermo Scientific)测量DNA浓度。通过Zetasizer(Nano ZS，Malvern)测量粒度和ζ电位。
为了制备三甘油单硬脂酸酯(TGMS)纳米颗粒，将浓度为0.5mg/mL的TGMS(Sigma)在PB(pH 8.0)中超声处理以在水中制备自组装的TGMS NP。对于限制性酶(HhaI)负载，将浓度为0.5mg/mL的TGMS在酶(1000U)溶液中于4℃超声处理1小时。通过以21 000g离心5min除去过量的酶。选择HhaI作为限制性酶是由于它们的消化ssDNA的能力。
为了将aPD-1和酶@TGMS NP负载到DNA纳米茧中，将aPD-1和酶@TGMS NP与DNA纳米茧以0.2:1:1的比率混合(aPD-1:酶@TGMS NP:DNA纳米茧，重量:重量:重量)。超声处理后，在4℃下将混合物置于振荡摇床中过夜。通过离心(10 000g)除去过量的aPD-1和TGMS NP，并用PBS洗涤数次。
酶响应性药物释放。
将释放研究在37℃下在PBS+10％胎羊血清中在连续搅拌下进行。将PBS、MMP-9(500ng/mL，Sigma)或脂肪酶(10 000U，Sigma)加入到样品以研究DNA和抗体释放。使用1％(w/v)琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA崩解，并通过IgG总ELISA试剂盒(eBioscience)测定抗体释放。
小鼠和体内肿瘤模型。
从Jackson Lab(USA)购得雌性C57B6小鼠，并将其饲养在北卡罗来纳州立大学毒理学大楼(North Carolina State University Toxicology Building)。所有小鼠研究均在由北卡罗来纳州立大学(North Carolina State University)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的动物方案的背景下进行。为了测量对复发的影响，在将1×106个荧光素酶标记的B16F10肿瘤细胞移植到小鼠背部后第10天(肿瘤达到～100mm3)，切除肿瘤，留下少量残余组织。对于转移模型，在手术前一天通过尾静脉将1×105个B16F10肿瘤细胞静脉内输注到C57BL/6小鼠中。将小鼠称重并随机分成不同组。从第0天开始，向小鼠肿瘤周围注射不同的药物制剂。通过B16F10细胞的生物发光信号监测肿瘤生长。在IVIS Lumina成像系统(Caliper,USA)上获取图像。还通过数字卡尺测量肿瘤。将肿瘤体积(mm3)计算为(长直径×短直径2)/2。
体内MMP9产生的分析。
手术1小时后，收集伤口组织并将其在37℃下培养4天。每天取出100μL培养基，在-80℃冷冻并加入100mL新鲜培养基。通过ELISA(ThermoFisher)测定基质金属蛋白酶9(MMP9)浓度。
体内生物发光和成像。
用Xenogen IVIS光谱成像系统收集生物发光图像。在将DPBS(15mg/mL)中的d-荧光素(Pierce)腹膜内注射到动物(10μL/g体重)后10min，使用Living Image软件(Xenogen)采集数据。
共聚焦显微镜。
从小鼠切下肿瘤并在最佳切割培养基(O.C.T.)中快速冷冻。使用冷冻切片机切割出几个微米切片并将其固定在载玻片上。将切片在冰冷的丙酮中固定10分钟，然后用PBS再水合。用BSA(3％)封闭后，将切片用一抗在4℃下染色过夜。使用共聚焦显微镜(Zeiss)分析载玻片。
细胞毒性T淋巴细胞活性。
用辐射的B16F10癌细胞再次刺激从小鼠收获的脾细胞。将细胞用PBS洗涤三次，然后在96孔培养板中与B16F10靶细胞以500:1的效应靶细胞比率一起培养。温育24h后，收集悬浮液以用非放射性细胞毒性测定(Thermo Scientific)检测LDH渗漏水平，所述LDH渗漏水平指示效应细胞对靶细胞的特异性裂解水平。根据特异性裂解％＝((实验性LDH释放-效应细胞LDH释放)/(最大LDH释放-自发性LDH释放))×100％计算特异性裂解的百分比。
统计学分析。
使用GraphPad Prism(5.0)评价统计学分析。用配对的学生t检验和双向ANOVA计算统计学显著性。使用对数秩检验进行存活曲线的比较。0.05或更小的P值认为是显著的。
结果
