CN114096274A - 免疫治疗构建体以及其使用方法 - Google Patents

免疫治疗构建体以及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114096274A
CN114096274A CN202080049397.7A CN202080049397A CN114096274A CN 114096274 A CN114096274 A CN 114096274A CN 202080049397 A CN202080049397 A CN 202080049397A CN 114096274 A CN114096274 A CN 114096274A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
immunotherapeutic
tumor
construct
cpg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080049397.7A
Other languages
English (en)
Inventor
W·扬塔塞
W·恩加麦克赫德达库
A·伦德
M·雷达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oregon Health Science University
PDX Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Oregon Health Science University
PDX Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oregon Health Science University, PDX Pharmaceuticals Inc filed Critical Oregon Health Science University
Priority claimed from PCT/US2020/041844 external-priority patent/WO2021011496A1/en
Publication of CN114096274A publication Critical patent/CN114096274A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

本文公开了免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体包括递送颗粒、至少一种佐剂以及一或多种引起抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境的治疗剂/化合物。这些免疫治疗构建体产生适应性免疫或抗癌免疫应答，所述适应性免疫或抗癌免疫应答可以用于例如预防和治疗广泛类型的癌症。进一步公开了所述免疫治疗构建体的用途，所述用途包含用于预防和治疗人和动物的癌症。

Description

免疫治疗构建体以及其使用方法
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权R44CA217534和R43TR001906在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开涉及用于治疗和预防癌症以及其它疾病和病状的组合物和方法。所述组合物包含免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体包含含有至少一种治疗活性剂(所述治疗活性剂引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境)和至少一种佐剂(或免疫刺激剂)的递送系统(如颗粒)，从而通过利用受试者自身的初癌或癌细胞中的抗原产生适应性免疫。
背景技术
免疫检查点抑制剂，如针对PD-L1、PD-1、CTLA-4等的抑制剂，已在临床上示出了有前途的结果，从而获得了FDA对许多癌症类型的快速批准通道。然而，所述治疗仅适用于一部分癌症患者(约10-40％)。缺乏应答通常是由于缺乏预先存在的抗肿瘤免疫(例如，CD8+T细胞)，这加强了对使体内抗肿瘤T细胞的数量增长的疫苗的需求。
经典的癌症疫苗利用免疫刺激剂(被称为佐剂)和肿瘤蛋白(被称为抗原)。在理想情况下，应使用仅存在于癌细胞上的新抗原。然而，这些新抗原因肿瘤类型和患者而差异很大，这使得为每个患者开发个性化疫苗变得困难且昂贵。为了避免鉴定这些抗原的需要，放射、化疗和工程化病毒，如塔利拉维(talimogene laherparepvec，T-VEC)已经被用于杀死肿瘤并释放抗原以原位触发适应性免疫应答。然而，这些方法在免疫抑制肿瘤微环境中创建了导致抗肿瘤T细胞计数低或抗肿瘤T细胞无效的不期望的环境(例如，通过增加被称为氧化剂的化学应激物或促进免疫抑制途径)。此外，原位肿瘤疫苗接种策略受到肿瘤的免疫抑制微环境的影响并且无法保留疫苗组分以有效递送到靶细胞(例如，抗原呈递细胞)。
发明内容
为了克服上述缺点，开发了一类利用原位肿瘤疫苗接种策略的新型免疫治疗剂。原位肿瘤疫苗接种是一种策略，在所述策略中，在存在免疫刺激的情况下，肿瘤被局部杀死并释放肿瘤抗原，所述肿瘤抗原共同引发针对肿瘤的全身适应性免疫。在某些情况下，利用已经存在于肿瘤微环境(TME)中的肿瘤抗原。此策略具有很大的前景，因为其避免了像常规癌症疫苗开发一样预先鉴定肿瘤(新)抗原的需要。这也是一种个性化疗法，因为一组独特的肿瘤抗原被释放并引发针对每位患者的特异性免疫。
本文描述了用于共同递送佐剂和化合物的工程化颗粒，所述工程化颗粒能够诱导抗原释放和/或调节免疫抑制环境以增强CD8+ T细胞库并诱导全身性抗肿瘤免疫疗法效果。此技术可以被称为AIRISE，其代表增强免疫应答和抑制肿瘤的抑制环境。
本文描述了一类基于工程化颗粒的新型免疫治疗剂(具体地为免疫治疗构建体)，所述工程化颗粒使得能够共同递送能够诱导抗原释放(例如，通过杀死癌细胞)和/或调节免疫抑制环境(如肿瘤微环境，TME)的佐剂和治疗活性剂。这些免疫治疗构建体也可以使用TME中已经存在的抗原。所述免疫治疗构建体增强CD8+ T细胞库并诱导全身性抗肿瘤免疫疗法效果，而无需知道哪些抗原与所治疗的癌症相关。尽管本文广泛描述了细胞免疫，但体液免疫(抗体产生)也发挥了作用并遵循相同的概念。
通过所提供的工程化免疫治疗构建体递送到癌细胞的治疗活性剂(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA、shRNA、DNA、其它寡核苷酸和多核苷酸、小分子抑制剂、化学治疗药物、抗体等)的实例将杀死癌细胞，释放肿瘤抗原和/或操纵免疫抑制肿瘤微环境，同时共同递送的佐剂(例如，CpG、R848、poly I:C等)致敏并激活针对肿瘤抗原的适应性免疫细胞。经激活的效应细胞可以识别和攻击体内任何部位(包含远离局部递送免疫治疗构建体的部位)处的肿瘤，并且减少或甚至预防携带与经治疗的肿瘤相同的一或多种肿瘤抗原的新肿瘤的扩散或发展。此现象有时被称为异位效应。癌细胞的死亡进一步放大了具有持久效应的适应性免疫循环。还将建立记忆适应性免疫以进行持续性抗肿瘤免疫监视。
所述免疫治疗构建体可以局部、瘤内、鼻内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、皮肤、静脉内或通过吸入施用于例如可容易到达的肿瘤，如黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤；或全身性地用于其它癌症，如肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、肾癌、血癌和转移癌。
工程化免疫治疗构建体的直径可以在纳米或微米范围内，并且可以由能够装载治疗剂/佐剂货物并将其递送到靶位点(癌细胞、免疫细胞、细胞外基质等)并允许其具有所期望的功能的任何材料(例如，脂质、无机材料、聚合物以及其组合)制成。
任选地，免疫治疗构建体还含有一或多种归巢剂(抗体、适体、配体、肽等)，所述一或多种归巢剂使所述免疫治疗构建体能够优先地递送到靶癌细胞和/或各种免疫细胞类型(例如，树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞、T细胞)和/或被所述靶癌细胞和/或各种免疫细胞类型吸收。
本文所提供的免疫治疗构建体可以单独使用或与标准治疗组合使用，所述标准治疗包含但不限于免疫检查点抑制剂、化疗、外科手术、靶向疗法和放射疗法。可替代地，检查点抑制剂(siRNA、抑制剂或针对PD-L1/PD-1、CTLA-4等的抗体)、其它靶向治疗剂(例如，靶向其它癌蛋白的小分子抑制剂或抗体，或医用放射性同位素)可以作为治疗活性剂直接装载在所述免疫治疗构建体上/中。
对于局部递送，所述免疫治疗构建体可以任选地被调配成局部或微针调配物。
在特定实施例中，提供了一种免疫治疗构建体，其包含：递送系统，所述递送系统包含至少一种引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境的治疗剂；以及至少一种佐剂。所述免疫治疗构建体可能不包含肿瘤特异性抗原或卵清蛋白。在另一个实施例中，所述免疫治疗构建体不包含除所述一种治疗剂或所述至少一种佐剂之外的蛋白质，如果其中任何一种是蛋白质的话。所述治疗剂和佐剂可以装载到所述递送系统中、附着于所述递送系统的表面、偶联到所述递送系统、围封在所述递送系统内或包含在所述递送系统内。在所提供的免疫治疗构建体的特定实施例中，所述递送系统是流体动力学尺寸为5nm到999nm(例如，约80nm到约200nm或约90nm到约130nm)的纳米颗粒，如在水介质(如PBS、Tris缓冲液或水)中测量的。在又其它实例中，所述免疫治疗构建体是流体动力学尺寸为1微米到1000微米的微粒。在一些实施例中，所述递送系统的尺寸为约5nm到约200nm、约5nm到约90nm、约5nm到约20nm、约30nm到约100nm、约30nm到约80nm、约30nm到约60nm、约40nm到约80nm、约70nm到约90nm、或约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm或约100nm。
在免疫治疗构建体的各个实施例中，所述治疗剂包含寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA、DNA、shRNA或sgRNA(CRISPR-cas9元件))、多核苷酸、肽、蛋白质、化学治疗药物、毒素、抗氧化剂、小分子抑制剂、抗体或放射治疗剂。
在免疫治疗构建体的实例中，所述佐剂化合物具有免疫刺激活性。举例来说，佐剂化合物可以包含以下中的一或多种：结合TLR的DNA取代基，如CpG寡核苷酸(例如，ISS1018；Amplivax；CpG ODN 7909、CpG ODN 1826、CpG ODN D19、CpG ODN 1585、CpG ODN2216、CpG ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN 2395、ODN M362或SD-101)；含有CpG序列的DNA TLR激动剂(例如，dSLIM)；非CpG DNA TLR激动剂(例如，EnanDIM)；RNA TLR激动剂(例如，Poly I:C或Poly-ICLC)；铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝或硫酸铝钾)；抗CD40抗体(例如，CP-870,893)；细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；阳离子肽缀合的CpG寡核苷酸(例如，IC30、IC31)；小分子TLR激动剂(例如，咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)或3M-052)；融合蛋白(例如，ImuFact IMP321和ONTAK)；基于油/表面活性剂的佐剂，如MF59、MontanideIMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V和Montanide ISA-51；源自皂苷的QS21刺激元(美国马萨诸塞州伍斯特阿奎拉生物技术公司(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA))；分枝杆菌提取物或合成细菌细胞壁模拟物，如脂多糖(例如，单磷酰基脂质A、OM-174、OM-197-MP-EC或Pam3Cys)；呫吨酮衍生物(例如，瓦德美赞(vadimezan))；其混合物(例如，AS-15)；或专有佐剂，如里比公司(Ribi)的Detox、Quil或Superfos。还提供了使用本文所描述的免疫治疗构建体的方法，例如在治疗或预防癌症或另一种过度增殖性疾病的方法中。作为实例，对于黑色素瘤，免疫治疗构建体可以作为预防性疫苗用于具有大量非典型痣(nevi)或其它看似良性的痣(mole)的患者(包含并且尤其是具有遗传素质的患者)。作为另一个实例，所述免疫治疗构建体可以在外科手术切除(即新辅助治疗设置)之前通过瘤内/病变内注射给予可及的肿瘤/病变，以减少复发的机会和/或募集免疫系统以杀死任何可检测或不可检测的转移。作为另一个实例，即使所述肿瘤是不可切除的，所述免疫治疗构建体也可以通过瘤内注射给予肿瘤。这将激活并募集所述免疫系统以攻击身体其它部位经治疗的肿瘤和未经治疗的肿瘤。作为另一个实例，所述免疫治疗构建体可以全身性地给予以引发抗肿瘤适应性免疫应答。在某些实施例中，可以将所述免疫治疗构建体给予所述肿瘤周围的区(癌旁)或肿瘤切除后剩余的区(佐剂设置)。作为另一个实例，所述免疫治疗构建体可以全身性地给予，这将产生针对身体任何部位的癌症的适应性免疫。在某些实施例中，所述免疫治疗构建体可以直接施用于淋巴结(有或没有可检测的肿瘤)中。
另一个实施例是一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物接触。在此实施例的实例中，从所述受试者中获得的所述细胞是癌细胞。在其它实施例中，所述细胞不是癌细胞；例如，在一些情况下，非癌症(例如，正常)细胞是免疫学/免疫细胞。在治疗细胞的方法的实例中，所述方法进一步包含将至少一个经治疗的细胞返回施用于所述受试者。
还提供了将免疫治疗构建体的施用与至少一种其它治疗，例如癌症或另一种过度增殖性疾病或病状的治疗组合的方法实施例。
在所描述的方法实施例中的任何方法实施例中施用免疫治疗构建体可以包含以下中的一或多项：直接注射到所述受试者的肿瘤中；对所述受试者进行全身注射；局部应用于所述受试者；所述受试者吸入；对所述受试者进行肝动脉输注；对所述受试者进行对流增强递送；或对所述受试者进行微针应用。
在所提供的方法实施例中的任何方法实施例的实例中，所述受试者(经治疗、正在向其施用构建体或组合物、或从其获得细胞)是哺乳动物；例如，在某些实施例中，所述哺乳动物是人。
具体地，在本文中可设想到，所提供的免疫治疗构建体实施例和使用此类构建体的方法的实施例中的任何一个包含其中所述免疫治疗构建体不包含肿瘤特异性抗原或卵清蛋白的实例。
附图说明
图1：癌症治疗。与非特异性毒性化疗相比，靶向疗法显著改善了癌症预后。然而，效果并不持久。免疫检查点抑制剂(ICI)释放出人体自身的免疫系统以攻击癌症，从而有可能引起治愈。然而，仅一小部分患者对此治疗有反应。目标是开发一种新型免疫治疗构建体(增强免疫应答和抑制肿瘤的抑制环境-AIRISE)，所述免疫治疗构建体操纵肿瘤微环境(TME)以增强抗肿瘤T细胞库，这将提高用ICI治疗的癌症患者的治愈率。
图2：新型免疫治疗构建体的原位肿瘤疫苗接种机制。向肿瘤中的仅一种肿瘤(例如，黑色素瘤或乳腺肿瘤)瘤内注射免疫治疗构建体AIRISE。在一个实例中，即AIRISE-01或CpG/DTX-NP，多西他赛(docetaxel，DTX)，一种也具有佐剂特性的化学治疗药物将杀死局部癌细胞以释放肿瘤抗原，而CpG寡核苷酸(佐剂)将激活局部抗原呈递细胞(APC)(主要是树突细胞(DC))。在另一个实例中，即AIRISE-02或siSTAT3-CpG-NP，siSTAT3可以杀死一些癌细胞，同时敲低STAT3减少免疫抑制肿瘤微环境，从而预防抗肿瘤适应性免疫应答的引发、激活和运转。已经在肿瘤微环境(TME，包含癌症、免疫细胞等)中或由治疗释放的肿瘤抗原将被肿瘤和肿瘤引流淋巴结中的AIRISE激活的APC吸收。APC然后(交叉)呈递这些抗原以致敏肿瘤抗原特异性T细胞。这些经激活的细胞毒性(效应物CD8+)T细胞将增殖并进入体循环。无论经激活的细胞毒性T细胞位于体内何处，其都将特异性地归巢于具有与经治疗的肿瘤相同抗原中的一些抗原的肿瘤(例如，归巢于经治疗的肿瘤和未经治疗的转移瘤两者)中。细胞毒性T细胞杀死更多癌细胞会进一步释放更多肿瘤抗原，从而在正反馈循环中放大效应物(已经致敏的)T细胞的增殖。抗肿瘤体液免疫也按照相同的概念被激活。这些实例中的介孔二氧化硅纳米颗粒还具有抗氧化特性(莫里(Morry),生物材料杂志(J.Biomaterials),66:41-52,2015)，所述抗氧化特性还可以进一步调节免疫抑制TME，从而抑制促肿瘤活性。这种在肿瘤位点处局部诱导的疫苗接种会产生全身全身性抗肿瘤免疫应答。
图3：与CpG相比，用CpG-NP处理后的树突细胞(MHCII+CD80+CD11c+细胞)的激活更大。CpG或CpG-NP通过足垫注射(footpad injection)施用于小鼠。处理后一天，收集引流(DLN)和非引流淋巴结(NDLN)并将其加工到单个细胞中以供流式细胞术分析，从而鉴定经激活的树突细胞％。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。除非另有说明，否则在整个实例中使用CpG ODN 1826(SEQ ID NO:7)。
图4A-4D：向如在(图4A，植入有双侧肿瘤的小鼠)中的黑色素瘤小鼠模型施用的CpG-NP在诱导原位肿瘤疫苗接种方面的有效性，如局部经处理的肿瘤(图4B)和远隔未经处理的肿瘤(图4C)的抑制肿瘤生长曲线以及小鼠的延长存活期曲线(图4D)所指示的。将250,000和100,000个B16F10细胞植入到每只小鼠(C57BL/6)中以分别建立局部和远隔肿瘤。肿瘤植入后八天，每三天将总共三个剂量的CpG-NP或生理盐水瘤内注射到局部肿瘤中。剂量(每次注射)为20μg CpG和0.2mg NP。肿瘤体积被绘制为平均值和SEM。在CpG-NP与生理盐水之间评估了统计差异(*)。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
图5A-5D：向如在(图5A)中的黑色素瘤小鼠模型施用装载有CpG和/或多西他赛(DTX)(AIRISE-01)的NP在诱导原位肿瘤疫苗接种方面的有效性，如局部经处理的肿瘤(图5B)和远隔未经处理的肿瘤(图5C)的抑制肿瘤生长曲线以及小鼠的延长存活期曲线(图5D)所指示的。用CpG-NP、CpG-DTX-NP或生理盐水处理小鼠(与图4相同的模型)。剂量(每次注射)：20μg CpG；2μg DTX；0.2mg NP。肿瘤体积被绘制为平均值和SEM。*表示生理盐水与CpG-NP之间的统计差异。$表示生理盐水与CpG-DTX-NP之间的统计差异。**p和$$p<0.01；****p和$$$$p<0.0001。
图6：局部和远隔肿瘤、局部(经处理)和远隔肿瘤的DLN以及由CpG-DTX-NP(在此图中表示为NP)触发的非DLN中的细胞毒性CD8+ T细胞的增加。所有条件都与图5A的条件相同。在第一次注射后7天收集肿瘤和淋巴结(肿瘤引流和非引流)(参见图5A)。用一组抗体对细胞进行染色以评估淋巴样细胞群体和活性。p值：*p<0.05。**p<0.01，***p<0.001。
图7A-7D：向如在(图7A)中的黑色素瘤小鼠模型施用的siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02)在诱导原位肿瘤疫苗接种方面的有效性，如局部经处理的肿瘤(图7B)和远隔未经处理的肿瘤(图7C)的抑制肿瘤生长曲线以及小鼠的延长存活期曲线(图7D)所指示的。肿瘤体积被绘制为平均值和SEM。剂量(每次注射)：20μg CpG；4μg siSTAT3；0.2mg NP。评估了CpG-NP与siSTAT3-CpG-NP(响应最好的两组)之间的统计差异(如指定的p值，*)。
图8A-8D：siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02)效应的CD8依赖性。如在图8A中所示，荷B16F10肿瘤的C57/BL6小鼠被建立并处理，并且在整个研究过程中，从AIRISE-02首次瘤内处理前1天开始，向一组小鼠给予CD8耗竭抗体(克隆2.43，BioXcell，200μg/小鼠，每周两次，腹膜内)。CD8耗竭被示出为减轻AIRISE-02在抑制局部肿瘤(图8B)、远隔未经处理肿瘤(图8C)和延长小鼠存活期(图8D)方面的功效，表明AIRISE-02的作用是免疫依赖性的，而不是直接地细胞毒性的。
图9A-9D：siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02)增强了检查点抑制剂(PD1和CTLA4抗体)的作用。如(图9A)建立并处理荷B16F10肿瘤的C57/BL6小鼠。将检查点抑制剂(200μg PD1mAb/小鼠和100μg CTLA4 mAb/小鼠，腹膜内)给予两组小鼠，一组与瘤内AIRISE-02同时给予，而一组单独给予(即三个剂量，间隔三天)。AIRISE-02大大增强了检查点抑制剂混合物的效果；与单独的AIRISE-02或检查点抑制剂混合物相比，此组合更好地控制了局部(图9B)和远隔未经处理的肿瘤(图9C)两者，并延长了小鼠的存活期(图9D)。接受此组合的8只小鼠中的5只小鼠被治愈(无瘤)。
图10A-10B：siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02)延长了荷实验性转移肺肿瘤的小鼠的存活期。向C57/BL6小鼠(通过尾静脉)注射200,000个路易斯肺癌(Lewis Lung Carcinoma，LLC-JSP)细胞，导致在小鼠的肺中建立了肺癌。如在(图10A)中示出的，静脉内给予处理。如在(图10B)中示出的，在静脉内注射AIRISE-02的情况下，存活期被显著延长。
图11A-11D：与阳离子脂质颗粒(DharmaFECT)一起递送的CpG和siSTAT3产生原位疫苗接种效果。如图11A建立并处理荷B16F10肿瘤的C57/BL6小鼠。治疗构建体减少了经处理的肿瘤(图11B)和远隔肿瘤(图11C)，并且延长了小鼠的存活期(图11D)。剂量(每次注射)：20μg CpG；4μg siSTAT3。如通过DLS测量的，治疗构建体的平均尺寸为1068nm(1.1微米)。
图12A-12C：NP介导的siRNA和CpG向癌症和免疫细胞的共同递送。用携带针对STAT3的siRNA或乱序siRNA(siSCR)的NP或装载CpG的NP(CpG-N)处理B16F10(图12A)和J774(图12B)细胞(两者均为小鼠细胞系)以及从C3H/HEJ小鼠的骨髓采集的树突细胞(BMDC)(图12C)。对于B16F10和J774，在2.0wt.％的NP下，每个siRNA的剂量为50nM，并且CpG的剂量为2wt.％的NP，并且对于BMDC，CpG的剂量为4wt.％的NP。在处理后48小时用qRT-PCR对mRNA进行分析。数据表明纳米颗粒在癌症和免疫细胞两者中转染siRNA(例如，siSTAT3)的功效，这对装载在NP上的CpG的影响不大。除非在整个实例中另有说明，“NP”表示如在恩甘切尔德拉库尔(Ngamcherdtrakul)等人,先进功能材料(Advanced Functional Materials),25(18):2646-2659,2015和美国专利申请公开第2017/0173169号中所述的涂覆有交联PEI和PEG的介孔二氧化硅纳米颗粒。
图13：用携带针对HER2或STAT3的siRNA的曲妥珠单抗(trastuzumab)缀合的NP(T-NP)处理HCC1954细胞(人HER2+癌细胞)。在2.0wt.％的NP的情况下，每个siRNA的剂量始终为30nM。在处理后72小时用蛋白质印迹分析蛋白质并表明实现了80％的STAT3的敲低。数据表明，与单个siRNA相比，纳米颗粒可以递送至少两个siRNA序列(例如，siHER2和siSTAT3)，而不会失去功效。
图14A-14C：优先摄取含有抗体的纳米颗粒作为归巢靶剂。如在图14A中示出的，暴露1小时后，与正常肺细胞(NL20)相比，EGFR抗体(西妥昔单抗(cetuximab))缀合的纳米颗粒(C-NP)优先地被过表达EGFR的肺癌细胞(A549和H460)吸收。图14B示出了如通过流式细胞术测量的这些细胞系的EGFR表达水平。同样地，图14C示出，与MCF7(具有低HER2表达，如蛋白质印迹分析((图14C)的插图)所示)相比，HER2抗体(曲妥珠单抗)缀合的纳米颗粒(T-siSCR-NP)也优先地被过表达HER2的乳腺癌细胞(BT474、SKBR3)吸收。在利妥昔单抗(rituximab)(CD20抗体)缀合的纳米颗粒(R-siSCR-T)的情况下未观察到优先效应。siSCR表示乱序siRNA。
图15：将CpG(SEQ ID NO:7)添加到含有PLK1抑制剂(p-iPLK1-NP)的纳米颗粒中可增强治疗益处，如卡普兰-迈耶存活曲线(Kaplan Meier Survival curve)所展示的。向C57BL/6小鼠的右胁腹注射100K LLC-JSP细胞(肺癌细胞)，并且向其左胁腹注射40K细胞。在肿瘤接种后第12天，小鼠接受对右侧(局部)肿瘤的生理盐水、PD-L1抗体涂覆的纳米颗粒(p-NP)、装载有PLK1抑制剂的纳米颗粒(iPLK1-NP)、装载有PLK1抑制剂的p-NP(p-iPLK1-NP)或装载有PLK1抑制剂的p-NP以及CpG(p-iPLK1-NP-CpG)的瘤内处理。每3天施用50μl的0.5mg NP(2.5μg iPLK1、20μg PD-L1抗体、20μg CpG)，共3个剂量。
图16A-D：向如在(图16A)中的黑色素瘤小鼠模型施用装载有CpG和米托蒽醌(MTX)的NP在诱导原位肿瘤疫苗接种方面的有效性，如局部经处理的肿瘤(图16B)和远隔未经处理的肿瘤(图16C)的抑制肿瘤生长曲线以及小鼠的延长存活期曲线(图16D)所指示的。用CpG-MTX-NP或生理盐水处理小鼠。剂量(每次注射)：20μg CpG；2μg MTX；0.2mg NP。肿瘤体积被绘制为平均值和SEM。对于肿瘤体积，CpG-MTX-NP对生理盐水的**p<0.01。
图17A-C：AIRISE-02增强了局部(经处理)和未经处理肿瘤以及其肿瘤引流淋巴结(DLN)中的CD8+ T细胞的增殖。模型、治疗剂量和时间表如在图7中所示。首次处理后7天，分析从局部(经处理)肿瘤和远隔(未经处理)肿瘤两者的肿瘤和DLN中采集的细胞，以确定在肿瘤(A)和DLN(B)的活CD45+CD3+ T细胞群体中的CD8+ T细胞与CD4+FoxP3+调节性T细胞的比率以及淋巴结(C)中的效应物(CD44+)CD8+ T细胞的增殖状态(Ki-67)。除非括号中另有说明，否则AIRISE-02对生理盐水的*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(n＝3只/组)。
图18：TME中的NP细胞摄取。向小鼠(与图7中相同的模型，(约100mm3的B16F10肿瘤尺寸，n＝3只/组，绘制为平均值和SD))瘤内注射Alexa 488-siRNA-CpG-NP。注射后两小时，使经处理的肿瘤中的细胞显出轮廓，并分析每个群体中siRNA-CpG-NP(NP+)的存在。
图19：siSTAT3-NP可以敲低多个物种的多个细胞中的STAT3。用siSTAT3-NP(50nM)处理D-17(狗骨肉瘤)、BMDC(来自小鼠的骨髓源性树突细胞)、J774(小鼠巨噬细胞)、B16F10(小鼠黑色素瘤)和HCC1954(人乳腺癌)持续48小时。使用对应物种的引物对STAT3和HPRTmRNA进行qRT-PCR分析。在整个过程中使用单个siSTAT3序列。siSCR＝乱序siRNA对照。***p<0.001；****p<0.0001。
图20：AIRISE-02(siSTAT3-CpG-NP)+ICI在荷CT26双侧肿瘤的小鼠中产生完全应答。将250K和100K CT26细胞植入到每只小鼠(Balb/c)的双侧腹部中。肿瘤植入后15天，按照概述对小鼠进行处理。将局部经处理的肿瘤和远隔未经处理的肿瘤的肿瘤生长曲线绘制为蜘蛛图(每条线代表单独的小鼠)。注射剂量：16μg CpG；5μg siSTAT3；0.25mg NP。将检查点抑制剂(200μg PD1 mAb/小鼠和100μg CTLA4 mAb/小鼠，腹膜内)给予两组小鼠，一组与瘤内AIRISE-02同时给予，而一组单独给予。
图21：AIRISE-02(siSTAT3-CpG-NP)+ICI对荷侵袭性4T1乳腺双侧肿瘤的小鼠也有效。将100K和40K 4T1细胞植入到每只小鼠(Balb/c)的双侧乳腺脂肪垫中。肿瘤植入后11天，按照概述对小鼠进行处理。将局部经处理的肿瘤和远隔未经处理的肿瘤的肿瘤生长曲线绘制为蜘蛛图(每条线代表单独的小鼠)。剂量与图20的剂量相同。
图22：小鼠存活率曲线在图21中。