在该实施例中，本发明人开发了一种新的癌症免疫治疗剂，其可用于预防手术后肿瘤复发。癌症手术后肿瘤负荷最低。此外，局部促炎环境有利于免疫治疗。在该实施例中，本发明人开发了一种用于响应于炎症条件控释负载的抗PD1抗体(aPD1)和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的创新性递送载体(图1A)。CpG ODN触发表达Toll样受体9的细胞(包括人浆细胞样树突细胞(pDC))，具有有效的免疫刺激作用，并且可以增强多种癌症治疗的抗癌活性(Marabelle,A.等人J.Clin.Invest.2013,123,2447；Krieg,A.M.Oncogene 2008,27,161)。通过特异性地基于用CpG序列编码的模板的酶促滚环扩增(RCA)方法，载体(指定为DNA“纳米茧”，DNC)通过长链的单链DNA(ssDNA)组装(Jones,M.R.等人Science 2015,347,1260901)。DNA含有重复的CpG序列和限制性酶HhaI的切割位点，所述限制性酶HhaI能够消化DNC并随后产生CpG ODN片段。为了使释放事件具有生物响应性，将HhaI笼蔽到三甘油单硬脂酸酯(TGMS)纳米颗粒(TGMS NP)中并附接至DNC。TGMS是一种两亲物，其酯键能够通过酯酶和基质金属蛋白酶(MMP)进行裂解，所述酯酶和基质金属蛋白酶在发展组织重塑的伤口部位高度表达(Gajanayake,T.等人Sci.Transl.Med.2014,6,249ra110)。由肿瘤切除术切口的伤口部位中出现的炎症状态触发(图1B)，TGMS可以酶促裂解(Gajanayake,T.等人Sci.Transl.Med.2014,6,249ra110；Karp,J.M.等人谷歌专利：2011)，从而拆解笼并释放HhaI，所述HhaI也可以进一步依序将DNC转化为CpG ODN并且释放aPD1。控释型CpG ODN和aPD1的组合作用(图1C)可以有利于在黑素瘤模型中诱导持久且特异性的抗肿瘤T细胞响应，避免体内毒性峰值水平(Hamid,O.等人N.Engl.J.Med.2013,369,134)。
三甘油单硬脂酸纳米颗粒和DNA纳米茧(TGMS-DNC)复合物的合成与表征。
如图5所示，合成的ssDNA自组装成三维“茧”状结构，其平均粒径为150nm，如通过透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)揭示的。在用HhaI处理的情况下，所获得的DNC可以被消化成小的均匀片段(图6)。更重要的是，这些均匀片段可以诱导RAW264.7细胞中的TNF-α和IL6产生(图6)，这表明在限制性酶处理后DNC可以降解成CpG ODN。合成具有非特异性序列的两种不同的对照DNC(cDNC)(表1)以验证设计。
表1.DNA寡核苷酸的序列。
Figure BDA0001837949620000311
Figure BDA0001837949620000321
Figure BDA0001837949620000322
的部分序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中的GCGC)指示限制性酶HhaI的切割位点。
阴影部分指示CpG序列。
如琼脂糖凝胶(图7)中所示，在没有HhaI处理的情况下，这些cDNC不能如DNC那样在凝胶中迁移。在用HhaI处理时，一个cDNC(具有切割位点，没有CpG)可以容易地切成较小的均匀片段，而其他cDNC(具有CpG，没有切割位点)对HhaI裂解具有抗性。
可将酶笼蔽到单分散于PBS中的直径约30nm的三甘油单硬脂酸纳米颗粒(TGMSNP)中(图8)。当笼蔽到TGMS NP中时，HhaI的酶活性被显著抑制(图10)。还证实，如通过TEM和动态光散射(DLS)揭示的,TGMS NP在混合后可以高效地附接至DNA纳米茧以形成单分散的TGMS-DNC NP(图2A-B)。一旦与TGMS NP附接，DNA纳米茧就显示出DLS测量直径从150nm至210nm的增加。另外，发现在超声处理并在4℃温育过夜后可以将aPD1进一步负载到TGMS-DNC NP中。如通过ELISA测定的，aPD1的负载效率为约6.0％(图9)。
来自TGMS-DNC复合物的体外炎症响应性CpG和aPD1释放。
接下来分析响应于体外炎症条件的控释曲线。蛋白水解酶，诸如MMP，在炎症状态(如围手术期创伤)下显著上调(Ryan,T.J.Australas.J.Dermatol.1994,35,35；Armstrong,D.G.；Jude,E.B.J.Am.Podiatr.Med.Assoc.2002,92,12)。如通过TEM成像可视化的,确定TGMS NP通过MMP9处理快速解离(图11)。接下来，评价了TGMS-DNC响应于蛋白水解酶拆解和释放负载的aPD1的能力。将TGMS-DNC在37℃下与脂肪酶(酯酶)或MMP-9酶(500ng/mL)一起在PBS中温育。通过琼脂糖凝胶电泳和ELISA测定分别定量DNA纳米茧的降解和aPD1的释放曲线(图12)。数据显示，DNA纳米茧在MMP-9处理时随着时间的增加被降解成小的DNA片段。DNA和aPD1的累积释放曲线揭示脂肪酶和MMP可以触发DNC的分裂并随后释放负载的aPD1。而PBS对照溶液中的TGMS-DNC保持稳定并随时间释放不显著量的aPD1(图12)。此外，MMP-9处理后的DNC可有效诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)细胞中的IL-6和TNF-α产生，这表明DNC被消化成CpG核苷酸(图13)。
为了进一步在体外模仿炎症状态，通过用脂多糖(LPS)处理来激活RAW 264.7细胞(图2C)。24小时后，将来自激活的巨噬细胞的细胞培养基加入到TGMS-DNC中并将其在37℃下温育。在不同时间点定量培养基中的CpG核苷酸和aPD1的释放(图2D-F)。绘制累积释放与时间的关系揭示来自LPS激活的巨噬细胞的培养基触发TGMS-DNC降解，导致aPD1的持续释放。而未激活的巨噬细胞培养物的培养物并未如此。此外，原子力显微镜(AFM)图像和DLS数据表明，当用未激活的巨噬细胞培养物处理时，TGMS-DNC复合物保持稳定；而当用来自LPS激活的巨噬细胞的培养基处理时，观察到TGMS-DNC复合物的高降解效率(图2G-J)。
手术后TGMS-DNC复合物的体内抗肿瘤复发。
为了评价手术后TGMS-DNC复合物的抗肿瘤复发，使用B16F10小鼠黑素瘤不完全肿瘤切除模型(其模拟手术后出现的局部再发和全身再发)(图14)(Stephan,S.B.等人Nat.Biotechnol.2015,33,97)。为了验证手术部位中MMP-9的上调表达，通过ELISA测试在手术后第1-4天来自伤口组织的培养基的MMP-9活性(图15)。在离体培养的伤口中观察到与术前和未受伤的组织相比显著增加的活性MMP-9水平，从而表明手术促进了伤口部位的MMP-9分泌。在不完全除去肿瘤的手术后，向小鼠肿瘤周围(peritumorally)注射单剂量的不同药物制剂，包括PBS对照(第1组(G1))、HhaI-TGMS-DNC(G2)、HhaI-TGMS-cDNC(包括HhaI切割位点而没有CpG序列)-aPD1(G3)、游离aPD1/游离CpG核苷酸(G4)和HhaI-TGMS-DNC-aPD1(G5)(aPD1，0.5mg/kg DNA，10mg/kg)。通过B16F10细胞的生物发光信号和肿瘤的尺寸监测肿瘤生长(图3A-C)。接受HhaI-TGMS-DNC-aPD1治疗的小鼠显示出最小的复发肿瘤体积。值得注意的是，40％的小鼠显示出对组合疗法的完全响应。剩余的小鼠显示出显著延迟的肿瘤生长(图3B)。在其他测试组中，游离aPD1和游离CpG核苷酸共同施用的小鼠显示出适度的肿瘤生长延迟但不能防止复发。此外，用HhaI-TGMS-DNC和HhaI-TGMS-cDNC-aPD1治疗的小鼠中肿瘤复发的预防并不比对照更成功。还观察到单独的这些抗体(没有CpG DNC)对肿瘤消退具有不显著的功效，这表明CpG对于与aPD1治疗一起增强抗肿瘤免疫响应是关键的。除了预防肿瘤复发外，小鼠的肿瘤尺寸与其存活率相关联(图16)。在组合疗法后60天观察到完全肿瘤消退和存活(40％)。共同施用的游离aPD1和游离CpG核苷酸适度增加平均存活时间。另外，HhaI-TGMS-DNC和HhaI-TGMS-cDNC-aPD1处理均未相对于PBS对照改善存活率。
为了探索制剂增强的治疗效果背后的免疫机制，在手术后10天从复发肿瘤收获肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并通过流式细胞术和免疫荧光对其进行分析。经证实，HhaI-TGMS-DNC-aPD1组合治疗增加了复发肿瘤中激活的CD8+T细胞(CD8+CD44+CD62L-)的百分比和绝对数量(图3D-E)。免疫荧光染色还揭示未治疗的复发肿瘤具有有限的T细胞浸润(图3F)。相反，来自HhaI-TGMS-DNC-aPD1治疗的小鼠的肿瘤被CD8+和CD4+T细胞显著浸润。当在分析中考虑汇集肿瘤的绝对细胞数和质量时，HhaI-TGMS-DNC-aPD1组合治疗小鼠中每mg肿瘤的总CD8+T细胞相比于游离aPD1/游离CpG核苷酸和HhaI-TGMS-cDNC-aPD1治疗的小鼠增加2倍，并且相比于HhaI-TGMS-DNC治疗和PBS对照增加10倍(图3G)。此外，还研究了肿瘤浸润的CD4+FoxP3+T细胞(图17)。同样，与对照组相比，组合治疗的肿瘤中效应CD4+细胞也增加。总的来说，组合治疗不仅增加了CD8+T细胞与Treg的比率，而且增加了效应CD4+T细胞与Treg的比率(图3H)。