图23：siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02)的安全特性。向三只雌性Balb/c小鼠肌内施用AIRISE-02。小鼠被脱毛并在大腿尾部肌肉中注射一次。在注射前、注射后、注射后24小时和注射后72小时拍摄注射部位的图像。注射剂量：16μg CpG；5μg siSTAT3；0.25mg NP。
图24A-B：AIRISE-02在小鼠中的安全特性。通过在每只小鼠的两个肿瘤中的一个肿瘤中瘤内注射用AIRISE-02处理荷植入在乳腺脂肪垫的双侧MM3MG-HER2d16肿瘤的小鼠(Balb/c)(如在曹(Tsao)等人,JCI洞察(JCI Insight),4(24):e131882,2019中所述)，在两周内进行5次。如在(A)中所示监测体重；当肿瘤直径超过2cm或当小鼠表现出疼痛或痛苦的迹象时(处理后15-55天)，对小鼠实施安乐死。安乐死后，收集血液并加工成血清。通过Beckman AU680(加利福尼亚州西萨克拉门托市IDEXX生物分析公司(IDEXX BioAnalytics，West Sacramento，CA))测量血清生物标志物并在(B)中报告。剂量与图20的剂量相同。
图25：描述AIRISE-02在食蟹猴中的安全特征的示意图。如在表中所述，在三个递增剂量下，向食蟹猴(约2岁，3.1±0.2kg，n＝3只)皮下注射AIRISE-02。使用了CpG7909/2006(人序列)(SEQ ID NO:8)。监测体重、食物消耗、笼侧和详细观察、死亡率、发病率、注射部位处的反应、PK、临床病理学、细胞因子水平、补体分裂产物和抗药物抗体。
图26：用装载有不同量的siRNA和CpG的交联PEI和PEG(NP)涂覆的介孔二氧化硅纳米颗粒的流体动力学尺寸，指定为整个构建体的wt％。平均尺寸(Z-平均值)和多分散指数(PDI)由使用莫尔文泽塔斯特拉(Malvern Zetasizer)的3个测量结果示出。
图27：CpG-NP可以在存在抗原的情况下产生抗原特异性(适应性)免疫应答。图示出了在存在SF(SIINFEKL肽)的情况下温育后IFNγ激活的CD8+ T细胞的百分比。从未经处理的小鼠的淋巴结、用装载有SF和CpG的NP(CpG-SF-NP)、装载有SF的NP(SF-NP)处理的小鼠、装载有CpG的小鼠或NP(CpG-NP)以及用不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund'sAdjuvant)调配的SF(IFA/SF)处理的小鼠NP中获得细胞。*p<0.05。所使用的剂量：16μg CpG和40μg SF。小鼠的施用途径为足垫注射。
图28：装载有poly I:C的纳米颗粒(MSNP-PEI-PEG)在约2wt.％和9wt.％下在PBS中测量的流体动力学尺寸。
图29A-C：AIRISE-02。(A)介孔二氧化硅纳米颗粒核的TEM图像，(B)包括涂覆有PEI的介孔二氧化硅纳米颗粒的AIRISE-02的示意图，所述PEI如前所述交联(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)，与PEG缀合，从而产生纳米颗粒构建体(NP)。通过在PBS中混合10-40分钟，NP通过静电相互作用装载siSTAT3和CpG。(C)AIRISE-02((2％)siSTAT3-(6％)CpG-NP)的流体动力学尺寸。
图30：在使用和不使用微针滚轮预处理的猪皮上的局部siRNA-NP。在有或没有用微针滚轮对皮肤进行预处理的情况下，在Aquaphor中局部应用Dy677-siSCR-NP处理猪皮持续一小时的荧光图像。siRNA信号用箭头表示。也用Hoechst 33342对组织的细胞核进行染色。
图31：在有和没有微针滚轮预处理的小鼠中的局部siRNA-NP/Tween-Aquaphor。在有或没有用微针滚轮对皮肤进行预处理的情况下，在Tween/Aquaphor中局部应用Dy677-siSCR-NP处理小鼠皮肤持续1.5小时的荧光图像。siRNA信号用箭头表示。也用Hoechst33342对组织的细胞核进行染色。
图32A-B：有微针滚轮的局部siRNA-NP对注射siRNA-NP的EGFR敲低功效。在Tween/Aquaphor中通过微针滚轮应用(A)用siEGFR-NP或siSCR-NP进行一次局部处理后3天或在盐水(B)中进行一次siEGFR-NP或siSCR-NP注射后3天采集小鼠皮肤。固定皮肤组织并用荧光标记的EGFR抗体对其进行染色，以进行EGFR信号定量。每个病状处理4-8张图像(20×)，并且每组3只动物。
图33：含有装载有Dy677-siRNA的NP的基于葡聚糖的微针。
图34A-B：在用含有不同量的CpG和2wt％siSTAT3的AIRISE-02处理2天后小鼠(A)骨髓源性树突细胞和(B)J774细胞的活力。剂量：50nM siRNA。
图35：通过NP或Dharmafect将非靶向乱序siRNA(siSCR)和CpG共同递送到从C3H/HEJ小鼠采集的树突细胞中。在2.0wt.％的NP下，每个siRNA的剂量为50nM，并且CpG的剂量为4wt.％的NP。按照制造商的方案制备siRNA-Dharmafect调配物。在处理后48小时用qRT-PCR对mRNA进行分析。“NP”表示如在恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015和美国专利申请公开第2017/0173169号中所述的涂覆有交联PEI和PEG的介孔二氧化硅纳米颗粒。
图36：siSTAT3/siCXCR4-CpG-NP+ICI对荷侵袭性4T1乳腺肿瘤的小鼠有效。将100K和40K 4T1细胞植入到每只小鼠(Balb/c)的双侧乳腺脂肪垫中。肿瘤植入后8天，以与图20和21(3个剂量；间隔3天)相似的方式用有或没有siSTAT3/siCXCR4-CpG-NP的ICI处理小鼠。将局部经处理的肿瘤和远隔未经处理的肿瘤的肿瘤生长曲线绘制为蜘蛛图(每条线代表单独的小鼠)。注射剂量：16μg CpG；5μg siSTAT3；5μg siCXCR4；0.25mg NP。
序列表的引用
本文所述的核酸序列使用如在37 C.F.R.§1.822中所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写示出。每个核酸序列仅示出了一条链，但互补链被理解为包含在适当的实施例中。在2020年7月13日或前后创建的文件大小为2KB、标题为“51127-004WO2_序列表_07.13.20_ST25.txt”的计算机可读文本文件含有本申请的序列表并特此以全文引用的方式并入。
SEQ ID NO:1是对STAT3具有特异性的siRNA(siSTAT3)的代表性有义序列：5'GGAUCUAGAACAGAAAAUGdTdT 3'(其最后两个位置是脱氧碱基)。
SEQ ID NO:2是对STAT3具有特异性的siRNA(siSTAT3)的代表性反义序列：5'CAUUUUCUGUUCUAGAUCCdTdG 3'(其最后两个位置是脱氧碱基)。
SEQ ID NO:3是对HER2具有特异性的siRNA(siHER2)的代表性有义序列：5'CACGUUUGAGUCCAUGCCCAAUU 3'。
SEQ ID NO:4是对HER2具有特异性的siRNA(siHER2)的代表性反义序列：5'UUGGGCAUGGACUCAAACGUGUU 3'。
SEQ ID NO:5是对SCR具有特异性的siRNA(siSCR)的代表性有义序列：5'UGGUUUACAUGUCGACUAA 3'。
SEQ ID NO:6是对SCR具有特异性的siRNA(siSCR)的代表性反义序列：5′UUAGUCGACAUGUAAACCA 3′。
SEQ ID NO:7是CpG ODN 1826的序列，其用于整个实例(小鼠系统)中：5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'。此ODN含有完整的硫代磷酸酯主链并且具有核酸酶抗性。
SEQ ID NO:8是CpG ODN 2006/7909的序列，其用于猴和人系统的实例中：5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'。此ODN含有完整的硫代磷酸酯主链并且具有核酸酶抗性。
具体实施方式
本文所述的用于癌症治疗的被称为AIRISE(增强免疫应答和抑制肿瘤抑制环境)的免疫治疗方法(图1和2)利用患者本身的肿瘤作为个性化肿瘤抗原集的贮库(原位肿瘤疫苗接种)。所提供的免疫治疗构建体携带导致抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境的至少一种佐剂(例如，CpG寡核苷酸)和一或多种治疗剂/化合物(例如，siRNA、反义、寡核苷酸、药物、小分子、抗体等)。此类治疗剂的特定实例是针对STAT3的多西他赛和siRNA。
在肿瘤位点处施用所提供的免疫治疗构建体(例如，通过瘤内注射或通过全身递送进行肿瘤归巢)之后，在存在免疫刺激(由所供应的佐剂提供)的情况下释放肿瘤抗原。此类抗原释放和免疫刺激共同引发和支持抗原特异性适应性免疫。肿瘤抗原可以被现有的抗原呈递细胞(APC)吸收，所述APC将抗原呈递给原初T细胞。(针对那些肿瘤抗原的)T细胞由此被致敏并激活成效应T细胞(在淋巴结中或在肿瘤位点中)并在全身增殖，因此为经治疗的肿瘤以及远离初始施用(例如，转移位点)的其它肿瘤提供增强且改善的免疫应答。在远离初始施用部位的肿瘤中的功效在本领域中也称为异位效应。
这些被训练以识别特异性肿瘤抗原的抗肿瘤T细胞将控制注射部位和身体其它部位两者处的肿瘤(参见图2)。货物组合可以应用于任何类型的微颗粒/纳米颗粒——也就是说，免疫治疗构建体的实施例以及其使用方法与递送媒剂无关。本文描述了特定示例递送媒剂。
本发明提供了使用本文所述的免疫疗法的原位肿瘤疫苗接种效果，所述免疫疗法用装载有CpG和siSTAT3(siSTAT3-CpG-NP)或CpG和多西他赛(CpG/DTX-NP)的免疫治疗构建体例示。对于这两种示范性治疗活性剂，多西他赛(DTX)将杀死局部癌细胞以释放肿瘤抗原，而CpG将激活局部抗原呈递细胞(APC，主要是DC)；虽然siSTAT3将杀死一些癌细胞，但其主要作用是减少免疫抑制肿瘤微环境(TME)，所述TME预防抗肿瘤适应性免疫应答的致敏和作用。值得注意的是，siSTAT3-CpG-NP被设计为被癌症和APC两者吸收。虽然其可能对一些癌细胞具有一定杀伤作用，但它不会杀死癌细胞，而是通过敲低STAT3来激活APC。肿瘤抗原(已经在TME中，或者由所提供的治疗释放)被肿瘤和肿瘤引流淋巴结中的CpG激活或AIRISE激活的APC吸收。APC然后(交叉)呈递这些抗原以致敏肿瘤抗原特异性T细胞。这些经激活的细胞毒性(效应物)T细胞将增殖并进入体循环。无论经激活的细胞毒性T细胞位于体内何处，其都将特异性地归巢于具有与经治疗的肿瘤相同抗原中的一些抗原的肿瘤(例如，归巢于经治疗的肿瘤和远隔(未经治疗的)肿瘤两者)中。细胞毒性T细胞杀死更多癌细胞会进一步释放更多肿瘤抗原，从而在正反馈循环中放大效应物(已经致敏的)T细胞的增殖。在某些实施例中，抗氧化介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)可以进一步调节局部免疫抑制性TME，从而抑制促肿瘤活性。这种在肿瘤位点处局部诱导的疫苗接种会产生全身全身性抗肿瘤免疫。
在某些实施例中，递送媒剂包含：用于药物装载的MSNP核(例如，约50nm)，所述MSNP核涂覆有用于寡聚物装载和内体逃逸的可生物还原的交联阳离子聚合物，例如聚乙烯亚胺(PEI)；以及稳定剂，例如聚乙二醇(PEG)，所述稳定剂可以预防纳米颗粒聚集，保护寡核苷酸货物免受血液酶降解(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)并屏蔽PEI的电荷，从而增强安全性。将寡核苷酸(siRNA和/或CpG)最后装载在构建体上，在室温下在PBS中混合几分钟(例如，5分钟)；所述寡核苷酸以非寡核苷酸序列依赖性方式与PEI静电结合，并在PEG层下保护其免受酶促降解(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)。所得纳米颗粒(NP)在MSNP尺寸、PEI和PEG分子量和组合物、PEI交联条件(以增强缓冲能力并降低电荷)、寡核苷酸和(任选地)抗体装载方面对siRNA递送功效进行高度优化(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)。在窄尺寸分布的情况下，siRNA-NP的这一实施例的刚性MSNP核尺寸为50nm(通过TEM)，并且流体动力学尺寸(具有聚合物涂层的NP)为100nm。其包含13.5wt.％PEI、18.2wt.％PEG，并且可以装载2-4wt.％siRNA或至多10wt.％的CpG寡核苷酸。药物(例如，紫杉烷)可以以0.5-3wt.％装载在MSNP核中或聚合物上。此段落中的所有值均按纳米构建体的重量计。还参见美国专利申请公开第2017/0172923号。
在第一特定实施例中，提供了一种免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体包含：递送系统；至少一种治疗剂，所述至少一种治疗剂例如装载到所述递送系统中、附着于所述递送系统的表面、偶联到所述递送系统、围封在所述递送系统内或包含在所述递送系统内，其中治疗剂引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境；以及至少一种佐剂化合物，所述至少一种佐剂化合物例如附着于所述递送系统的表面、偶联到所述递送系统、围封在所述递送系统内或包含在所述递送系统内。
在此实施例的实例中，所述递送系统包含(或者在其它实施例中是)脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒、涂覆有聚合物或脂质的无机颗粒或其混合物。
在免疫治疗构建体的各个实例中，递送媒剂是无机颗粒，并且包含介孔二氧化硅颗粒、金颗粒、铝颗粒、磷酸钙颗粒、氧化铁颗粒或抗氧化剂颗粒(如氧化铈)中的一或多种。
在免疫治疗构建体的又更多实例中，递送媒剂包含以下中的一或多种：富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支链和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、硅、二氧化硅和聚合物微球和纳米球、二氧化硅壳、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金颗粒、氧化铈颗粒、氧化锌颗粒、银颗粒、铝颗粒、碳颗粒、铁颗粒、氧化铁颗粒、佐剂颗粒(例如，病毒体或其它病毒样颗粒)和/或经修饰的胶束。任选地，递送媒剂包含聚合物；在特定实例中，聚合物颗粒包含PLGA、PLL、聚精氨酸、PEG、PEI或壳聚糖中的一或多种。
可设想到，在所提供的免疫治疗构建体实施例中的任何实施例中，实例是流体动力学尺寸为5nm到999nm(例如，约80nm到约200nm、或约90nm到约150nm)的纳米颗粒，如在水介质(如PBS、Tris缓冲液或水)中测量的。在一些实施例中，免疫治疗构建体的流体动力学尺寸小于150nm，如在水介质(如PBS、Tris缓冲液或水)中测量的。在又其它实例中，免疫治疗构建体是流体动力学尺寸为1微米到1000微米(例如，1微米到50微米)的微粒，如在水介质(如PBS、Tris缓冲液或水)中测量的。
在所描述的免疫治疗构建体的各个实施例中，治疗剂包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA、DNA、sgRNA(CRISPR-cas9元件)、其它寡核苷酸、其它多核苷酸、肽、蛋白质、化学治疗药物、毒素、抗氧化剂、小分子抑制剂、抗体或放射治疗剂。在特定实例中，治疗剂抑制STAT3、CD39、CD73、TGF-β、PD-L1、PD1、CTLA4、MIF、PLK1、HIF、NOX1-4、HER2、EGFR、BCL2、AKT1、HIF1-α、NOX1-4、AR、MYC或MTDH的表达或活性。
在免疫治疗构建体的又更多实施例中，治疗剂是抗癌剂，所述抗癌剂包含以下中的一或多种：抗生素(例如，多西他赛、多柔比星(doxorubicin)或米托蒽醌(mitoxantrone))、植物碱(例如，卡巴他赛(cabazitaxel))、PLK1抑制剂、有丝分裂激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂(如针对PD-L1、PD1或CTLA4的抗体)、基于铂的化学治疗剂、小分子HER2抑制剂或HER2特异性抗体。有丝分裂激酶抑制剂的实例包含但不限于polo样激酶(PLK)、极光激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、HASPIN、单极纺锤体1激酶(Mps1)或NimA相关激酶(NEK)中的至少一种的抑制剂。在一些实施例中，有丝分裂激酶抑制剂包含GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727(沃拉色替(volasertib))、Chk 1激酶抑制剂LY2603618、AU14022、YK-4-279或PMN中的一或多种。
在免疫治疗构建体的任何实施例的实例中，佐剂化合物具有免疫刺激活性。举例来说，佐剂化合物可以包含以下中的一或多种：CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNA TLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNA TLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物。在特定实例中，佐剂化合物包含CpG寡核苷酸、咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特、poly IC、poly ICLC、dSLIM或EnanDIM。
具体地，在本文中可设想到，所提供的免疫治疗构建体实施例中的任何实施例可以不包含肿瘤特异性抗原或卵清蛋白。
又另一个所提供的实施例是一种组合物，所述组合物包含：至少一种如本文所提供的免疫治疗构建体；以及至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或其混合物。
还提供了使用本文所描述的免疫治疗构建体的方法，例如治疗或预防癌症或另一种过度增殖性疾病的方法。
一种提供的治疗癌症的方法包含向患有癌症的受试者施用有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物，以减轻癌症的一或多种症状。
另一个提供的方法实施例是一种治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物接触。
另一个提供的方法实施例是一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物接触。在此实施例的实例中，从所述受试者中获得的所述细胞是癌细胞。在其它实施例中，所述细胞不是癌细胞；例如，在一些情况下，非癌症(例如，正常)细胞是免疫学细胞。在治疗细胞的方法的实例中，所述方法进一步包含将至少一个经治疗的细胞返回施用于所述受试者。
另一个提供的实施例是一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状或具有发展此类疾病或病状的高风险的受试者的方法，所述方法涉及向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含至少一种如本文所述的免疫治疗构建体。举例来说，可设想到，在各个实施例中，所述过度增殖性疾病或病状包含癌症、初癌或癌症转移中的一或多种。例如，在一些情况下，所述过度增殖性疾病包含以下中的一或多种：黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、结直肠癌、淋巴瘤、结肠癌或肝癌。
还提供了将免疫治疗构建体的施用与至少一种其它治疗，例如癌症或另一种过度增殖性疾病或病状的治疗组合的方法实施例。在此类组合方法的第一实例中，所述方法增强了抗癌疗法在有需要的受试者中的效果，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物；以及至少一种抗癌剂(例如，化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂)。在另一个示例组合方法中，所述方法增强了在诊断为患有瘤变的受试者中的检查点阻断免疫疗法效果，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物；以及至少一种免疫检查点抑制剂。又另一种组合方法是一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者中的放射疗法效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所描述的实施例中的任何一个实施例的免疫治疗构建体或包含免疫治疗构建体的组合物；以及至少一种放射疗法。在任何组合方法实施例中，提供了其中免疫治疗构建体或组合物和第二药剂(通常为抗癌治疗剂或治疗)顺序或同时施用的实例。如本文所使用的，关于抗癌疗法的治疗效果的术语“增强”是指抗癌疗法(例如，用抗癌剂、放射疗法或检查点免疫疗法治疗)的治疗效果的增加高于在没有本发明的免疫治疗构建体的情况下施用抗癌疗法时通常获得的那些治疗效果。当通过抗癌疗法获得的治疗效果的强度和/或程度加速和/或增加时，表现出“治疗效果的增加”。其还包含延长治疗益处的持续时间。当与本发明提供的免疫治疗构建体共同施用时，其还可以表现出在需要获得相同益处和/或效果时抗癌疗法的剂量、给药频率或治疗持续时间较低，当单独施用时，其还表现出抗癌疗法的剂量、频率或持续时间较高。增强效果优选地但不一定产生对急性症状的治疗，对于所述急性症状，单独的抗癌疗法无效或治疗效果较差。与单独施用抗癌疗法相比，当本发明的免疫治疗构建体与抗癌疗法共同施用时，在治疗效果增加至少10％(例如，至少25％、至少50％、至少75％或至少100％)时实现增强。
在所描述的方法实施例中的任何方法实施例中施用免疫治疗构建体可以包含以下中的一或多项：直接注射到受试者的肿瘤、病变或切除的肿瘤区中或周围；或对所述受试者进行全身注射；或局部应用于所述受试者；或吸入；或植入装置；或对所述受试者进行微针应用。
在所提供的方法实施例中的任何方法实施例的实例中，所述受试者(经治疗、正在向其施用构建体或组合物、或从其获得细胞)是哺乳动物；例如，在某些实施例中，所述哺乳动物是人。
本文还提供了一种包含本文所述的免疫治疗构建体和至少一种抗癌剂的试剂盒。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
现在用另外的细节和选项描述本公开的各方面以支持本公开的教导，如下：(I)免疫治疗构建体；(II)治疗剂(其引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境)；(III)佐剂化合物；(IV)任选的另外的组分；(V)递送系统；(VI)药物组合物和施用调配物；(VII)示范性使用方法；(VIII)试剂盒；(IX)示范性实施例；以及(X)实例。
(I)免疫治疗构建体
本文描述了一类新型免疫治疗剂(具体地为“免疫治疗构建体”)，所述新型免疫治疗剂包含将佐剂和治疗活性剂共同递送到癌细胞的工程化颗粒。实施例提供了诱导抗原释放(具体地为肿瘤抗原释放)和/或调节免疫抑制环境(如肿瘤微环境)的治疗活性剂。这些免疫治疗构建体增强CD8+ T细胞库并诱导全身性抗肿瘤免疫治疗效果，而无需知道或鉴定哪些抗原与所治疗的癌症相关。
此策略将具有许多关键特征；其是有效的、个性化的、由于局部递送而安全的、因为其训练和利用身体免疫细胞来攻击具有记忆效应的癌症而持久的、廉价的(例如，需要低剂量和低给药量)，并且适用于多种类型的癌症。
应当理解，免疫治疗构建体中每种组分(例如治疗剂、佐剂、递送媒剂或递送媒剂的任何组分)的量可以根据实施例而变化。举例来说，任何单独组分可以占免疫治疗构建体的0.001重量％到80重量％、0.01重量％到75重量％、0.5到50重量％、0.5到10重量％、0.5到5重量％、1到10重量％或2到4重量％。在一些实施例中，治疗剂包括寡核苷酸(例如，siRNA或本文所述的任何其它寡核苷酸)，并且寡核苷酸占免疫治疗构建体的0.5到30重量％，例如0.5到10重量％、1到5％、5到15重量％或10到30重量％。在一些实施例中，治疗剂包括抗癌剂(例如，小分子抑制剂或本文所述的任何其它抗癌剂)，并且抗癌剂占免疫治疗构建体的0.1到30重量％，例如0.5到10重量％、1到5重量％、5到15重量％或10到30重量％。在一些实施例中，治疗剂包括抗体，并且抗体占免疫治疗构建体的0.1到30重量％，例如0.5到10重量％、1到5重量％、5到15重量％或10到30重量％。
(II)治疗剂
通过所提供的工程化免疫治疗构建体递送到癌症和/或免疫细胞的治疗活性剂(例如，治疗性寡核苷酸，包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、sgRNA-cas9、DNA和mRNA，以及小分子抑制剂、化学治疗药物、抗体、化学药剂等)的实例引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境。在具体实施例中，活性剂杀死癌细胞，由此释放肿瘤抗原，而共同递送的佐剂(例如，CpG、R848、poly I:C等)致敏和激活针对所释放的肿瘤抗原的适应性免疫细胞。经激活的效应细胞可以识别和攻击体内任何部位(包含远离局部递送免疫治疗构建体的部位)处的肿瘤，并且减少或甚至预防携带与经治疗的肿瘤相同的一或多种肿瘤抗原的新肿瘤的扩散、复发或发展。在某些实施例中，可以调整免疫治疗构建体上的治疗剂的剂量以减少对有益免疫细胞的毒性。在某些实施例中，在免疫治疗构建体上使用影响癌症活力而不伤害免疫细胞的治疗剂。在其它实例中，治疗活性剂(例如，siRNA、抑制剂或其它针对STAT3、CD39、CD73、IDO-6、PD-L1、TGF-β、抗氧化剂等的药物)也可以装载在递送媒剂(例如，颗粒)上/递送媒剂内以调节免疫抑制肿瘤微环境，从而利用已经存在于肿瘤中的抗原或由免疫治疗构建体触发其释放的抗原致敏和激活免疫细胞以有效攻击癌细胞。例如，治疗剂可以靶向STAT3、IDO-1、TGF-β、CD47、NOX1-5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、生存素、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1-α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、角蛋白K6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、弗林蛋白酶、KSP、eiF-4E、p53、β-连环蛋白、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、PD-L1、PD-1、CTLA-4、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、SOCS1、TRAIL、p65以及有丝分裂激酶(例如，PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、CDK1、CDK2、CHK1、CHK2、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPIN、极光激酶A)。治疗剂可以靶向本领域已知的其它免疫抑制基因(例如，刘(Liu)等人,数据库(Database),bax094,2017；拉比诺维奇(Rabinovich)等人,免疫学年度评论(Annu Rev Immunol),25:267,2010)。治疗剂还可以抑制本领域已知的免疫检查点的活性。对癌症治疗有益的免疫检查点在被抑制时非穷尽地包含PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、B7-H3、VISTA、A2AR、IDO等(凯尔(Khair)等人,免疫学前沿(Frontiers Immunology),10:453,2019)。总之，免疫治疗构建体将产生持久的免疫介导的抗癌效果。也可以建立记忆适应性免疫。
在某些实施例中，免疫治疗构建体用于激活免疫应答。此类实施例不限于激活免疫应答的特定方式。