为了进一步证实该制剂的效力，通过在手术前一天静脉内注射表达荧光素酶的B16F10细胞来攻击小鼠，在转移肿瘤模型中对其进行测试。在不完全除去大多数原发性肿瘤的手术后，向小鼠肿瘤周围注射单剂量的所指出的不同制剂，包括PBS对照(第1组(G1))、HhaI-TGMS-DNC(G2)、HhaI-TGMS-cDNC(包括HhaI切割位点而没有CpG序列)-aPD1(G3)、游离aPD1/游离CpG核苷酸(G4)和HhaI-TGMS-DNC-aPD1(G5)(aPD1，0.5mg/kg DNA，10mg/kg)。清楚地观察到通过手术后注射HhaI-TGMS-DNC-aPD1产生的全身抗肿瘤免疫响应(图4A-B)。原发性肿瘤和播散性肿瘤均显示出显著延迟的生长，40％的小鼠存活40天。形成鲜明对比的是，对照组产生的抗肿瘤免疫响应对多个器官中的远处转移几乎没有影响，并且与未治疗组相比，显示出的存活率改善可忽略不计(图4C)。通过测量IFN-γ的产生来检查脾细胞反应。将在第30天从小鼠收获的脾细胞用经辐射的B16F10细胞处理16h。显示，在HhaI-TGMS-DNC-aPD1治疗后，脾中IFN-γ分泌CD8T细胞的比例与对照组相比在小鼠中增加大约2-3倍(图4D-E)。此外，当将脾细胞在体外与B16F10癌细胞一起温育时，也观察到增强的细胞毒性响应(图4F)。合起来看，通过将HhaI-TGMS-DNC-aPD1局部注射到手术部位、原位根除肿瘤以及播散性转移肿瘤，可以实现全身抗肿瘤功效。
总之，在该实施例中公开了用于癌症免疫疗法的局部递送系统，其可以显著改善在切除原发性肿瘤后抗癌免疫响应治疗剩余或转移性肿瘤的能力。手术新型的基于CpGDNA的载体不仅充当aPD1的治疗性负载基体，而且还可以在CpG DNA分裂后增强治疗功效。aPD1和CpG ODN在肿瘤部位的持续释放和协同作用可以通过手术诱导的炎症微环境激活。证明CpG和aPD1的生物响应性控释比游离CpG核苷酸和aPD1更有效。控释还可以防止aPD1在体内毒性峰值剂量的风险。
本实施例中引用的参考文献
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实施例2.协同性经皮免疫疗法通过阻断PD1和IDO增强抗肿瘤免疫响应
癌症免疫学的最新发展证实了免疫调控方法在治疗癌症中的至关重要性。1-4其中，免疫检查点抑制剂程序性细胞死亡蛋白1是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的强力负调控子。5-6肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)参与PD1/PDL1(程序性死亡配体1)相互作用，这导致T细胞凋亡、失能或耗尽。7用单克隆抗体阻断PD1功能导致增加的T细胞响应和各种类型肿瘤的长期缓解。8-9在用于晚期黑素瘤的临床试验中，抗PD1抗体(aPD1)治疗引起显著更长的无进展存活并且已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准。10-13然而，aPD1疗法的临床益处仅限于一小部分患者。14在免疫逃逸的演变中，淋巴细胞的低效浸润可能会削弱这种效应。15例如，肿瘤可以触发多种免疫抑制分子，诸如调控性树突细胞(DC)中的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)，其催化色氨酸的降解并限制T细胞功能。此外，调控性T细胞可被IDO表达的上调所吸引，这将显著地抵抗抗肿瘤响应。16-18同时，由于在传统的全身施用后抗体与正常组织的脱靶结合，潜在的免疫相关不良事件也带来了重大挑战。19
为了克服这些挑战，开发了用于肿瘤微环境中PD1和IDO的协同检查点阻断的基于微针(MN)的经皮递送平台。20-25已证实用1-甲基-DL-色氨酸(1-MT)对IDO的药理学抑制增强T细胞依赖性抗肿瘤免疫。15，26-27口服施用的NLG2101目前正处于Ib/II期试验剂量递增的临床研究中用于治疗转移性乳腺癌、脑癌、黑素瘤和胰腺癌。17因此，通过IDO抑制剂限制免疫抑制可以最大化PD1阻断的治疗效果。该实施例中采用的策略是设计针对透明质酸(m-HA)共价缀合的1-MT以形成两亲结构，并通过自组装容易地构建纳米颗粒(NP)以包封aPD1。28-31这种基于“通过掺入药物B形成的载体中的药物A”的组合策略的制剂方法有效地促进了治疗剂的负载能力。32-34整合到MN系统中，组合治疗剂可以穿过角质层运输并且容易累积在局部肿瘤周围的皮肤驻留DC的网络中。21,35-39基于MN的持续递送平台可以增强此类药剂的局部保留，改善它们对肿瘤浸润淋巴细胞的作用并降低由于渗漏到体循环中而引起的毒性。同时，借助于透明质酸酶(HA酶)(肿瘤微环境中过表达的酶)，可以通过酶促消化肿瘤部位的HA来激活药物释放。40小分子1-MT从m-HA的释放可以阻断肿瘤微环境中的免疫抑制途径。同时，随后触发的aPD1释放在同种异体反应性T细胞群增加的情况下发挥PD1阻断作用(图1)。使用B16F10小鼠黑素瘤模型，证实aPD1和1-MT的协同递送引起强力且持续的抗肿瘤效果，其伴随增强的效应T细胞免疫以及肿瘤环境中的免疫抑制减少。