治疗性寡核苷酸：可以使用不同类型的治疗性寡核苷酸，并且所述治疗性寡核苷酸非穷尽地包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶、适体、DNA、mRNA、sgRNA(用于CRISPR)和CRISPR-cas9元件。换句话说，任何核苷酸链都可以用于本领域中，只要其可以特异性地调节(干扰或增强)某些基因和蛋白质的作用或合成。每个特定寡核苷酸可以具有单个或多个靶标。本发明所关注的基因/蛋白质靶标的实例包含免疫检查点、转录因子、磷酸酶、激酶等。特异性靶标包含STAT3、IDO-1、TGF-β、CD47、NOX1-5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、生存素、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1-α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、角蛋白K6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、弗林蛋白酶、KSP、eiF-4E、p53、β-连环蛋白、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、PD-L1、PD-1、CTLA-4、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、SOCS1、TRAIL、p65以及有丝分裂激酶(例如，PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、CDK1、CDK2、CHK1、CHK2、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPIN、极光激酶A)。治疗性寡核苷酸还可以靶向本领域已知的其它免疫抑制基因(例如，刘等人,数据库,bax094,2017；拉比诺维奇等人,免疫学年度评论,25:267,2010)。治疗性寡核苷酸可以抑制本领域已知的免疫检查点的表达和活性。对癌症治疗有益的免疫检查点在被抑制时非穷尽地包含PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、B7-H3、VISTA、A2AR、IDO等(凯尔等人,免疫学前沿,10:453,2019)。治疗性寡核苷酸还可以含有靶向两个基因的两条链(如针对BLC2和AKT1的siRNA、针对AR和MYC的siRNA)。其还可以含有免疫刺激序列/元件，所述免疫刺激序列/元件因此可以同时增强免疫应答并调节靶基因的表达。其还可以被设计为靶向上述具有突变的基因。
在某些实施例中，免疫治疗构建体包含作为活性剂的介导RNA干扰的寡核苷酸。RNA干扰是一种由双链RNA(dsRNA)触发并且能够下调与dsRNA同源的基因的转录的高度保守的机制。dsRNA首先由Dicer加工成21-23个核苷酸的短双链体，称为短干扰RNA(siRNA)。并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其能够通过切割靶mRNA来介导基因沉默。“siRNA”或“小干扰核糖核酸”是指在生理条件下沿着互补区杂交的两条核糖核苷酸链。siRNA分子包含与靶基因的mRNA区基本上相同的双链区。与靶基因的对应序列具有100％同一性的区是合适的。此状态被称为“全互补”。然而，与靶基因的对应区相比，所述区也可以含有一个、两个或三个错配，这取决于被靶向的mRNA区的长度，并且如此可能不全互补。用于分析和鉴定具有足够序列同一性以有效抑制特异性靶序列表达的siRNA的方法是本领域已知的。合适的mRNA靶区将是编码区。非翻译区也是合适的，如5'-UTR、3'-UTR和剪接点，只要所述区是mRNA靶标所独有的。
在一些实施例中，在涉及RNA干扰的方法和系统中利用包封在免疫治疗构建体内或与免疫治疗构建体相关联的siRNA。此类实施例不限于特定大小或类型的siRNA分子。与靶标互补的siRNA区的长度例如可以为15个核苷酸到100个核苷酸、18个核苷酸到25个核苷酸、20个核苷酸到23个核苷酸或超过15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸或18个核苷酸。在与对应靶区存在错配的情况下，互补区的长度通常需要稍长一些。
在某些实施例中，可设想到，使用本文公开的免疫治疗构建体的siRNA递送方法(例如，通过将siRNA装载在免疫治疗构建体上)可以用于抑制任何所关注的基因的产生。具体靶标包含STAT3、IDO-1、TGF-β、CD47、NOX1-5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、生存素、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、角蛋白K6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、弗林蛋白酶、KSP、eiF-4E、p53、β-连环蛋白、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、PD-L1、PD-1、CTLA-4、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、SOCS1、TRAIL、p65以及有丝分裂激酶(例如，PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、CDK1、CDK2、CHK1、CHK2、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPIN、极光激酶A)，这些基因被称为癌症和其它疾病的驱动基因。刘等人,数据库,bax094,2017和拉比诺维奇等人,免疫学年度评论,25:267,2010中描述了其它已知的潜在免疫抑制基因。此外，具体地，可设想到，siRNA可以针对变体或突变基因，而不是野生型基因。
本领域普通技术人员将理解如何访问这些靶标的代表性序列，所述代表性序列可在公共序列数据库中容易获得。下表提供了样品序列信息：
Figure BDA0003457735980000211
Figure BDA0003457735980000221
Figure BDA0003457735980000231
Figure BDA0003457735980000241
Figure BDA0003457735980000251
此类实施例不限于在体外和/或体内评估siRNA的递送特性的特定方式。在一些实施例中，用显像剂(例如，荧光染料FITC、RITC、CyTM染料、
Figure BDA0003457735980000252
染料或Alexa
Figure BDA0003457735980000253
染料)或放射性示踪剂标记siRNA分子允许在器官水平上可视化siRNA分子的生物分布以及还有细胞内递送曲线。在一些实施例中，RT-PCR、FISH、IHC、流式细胞术和蛋白质印迹分别用于在mRNA水平和蛋白质水平上分析靶蛋白。
在某些实施例中，本公开提供了用于抑制细胞中的靶基因的方法，所述方法包含将能够通过RNA干扰抑制靶基因的siRNA引入到所述细胞中，其中所述siRNA包含彼此互补的两条RNA链，其中所述siRNA被装载到免疫治疗构建体上。在一些实施例中，siRNA在3'有义链上被胆固醇修饰。在一些实施例中，细胞在人或动物受试者(例如，马、狗、猫或其它家养动物、农场动物或其它患有癌症的动物)体内。
微RNA(miRNA)或miRNA模拟物是短的非编码RNA，所述非编码RNA可以通过3'-UTR元件靶向并基本上沉默蛋白编码基因。miRNA在众多生物过程中的重要作用已经被确立，但缺乏对复杂疾病中的miRNA功能的综合分析。miRNA最初被转录为初级miRNA(pri-miRNA)，所述初级miRNA然后被核RNAse Drosha和Pasha切割以产生前体-miRNA(pre-miRNA)。这些前体由细胞质RNAse III dicer进一步加工以形成短双链miR-miR*双链体，然后将其中的一条链(miR)整合到包含酶dicer和Argonaute(Ago)的RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。成熟的miRNA(约17-24nt)将RISC引导到位于靶基因的3'UTR内的特异性靶位点。一旦与靶位点结合，miRNA就会通过mRNA衰变、翻译抑制和/或隔离进入处理小体(P小体)中来遏制翻译(欧拉利奥(Eulalio)等人,细胞(Cell),132:9-14,2008；贝姆-安斯曼特(Behm-Ansmant)等人,冷泉港定量生物学研讨会(Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.),71:523-530,2006；朱(Chu)和拉娜(Rana),公共科学图书馆·生物学(Plos.Biology.),4:e210,2006)。最近的估计发现超过60％的蛋白编码基因携带3'-UTR miRNA靶位点(弗里德曼(Friedman)等人,基因组研究(Genome Res.),19:92-105,2009)。在这方面，miRNA充当各种过程的关键调节剂，如早期发育(莱因哈特(Reinhart)等人，自然(Nature),403:901-906,2000)、细胞增殖和细胞死亡(布伦内克(Brennecke)等人,细胞,113(1):25-36,2003)、细胞凋亡和脂肪代谢(徐(Xu)等人,当代生物学(Curr.Biol.),13(9):790-795,2003)和细胞分化(陈(Chen)等人,分子微生物学(Mol.Microbiol.),53843-856,2004；Dostie等人,RNA协会的RNA-A出版物(RNA-A Publication of the RNA Society),9:180-186,2003)。此外，对慢性淋巴细胞白血病(卡林(Calin)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),105:5166-5171,2008)、结肠腺癌(迈克尔(Michael)等人，分子癌症研究(Mol.Cancer Res.),1:882-891,2003)、伯基特淋巴瘤(梅茨勒(Metzler)等人,基因、染色体和癌症(GenesChromosomes Cancer),39:167-169,2004)、心脏病(赵(Zhao)等人,细胞,129:303-317,2007)和病毒感染(费弗尔(Pfeffer)等人,科学(Science),304:734-736,2004)中miRNA表达的研究表明miRNA与多种疾病之间的重要联系。
迄今为止观察到的miRNA的长度通常为21-22个核苷酸，并且其来自较长的前体，所述前体由非蛋白质编码基因转录而来。在卡林顿(Carrington)和安布罗斯(Ambros)(科学,301(5631):336-338,2003)中进行综述。前体形成在自互补区中相互折叠的结构；然后其被动物中的核酸酶Dicer(或植物中的DCL1)加工。miRNA分子通过与其靶标精确或不精确的碱基配对来中断翻译。在一些实施例中，miRNA可以用作所提供的在治疗上或施用于受试者(如人类患者)以治疗疾病(例如，癌症)的免疫治疗构建体的组分；可替代地，在一些实施例中，与miRNA互补的核酸可以在体内在治疗上施用于受试者或者在体外使用以产生期望的治疗结果(例如，miRNA-142-3p、miRNA-142-3p、miRNA-124或miRNA-138)。以此方式，互补核酸可以用作模板以产生期望的治疗性miRNA(例如，miRNA-142-3p、miRNA-142-3p、miRNA-124或miRNA-138)。
具体地，设想到治疗性寡核苷酸针对STAT3或对STAT3具有特异性的实施例。STAT3是指蛋白质“信号转导物和转录激活剂3”以及其同源物；所述术语包含人蛋白，无论所述蛋白是野生型还是突变形式。在实施例中，“STAT3”是指与Entrez Gene 6774、OMIM 102582、UniProt P40763和/或RefSeq(蛋白质)NP 003141相关的蛋白质(其是指自本申请提交之日起已知的蛋白质和相关核酸)。“磷酸化STAT3”是指通过磷酸化被磷酸化和激活的STAT3蛋白。在实施例中，磷酸化STAT3在酪氨酸705上或对应于同源物中的酪氨酸705的残基上被磷酸化。在实施例中，STAT3的激活意指STAT3能够激活其它基因的转录。在实施例中，经激活的STAT3在酪氨酸705上或对应于酪氨酸705的残基上被磷酸化，形成二聚体(例如，同源二聚体或异源二聚体)，易位到细胞核和/或激活转录。在实施例中，经激活的STAT3形成同源二聚体。使STAT3磷酸化并且由此激活STAT3的蛋白质的实例包含JAK2、EGFR、c-MET和PDGF-R。
抗癌剂：短语抗癌剂按照其普通一般含义使用，并且是指具有抗肿瘤性质或抑制细胞生长或增殖的能力的组合物(例如，化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是靶向治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中具有效用的药剂。在一些实施例中，抗癌剂是由FDA或除美国以外国家的类似监管机构批准的用于治疗癌症的药剂。
抗癌剂的实例包含但不限于：MEK(例如MEK1、MEK2或MEK1和MEK2)抑制剂(例如，XL518、CI-1040、PD035901、司美替尼(selumetinib)/AZD6244、GSK1120212/曲美替尼(trametinib)、GDC-0973、ARRY-162、ARRY-300、AZD8330、PD0325901、U0126、PD98059、TAK-733、PD318088、AS703026、BAY 869766、PD184352、SB239063、BAY 43-9006)；烷化剂，如氮芥(例如，甲氯乙胺(mechloroethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、乌拉莫司汀(uramustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、马法兰(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide))、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺和噻替哌(thiotepa))、烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan)和海普舒凡(hepsulfam))、亚硝基脲(nitrosourea)(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司丁(lomusitne)、司莫司汀(semustine)和链脲佐菌素(streptozocin))和三氮烯(例如，达卡巴嗪(decarbazine))；抗代谢物，如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、亚叶酸(leucovorin)、雷替曲塞(raltitrexed)和培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(例如，氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxouridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、卡培他滨(capecitabine)和吉西他滨(gemcitabine))和嘌呤类似物(例如，巯嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、喷司他丁(pentostatin)、氟达拉滨(fludarabine)和5-硫唑嘌呤(azathioprine))；植物碱(例如，长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛、卡巴他赛和高三尖杉酯碱(homoharringtonine))；拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱衍生物(例如，伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan))、安吖啶(amsacrine)和表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)(例如，依托泊苷(etoposide)(VP16)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)和替尼泊苷(teniposide))；抗生素，如蒽二酮(例如，米托蒽醌)、蒽环类药物(如多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)和盐酸氟柔红霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride))、链霉菌源性抗生素或其衍生物(例如，放线菌素(dactinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、格尔德霉素(geldanamycin)、普卡霉素(plicamycin)和17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG；坦螺旋霉素(tanespimycin))、氯法齐明(clofazimine)和β内酰胺衍生物；基于铂的化学治疗剂(例如，顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin))；经取代的脲(例如，羟基脲(hydroxyurea))；甲基肼衍生物(例如，丙卡巴肼(procarbazine))、肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(mitotane)和氨鲁米特(aminoglutethimide))；血管生成抑制酶(例如，L-天冬酰胺酶和精氨酸脱亚胺酶)；PI3K抑制剂(例如，渥曼青霉素(wortmannin)和LY294002)；mTOR抑制剂(例如，舍曲林(sertraline))；DNA甲基转移酶抑制剂(例如，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)；反义寡核苷酸；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂(例如，脱氧腺苷和雷公藤甲素)；BCR/ABL拮抗剂；bFGF抑制剂；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；硝酸镓；明胶酶抑制剂；谷胱甘肽抑制剂(例如，依他硝唑(etanidazole))；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；白血病抑制因子；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；MIF抑制剂；错配的双链RNA；分枝杆菌细胞壁提取物；一氧化氮调节剂；磷酸酶抑制剂；纤溶酶原活化物抑制剂；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；核酶；信号转导抑制剂/调节剂(例如，伊曲康唑(itraconazole))；单链抗原结合蛋白；干细胞抑制剂；溶基质素抑制剂；合成糖胺聚糖；端粒酶抑制剂；促甲状腺激素；翻译抑制剂；尿激酶受体拮抗剂；促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)，如戈舍瑞林(goserelin)和亮丙瑞林(leuprolide/leuprorelin)；类固醇，如肾上腺皮质类固醇(例如，强的松(prednisone)和地塞米松(dexamethasone))；孕酮(例如，己酸羟孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸甲羟孕酮)；抗黄体素(antiprogestrogen)(例如，米非司酮(mifepristone))；雌激素(例如，己烯雌酚(di-ethlystilbestrol)和乙炔雌二醇(ethinyl estradiol))；抗雌激素，如芳香酶抑制剂(例如，依西美坦(exemestane)、法倔唑(fadrozole)、来曲唑(letrozole)、喷托唑(pentrozole)和阿那曲唑(anastrozole))、选择性雌激素受体调节剂(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、他莫昔芬甲碘化物(tamoxifenmethiodide)、帕诺米芬(panomifene)和氯米芬(clomifene)类似物)；雄激素(例如，丙酸睾酮(testosterone propionate)和氟甲睾酮(fluoxymesterone))；抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、非那雄胺(finasteride)和比卡鲁胺(bicalutamide))；免疫刺激剂、左旋咪唑(levamisole)、白介素(例如，白介素-2)和干扰素/干扰素激动剂(例如，α-干扰素)；单克隆抗体，如抗CD20(例如，利妥昔单抗)、抗HER2(例如，曲妥珠单抗)、抗CD52、抗CD25(例如，达利珠单抗(daclizumab))、抗HLA-DR和抗VEGF单克隆抗体)；免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-卡奇霉素(calicheamicin)缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)缀合物等)；放射免疫治疗剂(例如，与111In、90Y或131I等缀合的抗CD20单克隆抗体)；他汀类药物(例如，西立伐他汀(cerivastatin)和匹伐他汀(pitavastatin))；5-T1B受体激动剂(例如，5-壬基氧基色胺)；BRAF激酶抑制剂(例如，维莫非尼(vemurafenib)和达拉菲尼(dabrafenib))；酪氨酸激酶抑制剂，如EGFR、HER2、KDR、FLT4、EphB4和Src中的一或多种的抑制剂(例如，吉非替尼(gefitinib)(IressaTM)、厄洛替尼(erlotinib)(TarcevaTM)、西妥昔单抗(ErbituxTM)、拉帕替尼(lapatinib)(TykerbTM)、帕尼单抗(panitumumab)(VectibixTM)、凡德他尼(vandetanib)(CaprelsaTM)、阿法替尼(afatinib)/BIBW2992、CI-1033/卡奈替尼(canertinib)、来那替尼(neratinib)/HKI-272、CP-724714、TAK-285、AST-1306、ARRY334543、AG-1478、达克替尼(dacomitinib)/PF299804、OSI-420/去甲基厄洛替尼(desmethyl erlotinib)、AZD8931、ARRY-380、AEE788、培利替尼(pelitinib)/EKB-569、CUDC-101、WZ8040、WZ4002、WZ3146、AG-490、XL647、PD153035、BMS-599626、索拉非尼(sorafenib)、伊马替尼(imatinib)
Figure BDA0003457735980000291
舒尼替尼(sunitinib)和达沙替尼(dasatinib))；免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA4、抗PD1/L1抗体)；PLK1抑制剂(GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、沃拉色替)等或其混合物(例如，亮丙瑞林+雌激素+孕酮)。
此外，本文所述的免疫治疗构建体可以与常规免疫治疗剂共同施用，所述常规免疫治疗剂包含但不限于免疫刺激剂(例如，卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、左旋咪唑、白介素-2、α-干扰素等)、治疗性单克隆抗体(例如，抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR和抗VEGF单克隆抗体)、免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-刺孢霉素缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素缀合物等)、免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA4、抗PD1、抗PD-L1抗体)和放射免疫疗法(例如，与111In、90Y或131I等缀合的抗CD20单克隆抗体)。这些免疫治疗剂也可以直接装载到免疫治疗构建体上，以增强其治疗效果、降低毒性并缩短施用时间。
在另一个实施例中，本文所述的免疫治疗构建体可以与常规放射治疗剂共同施用，所述常规放射治疗剂包含但不限于放射性核素，如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At和212Bi。这些放射治疗剂也可以直接装载到免疫治疗构建体上，以增强治疗效果、降低毒性并缩短施用时间。
代替寡核苷酸，干扰或增强靶基因和蛋白质的活性的抗体和小分子抑制剂可以以类似的方式使用。例如，代替针对PD-1的siRNA，PD-1抗体也可以作为本文提供的免疫治疗构建体中的治疗剂组分装载在纳米颗粒上。
(III)佐剂
本文提供的免疫治疗构建体包含至少一种佐剂组分，例如包含在递送媒剂内或以其它方式与递送媒剂相关联。免疫治疗构建体实施例不限于特定类型的佐剂，尽管本文提供了具体实例。佐剂也可以是治疗剂的一部分或与治疗剂缀合。例如，敲低靶基因的siRNA可以被设计为含有免疫刺激序列。在一些实施例中，所述至少一种佐剂占免疫治疗构建体的0.5到20重量％。
通常，佐剂是任何物质，其混合到疫苗组合物中会增加或以其它方式修饰对(癌症)抗原的免疫应答。具体地，可设想到具有免疫刺激活性的佐剂。佐剂诱导免疫系统的非特异性激活，除非其与抗原(例如，疫苗中的佐剂)相关联。佐剂增加对抗原的免疫应答的能力通常表现为免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减少。例如，体液免疫的增加典型地表现为针对抗原产生的抗体的效价显著增加，而T细胞活性的增加典型地表现为抗原特异性T细胞增殖、靶细胞死亡或细胞因子分泌增加。佐剂还可以例如通过将初次体液或Th2应答变为初次细胞或Th1应答而改变免疫应答。
合适的佐剂包含：结合TLR的DNA取代基，如CpG寡核苷酸(例如，ISS 1018；Amplivax；CpG ODN 7909、CpG ODN 1826、CpG ODN D19、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpGODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN 2395、ODN M362和SD-101)；含有CpG序列的DNA TLR激动剂(例如，dSLIM)、非CpG DNA TLR激动剂(例如，EnanDIM)和阳离子肽缀合的CpG寡核苷酸(例如，IC30、IC31)；RNA TLR激动剂(例如，Poly I:C和Poly-ICLC)；铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝和硫酸铝钾)；抗CD40抗体(例如，CP-870,893)；细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；小分子TLR激动剂(例如，咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特或3M-052)；融合蛋白(例如，ImuFact IMP321、CyaA和ONTAK)；基于油或表面活性剂的佐剂，如MF59、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V和Montanide ISA-51；植物提取物，如源自皂苷的QS21刺激元(美国马萨诸塞州伍斯特阿奎拉生物技术公司)；分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物，如脂多糖(例如，单磷酰基脂质A、OM-174、OM-197-MP-EC或Pam3Cys)；呫吨酮衍生物(例如，瓦德美赞)；其混合物(例如，AS-15)；以及其它专有佐剂，如里比公司的Detox、Quil或Superfos。先前已经描述了若干种免疫佐剂(例如，对树突细胞具有特异性的MF59以及其制剂)(杜普伊(Dupuis)等人,细胞免疫学(Cell Immunol.)186(1):18-27,1998；艾莉森(Allison),生物标准化进展(Dev BiolStand.)；92:3-11,1998)。
也可以使用细胞因子。已经将若干细胞因子直接与影响树突细胞向淋巴组织的迁移(例如，TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利第5,849,589号)以及充当免疫佐剂(例如，IL-12)(加布里洛维奇(Gabrilovich)等人,侧重于肿瘤免疫学的免疫疗法杂志(J Immunother Emphasis TumorImmunol.)(6):414-418,1996)相联系。Toll样受体(TLR)或激活TLR的药剂也可以用作佐剂，并且是模式识别受体(PRR)家族的重要成员，所述PRR识别许多微生物共享的保守基序，被称为“病原体相关的分子模式(PAMPS)”。
在一些实施例中，佐剂包含CpG寡核苷酸。据报道，CpG免疫刺激性寡核苷酸也可以增强疫苗环境中佐剂的效果。不受任何特定机械理论的束缚，CpG寡核苷酸至少部分地经由Toll样受体(TLR)(主要是TLR9)通过激活先天性(非适应性)免疫系统而起作用。CpG触发的TLR9激活增强了对多种多样抗原的抗原特异性体液和细胞应答，包含预防性疫苗和治疗性疫苗两者中的肽或蛋白抗原、活病毒或灭活病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗以及多糖缀合物。更重要的是，其增强了树突细胞的成熟和分化，从而导致TH1细胞的激活增强和强大的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生，即使在不存在CD4 T细胞帮助的情况下也是如此。即使在不存在如明矾或不完全弗氏佐剂(IFA)等通常促进TH2偏倚的疫苗佐剂的情况下，由TLR9刺激诱导的TH1偏倚也得以维持。CpG寡核苷酸在与其它佐剂一起调配或共同施用时或在如微粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似调配物等调配物中示出了甚至更高的佐剂活性，当抗原相对较弱时，这对于诱导强烈应答尤其必要。其还加速了免疫应答并使抗原剂量降低两个数量级，在一些实验中，在没有CpG的情况下对全剂量疫苗产生相当的抗体应答(克里格(Krieg),自然评论药物发现(Nature Reviews，Drug Discovery),5:471-484,2006)。美国专利第6,406,705号描述了CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原的组合使用以诱导抗原特异性免疫应答。可商购获得的CpG TLR9激动剂是Mologen(德国柏林(Berlin,GERMANY))的dSLIM(双茎环免疫调节剂)。也可以使用其它TLR结合分子，如结合RNA的TLR 7、TLR 8和/或TLR9。
根据本发明的实施例，呫吨酮衍生物，例如瓦德美赞或AsA404(也称为5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA))也可以用作佐剂。可替代地，此类衍生物也可以例如通过全身或瘤内递送与本发明的疫苗并行施用，以刺激肿瘤部位处的免疫。在不受理论束缚的情况下，据信此类呫吨酮衍生物通过经由IFN基因ISTING受体的刺激物刺激干扰素(IFN)产生而起作用(参见例如康伦(Conlon)等人,免疫学杂志(J Immunology),190:5216-5225,2013；以及吉姆(Kim)等人,美国化学学会化学生物学杂志(ACS Chem Biol),8:1396-1401,2013)。其它有用佐剂的实例包含经化学修饰的CpG(例如，CpR、Idera)、Poly(I:C)(例如，polyi:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA以及可以在治疗上起作用和/或作为佐剂起作用的免疫活性小分子和抗体，如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗(bevacizumab)、CelebrexTM、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉非尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)和SC58175。本领域技术人员可以在无需过度实验的情况下容易地确定在本发明的上下文中有用的佐剂和添加剂的量和浓度。另外的佐剂包含集落刺激因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。
Poly-ICLC是一种合成制备的双链RNA，其包含平均长度为5000个核苷酸的polyl和polyC链，已经通过添加聚赖氨酸和羧甲基纤维素使其对血清核酸酶的热变性和水解具有稳定性。所述化合物激活TLR3和MDA5的RNA解旋酶结构域，这两个都是PAMP家族的成员，从而导致DC和自然杀伤(NK)细胞激活并产生I型干扰素、细胞因子和趋化因子的“天然混合物”。此外，poly-ICLC通过两个IFN诱导型核酶系统，即2'5'-OAS和Pl/eIF2a激酶(也称为PKR(4-6))以及RIG-I解旋酶和MDA5发挥更直接、更广泛的宿主靶向抗感染和可能的抗肿瘤作用。
可以与免疫治疗构建体相关的免疫佐剂的实例包含TLR配体、C型凝集素受体配体、NOD样受体配体、RLR配体和RAGE配体。TLR配体可以包含脂多糖(LPS)及其衍生物以及脂质A及其衍生物，包含单磷酰基脂质A(MPL)、吡葡亚硝脲基(glycopyranosyl)脂质A、PET-脂质A和3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A。在一个特定实施例中，免疫佐剂是MPL。在另一个实施例中，免疫佐剂是LPS。TLR配体还可以包含TLR3配体(例如，聚肌-聚胞苷酸(poly(I:C))、TLR7配体(例如，咪喹莫特和瑞喹莫特)和TLR9配体。
如本文所使用的，术语“结合TLR的DNA取代基”是指能够与toll样受体(“TLR”，包含至少一种脱氧核糖核酸)结合的取代基或部分。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是核酸。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含至少一种核酸类似物。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含至少一种具有替代主链的核酸类似物(例如，磷酸二酯衍生物(例如，氨基磷酸酯、膦酸二酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰乙酸、膦酰甲酸、甲基膦酸酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺)、肽核酸主链、LNA或键)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基中的所有核苷酸糖都是脱氧核糖(例如，所有核苷酸都是DNA)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是具有选自磷酸二酯和磷酸二酯衍生物(例如，氨基磷酸酯、膦酸二酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰乙酸、膦酰甲酸、甲基膦酸酯、硼膦酸酯、O-甲基亚磷酰胺或其组合)的核苷酸间键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含具有选自磷酸二酯和硫代磷酸酯的核苷酸间键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是具有选自磷酸二酯和二硫代磷酸酯的主链键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是包含磷酸二酯主链键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是包含硫代磷酸酯主链键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是包含二硫代磷酸酯主链键的DNA。在实施例中，与其它TLR相比，结合TLR的DNA取代基优先地结合TLR9。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR9。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR3。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR7。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR8。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合细胞亚区室(例如，内体)相关的TLR(例如，TLR3、TLR7、TLR8或TLR9)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是富含G的寡核苷酸。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含CpG基序，其中C和G是核苷酸并且p是连接C和G的磷酸酯。在实施例中，CpG基序是未甲基化的。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是A类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是B类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是C类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基(例如，结合TLR9的DNA取代基)包含具有A、G、C或T碱基和磷酸二酯键和/或磷酸二酯衍生物键(例如，硫代磷酸酯键)的脱氧核糖核酸。
短语“CpG基序”是指通过磷酸二酯核苷酸间键或磷酸二酯衍生物核苷酸间键与3'G核苷酸连接的5'C核苷酸。在实施例中，CpG基序包含磷酸二酯核苷酸间键。在实施例中，CpG基序包含磷酸二酯衍生物核苷酸间键。
如本文所使用的，术语“A类CpG ODN(Class A CpG ODN)”或“A类CpG ODN(A-classCpG ODN)”或“D型CpG ODN”或“A类CpG DNA序列”根据其在生物学和化学科学中的共同含义使用并且指代以下：包含寡脱氧核苷酸的CpG基序，所述寡脱氧核苷酸包含在5'、3'或两端处的一或多个poly-G序列；包含CpG基序的内部回文序列；或者连接脱氧核苷酸的一或多种磷酸二酯衍生物。在实施例中，A类CpG ODN包含在5'、3'或两端处的poly-G序列；包含CpG基序的内部回文序列；以及连接脱氧核苷酸的一或多种磷酸二酯衍生物。在实施例中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。A类CpG ODN的实例包含ODN D19、ODN 1585、ODN 2216和ODN 2336。
术语“B类CpG ODN(Class B CpG ODN)”或“B类CpG ODN(B-class CpG ODN)”或“K型CpG ODN”或“B类CpG DNA序列”根据其在生物学和化学科学中的共同含义使用并且指代以下：包含寡脱氧核苷酸的CpG基序，所述寡脱氧核苷酸包含一或多个包含CpG基序的6聚体基序；连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在实施例中，B类CpG ODN包含6聚体基序的一或多个拷贝，所述6聚体基序包含CpG基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在实施例中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。在实施例中，B类CpG ODN包含一个包含CpG基序的6聚体基序。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的两个拷贝。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的三个拷贝。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的四个拷贝。B类CpG ODN的实例包含ODN 1668、ODN 1826、ODN2006和ODN 2007。
术语“C类CpG ODN(Class C CpG ODN)”或“C类CpG ODN(C-class CpG ODN)”或“C型CpG DNA序列”根据其在生物学和化学科学中的共同含义使用并且指代包含回文序列的寡脱氧核苷酸，所述回文序列包含CpG基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物(硫代磷酸酯)。C类CpG ODN的实例包含ODN 2395和ODN M362。
(IV)任选的另外的组分
靶向部分
可以包含一或多个靶向部分(也称为靶向分子)，例如装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。在实施例中，靶向部分展示在递送媒剂的外表面上。在某些实施例中，此类靶向部分允许特异性细胞靶向(例如，预防有毒治疗剂递送到免疫细胞、富集/靶向具有细胞特异性功能的治疗剂的递送)。在某些实施例中，靶向部分也可以具有治疗活性并且因此也用作本文提供的免疫治疗构建体(例如，PD-L1抗体)的治疗剂。此类靶向部分可能特别有利于全身递送。
示范性靶向分子包含与和器官、组织、细胞或细胞外基质或特定类型的肿瘤或受感染细胞相关的一或多个靶标结合的蛋白质、肽、配体、核酸、脂质、糖类、抗体、适配体、亲和体分子、配体、小分子或多糖。可以通过选择具有适当亲和力和特异性的靶向分子来调节递送媒剂所靶向的特异性程度。例如，抗体是非常特异的。这些可以是多克隆、单克隆片段、重组或单链，其中许多是可商购获得的或者使用标准技术容易地获得的。T细胞特异性分子、抗原和靶向肿瘤的分子可以与免疫治疗构建体的表面结合。靶向分子可以与存在于颗粒表面上的一或多个PEG链的末端缀合。
在一些实施例中，靶向部分是特异性地识别细胞或肿瘤标志物的抗体或其抗原结合片段(例如，单链可变片段)，所述细胞或肿瘤标志物仅或大量存在于靶细胞，如恶性细胞(例如，肿瘤抗原)上。可以用于将免疫治疗构建体引导到所关注的细胞和组织的合适的靶向分子以及将靶分子与纳米颗粒缀合的方法是本领域已知的。参见例如鲁奥斯拉蒂(Ruoslahti)等人(癌症自然评论(Nat.Rev.Cancer),2:83-90,2002)。关于疫苗抗原上文讨论了可以用抗原结合分子(如抗体)靶向的示范性肿瘤抗原。在某些情况下，治疗剂可能对癌症和免疫细胞两者都有毒性，从而导致功效欠佳。因此，在某些实施例中，免疫治疗构建体可以与靶向部分缀合以富集治疗剂和佐剂仅向癌细胞的递送。实例包含针对在癌细胞上表达或任选地在癌细胞上过表达的HER2、EGFR、PSMA、PD-L1等的抗体。在一些实施例中，免疫治疗构建体可以与靶向部分缀合以富集治疗剂和佐剂仅向免疫细胞的递送。
靶向分子还可以包含神经纤毛蛋白和内皮靶向分子、整合素、选择素、粘附分子、靶向骨的分子，如唑来膦酸和阿仑膦酸(例如以靶向转移到骨的癌症)、基质和靶向成纤维细胞的分子。
在一些实施例中，靶向部分将免疫治疗构建体靶向抗原呈递细胞(APC)以及具体地被称为树突细胞的APC亚类。树突细胞表达许多可以介导内吞作用的细胞表面受体。在一些实施例中，免疫治疗构建体增强DC处理肿瘤抗原的活性，并且因此更好地触发原位肿瘤疫苗接种。可以执行到DC的靶向递送。将外源性抗原靶向系统分布的抗原呈递细胞上的内化表面分子可促进颗粒的吸收，并且可以克服疗法中的主要限速步骤。
靶向树突细胞的分子包含识别并结合树突细胞表面上展示的表位的单克隆或多克隆抗体或其片段。靶向树突细胞的分子还包含与树突细胞上的细胞表面受体结合的配体。一种此类受体，即凝集素DEC-205，已经被用于体外和小鼠体内，以将体液(基于抗体)和细胞(CD8 T细胞)应答两者增强2-4个数量级(哈维格(Hawiger)等人,实验医学杂志(J.Exp.Med.),194(6):769-79,2001；博尼法兹(Bonifaz)等人,实验医学杂志,196(12):1627-38 2002；博尼法兹等人,实验医学杂志,199(6):815-24,2004)。在这些报告中，抗原与抗DEC205重链融合，并且使用重组抗体分子进行免疫。
包含甘露糖特异性凝集素(甘露糖受体)和IgG Fc受体的多种其它内吞受体也已经以此方式靶向，其中抗原呈递效率类似地增强。可以靶向的其它合适的受体包含DC-SIGN、33D1、SIGLEC-H、DCIR、CD11c、热休克蛋白受体和清道夫受体。这些受体的靶向部分可以附着于免疫治疗构建体，以便其优先吸收到表达这些受体的免疫细胞中。实例是甘露糖附着于免疫治疗构建体，以靶向递送到具有高水平甘露糖受体的巨噬细胞和DC。
可能被靶向的其它受体包含toll样受体(TLR)。TLR识别并结合病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP靶向树突细胞表面上的TLR并在内部发出信号，由此潜在地增加DC抗原摄取、成熟和T细胞刺激能力。与颗粒表面缀合或共包封的PAMP包含未甲基化的CpG DNA(细菌)、双链RNA(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、脂阿拉伯甘露聚糖(细菌)、酵母聚糖(酵母)、支原体脂蛋白，如MALP-2(细菌)、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌苷-胞苷)酸(细菌)、脂磷壁酸(细菌)或咪唑并喹啉(合成的)。
可以使用本领域已知的多种方法将靶向分子与递送媒剂共价结合。在优选的实施例中，靶向部分通过聚乙二醇化或生物素-亲和素桥附着于递送媒剂。
CD40激动剂：在特定实施例中，靶向部分靶向CD40。所述部分可以是CD40激动剂。细胞表面分子CD40是肿瘤坏死因子受体超家族的一员并且通过免疫、造血、血管、上皮和其它细胞(包含多种肿瘤细胞)广泛表达。作为癌症疗法的潜在靶标，CD40可以通过免疫激活的间接作用和对肿瘤的直接细胞毒性作用介导肿瘤衰退，从而导致CD40激动剂的“二合一”作用机制。CD40激动剂是本领域已知的并且在旺达黑德(Vonderheide)(临床癌症研究(Clin Cancer Res),13(4):1083-1088,2007)中有综述。示范性激动剂包含重组CD40L(重组人三聚体)、CD-870、893(全人IgG2 mAb)、SGN-40(人源化IgG1)和HCD 122(全人IgG1mAb)。在T细胞介导的免疫的鼠类模型中，可溶性激动性CD40抗体已经被证明可以取代CD4+淋巴细胞提供的T细胞帮助(卡利尔(Khalil)等人,癌症疗法的最新进展(Update CancerTher.)2:61-65,2007)。
整合素配体：在另一个实施例中，靶向部分是整合素的配体。研究表明，整合素在肿瘤细胞表面上过表达，并且因此可以用作区分肿瘤细胞与正常细胞的标志物。某些整合素还通过细胞外途径激活TGF-β。在潜伏的TGF-β从肿瘤细胞中释放出来后，其与肿瘤细胞表面上的整合素结合，从而导致潜伏的TGF-β激活。肿瘤微环境中增加的TGF-β浓度支持免疫抑制并将调节性T细胞募集到肿瘤环境。
RGD肽可以提供双重功能：其不仅是典型的靶向整合素的配体(鲁奥斯拉蒂等人,细胞与发育生物学年度评论(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.),12:697-715,1996)，而且也可以用作免疫危险信号，从而激活APC(阿尔廷切克(Altincicek)等人,生物化学杂志(BiolChem.)390,1303-11,2009)。因此，在优选的实施例中，RGD肽被装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。
识别p53抗原的T细胞受体：在特定实施例中，靶向部分是在人MHC的背景下识别p53抗原的T细胞受体(TCR)。源自细菌、真核或酵母细胞的T细胞受体重组蛋白包含由α、β链或γ/δ链(α/βTCR或γ/ΔTCR)构成的T细胞受体。
IL-15/IL-15Rα：在另一个实施例中，靶向部分是IL-15/IL-15Rα复合物。白介素-15(IL-15)是与IL-2共享某些受体亚基并且因此具有一些重叠的作用机制的细胞因子。IL-15由树突细胞表达，并且为自然杀伤(NK)细胞的增殖和致敏提供关键信号。因此，IL-15/IL-15Rα复合物可以用于将纳米微粒组合物靶向到例如自然杀伤(NK)细胞。
(V)递送系统
本文提供的免疫治疗构建体的实施例对于用于递送治疗剂和佐剂的递送系统是不可知的。因此，在各个实施例中，递送系统可以使用或基于任何类型的已知或待开发的微粒递送媒剂。这些包含纳米颗粒、富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支链和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、基于脂质的纳米颗粒、脂质复合物、聚合物纳米颗粒、磷酸钙颗粒、铝盐颗粒、多聚复合物、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、玻璃和聚合物微球和纳米球、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、佐剂颗粒(例如，病毒体或其它病毒样颗粒)、银纳米颗粒、碳纳米颗粒、铁纳米颗粒、多孔和无孔二氧化硅纳米颗粒和经修饰的胶束。也可以使用包含若干类材料的混合颗粒。可以使用纳米和微米尺寸的颗粒。颗粒可以具有任何形状、结构和孔隙率。治疗剂、佐剂和任何另外的化合物可以通过任何合适的方式与递送剂包含在一起，例如装载到递送系统中、附着于递送系统的表面、偶联到递送系统、围封在递送系统内或包含在递送系统内。此类药剂可以被包封、共价结合或非共价结合(例如，通过静电、疏水、范得华(van der Waals)或化合物特异性相互作用(如核酸碱基配对、配体-受体、抗体-抗原、生物素-亲和素等))。
在一些实施例中，递送系统包含介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)，如在美国专利公开第US2017/0173169号或第US2017/0172923号中描述的那些纳米颗粒，其中所描述的MSNP特此通过引用并入本文。
在一些实施例中，介孔纳米颗粒(或不同的纳米颗粒)的平均粒径为约5nm到约200nm、约5nm到约90nm、约5nm到约20nm、约30nm到约100nm、约30nm到约80nm、约30nm到约60nm、约40nm到约80nm、约70nm到约90nm、或约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm或约100nm。在一些实施例中，介孔二氧化硅纳米颗粒涂覆有阳离子聚合物或其它化合物。阳离子聚合物可以使用任何合适的方式与纳米颗粒的表面结合。在一些实施例中，阳离子聚合物通过静电相互作用与纳米颗粒结合。阳离子聚合物可以是任何带正电荷的聚合物，如但不限于PEI、聚酰胺-胺、聚(烯丙胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、壳聚糖、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)、聚(L-赖氨酸)、二乙基氨基乙基-葡聚糖、聚-(N-乙基-乙烯吡啶溴化铵)、聚(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙二醇)-共-聚(三甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯氯化物)。其它阳离子聚合物对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在例如由布兰德鲁普(Brandrup)、E.H.伊默古特(E.H.Immergut)和E.A.格拉库(E.A.Grukle)编辑的聚合物手册(Polymer Handbook),第4版,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,2003)中找到。
阳离子聚合物可以是直链的或支链的。在一些实施例中，阳离子聚合物的尺寸的范围可以为约500Da到25kDa并且可以是支链的或直链的。例如，平均尺寸为1.8kDa到10kDa的支链PEI可以装载到纳米颗粒核上。阳离子聚合物与纳米颗粒的比率可以根据期望的结果而变化。阳离子聚合物可以以纳米构建体的1到50wt.％存在，例如5到40wt.％、10到30wt.％、20到30wt.％、5到15wt.％、5到20wt.％、5到25wt.％、5到30wt.％、10到20wt.％、10到25wt.％或25到40wt.％，例如约5wt.％、10wt.％、15wt.％、20wt.％、25wt.％、30wt.％或35wt.％。在一些实施例中，阳离子聚合物以10到20wt.％存在。
在一些实施例中，阳离子聚合物例如与预涂覆在纳米颗粒上或在纳米颗粒上涂覆后的可裂解的二硫键交联。在一些实施例中，在与纳米颗粒(例如，MSNP)结合之后，所附着的阳离子聚合物使用例如DSP(二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯])、DTSSP(3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)和DTBP(二甲基3,3'-二硫代双丙亚氨酸二甲酯)交联。交联可以在溶液中不存在或存在游离阳离子聚合物的情况下发生。在其它实施例中，阳离子聚合物未交联。
稳定剂可以与MSNP(或不同的纳米颗粒)和/或阳离子聚合物例如通过任何合适的方式缀合。在一些实施例中，稳定剂与涂覆在纳米颗粒(例如，MSNP)上的交联阳离子聚合物的胺或其它反应基缀合。示范性稳定剂包含但不限于PEG、葡聚糖、聚唾液酸、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺或其组合。
稳定剂可以具有多个化学反应基，例如用于附着于纳米颗粒、阳离子聚合物和/或其它组分。例如，反应性稳定剂，例如PEG衍生物，可以具有两个亲电子部分，如含有迈克尔(Michael)受体和活化酯两者的马来酰亚胺-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-PEG-NHS)。与本发明的组合物和方法结合使用的稳定剂(例如，PEG)的分子量的范围通常在500Da-40kDa之间，例如2-10kDa。稳定剂可以以纳米构建体的1到50wt.％存在，例如，5到30wt.％、10到20wt.％、10到25wt.％、5到15wt.％、5到20wt.％、5到25wt.％或1到10wt.％，例如约5wt.％、10wt.％、15wt.％、20wt.％、25wt.％、35wt.％、40wt.％或45wt.％。
如本文所使用的，“平均粒径”通常是指颗粒群中颗粒的统计平均粒径(直径)。基本上球形的颗粒的直径可以指代物理或流体动力学直径。非球形颗粒的直径可以优先地指代流体动力学直径。如本文所使用的，非球形颗粒的直径可以指代颗粒表面上两点之间的最大线性距离。平均流体动力学粒径可以使用本领域已知的方法(如动态光散射)测量。
“单分散”和“均匀尺寸分布”在本文中可互换使用并且描述纳米颗粒或微粒的群体，其中所有颗粒的尺寸相同或几乎相同。如本文所使用的，单分散分布是指其中90％的分布位于中值粒径的15％以内、更优选地位于中值粒径的10％以内、最优选地位于中值粒径的5％以内的颗粒分布。
如本文所使用的，“纳米颗粒”通常是指直径为5nm到但不包含1微米，优选地20nm到1微米的颗粒。颗粒可以具有任何形状。具有球形形状的纳米颗粒通常被称为“纳米球”。本公开不限于用于与被配置用于治疗或预防癌症和相关过度增殖性病症的佐剂和治疗剂复合的特定类型或种类的纳米颗粒。
纳米颗粒的实例包含富勒烯(也称为C60、C70、C76、C80、C84)、内嵌金属富勒烯(EMI)(在其富勒烯笼内含有另外的原子、离子或簇)、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯(TNTEME，在碳笼内的三金属氮化物模板中形成的高对称四原子分子簇内嵌体)、单壁和多壁碳纳米管、支链和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚(具有内部金属富勒烯和/或其它内部化学结构的纳米管)、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质颗粒脂质体、脂质复合物、聚合物纳米颗粒、多聚复合物、纳米壳、树枝状大分子、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、佐剂颗粒(例如，病毒体或其它病毒样颗粒)和纤维素纳米颗粒。其它示范性纳米颗粒包含玻璃和聚合物微球和纳米球、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒、碳纳米颗粒和铁纳米颗粒。
在一些实施例中，纳米颗粒是经修饰的胶束。在这些实施例中，经修饰的胶束包含被修饰为含有疏水聚合物嵌段的多元醇聚合物。如本公开中所使用的，术语“疏水聚合物嵌段”表示其本身将是疏水的聚合物的一段。如本文所使用的，术语“胶束”是指分散在液体中的分子的聚集体。呈水溶液形式的典型胶束与和周围溶剂接触的亲水“头部”区形成聚集体，从而将疏水单尾区隔离在胶束中心。在一些实施例中，头部区可以是例如多元醇聚合物的表面区，而尾部区可以是例如多元醇聚合物的疏水聚合物嵌段区。
除了纳米级之外，本发明进一步涵盖使用微米级的颗粒。在使用微粒的情况下，优选的是约1-50微米的相对较小的微粒。为便于讨论，本文所使用的“纳米颗粒”涵盖真正的纳米颗粒(尺寸为1nm到1000nm)、微粒(例如，1微米到50微米)或两者。