结果和讨论
将溶剂透析方法用于制备1-MT缀合的HA的自组装(m-HA，MW＝50kDa)，从而包封单克隆aPD1。41m-HA通过在HA与胺保护的1-MT之间形成酯键而制备(图22-24)。在IFN-γ刺激后，通过具有IDO的组成型表达的HeLa细胞测试功能性IDO抑制。(图25)。42-43鉴于1-MT的疏水性吲哚环结构对m-HA的改性，两亲性HA使得NP能够在水溶液中自组装。如透射电子显微镜(TEM)图像中所示，所得的基于HA的NP(HA-NP)具有球形形状，其具有单分散性尺寸分布。通过动态光散射(DLS)测定DI水中NP的平均直径为151nm(图1b)，这与TEM观察结果一致。负载aPD1的HA-NP在PBS和10％FBS溶液中稳定，在72h内具有可忽略不计的尺寸差异(图26)。HA-NP的ζ电位测量为-17.1±0.2mV，这是由于HA的羧基。由于疏水性和静电非特异性相互作用，在HA-NP形成期间aPD1被负载到内部结构中。29通过ELISA测定aPD1的负载能力为4.5％(重量/重量)(图27)。另外，通过Cy5.5标记的aPD1和罗丹明B替代的1-MT的共定位进一步证明了aPD1的成功掺入(图28)。获得的HA-NP是高度稳定的，在4℃下在PBS中5天内没有显示出可测量的沉淀。
为了评价HA酶触发的NP的解离以及随后的aPD1和1-MT的释放，探索了HA-NP随时间的演变性拆解行为。在添加HA酶后，HA-NP的构象和尺寸呈现出时间依赖性。颗粒在4小时内逐渐解离并且在与HA酶(1mg/mL)连续温育24h后尺寸减小至8nm(图1c和图29)。在pH 6.5下监测在具有或不具有HA酶的情况下aPD1从自组装m-HA的体外释放曲线，以模拟在温和酸性的肿瘤微环境中的生理释放动力学(图30)。由具有HA酶的样品实现了显著更高的aPD1释放曲线，这是由于酶水解介导的HA-NP基体的解离，而在不具有HA酶的PBS溶液中仅从HA-NP释放了少量aPD1(图1d)。此外，通过高效液相色谱(HPLC)测量，从HA-NP观察到1-MT的类似释放模式。在不具有HA酶的情况下，在8h内仅从HA-NP释放约8％的1-MT，并且在48h内释放大约18％的1-MT。相比之下，1-MT在HA酶的帮助下显示出将累积释放提升了5倍(图1e)。还观察到从HA-NP释放的1-MT以与用天然1-MT处理类似的模式中断了犬尿氨酸产生(图31)。总的来说，这些结果证实HA酶有利于解离自组装的HA-NP，从而同时促进aPD1和1-MT的持续释放。
为了靶向黑素瘤部位的免疫监视皮肤区域，制造MN阵列贴剂用于协同递送aPD1和1-MT。对于MN制备，首先通过离心将HA-NP负载到微模的尖端中。m-HA水凝胶和包埋的HA-NP充当MN结构的基体材料(图32)。将针以面积为10×10mm2的15×15阵列布置，然后根据注射器进行定制。每根针都是圆锥形的，基部半径为150μm，高度为800μm并且尖端半径为5μm(图2a、2b)。荧光图像指示FITC标记的aPD1在针基体内的分布(图2c)。为了评估皮肤穿透能力，将制备的MN以柔和力插入到小鼠的背部皮肤中(图2d)。通过表皮内沉积的荧光有效负载证明有效插入，深度为大约200μm(图33)。组织学检查进一步揭示完全穿透到皮肤中(图34)。皮肤上的台盼蓝斑点阵列对应于MN插入位点，这进一步表明所有MN是完全插入的(图2e)。MN阵列的断裂力测量为每针0.41±0.03N，这提供了在不屈曲的情况下插入到皮肤中所需的力(每针0.06N)的六倍安全裕度(margin of safety)(图35)。22为了探索包封在MN中的HA-NP在MN配制后是否保持酶介导的降解能力，将含有HA-NP的针的尖端在pH 6.5的HA酶溶液中温育。在MN基体的帮助下，由具有HA酶的MN实现了更持久的aPD1释放曲线，而从不具有HA酶的样品收集到不显著的释放(图36)。
具有缀合的1-MT和包封的aPD1的HA-NP制剂可以改善它们的物理化学特性。因此，在具有B16F10黑素瘤的小鼠模型中进行了对MN施用后游离aPD1/1-MT和NP的体内动力学的评估。在MN施用后在肿瘤部位测试药物保留能力。在注射负载有aPD1和Cy5.5-1-MT-HA或游离Cy5.5-1-MT的MN后第1天、第3天和第5天进行体内生物发光成像。对于自组装的1-MT-HANP制剂组，在黑色素瘤部位周围可视化到显著延长的Cy5.5信号，而对于游离药物组在三天后可以检测到的信号很少(图2f，上图)。这表明1-MT在与HA缀合后倾向于与贴剂保持在黑素瘤部位，而游离1-MT迅速从贴剂裂解下来并在一天内被身体排出(图2f，下图)。更长的保留时间也涉及基于肿瘤发生中缀合的HA与CD44受体之间的亲和力的主动靶向。40在施用后的不同时间点比较肿瘤和主要器官中出现的1-MT的生物分布，其显示肿瘤中累积最高，然后是肺和肝脏(图2g)。与对照组中的肿瘤部位和其他器官的生物分布相比，观察到类似的模式。对信号的定量显示缀合的1-MT在黑素瘤部位的累积与游离1-MT相比在第1天高3倍并且在MN后第2天和第3天高5倍(图2h)。更重要的是，与对照组相比，通过HA-NP组中肿瘤载玻片的免疫荧光染色观察到包封的aPD1的肿瘤摄取显著增加(图2i和图37)。不同时间间隔处抽取血液并且对1-MT的HPLC分析显示当与HA缀合时发生大大延长的血液循环时间(图38)。肿瘤区域以及外周循环中持续高浓度的药物将增强免疫系统治疗体内原发性肿瘤和转移性肿瘤的能力。
B16F10小鼠黑素瘤肿瘤模型是一种高度侵袭性的肿瘤模型，将其用于评价协同免疫疗法在临床相关环境中的功效。将B16F10-luc癌细胞皮下植入到雌性C57BL/6小鼠的后背区域中。将具有黑素瘤的小鼠分组并用单次施用的以下项治疗：空白MN贴剂(第1组(G1))、aPD1的静脉内(i.v.)注射(第1组(G2))、aPD1和1-MT的肿瘤内(i.t.)注射(第1组(G3))、负载aPD1的MN贴剂(第1组(G4))、负载1-MT的MN贴剂(第1组(G5))和负载aPD1/1-MTNP的MN贴剂(第1组(G6))。由MN施用的NP显著延迟肿瘤生长，使得治疗7天后小鼠中的肿瘤最小(图3a)。考虑到肿瘤穿透效率，i.v.施用的aPD1和1-MT没有实现肿瘤生长的显著延迟，但是平均肿瘤重量低于空白MN组。用含有aPD1或1-MT的MN施用的组仅显示有限的抗肿瘤效率(图3b、3c)。这些肿瘤消退显示负载NP的MN以协同和持续的方式释放aPD1和小分子IDO抑制剂。肿瘤体积的显著延迟与其在B16F10黑素瘤模型中的存活率相关联。在协同治疗后40天观察到70％的小鼠存活，这比我们先前的结果更好。40相反，40天之后在四个对照组中没有一只小鼠存活(图3d)。此外，在各种治疗后未观察到明显的体重减轻或其他临床毒性征象，因此1-MT/aPD1MN贴剂可能是具有相对大的临床潜力的安全癌症治疗技术。(图3e)。
为了解决在该系统中介导肿瘤消退的细胞机制，在第12天分离TIL并通过免疫荧光和流式细胞术对其分析(图4a)。免疫荧光图像显示对照组中的肿瘤具有有限的T细胞浸润(图4b)。与对照相比，用协同疗法治疗的肿瘤被CD8+和CD4+T细胞显著浸润。苏木精和曙红(H&E)染色进一步表明通过黑色素可视化的肿瘤细胞群减少(图4c)。在第12天，aPD1/1-MT治疗的小鼠中肿瘤中CD3+细胞的绝对数量显著较低，这也对应于肿瘤重量的减少。此外，观察到肿瘤内显著更高的CD8+和CD4+效应T细胞增殖，如通过细胞周期相关蛋白Ki67的表达所测量的(图39)。更重要的是，与空白MN对照相比，在aPD1/1-MT治疗的小鼠中募集到肿瘤部位的CD8+细胞/毫克肿瘤增加了几乎6倍，这表明B16F10反应性CD8+T细胞被运输到肿瘤部位。此外，分析肿瘤浸润的CD4+FoxP3+T细胞。与效应T细胞相反，在治疗组中对于调控性T(Treg)细胞的细胞募集被抑制。Treg细胞浸润的减少也反映在CD8+T细胞与Treg细胞比率的显著增加。aPD1/1-MT疗法后小鼠中T效应细胞与Treg细胞的肿瘤内比率也提升，这与肿瘤消退相关联(图40)。合起来看，这些观察结果表明，协同疗法将aPD1和1-MT高效地递送在肿瘤部位，产生在定性上更有效的细胞毒性T细胞响应(图4d)。值得注意的是，所述系统显示出其生物相容性和低细胞毒性(图41)。在诸如皮肤、结肠、肝脏、肾脏、肺和肠的主要器官上进行组织病理学分析，并且没有观察到毒性或炎症的迹象(图42)。
总之，在该实施例中描述了优先靶向免疫抑制性受体PD1和免疫抑制酶IDO以增强抗肿瘤响应的协同经皮免疫疗法。使用MN作为载体来递送检查点抑制剂aPD1和1-MT的平台促进了治疗剂在患病部位的保留时间并且潜在地减轻了全身性施用癌症免疫治疗剂的副作用。
方法
材料
除非另有提及，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich。透明质酸钠(HA，分子量50Da)购自Freda Biochem Co.,Ltd.(中国山东)，皮肤粘贴外科用粘合剂购自MedlineIndustries,Inc.。体内使用的抗PD1抗体(aPD1)购自Biolegend Inc.(目录号124329，克隆：10F.9G2)并且1-甲基-DL-色氨酸购自Sigma。对于根据制造商说明书进行的FACS分析，染色抗体包括CD3、CD4、CD8、Ki67(Thermo Scientific)、细胞内Foxp3(eBioscience)，并使用flowjo软件(版本10)在Calibur FACS仪器(BD)上进行分析。通过Millipore NanoPure纯化系统(电阻率高于18.2MΩ·cm-1)制备去离子水。所有有机溶剂均订购自FisherScientific Inc.并按原样使用。