纳米颗粒的实例包含例如但不限于顺磁纳米颗粒、超顺磁纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯类材料、无机纳米管、树枝状大分子、具有共价连接的金属螯合物的树枝状大分子、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳、佐剂颗粒(例如，病毒体或其它病毒样颗粒)和量子点。在一些实施例中，纳米颗粒是金属纳米颗粒(例如，金、钯、铂、银、铜、镍、钴、铱或其两种或更多种的合金的纳米颗粒)。纳米颗粒可以包含核或核和壳，如核壳纳米颗粒一样。也可以使用包含若干类材料的混合颗粒。
公开了包含一或多种活性剂和一或多种佐剂化合物的含有免疫治疗构建体的组合物，所述一或多种活性剂和一或多种佐剂化合物各自装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。与在溶液中将一或多种活性剂递送到靶细胞相比，纳米微粒组合物提供了许多优点。例如，纳米微粒组合物在纳米颗粒上或纳米颗粒中呈现局部浓度的一或多种活性剂，从而在纳米颗粒遇到靶细胞时使亲合力增加。纳米微粒组合物还可以充当具有可调释放动力学的活性剂的贮库，所述释放动力学可以延长数天以延长一或多种药剂的有效全身半衰期和功效。
通常，将两种或更多种活性剂(包含一种治疗剂和一种佐剂)装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。两种或更多种活性剂中的每一种活性剂的相对浓度和其在递送媒剂上或递送媒剂内的位置可以在组合物的制造期间被操纵以适应将被靶细胞接收的优选剂量和呈递。将两种或更多种活性剂装载到同一递送媒剂中或同一递送媒剂上允许将这两种或更多种活性剂同时呈递给靶细胞或同一肿瘤微环境或以其它方面预定的顺序呈递给靶细胞。
递送媒剂可以是例如纳米脂质凝胶、聚合物颗粒、二氧化硅颗粒、脂质体或多层囊泡。在某些实施例中，微粒递送媒剂是纳米级组合物，例如10nm到但不包含1微米。然而，应当理解，在一些实施例中并且对于一些用途，颗粒可以更小或更大(例如，微粒等)。尽管本文公开的示例免疫治疗构建体可以被称为纳米颗粒组合物，但应理解，在一些实施例中并且对于一些用途，微粒组合物可以稍大于纳米颗粒。例如，微粒组合物也可以介于1微米到1000微米之间。此类组合物可以被称为微粒组合物。
在治疗癌症的实施例中，期望颗粒具有适合于进入肿瘤微环境的尺寸。在特定实施例中，颗粒的尺寸适合于通过增强的渗透性和滞留(EPR)效应进入肿瘤微环境和/或肿瘤细胞。EPR是指某些尺寸的分子(例如，本文所讨论的微粒组合物)倾向于在肿瘤组织中比在正常组织中累积更多的特性。因此，在用于治疗癌症的组合物中，递送媒剂优选地在25nm到500nm的范围内(包含端值)，更优选地在30nm到300nm的范围内(包含端值)。
纳米脂质凝胶：纳米脂质凝胶是核壳纳米微粒，所述核壳纳米微粒将脂质体和基于聚合物的颗粒两者的优点组合以持续递送活性剂。在这些实施例和应用中的一些中，与常规纳米颗粒组合物相比，纳米脂质凝胶可以表现出增加的装载效率、增加的缓释和改善的大分子和分子组合的治疗功效。
通常，纳米脂质凝胶的外壳保护货物，并提供生物相容性以及用靶向分子进行官能化的表面。外壳将组分包封起来，因此所述组分在期望时(例如，响应于环境条件或刺激)才会暴露出来，从而产生单分散、可重复的颗粒群并介导内化为期望的细胞类型。可以是树枝状大分子或其它聚合物的内核具有与外壳分离和另外的功能。例如，内壳允许药物、疫苗或显像剂的二次沉积；增加具有不同物化特性的组分到颗粒中的装载；允许从颗粒中可调释放内容物；通过破坏内体来增加DNA/RNA、药物和/或蛋白质的胞质可用性，所有这些都会导致增强的药物作用、抗原呈递和转染/沉默。
纳米脂质凝胶具有含有一或多种主分子的聚合物基质核。聚合物基质优选地为水凝胶，如含有一或多个聚(环氧烷烃)片段(如聚乙二醇)和一或多个脂肪族聚酯片段(如聚乳酸)的交联嵌段共聚物。一或多个货物分子分散在聚合物基质内或与聚合物基质共价结合。水凝胶核被脂质体壳包围。
纳米脂质凝胶可以被构造成并入各种活性剂，所述活性剂随后可以以受控方式释放。活性剂可以分散在水凝胶基质内、分散在脂质体壳内、共价附着于脂质体壳以及其组合。可以在纳米脂质凝胶内的这些位置中的每个位置处选择性地并入活性剂。此外，可以独立调整这些位置中的每个位置中的活性剂的释放速率。由于这些位置中的每个位置都具有不同的特性，包含尺寸和疏水性/亲水性，因此在这些位置中的每个位置处独立并入的化学实体在尺寸和组成方面可能会有显著差异。例如，纳米脂质凝胶可以装载有一或多种分散在聚合物基质内的化合物以及与其相关的小分子疏水性药物和佐剂。可以装载的纳米脂质凝胶同时提供持续释放在化学组成和分子量方面差异很大的药剂。
纳米脂质凝胶通常呈球形，其中平均粒径的范围介于50nm与1000nm之间，更优选地介于75nm与300nm之间，最优选地介于90nm与200nm之间。在某些实施例中，纳米脂质凝胶的平均粒径介于100nm与140nm之间。颗粒可以是非球形的。
根据存在于纳米脂质凝胶的脂质体壳中的脂质的性质，可以制备具有正、负或接近中性表面电荷的纳米脂质凝胶。在某些实施例中，纳米脂质凝胶具有接近中性的表面电荷。在某些实施例中，纳米脂质凝胶的ζ电位介于10mV与-10mV之间，更优选地介于5mV与-5mV之间，更优选地介于3mV与-3mV之间，最优选地介于2mV与-2mV之间。
疏水性活性剂(如蛋白质)可以共价连接到纳米脂质凝胶的表面，而亲水性活性剂可以共价连接到纳米脂质凝胶的表面或分散在脂质体壳内。在某些实施离中，脂质体壳包含一或多种聚乙二醇化脂质。在这些情况下，一或多种活性剂可以与存在于脂质体壳表面上的一或多种PEG链的末端缀合。
在另一个实施例中，脂质被修饰以包含亲和素部分，如果期望的话，使生物素化靶向部分、可检测标记或其它活性剂能够与其偶联。
在特定实施例中，一或多种活性剂通过连接基团共价连接到纳米脂质凝胶的表面，所述连接基团响应于外部化学或物理刺激(如环境pH值的变化)而裂解，以在期望的生理位置处触发活性剂的释放。
核：纳米脂质凝胶核由聚合物基质形成。基质可以包含如下文更详细地讨论的一或多种主分子。纳米脂质凝胶核可以进一步包含一或多种活性剂。活性剂可以与主分子复合，用聚合物基质或其组合分散。
纳米脂质凝胶的聚合物基质可以由一或多种聚合物或共聚物形成。通过改变聚合物基质的组成和形态，可以实现多种控释特性，从而允许在延长的时间段内递送中等恒定剂量的一或多种活性剂。
聚合物基质可以由不可生物降解的或可生物降解的聚合物形成；然而，优选地，聚合物基质是可生物降解的。聚合物基质可以被选择成在范围为从一天到一年、更优选地七天到26周、更优选地七天到20周、最优选地七天到16周的时间段内降解。可生物降解的交联剂可以用于增加聚合物的分子量，所述聚合物在交联剂降解后可作为小片段从体内清除。
通常，合成聚合物是优选的，尽管可以使用天然聚合物。代表性聚合物包含：聚(羟基酸)，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)；聚羟基链烷酸酯，如聚3-羟基丁酸酯或聚4-羟基丁酸酯；聚己内酯；聚(原酸酯)；聚酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚(乙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯，如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包含合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酰胺酯；其它生物相容性聚酯；聚(二噁烷酮)；聚(亚烷基烷基化物)；亲水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸酯；聚羟基戊酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸酯；聚(马来酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；聚(环氧烷烃)，如聚乙二醇(PEG)；衍生化纤维素，如烷基纤维素(例如，甲基纤维素)、羟烷基纤维素(例如，羟丙基纤维素)、纤维素醚、纤维素酯、硝酸纤维素、丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸或其共聚物或衍生物，包含酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)(在本文中统称为“聚丙烯酸”)以及其衍生物、共聚物和共混物。
如本文所使用的，“衍生物”包含对本领域技术人员常规制备的上述聚合物主链具有取代、添加化学基团和其它修饰的聚合物。天然聚合物，包含蛋白质，如白蛋白、胶原蛋白、明胶、醇溶蛋白(如玉米醇溶蛋白)和多糖(如海藻酸和果胶)，也可以并入到聚合物基质中。虽然多种聚合物可以用于形成聚合物基质，但所得聚合物基质通常将是水凝胶。在某些情况下，当聚合物基质含有天然聚合物时，天然聚合物是通过水解降解的生物聚合物，如聚羟基链烷酸酯。
聚合物基质可以任选地含有一或多种可交联聚合物。优选地，可交联聚合物含有一或多个可光聚合基团，从而允许在纳米脂质凝胶形成之后交联聚合物基质。合适的可光聚合基团的实例包含乙烯基、丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基和丙烯酰胺基。当存在时，可光聚合基团可以被并入到可交联聚合物的主链内、可交联聚合物的一或多个侧链内、可交联聚合物的一或多个末端处或其组合。
聚合物基质可以由具有多种分子量的聚合物形成，以便形成具有包含药物释放速率在内的对特定应用最佳的特性的纳米脂质凝胶。通常，构成聚合物基质的聚合物的平均分子量的范围介于500Da与50kDa之间。在聚合物基质由不可交联聚合物形成的情况下，聚合物的平均分子量的范围通常介于1kDa与50kDa之间，更优选地介于1kDa与70kDa之间，最优选地介于5kDa与50kDa之间。在聚合物基质由可交联聚合物形成的情况下，聚合物的较低平均分子量的范围通常介于500Da与25kDa之间，更优选地介于1kDa与10kDa之间，最优选地介于3kDa与6kDa之间。在特定实施例中，聚合物基质由平均分子量为5kDa的可交联聚合物形成。
在一些实施例中，聚合物基质由聚(环氧烷烃)聚合物或含有一或多个聚(环氧烷烃)片段的嵌段共聚物形成。聚(环氧烷烃)聚合物或聚(环氧烷烃)聚合物片段可以含有8到500个重复单元，更优选地40到300个重复单元，最优选地50到150个重复单元。合适的聚(环氧烷烃)包含聚乙二醇(也称为聚氧乙烯或PEG)、聚丙烯1,2-乙二醇、聚(环氧丙烷)、聚丙烯1,3-乙二醇以及其共聚物。
在一些实施例中，聚合物基质由脂肪族聚酯或含有一或多个脂肪族聚酯片段的嵌段共聚物形成。优选地，聚酯或聚酯片段是聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)PGA或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
在一些实施例中，聚合物基质由含有一或多个聚(环氧烷烃)片段、一或多个脂肪族聚酯片段以及任选地一或多个可光聚合基团的嵌段共聚物形成。在这些情况下，所述一或多个聚(环氧烷烃)片段使聚合物具有必要的亲水性，使得所得聚合物基质形成合适的水凝胶，而聚酯片段提供具有可调疏水性/亲水性和/或期望的体内降解特性的聚合物基质。
聚酯片段的降解速率以及通常是对应的药物释放速率可以从几天(在纯PGA的情况下)到几个月(在纯PLA的情况下)不等，并且可以通过改变聚酯片段中PLA与PGA的比率容易地操纵。此外，如PEG等聚(环氧烷烃)和如PGA、PLA和PLGA等脂肪族聚酯已经被证实可以安全用于人类；这些材料已经在包含药物递送系统的人体临床应用中使用超过30年。
在某些实施例中，聚合物基质由三嵌段共聚物形成，所述三嵌段共聚物含有中心聚(环氧烷烃)片段、附着于中心聚(环氧烷烃)片段的任一端的相邻脂肪族聚酯片段以及一或多个可光聚合基团。优选地，中心聚(环氧烷烃)片段是PEG，并且脂肪族聚酯片段是PGA、PLA或PLGA。
通常，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量大于相邻聚酯片段的平均分子量。在某些实施例中，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量是相邻聚酯片段之一的平均分子量的至少三倍，更优选地是相邻聚酯片段之一的平均分子量的至少五倍，最优选地是相邻聚酯片段之一的平均分子量的至少十倍。
在一些情况下，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量的范围介于500Da与10,000Da之间，更优选地介于1,000Da与7,000Da之间，最优选地介于2,500Da与5,000Da之间。在特定实施例中，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量为4,000Da。通常，每个相邻聚酯片段的平均分子量的范围介于100Da与3,500Da之间，更优选地介于100Da与1,000Da之间，最优选地介于100Da与500Da之间。
天然聚合物的实例包含蛋白质，如白蛋白、胶原蛋白、明胶和醇溶谷蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)以及多糖(如海藻酸)、纤维素衍生物和聚羟基链烷酸酯(例如，聚羟基丁酸酯)。在生产期间，可以通过使用如与聚乙二醇(PEG)共聚的聚(丙交酯-共-乙交酯)等聚合物来调整微粒在体内的稳定性。如果PEG暴露在外表面上，由于PEG的亲水性，其可能会增加这些材料循环的时间。
不可生物降解的聚合物的实例包含乙烯醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物以及其混合物。
基质也可以由凝胶型聚合物，如通过传统的离子胶凝技术生产的海藻酸制备。聚合物首先溶解在水溶液中，与硫酸钡或一些生物活性剂混合，并且然后通过液滴形成装置挤出，在一些情况下，所述液滴形成装置采用氮气流来中断液滴。缓慢搅拌(例如，100-170RPM)的离子硬化浴位于挤出装置下方以捕获形成的微滴。使微粒在浴中温育二十到三十分钟，以允许有足够的时间发生胶凝。通过使用各种尺寸的挤出机或改变氮气或聚合物溶液的流速来控制微粒尺寸。壳聚糖微粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并与三聚磷酸盐交联来制备。羧甲基纤维素(CMC)微粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并用铅离子沉淀微粒来制备。在带负电荷的聚合物(例如，海藻酸、CMC)的情况下，不同分子量的带正电荷的配体(例如，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)可以离子连接。
也许最广泛使用的是脂肪族聚酯，具体地是疏水性聚(乳酸)(PLA)、更亲水性聚(乙醇酸)PGA以及其共聚物、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。这些聚合物的降解速率以及通常是对应的药物释放速率可以从几天(PGA)到几个月(PLA)不等，并且通过改变PLA与PGA的比率容易地操纵。其次，PLGA以及其均聚物PGA和PLA的生理相容性已经被证实可安全用于人类；这些材料在包含药物递送系统在内的各种人类临床应用中已有30多年的历史。PLGA纳米颗粒可以以通过被动或主动靶向改善药物的药代动力学和靶组织的生物分布的多种方式调配。微粒被设计成在数天到数周时间段内释放待包封或附着的分子。影响释放持续时间的因素包含周围介质的pH值(由于PLGA的酸催化水解，pH 5及以下的释放速率更高)和聚合物组成。脂肪族聚酯的疏水性不同，并且所述疏水性进而影响降解速率。具体而言，疏水性聚(乳酸)(PLA)、更亲水性聚(乙醇酸)PGA以及其共聚物、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)具有不同的释放速率。这些聚合物的降解速率以及通常是对应的药物释放速率可以从几天(PGA)到几个月(PLA)不等，并且通过改变PLA与PGA的比率容易地操纵。
壳组分：纳米脂质凝胶包含由一或多个同心脂质单层或脂质双层构成的脂质体壳。壳可以进一步包含一或多种活性剂、靶向分子或其组合。
纳米脂质凝胶包含由一或多个同心脂质单层或脂质双层构成的脂质体壳。脂质体壳的组成可以变化以影响一或多种活性剂在体内的释放速率。如果期望的话，脂质也可以共价交联以改变在体内的药物释放。
脂质壳可以由单个脂质双层(单层)或若干同心脂质双层(多层)形成。脂质壳可以由单一脂质形成；然而，在优选的实施例中，脂质壳由多于一种脂质的组合形成。脂质在生理pH值下可以是中性、阴离子或阳离子的。
合适的中性和阴离子脂质包含固醇和脂质，如胆固醇、磷脂、溶血脂、溶血磷脂和鞘脂。中性和阴离子脂质包含：磷脂酰胆碱(PC)(如鸡蛋PC、大豆PC)，包含1,2-二酰基-丙三基-3-磷酸胆碱；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇(PI)；糖脂；磷酸鞘酯，如鞘磷脂；神经鞘糖脂类(也称为1-神经酰胺基糖苷)，如神经酰胺半乳糖苷、神经节苷脂和脑苷脂；脂肪酸、含有羧酸基的固醇，如胆固醇或其衍生物；以及1,2-二酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺，包含1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺或1,2-二油酰基甘油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。也适合的是这些脂质的天然(例如，组织源性L-α-磷脂酰：蛋黄、心脏、脑、肝脏、大豆)和/或合成的(例如，饱和和不饱和的1,2-二酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱、1-酰基-2-酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱、1,2-二庚酰基-SN-丙三基-3-磷酸胆碱)衍生物。
合适的阳离子脂质包含N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐，也称为TAP脂质，例如甲基硫酸盐。合适的TAP脂质包含DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)和DSTAP(二硬脂酰基-)。其它合适的阳离子脂质包含：二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二酰基氧基-3-三甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N-二甲基胺(DODAP)、1,2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷、二十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-[N--(N',N'-二甲基氨基-乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2,3-二油酰基氧基-N-(2-(精胺甲酰胺基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵基三氟乙酸酯(DOSPA)、β-丙氨酰胆固醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、diC14-脒、N-叔丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基氨基-丙脒、N-(α-三甲基氨基乙酰基)二十二烷基-D-谷氨酸氯化物(TMAG)、二十四癸酰基-N-(三甲基氨基-乙酰基)二乙醇胺氯化物、1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精基)-丙酰胺(DOSPER)和N,N,N',N'-四甲基-,N'-双(2-羟乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁烷二铵碘化物、1-[2-(酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物，如1-[2-(9(Z)-十八癸烯酰基氧基))乙基]-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物(DOTIM)和1-[2-(十六烷酰基氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DPTIM)以及在季胺上含有羟烷基部分的2,3-二烷氧基丙基季铵衍生物，例如1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟基戊基溴化铵(DORIE-Hpe)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、1,2-二棕榈酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)和1,2-二甾基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)。
其它合适的脂质包含上述中性、阴离子和阳离子脂质的聚乙二醇化衍生物。将一或多种聚乙二醇化脂质衍生物并入到脂质壳中可以产生纳米脂质凝胶，所述纳米脂质凝胶在其表面上显示聚乙二醇链。与其表面缺少PEG链的纳米脂质凝胶相比，所得纳米脂质凝胶在体内可以具有更高的稳定性和循环时间。合适的聚乙二醇化脂质的实例包含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，包含DSPE PEG(2000MW)和DSPE PEG(5000MW)、二棕榈酰基-丙三基-琥珀酸酯聚乙二醇(DPGS-PEG)、硬脂酰-聚乙二醇和胆甾醇基-聚乙二醇。
在某些实施例中，脂质壳由多于一种脂质的组合形成。在某些实施例中，脂质壳由至少三种脂质的混合物形成。在特定实施例中，脂质壳由磷脂酰胆碱(PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)和胆固醇的混合物形成。
在一些实施例中，脂质壳由一或多种聚乙二醇化磷脂和一或多种另外的脂质或固醇的混合物形成。在某些情况下，所述一或多种聚乙二醇化脂质与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比的范围为1:1到1:6，更优选地1:2到1:6，最优选地1:3到1:5。在特定实施例中，所述一或多种聚乙二醇化脂质与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比为1:4。
在一些实施例中，脂质壳由一或多种磷脂和一或多种另外的脂质或固醇的混合物形成。在某些情况下，所述一或多种磷脂与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比的范围为1:1到6:1，更优选地2:1到6:1，最优选地3:1到5:1。在特定实施例中，所述一或多种磷脂与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比为4:1。
在优选的实施例中，脂质壳由磷脂(如磷脂酰胆碱(PC))、聚乙二醇化磷脂(如1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG))和胆固醇的混合物形成。在特定实施例中，脂质壳由磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)和胆固醇的混合物以3:1:1的摩尔比形成。
聚合物颗粒：递送媒剂也可以是聚合物颗粒，例如微米或纳米颗粒。颗粒可以是可生物降解的或不可生物降解的。上文关于纳米脂质凝胶的聚合物基质组分讨论了可以用于制造聚合物颗粒的示范性聚合物。
优选的可生物降解的聚合物的实例包含羟基酸(如乳酸和乙醇酸)的聚合物以及与PEG的共聚物、聚酐、聚(原)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、其共混物和共聚物。在优选的实施例中，颗粒由一或多种聚酯构成。
例如，颗粒可以含有以下聚酯中的一或多种：均聚物，所述均聚物包含：乙醇酸单元，本文称为“PGA”；以及乳酸单元，如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D,L-丙交酯，在本文中统称为“PLA”；以及己内酯单元，如聚(ε-己内酯)，在本文中统称为“PCL”；以及共聚物，所述共聚物包含乳酸和乙醇酸单元，如由乳酸:乙醇酸的比率表征的各种形式的聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在本文统称为“PLGA”；以及聚丙烯酸酯及其衍生物。示范性聚合物还包含聚乙二醇(PEG)和上述聚酯的共聚物，如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，在本文中统称为“聚乙二醇化聚合物”。在某些实施例中，PEG区可以与聚合物共价相关以通过可切割接头产生“聚乙二醇化聚合物”。也可以使用海藻酸聚合物。
在一些实施例中，颗粒由PLGA构成。PLGA是一种安全的、经FDA批准的聚合物。PLGA颗粒是有利的，因为其可以保护活性剂(即包封剂)，促进延长释放，并且可以添加靶向部分。
颗粒可以含有一或多种聚合物缀合物，所述一或多种聚合物缀合物含有聚合物与靶向部分、可检测标记或其它活性剂之间的端对端键。例如，经修饰的聚合物可以是PLGA-PEG-膦酸酯。在另一个实例中，颗粒被修饰以包含亲和素部分和生物素化靶向部分、可检测标记或其它可以与其偶联的活性剂。
优选的天然聚合物的实例包含蛋白质，如白蛋白、胶原蛋白、明胶和醇溶谷蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)以及多糖(如海藻酸)、纤维素衍生物和聚羟基链烷酸酯(例如，聚羟基丁酸酯)。在生产期间，可以通过使用如与聚乙二醇(PEG)共聚的聚(丙交酯-共-乙交酯)等聚合物来调整颗粒在体内的稳定性。如果PEG暴露在外表面上，由于PEG的亲水性，其可能会增加这些材料循环的时间。
不可生物降解的聚合物的实例包含乙烯醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物以及其混合物。
纳米脂质凝胶：纳米脂质凝胶是一种结合脂质体和基于聚合物的颗粒两者的优点以持续递送核酸、蛋白质和/或小分子的纳米颗粒。纳米脂质凝胶可以呈球形、盘状、棒或其它具有不同纵横比的几何形状的形式。纳米球可以更大，即微粒。纳米脂质凝胶通常由合成或天然聚合物形成，所述聚合物能够通过远程装载来包封药剂，并且可以调节特性以促进不同的释放速率。释放速率通过改变聚合物与脂质的比率(从0.05到5.0，更优选地从0.5到1.5)来调节。
纳米脂质凝胶被设计成在形成之前、期间或之后装载有药剂，并且随后充当药剂的控释媒剂。纳米脂质凝胶可以装载有多于一种药剂，使得随后实现多种药剂的控释。
纳米脂质凝胶在形成期间和/或在形成之后通过在存在药剂的情况下纳米脂质凝胶的再水合过程而装载有一或多种治疗剂和/或佐剂。例如，纳米脂质凝胶装载有用作佐剂的分子，并且纳米脂质凝胶此后在形成后并入一或多种抗癌剂，以与抗癌剂一起递送和释放佐剂。
聚合物纳米颗粒
乳化法：在一些实施例中，使用乳化溶剂蒸发方法制备聚合物纳米颗粒。例如，将聚合物材料溶解在与水不混溶的有机溶剂中并与药物溶液或药物溶液的组合混合。与水不混溶的有机溶剂可以是以下中的一或多种：氯仿、二氯甲烷和酰基乙酸酯。所述药剂可以溶解在以下中的一或多种中：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈和二甲基亚砜(DMSO)。然后将水溶液添加到所得混合物溶液中以通过乳化产生乳化溶液。乳化技术可以是探针超声处理或通过均质器均质化。肽或荧光团或药物可以与颗粒的聚合物基质的表面相关、包封在颗粒的聚合物基质中、被颗粒的聚合物基质包围和/或分布在整个颗粒的聚合物基质中。
纳米沉淀法：在另一个实施例中，使用纳米沉淀方法或微流体装置制备聚合物纳米颗粒。聚合物材料在水溶性有机溶剂中与药物或药物组合混合。然后将所得混合物溶液添加到水溶液中以产生纳米颗粒溶液。
示范性制备方法：可以使用多种方法由不同聚合物制造颗粒，所述方法可以基于包含颗粒的聚合物组合物在内的标准进行选择，所述药剂根据本领域已知的方法装载到所述颗粒中或与所述颗粒相关。下文提供了示范性方法。
溶剂蒸发：在此方法中，将聚合物溶解在如二氯甲烷等挥发性有机溶剂中。将(可溶的或分散为细颗粒的)药物添加到溶液中，并将混合物悬浮于含有如聚(乙烯醇)的表面活性剂的水溶液中。搅拌所得乳液，直到大部分有机溶剂蒸发，从而留下固体颗粒。用水洗涤所得颗粒并在冻干机中干燥过夜。通过此方法，可以获得具有不同尺寸(0.5-1000微米)和形态的颗粒。此方法适用于相对稳定的聚合物，如聚酯和聚苯乙烯。
然而，不稳定的聚合物(如聚酐)可能会在制造过程中由于水的存在而降解。对于这些聚合物，在完全无水有机溶剂中进行的以下两种方法更有用。
热熔微胶囊化：在此方法中，聚合物首先熔融，并且然后与固体颗粒混合。将混合物悬浮于不可混溶的溶剂(如硅油)中，并在连续搅拌下加热到高于聚合物熔点5℃。一旦乳液稳定，将其冷却直至聚合物颗粒固化。通过用石油醚倾析洗涤所得颗粒以得到自由流动的粉末。用此方法可以获得尺寸介于0.5与1000微米之间的颗粒。用此技术制备的球体的外表面通常是光滑且致密的。此程序用于制备由聚酯和聚酐制成的颗粒。然而，此方法仅限于分子量介于1,000-50,000之间的聚合物。
溶剂去除：此技术主要设计用于聚酐。在此方法中，将药物分散或溶解在所选聚合物在挥发性有机溶剂(如二氯甲烷)中的溶液中。通过搅拌将此混合物悬浮于有机油(如硅油)中以形成乳液。与溶剂蒸发不同，此方法可以用于由具有高熔点和不同分子量的聚合物制备颗粒。通过此程序，可以获得范围介于1-300微米之间的颗粒。用此技术生产的球体的外部形态高度依赖于所用聚合物的类型。
喷雾干燥：在此方法中，将聚合物溶解在有机溶剂中。将已知量的活性药物悬浮(不溶性药物)或共溶解(可溶性药物)于聚合物溶液中。然后对溶液或分散体进行喷雾干燥。小型喷雾干燥机(步琪(Buchi))的典型加工参数如下：聚合物浓度＝0.04g/mL，入口温度＝-24℃，出口温度＝13-15℃，吸气器设置＝15，泵设置＝10毫升/分钟，喷雾流量＝600Nl/小时，并且喷嘴直径＝0.5mm。获得了范围介于1-10微米之间的微粒，其形态取决于所用聚合物的类型。
水凝胶颗粒：由凝胶型聚合物(如海藻酸)制备的颗粒是通过传统的离子胶凝技术生产的。聚合物首先溶解在水溶液中，与硫酸钡或一些生物活性剂混合，并且然后通过液滴形成装置挤出，在一些情况下，所述液滴形成装置采用氮气流来中断液滴。缓慢搅拌(例如，100-170RPM)的离子硬化浴位于挤出装置下方以捕获形成的微滴。使颗粒在浴中温育二十到三十分钟，以允许有足够的时间发生胶凝。通过使用各种尺寸的挤出机或改变氮气或聚合物溶液的流速来控制颗粒尺寸。壳聚糖颗粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并与三聚磷酸盐交联来制备。羧甲基纤维素(CMC)颗粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并用铅离子沉淀颗粒来制备。在带负电荷的聚合物(例如，海藻酸、CMC)的情况下，不同分子量的带正电荷的配体(例如，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)可以离子连接。
其它递送媒剂
在一些实施例中，递送媒剂是脂质体或脂质纳米颗粒。脂质体通常是由层状相脂质双层构成的球形囊泡。脂质体可以是例如多层囊泡(MLV)、小单层脂质体囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)或螺旋状囊泡。可用于制备所公开的纳米微粒组合物的脂质体、胶束和其它基于脂质的递送媒剂是本领域已知的。参见例如托尔钦林(Torchilin)等人(先进药物递送评论(Adv Drug Delivery Rev),58(14):1532-55,2006)。预计多种脂质体和外泌体可以与本发明一起使用。脂质体可以包含N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基硫酸甲酯铵(DOTAP)或LipofectamineTM。在一些实施例中，可以使用涉及壳聚糖的递送系统，例如在鲁(Lu)等人,(癌细胞(Cancer Cell),18:185-197,2010)中所描述的。在一些实施例中，纳米载剂可以用于向受试者递送miRNA；纳米载剂在例如普拉马尼克(Pramanik)等人,(分子癌症疗法(Mol Cancer Ther)10:1470-1480,2011)中所描述的。
递送媒剂也可以是二氧化硅颗粒。可用于制备所公开的纳米微粒组合物的合适的二氧化硅颗粒也是本领域已知的。参见例如芭布(Barbe)等人,(先进材料(AdvMaterials),16(21):1959-1966,2004)、恩甘切尔德拉库尔等人,(先进功能材料,25:2646-2659,2015)以及阿吉奥(Argyo)等人,(材料化学(Chem.Mater.),26(1):435-451,2014)。例如，在一些实施例中，硅酮纳米颗粒(例如，如在巴拉利(Bharali)等人,美国国家科学院院刊(PNAS),102(32):11539-11544,2005中所描述的)可以用于将佐剂和另一种治疗活性剂递送到细胞。二氧化硅或硅在体内的溶解度为颗粒携带的药剂提供了时间释放的能力。此外，可生物降解的聚合物或可生物还原的交联剂可以用于修饰二氧化硅或硅颗粒以提供时间释放能力。
(VI)药物组合物和施用调配物
本文提供了用于治疗癌症、初癌和其它增殖性疾病的组合物。组合物包含至少两种活性组分/药剂，其中一种是治疗活性剂，所述治疗活性剂(1)引起肿瘤抗原释放和/或(2)调节免疫抑制肿瘤微环境；并且其中另一种是佐剂。如本文所述，活性剂在递送媒剂中递送/与递送媒剂相缔合，所述递送媒剂如脂质体、有机或无机(纳米或微米)颗粒等。
组合物可以直接提供给细胞(如通过使其与细胞接触)或间接提供给细胞(如通过任何生物过程的作用)。例如，组合物可以在生理学上可接受的载剂或媒剂中进行调配并注射到细胞周围的组织或流体中。组合物可以通过简单的扩散、内吞作用或通过任何主动或被动转运机制跨过细胞膜。
当调配成药物组合物时，治疗化合物(如与至少一种治疗剂和至少一种佐剂偶联的递送系统)可以与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。如本文所使用的，短语“药学上可接受的”是指通常认为生理上可耐受的并且在向人或兽医受试者施用时通常不会产生过敏或类似不良反应(如胃不适、头晕等)的分子实体和组合物。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的衍生物”意指在施用于接受者后能够(直接或间接)提供所期望的活性剂或其活性代谢物或残留物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，例如所期望的活性剂的酯。此类衍生物对于本领域技术人员来说是可识别的，无需过度实验。尽管如此，还是要参考伯格(Burger)的药物化学与药物发现(MedicinalChemistry and Drug Discovery)第5版,第1卷：原理与实践(Principles and Practice)的教导。药学上可接受的衍生物包含盐、溶剂化物、酯、氨基甲酸酯和磷酸酯。
虽然可以按原样将组合物用于疗法中，但优选的是，可以在药物调配物中施用所述组合物，例如，与关于预期施用途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载剂混合。因此，一方面，药物组合物或调配物包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载剂相关的至少一种活性组合物或其药学上可接受的衍生物。赋形剂、稀释剂和/或载剂在与调配物的其它成分相容的意义上是“可接受的”，并且不会对其接收者造成重大伤害。
本文公开的任何组合物调配物可以有利地包含任何其它药学上可接受的载剂，包含不会产生超过施用的益处的明显不利的、过敏的或其它不良反应的载体(无论是用于研究、预防性治疗和/或治疗性治疗)。用于治疗用途的示范性药学上可接受的赋形剂、稀释剂和载剂在药学领域中是众所周知的，并且例如在雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)利平科特·威廉姆斯和威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins)(A.R.,格纳罗(Gennaro)编辑,2005)以及雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版,麦克印刷公司(Mack PrintingCompany),1990中所描述的。此外，可以将调配物制备成满足美国食品和药物管理局生物标准办公室(United States FDA Office of Biological Standards)和/或其它相关外国监管机构要求的无菌性、热原性、总体安全性和纯度标准。药物赋形剂、稀释剂和载剂可以关于预期的施用途径和标准药学实践进行选择。
可以在一或多种合适的赋形剂、稀释剂和载剂的帮助下以常规方式呈现此类药物调配物以供使用。药学上可接受的赋形剂有助于或使得有可能形成生物活性材料的剂型，并且包含稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、着色剂和其它成分。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。防腐剂的实例包含苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。如果赋形剂是药学上可接受的，除了执行其期望的功能之外，其在摄入时无毒且耐受良好并且不干扰生物活性材料的吸收。
示范性的通常使用的药学上可接受的载剂包含任何和所有膨胀剂或填充剂、溶剂或共溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，EDTA)、凝胶、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。
示范性缓冲剂包含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
示范性防腐剂包含苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎氯铵、六甲基氯化铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
示范性等渗剂包含多元糖醇，包含三元或更高级糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇或甘露醇。
示范性稳定剂包含有机糖、多元糖醇、聚乙二醇；含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水聚合物或多糖。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”意指当向受试者施用以治疗状态、病症或病状时足以影响此类状态、病症或病状的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。精确剂量和调配物将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如，利伯曼(Lieberman),医药剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷,1992)；劳埃德(Lloyd),医药学配混的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)(1999)；雷明顿：药学的科学与实践,第20版,编辑格纳罗,(2003)；以及皮卡尔(Pickar),剂量计算(Dosage Calculations)(1999))。在某些情况下，“治疗有效量”用于意指足以调节(例如，增加或降低)期望活性例如10％、50％或90％的量或剂量。通常，在涉及一或多种治疗剂的治疗方案之后，治疗有效量足以引起宿主中的临床显著病状的改善。如本文所讨论的，活性成分的浓度或量取决于期望的剂量和施用方案。
向特定受试者施用的实际剂量可以由医生、兽医或研究人员在考虑如身体、生理和心理因素(包含靶标、体重、癌症阶段、癌症类型、既往或同时进行的治疗干预、受试者的自发病和施用途径)等参数的情况下确定。
用于此用途的有效量将取决于疾病的严重程度及其部位，特别是当涉及转移部位时，以及正在治疗的患者的体重和一般状态。通常，免疫治疗构建体的剂量范围为每天0.01mg/kg到100mg/kg宿主体重，其中更常用的剂量为每天0.1mg/kg到10mg/kg，例如剂量为3-7mg/kg。可以根据需要调整长期时间段内的维持剂量。然而，这些剂量可以根据患者的要求、所治疗的病状的严重程度以及所使用的化合物而变化。例如，可以根据在特定患者中诊断出的癌症的类型和阶段来凭经验确定剂量。在本发明的上下文中，施用给患者的剂量应足以随时间推移在患者中实现有益的治疗应答。剂量的大小也将由在特定患者中伴随特定载体或经转导的细胞类型的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。针对特定情况确定适当剂量在从业者的技能内。通常，以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量以小增量增加，直到达到在多种情况下的最佳效果。为了方便起见，可以将每日总剂量分成几份，并根据需要在一天中分批施用。
所选剂量可能受期望的治疗效果、施用途径、期望的治疗持续时间和所采用的特定免疫治疗复合物的影响。通常，免疫治疗构建体可以以每次施用0.001mg/kg到100mg/kg的范围进行施用(例如，每天；或每周2次、3次、4次、5次或更多次；或每月2次、3次、4次、5次或更多次等，如下文更详细地讨论的)。施用途径也可以作为确定剂量的一个考虑因素。例如，在特定实施例中，免疫治疗构建体通过静脉内或解释途径以0.01mg/kg到100mg/kg的范围施用(例如，每天；或每周2次、3次、4次、5次或更多次；或每月2次、3次、4次、5次或更多次等)或通过皮下途径(例如，局部注射到肿瘤中或肿瘤附近或TME中)以0.0001mg/kg到1mg/kg的范围施用(例如，每天；或每周2次、3次、4次、5次或更多次；或每月2、3、4、5次或更多次等)。下文讨论了更多示范性剂量。
合适的剂量范围可以为每天、每周或每月0.01mg/kg到100mg/kg体重。示范性剂量可以包含0.05mg/kg到10.0mg/kg的本文公开的活性化合物(免疫治疗构建体)。每日总剂量可以为每天一到三次施用于受试者的0.05mg/kg到30.0mg/kg的药剂，包含使用60分钟口服、静脉内或其它给药的药物施用形式施用0.05-3.0、0.1-3.0、0.5-3.0、1.0-3.0、1.5-3.0、2.0-3.0、2.5-3.0和0.5-3.0mg/kg/天的总日剂量。在一个特定实例中，剂量可以以QD或BID施用于受试者，例如总日剂量为1.5mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg或7.5mg/kg的具有高达92-98％wt/v的本文公开的化合物的组合物。
另外的有用剂量通常可在0.1到5μg/kg或0.5到1μg/kg的范围内。在其它实例中，剂量可以包含1μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、200μg/kg、0.1到5mg/kg或0.5到1mg/kg。在其它实例中，剂量可以包含1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、200mg/kg、400mg/kg、450mg/kg或更多。
本公开的治疗材料可以用于严重的疾病状态，即危及生命或潜在危及生命的情况。在此类情况下，主治医生可能并且可以认为期望施用显著过量的这些组合物。
如本领域技术人员将理解的，特定剂量将受活性化合物的药代动力学影响。对于施用，治疗有效量(在本文中也称为剂量)可以基于体外测定和/或动物模型研究的结果初步估计。此类信息可以用于更准确地确定所关注的受试者的有用剂量。有用的临床前测试包含药效学分析、毒性分析等。
治疗有效量可以通过在治疗方案过程期间施用单剂量或多剂量来实现(例如，每小时、每2小时、每3小时、每4小时、每6小时、每9小时、每12小时、每18小时、每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周或每月)。
含有活性剂的化合物的有效量包含部分或完全达到期望治疗、预防和/或生物学效果的剂量。特定应用的实际有效量取决于所治疗的病状和施用途径。用于人的有效量可以根据动物模型确定。例如，可以调配用于人的剂量以实现已发现对动物有效的局部(例如，瘤内)或循环水平。
组合物可以与一或多种麻醉剂一起施用，所述一或多种麻醉剂包含乙醇、布比卡因(bupivacaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、左旋布比卡因(levobupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、普鲁卡因(procaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、丁卡因(tetracaine)、地氟醚(desflurane)、异氟醚(isoflurane)、氯胺酮(ketamine)、丙泊酚(propofol)、七氟醚(sevoflurane)、可待因(codeine)、芬太尼(fentanyl)、氢吗啡酮(hydromorphone)、麻卡因(marcaine)、度冷丁(meperidine)、美沙酮(methadone)、吗啡(morphine)、羟考酮(oxycodone)、瑞芬太尼(remifentanil)、舒芬太尼(sufentanil)、布托啡诺(butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)、曲马多(tramadol)、苯佐卡因(benzocaine)、地布卡因(dibucaine)、氯乙烷(ethyl chloride)、利多卡因(xylocaine)和/或非那吡啶(phenazopyridine)。
在包含治疗或预防癌症(包含例如癌症转移)的特定实施例中，本文公开的组合物可以与其它癌症治疗(如化学治疗剂、放射疗法和/或免疫疗法)结合使用。本文所述的组合物可以在选定的时间窗内，例如在10分钟、1小时、3小时、10小时、15小时、24小时或48小时的时间窗内或当补充治疗在临床相关的治疗窗内时与另一治疗同时或顺序施用。
药物组合物可以通过肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、通过滴注或以调配成适合于每种施用途径的剂型的贮库施用。
在一些实施例中，以将组合物递送到靶向细胞的有效量全身性地施用组合物，例如通过静脉内或腹膜内施用。其它途径包含滴注或粘膜。
在某些实施例中，组合物是局部施用的，例如通过直接注射到待治疗的部位中。在一些实施例中，将组合物注射或以其它方式直接施用于一或多个肿瘤或患病组织。通常，局部注射使组合物的局部浓度增加，所述浓度大于全身施用所能达到的浓度。在一些实施例中，通过使用导管或注射器将组合物局部递送到合适的细胞。将此类组合物局部递送到细胞的其它方式包含使用输注泵或将组合物并入到聚合物植入物中，这可以实现组合物向植入物的紧邻区的持续释放。
举例来说，在某些实施例中，局部给予免疫治疗构建体，例如给予容易接近的肿瘤，如黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌和淋巴瘤；或全身性地用于其它癌症，如肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和转移癌。
因此，本文所述的治疗组合物可以通过多种途径施用(自身或作为组合疗法的一部分)，所述途径包含用于人或兽医学的任何方便的方式。治疗有效量的期望活性剂可以调配成药物组合物，以通过胃肠外、经粘膜(例如，经口、经鼻或经直肠)或经皮引入。在一些实施例中，施用是肠胃外的，例如通过静脉内注射或小动脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。施用可以作为团注或在一定时间段内通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径连续输注。在某些实施例中，允许局部递送到非皮肤肿瘤的植入系统也可以用于递送本文提供的免疫治疗构建体，例如肝动脉输注泵、对流增强递送。在某些实施例中，例如那些涉及影响关节的炎性病状的治疗的实施例，可以通过优选地用注射器注射将药物组合物直接施用于滑膜、滑液或关节囊。施用可以是局部的或全身的；所述选择可能受所治疗的病状以及所施用的活性剂和组合物的影响。
对于注射，组合物可以制成水溶液，如在缓冲液中，例如汉克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水。溶液可以含有调配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，组合物可以呈冻干和/或粉末形式，以在使用之前用合适的媒剂(例如，无菌无热原水)构建。
包含免疫治疗构建体的组合物可以在水溶液中通过肠胃外注射施用。可注射调配物也可以呈悬浮液或乳液的形式并且任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。此类可注射组合物可以包含稀释剂，如无菌水、各种缓冲内含物(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲生理盐水；以及任选地添加剂，如洗涤剂和增溶剂(例如，TWEENTM 20、TWEENTM 80也称为聚山梨醇酯20或80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)。非水溶剂或媒剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油和玉米油等植物油、明胶以及如油酸乙酯等可注射有机酯。用于注射的调配物可以例如在即将使用前被冻干并重新悬浮。可注射调配物可以通过例如通过细菌保留过滤器过滤、通过将灭菌剂并入到组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物来灭菌。
在其它实施例中，包含免疫治疗构建体的组合物被局部或通过滴注施用。局部施用可以包含应用于肺、鼻、口腔(舌下、颊)、阴道或直肠粘膜。这些施用方法可以通过用粘膜转运元件调配递送媒剂的壳或涂层而变得有效。组合物可以在吸入的同时被递送到肺，并且当作为气溶胶或空气动力学直径小于5微米的喷雾干燥的颗粒递送时横跨肺上皮层到达血流。
可以使用多种被设计用于经肺部递送治疗产品的机械装置，包含但不限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。
用于施用于粘膜的调配物通常是可以并入到片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳液中的喷雾干燥的药物颗粒。标准药用赋形剂可以从任何调配师处获得。
也可以制备透皮调配物。这些通常是软膏、乳液、喷雾剂或贴剂，所有这些都可以使用标准技术来制备。透皮调配物可以包含渗透促进剂。化学促进剂和包含电穿孔和微针的物理方法可以与此方法结合使用。
微针(MN)是一种高度为10-2000μm并且宽度为10-50μm的微米级的针，其可以直接穿透表皮层至真皮组织，疼痛极小或无痛(昊(Hao)等人,生物医学纳米技术杂志(J BiomedNanotechnol),13(12):1581-1597,2017)。可以使用若干种类型的微针。在一些实施例中，基于金属或塑料的微针滚轮可以用于物理地破坏皮肤表面以增强所应用的局部药剂(在此情况下为免疫治疗构建体)的渗透。在一些实施例中，可降解且可溶解的微针可以含有免疫治疗构建体。在施用于皮肤之后，微针可以溶解并释放皮肤层深处的构建体。在一些实施例中，不可降解的微针可以涂覆有免疫治疗构建体，使得其在皮肤层深处递送经涂覆的构建体。微针可以由多种材料制成，包含但不限于聚合物、糖类、多糖、肽、蛋白质、金属、无机化合物等(叶(Ye)等人,先进药物递送评论,127:106-118,2018)。本领域已知的用于微针技术的所有材料和制造方法都适用于增强此免疫治疗构建体的递送。
任何有助于全身或局部递送治疗剂的装置也适用于免疫治疗构建体。例如，肝动脉输注(HAI)泵，即一种将高浓度的细胞毒素剂直接递送到肝转移且全身毒性最小的植入式化疗装置(科恩(Cohen)等人,肿瘤学家(The Oncologist),8(6):553-566,2003)也可以用于递送本文所述的免疫治疗构建体。
(VII)示范性使用方法：
在本文提供的包含至少一种佐剂和至少一种能够诱导抗原释放和/或调节免疫抑制环境(如肿瘤微环境)的治疗活性剂的免疫治疗构建体的情况下，现在已经有治疗和/或预防过度增殖性疾病、病症或病状的方法，所述过度增殖性疾病、病症或病状包含癌症、癌症症状、癌症进展(包含从初癌到癌症)和癌症转移。过度增殖性疾病、病症或病状的具体实例包含癌症。在一些实施例中，癌症可以抑制患有癌症的受试者或个体的免疫系统。在一些实施例中，如本文提供的免疫治疗构建体可以抑制或逆转癌症介导的免疫抑制，并允许免疫识别和清除恶性肿瘤。
如本文所使用的，术语“治疗”或“正在治疗”是指与未经治疗的受试者相比，在经治疗的受试者中发生的癌症的任何改善。此类改善可以是预防癌症恶化或进展(例如，经改善的无进展存活期)。此外，此类改善也可以是癌症或其伴随症状的减少或治愈(例如，肿瘤体积的减小、部分缓解、完全缓解(例如，持续6个月、1年、2年、3年、4年或5年或更长时间)、预防癌症复发或重新恶化、减少转移或减少肿瘤或病变的数量)。应当理解，治疗可能不会对100％待治疗的受试者成功，但与本领域技术人员(例如，医师)所确定的个体已接受的其它治疗相比，所述治疗在某些个体中是成功的。如本文所使用的，术语“预防”是指避免本文所使用的癌症或其伴随综合病症的发作。应当理解，预防是指在未来的某个时间窗内避免癌症的发作。所述时间窗应当优选地从施用本发明意义上的化合物开始并且持续至少1个月、至少6个月、至少9个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年或者甚至持续受试者剩余的生理寿命。应当理解，预防可能不会对100％待治疗的受试者成功，但与本领域技术人员(例如，医师)所确定的个体已接受的其它治疗相比，所述预防在某些个体中是成功的。预防也可以在缓解后癌症复发的背景下进行，例如如通过群体中复发概率的降低所测量的。预防还指消除身体任何部位的癌细胞，所述癌细胞可能以其它方式再生并在以后表现出积极的预后和疾病症状。
所公开的组合物可以用于治疗良性或恶性癌症及其肿瘤。治疗可以直接靶向并杀死癌细胞，通过增加针对癌细胞的免疫应答间接靶向癌细胞；或其组合。
在成熟的动物中，在大多数器官和组织中的细胞再生与细胞死亡之间通常维持平衡。体内各种类型的成熟细胞都有给定的寿命；随着这些细胞死亡，各种类型的干细胞的增殖和分化会产生新的细胞。在正常情况下，新细胞的产生如此调控，以致于任何特定类型的细胞的数量都保持恒定。然而，偶尔会出现不再对正常生长控制机制作出反应的细胞。这些细胞产生的细胞克隆可以扩展到相当大的尺寸，从而产生肿瘤或赘生物。不能无限生长并且不会广泛侵袭周围健康组织的肿瘤是良性的。持续生长并逐渐具有侵袭性的肿瘤是恶性的。术语癌症具体地指代恶性肿瘤。除了不受控制的生长外，恶性肿瘤还表现出转移。在此过程中，一小簇癌细胞从肿瘤中脱落，侵袭血管或淋巴管，并被携带到其它组织，在所述其它组织中继续增殖。以此方式，一个部位处的原发性肿瘤可能在另一个部位处产生继发性肿瘤。
所公开的组合物可以延迟或抑制受试者中肿瘤的生长，减少肿瘤的生长或大小或完全消除肿瘤，抑制或减少肿瘤的转移和/或抑制或减少与肿瘤发展或生长相关的症状。例如，在一些实施例中，组合物降低受试者的肿瘤负荷或者随时间推移减缓或预防肿瘤生长。
恶性肿瘤可以根据肿瘤源自的组织的胚胎起源进行分类。癌是源自内胚层或外胚层组织(如皮肤或内脏器官和腺体的上皮层)的肿瘤。发生频率较低的肉瘤源自于中胚层结缔组织，如骨骼、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病以单细胞形式增殖，而淋巴瘤则倾向于以肿瘤块的形式生长。恶性肿瘤可能会出现在身体的许多器官或组织处，从而形成癌症。
可以用所提供的组合物和方法治疗的癌症类型包含但不限于如多发性骨髓瘤等血管癌以及实体癌，包含骨、膀胱、脑、乳腺、宫颈、结肠、直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃和子宫的腺癌和肉瘤。在一些实施例中，所公开的组合物用于同时治疗多种癌症类型。所述组合物还可用于治疗多个位置处的转移或肿瘤。
施用不仅限于治疗现有肿瘤，而且还可以用于预防或降低个体发展此类疾病的风险(即用于预防性用途)并减少癌症的扩散，例如通过转移。预防性疫苗接种的潜在候选者包含具有发展癌症的高风险的个体，即具有某些类型癌症的个人或家族病史的个体。
在一个实施例中，包含佐剂CpG、针对BRAFV600E的siRNA以杀死导致抗原释放的黑色素瘤和前体细胞(痣中的黑色素细胞)以及针对STAT3的siRNA以缓解免疫抑制环境的免疫治疗构建体可以用于在患有发展黑色素瘤高风险的受试者和黑色素瘤患者中产生适应性免疫。免疫治疗构建体不仅可以预防和治疗黑色素瘤，而且还将为晚期黑色素瘤患者提供外科手术后的后期复发或重新恶化的保护。针对其它基因的siRNA连同靶向剂一起可以并入在纳米颗粒/构建体上或中。