HA-NP的制备
通过在水性溶液中自组装制备NP。简而言之，将10mg两亲性m-HA和1mg aPD1溶于水/甲醇(2:1体积/体积)中。将乳液在4℃下搅拌2h。然后，通过用去离子(DI)水透析3天除去甲醇从而除去未缀合的1-MT，并通过离心过滤器(3,000Da分子量截止值，Millipore)进一步过滤。使用在pH 7.4下用PBS平衡的G-100Sephadex柱除去游离的aPD1。将最终的DI水中的NP悬浮液储存在4℃下以用于后续研究。在Zetasizer(Nano ZS；Malvern)上测量DI水中NP悬浮液的ζ电位和尺寸分布。
通过经由小鼠IgG ELISA测定测量未包封的IgG的量并使用空颗粒作为基本校正来确定aPD1包封的NP的负载能力(LC)和包封效率(EE)。LC和EE计算为LC＝(A-B)/C，EE＝(A-B)/A，其中A是预期的aPD1包封量，B是收集溶液中aPD1的游离量，并且C是颗粒的总重量。通过Malvern Zetasizer NanoZS上的动态光散射(DLS)测量粒度和多分散性强度。在适当稀释后，使用相同的仪器通过其电泳迁移率确定NP的ζ电位。在室温下一式三份地测试测量值。NP形态的TEM图像在JEOL 2000FX TEM仪器上在100kV下获得。
对于荧光NP，将Cyanine5.5NHS酯(Lumiprobe，Cy5.5)与aPD1和1-MT的伯胺共价偶联。在使用前立即将Cy5.5溶于无水DMSO中，浓度为10mg/ml。使Cy5.5和1-MT以5:1的最佳比率反应。对于与aPD1的缀合，立即混合40μg Cy5.5/mg抗体。将管包裹在箔中并在室温下温育1小时。除去未反应的Cy5.5，使用Sephadex G-25M通过凝胶过滤交换aPD1。
体外aPD1释放曲线研究
为了测量来自HA-NP的aPD1释放曲线，在37℃和pH＝6.4下将1mg/mL HA酶加入到在轨道式振荡器上的HA-NP悬浮液中。在预定时间，取出10μL样品用于分析，然后将10μL新鲜释放介质加入到孔中以保持恒定体积并放回到轨道式振荡器上。将从HA-NP悬浮液释放的aPD1的量稀释并通过小鼠IgG ELISA测量。在UV-Vis分光光度计中在450nm处检测吸光度，并且根据抗体标准曲线内推浓度。通过在6孔板中的2mL释放介质中温育MN贴剂来评价抗体自MN的体外释放。
微针的制造和表征
上下文中的所有MN均使用六个硅胶模具制造，所述硅树脂模具具有通过激光烧蚀加工的锥形孔阵列(Blueacre Technology Ltd.)。每个微针具有300μm×300μm的圆形基部，其逐渐变细至800μm的高度，尖端半径为约5μm。将微针以15×15阵列布置，中心间距为600μm。
使用Labconco(7812002)CentriVap集中器将制备的HA-NP在0.5mL蒸馏水中浓缩。然后，通过移液管将50uL HA-NP悬浮液(含有1mg Np)直接沉积到每个硅胶微模表面上，然后持续真空(600mmHg)条件5min以使NP溶液流入空腔中。之后，将微模转移至HettichUniversal 32R离心机，以2000rpm离心20min，以将HA-NP压缩成微针腔。收集制造期间模具表面上的残留HA-NP，并重复沉积过程三次以确保负载均匀性。接下来，在2cm×2cm的微模基板周围施加一片4cm×9cm的银色胶带。此外，将3mL溶解的m-HA(4重量％)溶液加入到制备的微模储器中。对于没有1-MT负载的空白MN，使用天然HA来制造MN基体。将最终的装置在25℃下在真空干燥器中干燥过夜。干燥完成后，将针阵列小心地与硅胶模具分离，并将针基部定制成圆形以适合注射器。可以将所得产物储存在密封的六孔容器中长达30天。用罗丹明B标记的HA和Cy5.5标记的aPD1或1-MT纳米颗粒制造荧光微针。在分析仪器设施处用金/钯溅射涂覆后，在以20kV操作的FEI Verios 460L场发射扫描电子显微镜(FESEM)上表征微针的形态。通过Olympus IX70多参数荧光显微镜获取MN的荧光图像。
小鼠和体内肿瘤模型