包含全身免疫疗法、化疗和生物化疗的各种治疗方式已经在佐剂设置中进行了测试，但其也造成全身毒性和副作用，所述全身毒性和副作用可以通过使用本文所述的免疫治疗构建体进行局部治疗来克服。在某些实施例中，免疫治疗构建体(例如，含有CpG或另一种佐剂连同化学药物、靶向疗法和/或针对STAT3的siRNA)可以用于在外科手术切除原发性乳腺肿瘤之前通过瘤内注射来治疗辅助设置中的乳腺癌，这将预防癌症的复发和转移，而没有全身药物的毒性。
如本文所使用的，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包含白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示范性癌症包含：淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗抗性、
Figure BDA0003457735980000601
抗性、HER2阳性、阿霉素抗性、他莫苷芬抗性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈或食管)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的实例包含甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛细胞瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓质癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、乳头佩吉特病(Paget's Disease of the Nipple)、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。如本文所使用的，术语“初癌”是指在癌症之前或发展成癌症的病状或生长。如本文所使用的，术语“癌症转移”是指癌细胞或肿瘤从一个器官或身体部位扩散到另一个器官或身体部位。
术语“白血病”是指血液形成器官的渐进性、恶性疾病，并且总体上其特征在于白细胞和其前体在血液和骨髓中的失调增殖和发展。白血病通常在临床上基于以下各项进行分类：(1)疾病的持续时间和特性-急性的或慢性的；(2)所涉及的细胞的类型；脊髓的(骨髓性的)、淋巴的(淋巴性的)或单核细胞的；以及(3)异常细胞在血液中的数量的增加或非增加-白血病性或非白血病性(亚白血病性)。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示范性白血病包含例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞不增多性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯氏白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、血胚细胞白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、成骨髓细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利氏白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、李德尔氏细胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病或未分化型细胞白血病。
术语“肉瘤”通常是指由类似于胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由包埋在纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包含软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯氏肿瘤肉瘤(Wilms'tumorsarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯氏肉瘤(Roussarcoma)、浆液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑色素瘤”应理解为源自皮肤和其它器官的黑色素细胞系统的肿瘤。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的黑色素瘤包含例如肢端雀斑样痣黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈丁-帕西黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，所述上皮细胞倾向于浸润周围组织并引起转移。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示范性癌包含例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺性囊性癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞瘤、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮(carcinoma cutaneum)、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌(carcinomaex ulcere)、纤维癌、胶状癌(gelatiniforni carcinoma)、胶样癌(gelatinouscarcinoma)、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌、许特尔氏细胞癌(Hurthle cellcarcinoma)、玻质状癌(hyaline carcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(Krompecher's carcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌(lipomatous carcinoma)、小叶癌(lobularcarcinoma)、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液质癌(carcinoma mucosum)、粘液样癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨样癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌(carcinomaspongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、块状癌(carcinoma tuberosum)、小管癌(tubular carcinoma)、结节性皮癌(tuberouscarcinoma)、疣状癌或绒毛状癌(carcinoma villosum)。
(VIII)试剂盒
具体地包含至少一种所描述的治疗构建体(包含含有至少一种治疗剂和至少一种佐剂或与至少一种治疗剂和至少一种佐剂相关联的递送媒剂)的活性组分可以以试剂盒的形式提供。试剂盒可以包含一或多个容器，所述一或多个容器包含(含有)一或多种或更多种本文所述的化合物或复合物(例如，抗癌剂)，任选地连同一或多种用于疗法的另外的药剂。例如，一些试剂盒将包含一定量的至少一种另外的抗癌组合物、或一定量的至少一种另外的抗炎剂或两者。
试剂盒中的任何活性组分都可以按预先测量的剂量提供，尽管这不是必需的；并且预计某些试剂盒将包含多于一个剂量。
试剂盒还可以包含由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映了机构针对人类施用在制造、使用或销售方面的许可。所述通知可以声明所提供的活性成分可以施用于受试者。试剂盒可以包含使用试剂盒的进一步说明，例如关于施用的说明；妥善处置相关废物等。说明书可以呈试剂盒内提供的印刷说明书的形式，或者说明书可以印刷在试剂盒本身的一部分上。说明书可以呈表格、小册子、手册、CD-ROM或计算机可读装置的形式，或者可以在远程位置(如网站)处提供对说明书的指导。在特定实施例中，试剂盒还可以包含有效使用试剂盒所需的一些或全部必要的医疗用品，如施涂器、安瓿、海绵、无菌胶带、洗必泰(Chloraprep)、手套等。可以对本文所述的任何试剂盒的内容进行更改。试剂盒的说明书将指导使用包含在所述试剂盒中的活性成分来实现本文所述的临床和/或治疗用途。
本文描述了在所公开的发明的实施例的实践和/或测试中使用的合适的方法、材料和实例。此类方法和材料仅是说明性的并且不旨在是限制性的。可以使用与本文所述的方法、材料和实例类似或等效的其它方法、材料和实例。
将下文示范性实施例和实例包含在内以说明本公开的特定实施例。根据本公开，本领域普通技术人员应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
(IX)示范性实施例：
1.一种免疫治疗构建体，其包含：递送系统；至少一种治疗剂，所述至少一种治疗剂例如装载到所述递送系统中、附着于所述递送系统的表面、偶联到所述递送系统、围封在所述递送系统内或包含在所述递送系统内，其中所述治疗剂引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境；以及至少一种佐剂化合物，所述至少一种佐剂化合物例如附着于所述递送系统的表面、偶联到所述递送系统、围封在所述递送系统内或包含在所述递送系统内，其中所述免疫治疗构建体不包含肿瘤特异性抗原或卵清蛋白。
2.根据实施例1所述的免疫治疗构建体，其中所述递送系统包含脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒、涂覆有聚合物或脂质的无机颗粒或其混合物。
3.根据实施例2所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂是脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒或涂覆有聚合物或脂质的无机颗粒。
4.根据实施例3所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂是无机颗粒并且包含以下中的一或多种：介孔二氧化硅颗粒、金颗粒、铝颗粒、氧化铁颗粒、磷酸钙颗粒或抗氧化剂颗粒。
5.根据实施例4所述的免疫治疗构建体，其中所述无机颗粒包含包括氧化铈的抗氧化剂颗粒。
6.根据实施例4所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂包括介孔二氧化硅颗粒。
7.根据实施例1所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂包含以下中的一或多种：富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支链和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、硅、二氧化硅和聚合物微球和纳米球、二氧化硅壳、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金颗粒、氧化铈颗粒、氧化锌颗粒、银颗粒、铝颗粒、碳颗粒、铁颗粒、氧化铁颗粒、磷酸钙、佐剂颗粒和/或经修饰的胶束。
8.根据实施例1到7中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂是包含PLGA、PLL、聚精氨酸、PEG、PEI或壳聚糖中的一或多种的聚合物颗粒。
9.根据实施例1到8中任一实施例所述的免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体为流体动力学尺寸为5nm到999nm的纳米颗粒。
10.根据实施例1到8中任一实施例所述的免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体为流体动力学尺寸为1微米到1000微米的微粒。
11.根据实施例6所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂包括尺寸为约5-200nm的介孔二氧化硅纳米颗粒。
12.根据实施例11所述的免疫治疗构建体，其中所述介孔二氧化硅纳米颗粒涂覆有交联聚乙烯亚胺和聚乙二醇。
13.根据实施例1到12中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA、DNA、sgRNA(CRISPR-cas9元件)、寡核苷酸、多核苷酸、肽、蛋白质、化学治疗药物、毒素、抗氧化剂、小分子抑制剂、抗体或放射治疗剂。
14.根据实施例13所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA或DNA。
15.根据实施例14所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括siRNA。
16.根据实施例15所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抑制以下的表达或活性的siRNA：STAT3、CD39、CD73、TGF-β、PD-L1、PD1、CTLA4、MIF、PLK1、HIF、NOX1-4、HER2、EGFR、BCL2、AKT1、HIF1-α、NOX1-4、AR、MYC、BRAF、BRAF V600E或MTDH。
17.根据实施例15或16所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抑制STAT3的表达或活性的siRNA。
18.根据实施例15到17中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抑制HER2的活性的表达的siRNA。
19.根据实施例1到12中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂抑制以下的表达或活性：STAT3、CD39、CD73、TGF-β、PD-L1、PD1、CTLA4、MIF、PLK1、HIF、NOX1-4、HER2、EGFR、BCL2、AKT1、HIF1-α、NOX1-4、AR、MYC或MTDH。
20.根据实施例1到19中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述治疗剂是抗癌剂，所述抗癌剂包含以下中的一或多种：抗生素、植物碱、PLK1抑制剂、有丝分裂激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、基于铂的化学治疗剂、HER2小分子抑制剂或HER2特异性抗体。
21.根据实施例20所述的免疫治疗构建体，其中治疗剂是检查点抑制剂，并且所述检查点抑制剂是针对PD-L1、PD1或CTLA4的抗体。
22.根据实施例21所述的免疫治疗构建体，其中所述检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
23.根据实施例1到22中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括PLK1抑制剂。
24.根据实施例23所述的免疫治疗构建体，其中所述PLK1抑制剂是沃拉色替。
25.根据实施例1到24中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括多西他赛、米托蒽醌或卡巴他赛中的一或多种。
26.根据实施例1到25中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抗EGFR抗体，
27.根据实施例26所述的免疫治疗构建体，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
28.根据实施例1到25中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抗HER2抗体。
29.根据实施例28所述的免疫治疗构建体，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
30.根据实施例1到29中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述佐剂具有免疫刺激活性并且包括以下中的一或多种：CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNA TLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNA TLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物。
31.根据实施例1到30中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述佐剂化合物包含CpG寡核苷酸、咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特、poly I:C、poly ICLC、dSLIM或EnanDIM。
32.根据实施例1到31中任一实施例所述的免疫治疗构建体，其中所述佐剂化合物包括CpG寡核苷酸。
33.一种组合物，其包含：根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体以及至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或其混合物。
34.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的受试者施用有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物以减轻癌症的一或多种症状。
35.根据实施例34所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
36.根据实施例35所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
37.一种治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物接触。
38.一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物接触。
39.一种方法，其包括使细胞离体与治疗有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物接触。
40.根据实施例38或39所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
41.根据实施例38或39所述的方法，其中所述细胞不是癌细胞。
42.根据实施例41所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
43.根据实施例38或39所述的方法，其中所述细胞是永生化的。
44.根据实施例37到43中任一实施例所述的方法，其进一步包含将至少一个经治疗的细胞返回施用于受试者。
45.一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状或具有发展此类疾病或病状的高风险的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据实施例33所述的组合物。
46.根据实施例45所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
47.根据实施例46所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
48.根据实施例45到47中任一实施例所述的方法，其中所述过度增殖性疾病或病状包含癌症、初癌或癌症转移中的一或多种。
49.根据实施例45到48所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包含以下中的一或多种：黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、结直肠癌、淋巴瘤、结肠癌或肝癌。
50.根据实施例45到49中任一实施例所述的方法，其中所述施用包含以下中的一或多项：直接注射到所述受试者的肿瘤中；对所述受试者进行全身注射；或局部应用于所述受试者。
51.根据实施例45到50中任一实施例所述的方法，其中所述施用包含对所述受试者进行微针应用。
52.一种增强抗癌疗法在有需要的受试者中的效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物；以及至少一种抗癌剂。
53.根据实施例52所述的方法，其中所述抗癌剂是化学治疗剂或靶向治疗剂。
54.一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者中的检查点阻断免疫疗法效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物；以及至少一种免疫检查点抑制剂。
55.一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者中的放射疗法效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗构建体或根据实施例33所述的组合物；以及至少一种放射疗法。
56.根据实施例52到55中任一实施例所述的方法，其中所述免疫治疗构建体或组合物以及所述抗癌疗法依次或同时施用。
57.根据实施例52到56中任一实施例所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
58.根据实施例57所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
59.一种试剂盒，其包含根据实施例1到32中任一实施例所述的免疫治疗剂以及抗癌剂。
60.根据实施例59所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
(X)实例.
实例1：利用纳米技术将肿瘤工程化成引发全身性抗肿瘤免疫的用于癌症疫苗接种的贮库。
免疫检查点抑制剂(ICI)，如针对PD-L1/PD-1、CTLA-4等的抑制剂，已经在临床上示出了令人印象深刻的结果(沙仑(Sharon)等人,中国癌症研究期刊(Chin J Cancer),33(9):434-44,2014；布赫宾德(Buchbinder)和黛塞(Desai),美国临床肿瘤学杂志(Am JClin Oncol),39(1):98-106,2016)。免疫检查点抑制剂释放患者自身免疫系统的刹车以对抗癌症，从而提供免疫记忆并且即使在治疗停止后也能产生持久的免疫应答。因此，ICI可以在晚期癌症中提供比化疗和靶向疗法可以提供的应答更持久的应答，如图1示出的。然而，所述治疗仅适用于一部分患者(约10-40％)(鲁巴斯(Ribas),癌症治疗学更新(UpdateCancer Therapeutics),2(3):133-139,2007；托帕利安(Topalian)等人,新英格兰医学杂志(N Engl J Med),366(26):第2443-54页,2012)。缺乏应答通常是由于缺乏预先存在的抗肿瘤免疫(例如，针对肿瘤的效应(CD8+)T细胞)(圣塔佩亚(Santarpia)和卡拉查利乌(Karachaliou),癌症生物学与医学(Cancer Biology&Medicine),12(2):74-78,2015；图梅赫(Tumeh)等人,自然,515(7528):568-571,2014)。因此，致敏抗肿瘤CD8+ T细胞库的能力对于免疫疗法至关重要。
原位肿瘤疫苗接种是一种策略，在所述策略中，在存在免疫刺激的情况下，局部杀死肿瘤，从而释放肿瘤抗原，所述抗原共同引发针对肿瘤的全身适应性免疫(皮尔斯(Pierce)等人,人疫苗免疫治疗学(Hum Vaccin Immunother),11(8):1901-9,2015)。此策略具有很大的前景，因为其避免了在常规癌症疫苗开发中预先鉴定肿瘤抗原的需要。这也是一种个性化疗法，因为一组独特的肿瘤抗原被释放并引发针对每位患者的特异性免疫。
本文提供的癌症免疫治疗方法利用患者本身的肿瘤作为个性化肿瘤抗原集的贮库(原位肿瘤疫苗接种)。本文所述的系统的实例被称为AIRISE(增强免疫应答和抑制肿瘤的抑制环境)；当单独使用或与检查点抑制剂一起使用时，AIRISE旨在改善患者的存活期结果(图1)。所提供的颗粒(免疫治疗构建体)携带佐剂(例如，CpG)和一或多种引起抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境的化合物(siRNA、药物、小分子等)(例如，多西他赛、针对STAT3的siRNA)。在肿瘤部位处用所提供的免疫治疗构建体治疗(例如，通过局部瘤内注射或通过全身递送进行肿瘤归巢)之后，在存在免疫刺激(由佐剂提供)的情况下释放肿瘤抗原，从而启动适应性免疫。同时，调节免疫抑制肿瘤微环境的化合物可以在同一个纳米颗粒上共同递送，从而使原位肿瘤疫苗接种效果最大化。肿瘤抗原可以被AIRISE激活的抗原呈递细胞(APC)吸收，所述APC将抗原呈递给原初T细胞。T细胞(针对那些肿瘤抗原)被致敏并激活为效应T细胞(在淋巴结中或在肿瘤部位中)并在全身增殖。效应T细胞将特异性地归巢于在体内任何位置共享相同肿瘤抗原的肿瘤(例如，局部治疗的肿瘤和身体其它部位未经治疗的转移瘤)。被细胞毒性T细胞杀死的癌细胞会释放更多的肿瘤抗原，从而在正反馈循环中放大抗肿瘤T细胞的生成过程。值得注意的是，即使治疗(例如，瘤内注射)是局部的，在肿瘤部位处局部诱导的疫苗接种效应也会产生全身性的、持久的抗肿瘤免疫应答(图2)。例如，AIRISE可以直接注射到黑色素瘤病变中，并且治疗可能会影响经注射的肿瘤以及肺或肝中未经治疗的转移性黑色素瘤肿瘤。
这些被训练以识别特异性肿瘤抗原的抗肿瘤T细胞将控制经注射部位/经处理部位和身体其它部位两者处的肿瘤(图2)。货物组合可以应用于任何类型的微粒/纳米颗粒上以制备AIRISE。以下实例利用已经确立的介孔二氧化硅纳米颗粒(美国专利申请公开2017/0172923)作为概念验证。图11中示出的另一个实例利用流体动力学尺寸为1.1微米的阳离子脂质颗粒进行CpG和siSTAT3的原位疫苗接种，并产生与图7类似的结果，表明可以使用各种类型和大小的颗粒。
方法和材料
纳米颗粒的合成与表征：如前所述，合成了介孔基于二氧化硅的纳米颗粒(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015；恩甘切尔德拉库尔等人,国际纳米医学杂志(International J Nanomed),13:4015-4027,2018)。简而言之，介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)是通过溶胶-凝胶法(sol-gel synthesis)合成的。MSNP核被聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)逐层涂覆。如前所解释的那样，MSNP上的PEI也进行交联，以增强寡核苷酸递送功效和安全性(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)。在此实例中，涂覆有交联PEI和PEG的MSNP此后被称为“NP”。
NP上的货物装载：siRNA和CpG(ODN 1826；SEQ ID NO:7)通过10分钟混合静电装载在纳米颗粒(NP)上，尽管较短时间(2-5分钟)也是有效的。也通过在室温下在水溶液(例如，PBS)中混合4小时来将米托蒽醌装载到NP中。在通过离心分离载有货物的NP之后，如通过上清液中不存在游离货物分子所证实的，以完全结合的方式进行装载。通过分光光度法测量货物含量。siRNA与Dy677染料(达尔马康(Dharmacon))缀合，并且因此通过荧光信号进行定量。用纳米滴分光光度法测量CpG。也可以通过凝胶电泳测量未经结合的siRNA和CpG。在658nm处通过吸光度测量对米托蒽醌(MTX)进行定量。通过Zetasizer对具有CpG和siRNA的最终NP在PBS中的流体动力学尺寸进行表征(图26和29)。
在PEI结合之前，多西他赛被过量装载在纳米颗粒上。简而言之，在PEI结合之前，将MSNP与含多西他赛的乙醇混合过夜。未经结合的多西他赛和PEI在PBS中被洗掉。然后按照先前的方法将PEI-NP(DTX)与PEG缀合(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015；恩甘切尔德拉库尔等人,国际纳米医学杂志,13:4015-4027,2018)。在起始DTX与MSNP质量比为0.2-0.8时，最终产品含有0.5-1.7wt.％的DTX。其DLS尺寸为100nm。