雌性C57B6小鼠购自Jackson Lab(USA)。所有小鼠研究均在由北卡罗来纳州立大学和北卡罗来纳大学教堂山(University of North Carolina at Chapel Hill)的机构动物护理和使用委员会批准的动物方案的背景下进行。将小鼠称重并随机分成不同组。在将1×106个荧光素酶标记的B16F10肿瘤细胞移植到小鼠背部后第7天(肿瘤达到50-60mm3)，通过静脉内/肿瘤内HA-NP注射或通过微针向小鼠施用aPD1(1mg/kg)和1MT(2.5mg/kg)。将MN贴剂施用于背侧颈部皮肤区域上，持续10min，并使用购自Medline Industries，Inc.的皮肤粘贴外科用粘合剂进一步固定。通过B16F10细胞的生物发光信号监测肿瘤生长。通过身体检查监测肿瘤发生率，并且还通过数字卡尺随时间测量尺寸。将肿瘤体积(mm2)计算为(长直径×短直径)。为了评估潜在的毒性，每天监测小鼠的体重减轻，并在治疗后对肿瘤和主要器官(即，皮肤、心脏、肝脏、脾、肺和肾脏)进行组织病理学分析。
本实施例中引用的参考文献
出于所有的目的，将所有文章和参考文献(包括专利申请和公布)的公开内容以引用的方式并入。
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虽然已经参考各种和优选的实施方案描述本发明，但是本领域的技术人员应理解，在不背离本发明的基本范围的情况下，可做出各种改变并且等效物可取代本发明的要素。此外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可做出许多修改来使具体情况或材料适应本发明的教导。
因此，希望本发明不限于为实施本发明所设想的本公开的具体实施方案，相反，本发明将包括落入权利要求书范围内的所有实施方案。
序列表
<110> North Carolina State University
<120> 纳米颗粒、控释剂型和用于递送免疫治疗剂的方法
<130> 10620-018WO1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
gcgcgtcgtc gttcgaacga cgttgcgcgt cgtcgttcga acgacgttgc gcgtcgtcgt 60
tcgaacgacg tt 72
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
atatgtcgtc gttcgaacga cgttatataa cgtcgttcga acgacgttat atgtcgtcgt 60
tcgaacgacg tt 72
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
gcgcgtatta tttcgaaata atttgcgcgt attatttata aataatttgc gcgtattatt 60
tataaataat tt 72

Claims (10)

1.一种控释药物剂型，其包含：
CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中所述纳米茧包含免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封限制性酶，其中所述炎症响应性纳米颗粒包括三甘油单硬脂酸酯(TGMS)，其中所述限制性酶是HhaI，且其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体。
2.如权利要求1所述的剂型，其中所述抗PD1抗体是尼沃鲁单抗。
3.如权利要求1所述的剂型，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
4.如权利要求1所述的剂型，其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体与抗CTLA4抗体的组合。
5.一种控释药物剂型在制备用于预防癌症的再发的药物中的用途，包括：向宿主施用足以预防癌症再发的量的药物；其中所述药物包含CpG寡脱氧核苷酸纳米茧，其中所述纳米茧包含免疫治疗剂和炎症响应性纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封限制性酶，其中所述炎症响应性纳米颗粒包括三甘油单硬脂酸酯(TGMS)，其中所述限制性酶是HhaI，且其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述抗PD1抗体是尼沃鲁单抗。
7.如权利要求5所述的用途，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
8.如权利要求5所述的用途，其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体与抗CTLA4抗体的组合。
9.如权利要求5至8中任一项所述的用途，其中所述癌症是实体瘤。
10.如权利要求5至8中任一项所述的用途，其中所述癌症是黑素瘤。
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