B16F10双侧常位鼠类黑色素瘤肿瘤模型：6周龄雌性C57BL/6小鼠获自查尔斯河NCI菌落(马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington,MA))。每只小鼠在左肩(局部，250,000个细胞)和右肩(远隔，100,000个细胞)上皮内植入B16F10细胞。植入后8天，仅将测试化合物/构建体瘤内注射到左侧(局部)肿瘤，而右侧(远隔)肿瘤不进行处理。除非另有说明，测试化合物/构建体每3天给予3个剂量。每1-2天用游标卡尺测量小鼠中局部肿瘤和远隔肿瘤两者的负荷，并且肿瘤体积按V＝0.5×长度×宽度2进行计算。还监测了存活率。当总肿瘤负荷超过2000mm3时处死小鼠。
对于将NP治疗与免疫检查点抑制剂组合的研究，在同一天(每3天3个剂量)腹膜内给予PD-1Ab(200μg/小鼠)和CTLA-4Ab(100μg/小鼠)的混合物作为NP化合物的瘤内处理。
为了确认治疗功效是免疫介导的，向用测试化合物/构建体处理的小鼠腹膜内注射CD8抗体(200μg/小鼠)，从第一次瘤内处理的前一天开始并在整个研究过程中持续注射。
为了进行免疫分析，按照本领域的既定方案，收集局部和远隔肿瘤以及其相应的引流淋巴结并将其加工到单细胞中。然后用一组不同表面蛋白(例如，CD45、CD8、CD4、CD44、TIM3、PD-1、CD39、LAG3、CD3、CD19、CD11b、CD11c、MHCII、CD80、Ly6C、Ly6G、F4/80、CD206)的荧光标记的抗体对所采集的细胞进行染色，所述表面蛋白共同鉴定不同的免疫细胞群以及其状态。某些细胞内蛋白质(例如，Ki67、FoxP3、STAT3)也可以按照制造商方案(BD生物科学公司(BD Biosciences))进行染色。流式细胞术通常由BD Fortessa(4个激光，多达18个参数)在两个单独的抗体组(淋巴和骨髓)中进行。按照本领域已知的既定方案进行荧光补偿以确保多色流式细胞术分析的稳健性。如前所述，对于肿瘤微环境中的AIRISE摄取研究(图18)，将(装载有Alexa488染料缀合的siSCR而不是siSTAT3的)AIRISE-02瘤内注射到荷双侧B16F10肿瘤的小鼠中。处理后两小时，采集肿瘤(经处理的和未经处理的)，加工到单细胞中，并用本文所述的一组抗体进行表面染色。通过流式细胞术分析肿瘤中的不同细胞群中的AIRISE-02的存在。
LLC-JSP转移性鼠类肺肿瘤模型：将LLC-JSP(200,000个细胞)静脉内(尾静脉)注射到6周龄C57BL/6小鼠。癌细胞注射后三天，将小鼠随机分组并每3天用测试化合物/构建体处理，总共4个剂量。在此模型中，AIRISE-02通过尾静脉而不是瘤内进行静脉内注射。
CT26双侧异位肿瘤模型：将250K和100K CT26(鼠类结直肠癌)细胞植入到每只小鼠(Balb/c)的双侧腹部中。肿瘤植入后15天，用测试化合物/构建体处理小鼠。
4T1双侧常位肿瘤模型：将100K和40K 4T1细胞植入到每只小鼠(Balb/c)的双侧乳腺脂肪垫中。肿瘤植入后8天或11天(如指定)，用测试化合物/构建体处理小鼠。
结果和讨论
装载CpG的纳米颗粒表现出比游离CpG更好的佐剂特性。
向C57BL/6小鼠(n＝3只/组)注射NP上的4μg游离CpG或4μg CpG，注射到小鼠的一个足垫中。注射后二十四小时，采集局部引流淋巴结(DLN)和非引流淋巴结(NDLN)，并通过流式细胞术分析CD11c、MHCII和CD80表达。装载CpG的纳米颗粒在局部DLN中激活树突细胞显著优于游离CpG(图3)。CpG纳米颗粒还具有将若干种治疗货物共同递送到同一部位的额外的潜力。另外，示范性纳米颗粒针对siRNA的递送进行高度优化，所述siRNA可以在mRNA水平下调节肿瘤的免疫抑制特性。建议将CpG(或另一种佐剂)与siRNA或解决肿瘤免疫抑制的若干标志的其它靶向分子共同递送，以有益地引发免疫治疗效果。
装载佐剂的纳米颗粒触发原位肿瘤疫苗接种
为了评估CpG-NP触发原位肿瘤疫苗接种的能力，使用了荷两个(双侧)黑色素瘤的小鼠。处理是对两个肿瘤中的仅一个肿瘤进行瘤内注射，而另一个肿瘤不进行处理。监测两个肿瘤的生长；CpG-NP的瘤内处理成功地引发全身免疫应答并诱导强烈的异位效应——对局部经处理的和远隔未经处理的肿瘤两者的抑制(图4)。因此，存活期也延长了。本文所述的免疫治疗构建体技术触发原位疫苗接种，因此不需要将肿瘤抗原装载到任何复合物上或装载到任何复合物中。
药物和CpG在相同NP上的共同递送可以诱导有效的原位肿瘤疫苗接种
尚未广泛探索瘤内注射化学治疗药物以触发原位肿瘤疫苗接种。事实上，瘤内注射含有化学治疗药物和佐剂的纳米颗粒以前从未进行过。这是由于化学治疗药物对免疫细胞的潜在毒性可能否定任何激活的免疫治疗应答。
令人惊讶的是，同一纳米颗粒上的化学治疗药物多西他赛(DTX)和CpG(CpG-DTX-NP)的共同递送并未恶化CpG-NP的原位疫苗接种效果，尽管潜在化疗对免疫细胞具有毒性(图5)。事实上，CpG-DTX-NP可以比CpG-NP更好地控制局部经处理的肿瘤。同时，CpG-DTX-NP诱导原位疫苗接种效果仍略优于CpG-NP，如远隔肿瘤的控制和小鼠存活期的延长所示出的。此外，DTX-NP没有示出任何显著的活性。
另一种化学治疗药物米托蒽醌(MTX)和CpG在同一纳米颗粒上的共同递送也触发了CpG-NP的原位疫苗接种效果(图16)。
免疫细胞分析示出了肿瘤和淋巴结中激活的CD8+ T细胞的显著增加。
处理后(图5A)，在第一次给药后第7天在局部和远隔肿瘤中表征了T细胞状态。与生理盐水相比，用CpG-DTX-NP(在图6中简称为“NP”)处理导致细胞毒性CD8+ T细胞的期望特性如下：PD1(图6A)在经处理的肿瘤和远隔肿瘤两者中的表达较低，在经处理的肿瘤中的CD8+ T细胞的增殖较高(图6B)，在经处理的肿瘤中的CD8+ T细胞的耗竭较少(图6C)，并且CD8+ T细胞的比率比调节性T细胞的比率较高(图6D)。同样，在经处理的肿瘤的引流淋巴结(DLN)中可以看到更高的CD8+ T细胞(图6E)，其也被更多地激活(图6F)。经激活的CD8+ T细胞在两种肿瘤的DLN中增殖性(通过Ki67标志物)更强(图6G)。在非DLN中观察到更多增殖和激活的CD8+ T细胞(图6H)，表明T细胞被转运到局部淋巴结外(例如，在血液中)，从而促进治疗的异位效应。这些T细胞特性表明本文所述的纳米颗粒可以增加有益的抗肿瘤T细胞库(非耗竭状态)，从而产生全身免疫。虽然NP上的DTX杀死了肿瘤细胞以释放肿瘤抗原，但其并没有伤害CD8+ T细胞，而是增加了增殖。
siRNA和CpG在相同NP上的共同递送可以诱导有效的原位肿瘤疫苗接种
这是首次使用单个NP通过瘤内注射共同递送佐剂和siRNA。虽然之前已经通过纳米颗粒递送免疫原性化学治疗药物、肿瘤抗原或佐剂，但siRNA从未与纳米颗粒上的佐剂共同递送。
CpG寡核苷酸和siSTAT3在黑色素瘤小鼠模型中对NP诱导的全身抗肿瘤免疫应答的瘤内共同递送：
将siSTAT3(2wt％)装载在NP的介孔二氧化硅核中，而将CpG寡核苷酸(10wt.％)装载在外表面上(与阳离子聚合物层结合，但在PEG下受到保护以防止酶促降解)。提出肿瘤抗原(已经存在于肿瘤中或在治疗后因癌症死亡而释放)将在存在免疫刺激的情况下通过CpG引发抗肿瘤免疫。siSTAT3调节免疫抑制肿瘤环境，从而放大免疫治疗应答。为了证明这一点，在小鼠的双侧B16F10黑色素瘤肿瘤模型中评估了siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02)(图7A)。在肿瘤植入后8天，将AIRISE-02注射到所述肿瘤中的一个肿瘤(局部)中，总共三个剂量，间隔3天。AIRISE-02显著提高了小鼠的存活率(图7D)，减少了局部(经处理的，图7B)和远隔(未经处理的，图7C)肿瘤，表明了成功的原位肿瘤疫苗接种和治疗的异位效应(在经治疗/经注射部位之外的部位中的效应)。图7B-7C还示出siSTAT3-CpG-NP优于CpG-NP和siSTAT3-NP。
在单独的实验中，以与图7相同的方式用AIRISE-02(siSTAT3-CpG-NP)处理小鼠。第三次给药后一天(或第一次给药后7天)处死小鼠。收集肿瘤和相关的引流淋巴结(DLN)并用多色流式细胞术进行免疫分析。图17示出AIRISE-02在局部(经处理)和远隔(未经处理)肿瘤和相关DLN两者中导致显著更高的CD8/Treg比率(AIRISE-02相对于生理盐水，p<0.05)，证实了成功的原位肿瘤疫苗接种。调节性T细胞(Treg)通常在患者肿瘤中升高并抑制抗肿瘤免疫应答，包含CD8+ T细胞活性。因此，较高的瘤内CD8/Treg比率是期望的，并且是癌症患者存活期延长的一个指标。在此时间点，CpG-NP没有显著增加肿瘤或淋巴结中的CD8/Treg，这相较于图7中的AIRISE-02与其较差功效相对应。此外，与其它对照组(图17C)相比，经AIRISE-02处理的小鼠的淋巴结中的效应CD8+ T细胞增殖能力更强(Ki-67)。
在单独的实验中，通过瘤内注射siRNA-CpG-NP(AIRISE-02)处理小鼠(类似于图7的模型)。siRNA用Alexa-488进行标记。图18示出了在瘤内注射后两小时，siRNA-CpG-NP被TME中的15％细胞吸收，而先前研究中的CpG-siSTAT3缀合物据报道仅在瘤内注射后1小时和3小时被TME中的2％细胞吸收(科泰勒夫斯基(Kortylewski)等人,自然生物技术(Naturebiotechnology),27(10):925-932,2009)。在吸收siRNA-CpG-NP的细胞中，80％是癌细胞(CD45-)，而20％是免疫细胞(CD45+)，这与发现TME由80％-90％的癌细胞组成是一致的。相比之下，上述CpG-siSTAT3缀合物依赖于CpG以进行加工，并且主要仅被TLR9+细胞而非TLR9-癌细胞吸收。将siSTAT3和CpG递送到癌细胞和免疫细胞两者是更期望的。在免疫细胞中，骨髓细胞(CD45+CD3-CD19-)吸收最多的siSTAT3-CpG-NP。这些包含巨噬细胞(F4/80+)和DC(CD11c+MHCII+)。在远隔未经处理的肿瘤中未检测到NP(未示出)，表明未经处理的肿瘤中没有NP的浸出液。
也证实了AIRISE-02的治疗作用依赖于免疫应答，而不是治疗剂的直接细胞毒性作用。当使用抗CD8抗体从小鼠(图8A)中耗竭CD8时，siSTAT3-CpG-NP的治疗应答显著降低(图8B-8D)。这说明治疗效果是免疫介导的。
此外，由于NP治疗会产生更多的CD8+ T细胞库，因此提出这种治疗可以与检查点抑制剂治疗有益地组合以增强抗癌作用。这通过使用siSTAT3-CpG-NP(AIRISE-02，图9A)与目前在临床中使用的两种检查点抑制剂(抗PD-1和抗CTLA4抗体)进行测试。在存活率方面，NP治疗(瘤内进入两个肿瘤中的仅一个肿瘤)与检查点抑制剂混合物(腹膜内给予)具有类似的功效(图9D)。AIRISE-02和检查点抑制剂混合物的组合在控制局部肿瘤(图9B)和远隔肿瘤(图9C)以及小鼠存活率(图9D)方面显著提高了功效。值得注意的是，8只小鼠中的5只小鼠完全治愈(至今10个月内保持无肿瘤)，而单独使用AIRISE-02或ICI没有治愈任何小鼠(图10C)。在B16F10模型中的疗效被认为是令人印象深刻的，因为此模型在文献中被认为具有攻击性，并且当在肿瘤植入后一周开始处理时，在先前的基于CpG的疫苗+ICI中没有发现疗效(有时在预防性设置中报告疗效)。在另一组治愈的小鼠中，通过在最后一次处理后3个月植入B16F10细胞进行肿瘤再激发。经治愈的小鼠拒绝了癌症的生长，表明AIRISE+ICI成功的持久抗肿瘤作用(记忆效应)。
CpG寡核苷酸和siSTAT3在NP上的全身共递送延长了小鼠的存活期，表明潜在的免疫引发和激活。
除瘤内施用外，AIRISE-02还可以全身给予以治疗不容易进行瘤内注射的癌症，如肺癌。图10A示出了AIRISE-02通过尾静脉在荷路易斯肺癌(LLC-JSP)肿瘤的小鼠中的治疗方案。观察到延长的存活期(图10B)，表明成功的抗癌免疫疗法效果。
通过阳离子脂质瘤内共递送CpG寡核苷酸和siSTAT3也诱导原位肿瘤疫苗接种。
siSTAT3和CpG与阳离子脂质(来自达尔马康的Dharmafect)混合以形成脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒以与图7相同的方式施用于小鼠。图11A-11C示出使用阳离子脂质实现了与使用介孔二氧化硅纳米颗粒观察到的应答非常类似的应答(图7)。这说明，对于瘤内注射，可以使用不同类型的纳米颗粒来产生具有本文所述的货物组合的治疗剂。
NP可以将siRNA连同CpG一起递送给癌细胞和免疫细胞两者，从而使靶基因敲低。NP可以向癌细胞和免疫细胞两者递送siRNA，并敲低STAT3基因(作为实例)，如在针对B16F10癌细胞的图12A、针对J774巨噬细胞的图12B以及针对小鼠原代DC的图12C所示出的。有趣的是，发现siSCR-NP还降低DC中的STAT3水平(参见图12C对未经处理的)。这不是由纳米颗粒毒性引起的，因为与未经处理的对照(图34)相比，细胞活力没有改变，并且STAT3mRNA用管家mRNA进行归一化。不受任何解释的束缚，提出这可能是由于介孔二氧化硅纳米颗粒的抗氧化特性，因为之前有报道称抗氧化剂可以抵消免疫抑制途径，包含STAT3激活(尹(Yoon)等人,自噬(Autophagy),6(8):1125-1138,2010)。另一方面，发现Dharmefect(Horizon Discovery公司的基于阳离子脂质(非抗氧化剂)的商业转染剂)增加了DC中STAT3的表达(图35)，这可能导致不期望的免疫抑制TME。这表明使用恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015中描述的抗氧化介孔二氧化硅纳米颗粒平台可能比脂质纳米颗粒更有利于控制STAT3介导的途径。图19还示出STAT3非常保守，以致于相同的siSTAT3序列可以敲低犬、鼠类和人类细胞中的STAT3，从而促进了从鼠类研究到犬和人类研究的直接转化。因此，在跨物种的整个应用中使用相同的siSTAT3序列。
转染癌细胞、DC和巨噬细胞并减少某些基因(如STAT3)的能力表明本文所述的免疫治疗构建体可以用于免疫细胞的离体工程化。此类离体工程化的免疫细胞可以返回施用于患者以用于治疗效果和免疫应答(例如，杀死癌细胞)。细胞可以源自经治疗的患者或源自不同的健康供体(例如，干细胞以及其衍生物——千住(Senju)等人,国际血液学杂志(Int J Hematol),91(3):392-400,2010)。可以用免疫治疗构建体离体(有或没有另外的药剂)治疗癌细胞以产生全细胞癌症疫苗(基南(Keenan)等人,国际血液学杂志,91(3):392-400,2010；高德斯坦(Goldstein)等人,国际血液学杂志,117:118-127,2011)。
还发现AIRISE-02(siSTAT3-CpG-NP)在其它肿瘤模型中具有功效，所述肿瘤模型包含结肠癌(图20)和乳腺癌(图21和22)。具体地，示出在这两个模型中，将ICI(全身腹膜内给予)和局部给予每只小鼠的两个肿瘤中的一个肿瘤的AIRISE组合提供比单独使用AIRISE或单独使用ICI更好的功效。
AIRISE-02的安全性概况：在小鼠和猴子两者中评估了AIRISE安全性。发现向小鼠肌内注射AIRISE-02不会对小鼠皮肤产生毒性(无水肿或红斑，图23)。当小鼠用AIRISE-02处理与用生理盐水处理时，体重以及肾和肝功能的血清生物标志物也没有变化(图24)。AIRISE-02也在猴子身上进行了测试，并发现是安全的。具体地，以剂量递增方式(1、2.8和9.5mg/kg，每组n＝3只动物，图25)每隔一周将AIRISE-02皮下给予食蟹猴。所有三只动物都存活到预定的研究终止。对临床观察没有测试物品相关的影响。在皮肤观察方面，对于低剂量，没有物品相关的皮肤观察；对于中等剂量，在给药后48和/或72小时注意到测试物品相关的水肿(2-3级)，但在7天后消退；对于高剂量，早在给药后24小时开始并持续7天(最后一次观察)，在所有动物中均注意到试验物品相关的水肿(1-3级)和红斑(1级)，但无需关注。对体重没有测试物品相关的影响。对血液学参数没有测试物品相关的影响。对凝血参数没有测试物品相关的影响。对临床化学参数没有测试物品相关的影响。
实例2：免疫治疗构建体(如NP)也可以同时装载有两种类型的siRNA，而不会失去功效。
除了siRNA和CpG的共同递送之外，本文所述的免疫治疗构建体还可以共同递送多种siRNA。例如，图13示出当NP(基本上如实例1中所述进行制备)装载有两种针对HER2或STAT3的单独siRNA时，实现了每种蛋白质的特异性敲低。图13还示出当两种siRNA装载在同一个NP小瓶上时(参见T-siHER2/siSTAT3-NP)，实现了与装载在两个单独的NP小瓶上时类似的两种蛋白质的敲低(参见T-siHER2-NP+T-siSTAT3-NP)。作为另一个实例，图36示出了装载有siCXCR4、siSTAT3和CpG的NP(siSTAT3/siCXCR4-CpG-NP)在增强黑色素瘤模型中的免疫检查点抑制剂的功效方面的有效性。
这说明了本文所述的免疫治疗构建体颗粒在装载多于一种类型的寡核苷酸而不失去功效时的多功能性。如本文所述的纳米颗粒递送也是有益的，因为其允许装载多于一种siRNA，每种siRNA都可以杀死癌细胞和/或调节免疫抑制的多个方面。
在图13中示出的数据清楚地示出NP可以递送siRNA或两种或更多种不同siRNA的混合物，其中siRNA可以：对癌细胞提供细胞毒性作用，否定免疫抑制肿瘤微环境，含有免疫刺激序列或具有这些特性的任意组合。
实例3：细胞类型特异性/靶向免疫治疗构建体
siRNA具有巨大的潜力，因为任何基因都可以被精确地且有效地调节。免疫治疗构建体(AIRISE)可以通过利用在纳米颗粒上的抗体(或其它靶向剂)进行特异性递送来解决不同的免疫抑制途径或不同的免疫细胞群。包含本文提供的NP的免疫治疗构建体可以与靶向剂缀合以靶向递送到特异性细胞群，如肿瘤中的特异性细胞。如抗PD-L1抗体等一些抗体可以用作免疫抑制途径的靶向剂和调节剂两者。
图14A-14C提供了此类NP靶向的实例。与西妥昔单抗(抗EGFR抗体)缀合的NP示出与低EGFR细胞相比优先摄取EGFR+细胞(图14A-14B)。同样，与曲妥珠单抗(抗HER2抗体)缀合的NP示出与低HER2细胞相比优先摄取HER2+细胞(图14C)(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)。
据信，如本文所述，此种类型的靶向将与装载有佐剂和活性剂的NP同样有效。
实例4：多药剂纳米颗粒处理
在此实例中，PD-L1抗体(来自BioXcell的小鼠PD-L1)缀合在基本上如实例1中制备的介孔二氧化硅纳米颗粒上，所述纳米颗粒装载有PLK1抑制剂(沃拉色替)和CpG。PD-L1抗体用作ICI和肿瘤归巢剂(靶向剂)两者。
方法
在PEI结合之前，沃拉色替(PLK1抑制剂；iPLK1)被过量装载在纳米颗粒上。简而言之，在PEI结合之前，将MSNP与含沃拉色替的乙醇/DMSO溶液混合过夜。未经结合的多西他赛或沃拉色替和PEI在PBS中被洗掉。然后按照先前公开的方法将PEI-NP(iPLK1)与PEG缀合(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015；恩甘切尔德拉库尔等人,国际纳米医学杂志,13:4015-4027,2018)。最终产品含有0.5-2wt.％iPLK1。其DLS尺寸为100nm。对于含有PD-L1抗体(p-NP)的构建体，按照先前公开的方法使PD-L1抗体硫醇化并缀合到纳米颗粒上的PEG层末端(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015；恩甘切尔德拉库尔等人,国际纳米医学杂志,13:4015-4027,2018)。
LLC-JSP双侧鼠类肺肿瘤模型：6周龄雌性C57BL/6小鼠获自查尔斯河NCI菌落(马萨诸塞州威尔明顿)。每只小鼠在左胁腹(局部，100,000个细胞)和右胁腹(远隔，40,000个细胞)皮下注射LLC-JSP细胞。植入后12天，仅将测试化合物/构建体瘤内注射到左侧(局部)肿瘤，而右侧(远隔)肿瘤不进行处理。除非另有说明，测试化合物/构建体每3天给予3个剂量。每1-2天用游标卡尺测量小鼠中局部肿瘤和远隔肿瘤两者的负荷，并且肿瘤体积按V＝0.5×长度×宽度2进行计算。还监测了存活率。当总肿瘤负荷超过2000mm3时处死小鼠。
结果
在肿瘤接种后第12天，小鼠接受对左侧(局部)肿瘤的生理盐水、PD-L1抗体涂覆的纳米颗粒(p-NP)、装载有PLK1抑制剂的纳米颗粒(iPLK1-NP)、装载有PLK1抑制剂的p-NP(p-iPLK1-NP)或装载有PLK1抑制剂的p-NP以及CpG(p-iPLK1-NP-CpG)的瘤内处理(而远隔肿瘤未经处理)。每3天施用50μl的0.5mg NP(2.5μg iPLK1、20μg PD-L1抗体、20μg CpG)，共3个剂量。与没有CpG的相同的免疫治疗构建体相比，免疫治疗构建体延长了小鼠的存活期(图15)。免疫治疗构建体也比游离PD-L1抗体和沃拉色替更有效，所述游离PD-L1抗体和沃拉色替各自以比纳米颗粒高5倍的浓度给予。在同一NP上并入佐剂(CpG)进一步提高了存活率。例如，发现在p-iPLK1-NP上并入CpG(称为p-iPLK1-NP-CpG)显著提高了7只小鼠中的2只的存活率，并且一只小鼠完全没有肿瘤。
实例5：AIRISE的局部调配物和应用
本文公开的免疫治疗构建体可以调配成局部调配物。本领域已知的若干媒剂可以与构建体混合，例如，Aquaphor(基于软膏)和Carbopol(基于凝胶)。加热或表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80(Tween 80)作为乳化剂)可以用于允许更好地混合媒剂和AIRISE的水性悬浮液。作为实例，已证实10wt.％Tween-80不会导致任何siRNA从纳米颗粒过早泄漏。还示出在将混合物温热到55℃后，2.5wt.％Tween-80足以增强siRNA-NP和Aquaphor的混合。
可以使用用于同时增强渗透的方法，如超声波和微针滚轮(例如，针高范围为0.5mm到1.5mm的
Figure BDA0003457735980000771
)。当在猪皮(图30)和小鼠(图31)中测试时，应用针高短至0.5mm的微针可以增强局部siRNA-纳米颗粒调配物的渗透。
图30示出当在猪皮中测试时，微针滚轮增强siRNA纳米颗粒构建体的渗透，猪皮的厚度与人皮的厚度类似。将猪皮与调配物(含Dy677-siSCR-NP的Aquaphor)一起温育持续1.5小时(37℃；5％CO2)。1.5小时后，从经处理的区中取出皮肤穿孔并使用标准方法处理以进行荧光成像。观察到使用微针滚轮的皮肤渗透显著增强。虽然在没有滚轮的情况下给予含siRNA-NP的Aquaphor时，siRNA信号(箭头)被局限在猪皮的外表面，但是观察到siRNA信号(箭头)通过微针预应用穿过表皮下至真皮层(图30)。
图31示出微针滚轮增强siRNA-NP的局部递送。首先，在处理前一天给小鼠剃毛。将Dy677-siSCR-NP(0.72nmol siRNA)与100μL 2.5％Tween-Aquaphor混合(每次应用)。就在处理之前，仅在背部的一侧沿四个方向一致地应用真皮微辊，而另一侧不进行预处理。在有微针预处理和没有微针预处理的情况下，将混合物应用于剃过毛的区(大约2cm2的应用区)以进行比较。在1.5小时的处理时间后，采集经处理的皮肤样品并进行处理以供成像。
图32示出了在微辊+局部siRNA纳米构建体应用后3天所得的基因敲低。观察到siEGFR-NP相对于经生理盐水处理的组55％的EGFR敲低(*p<0.05)(图32A)。相比之下，siEGFR-NP的一次皮内注射(具有0.72nmol的相同siEGFR剂量)相对于经生理盐水处理的组产生40％的EGFR敲低(图32B)。
AIRISE-02的微针形式：探索了使用基于葡聚糖、支链淀粉、PVP、PEG、甲基纤维素、壳聚糖或本领域已知的其它聚合物或化合物的可溶解微针进行微针制造，如在图33中所示，所述微针制造允许无痛的家庭治疗并且由于高针密度(每1cm2 100针)而在递送AIRISE-02时非常有效。作为实例(图33)，将含有装载有Dy677-缀合的siRNA的NP的葡聚糖溶液(300mg/ml于水中)浇铸到微针模具上。将溶液离心或抽真空以致密地填充模具。微针通过空气、干燥剂、真空烘箱、冰箱或其组合干燥并从模具中取出。根据模板和优化，针的高度从300到800微米不等。siRNA-NP成功地装载到这些针阵列中(以每个阵列约0.5nmolsiRNA)，并且针在应用于猪皮后5分钟内完全溶解。可以通过改变微针的成分来设计不同的溶解时间。不同形状和形式的微针贴剂也可以用不同的模板制造。
实例6：不同的纳米颗粒材料可以用于递送所公开的货物组合并产生类似的免疫治疗效果。作为实例，将siSTAT3和CpG装载在阳离子脂质颗粒上(Dharmafect；可商购获得)上并以与实例1(基于介孔二氧化硅的AIRISE-02)相同的方式施用于小鼠。发现与阳离子脂质颗粒一起递送的CpG和siSTAT3也产生原位肿瘤疫苗接种/免疫刺激作用(图11)。使用jetPEI(可商购获得的达到临床阶段的基于PEI的转染剂)作为递送系统也获得了类似的结果。这示出了所公开的货物组合的多功能性和在递送平台方面的不可知性。然而，值得一提的是，尽管脂质平台通常有效地将siRNA递送给癌细胞，但逐层功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒(如本文所述的)在免疫细胞(例如，原代树突状细胞)中示出了比脂质对应物更好的siRNA敲低活性(图12)。
如本领域普通技术人员将理解的，本文公开的每个实施例可以包括其特定陈述的要素、步骤、成分或组分、基本上由其组成或由其组成。因此，术语“包含(include)”或“包含(including)”应被解释为叙述：“包括、由…组成或基本上由…组成。”过渡术语“包括(comprise或comprises)”意指包含并允许包含未指定的要素、步骤、成分或组分，即使是主要量。过渡性短语“由…组成”不包括任何未指定的要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由…组成”将实施例的范围限制为指定的要素、步骤、成分或组分，并且限制为不实质上影响实施例的要素、步骤、成分或组分。在此上下文中，实质性影响是免疫治疗构建体的生物学影响(如抗癌作用)中的可测量减少。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求中使用的表示成分的量、特性(如分子量、反应条件)等的所有数字应理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。因此，除非相反指出，否则说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化的近似值。至少，并且并非试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数字参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。当需要进一步澄清时，术语“约”具有当与所述数值或范围结合使用时由本领域的技术人员合理地赋予其的含义，即表示稍微大于或稍微小于所述值或范围，在所述值的±20％；所述值的±19％；所述值的±18％；所述值的±17％；所述值的±16％；所述值的±15％；所述值的±14％；所述值的±13％；所述值的±12％；所述值的±11％；所述值的±10％；所述值的±9％；所述值的±8％；所述值的±7％；所述值的±6％；所述值的±5％；所述值的±4％；所述值的±3％；所述值的±2％；或所述值的±1％的范围内。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中阐述的数值被尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地含有必然由其相应的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
除非本文中另有所指或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对值的范围的叙述仅旨在充当一种单独指代落入所述范围内的每个单独的值的简化方法。除非本文另外指明，否则将每个单独的值并入本说明书中，就好像每个单独的值是在本文中单独引用的一样。除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示范性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
本文公开的本发明的替代性要素或实施例的分组不应被解释为限制。每个组成员可以被单独地或者以与所述组中的其它成员或本文发现的其它要素进行任何组合的方式被引用和保护。出于便利性和/或专利性的目的，预计组中的一或多个成员可以被包含在组中或从组中删除。当进行任何这种包含或删除时，将说明书视为包含修改后的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施例，包含诸位发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。当然，对于本领域普通技术人员来说，在阅读前述描述后，这些描述的实施例的变型将变得清楚。发明人期望熟练的技术人员在适当时采用这些变化，并且诸位本发明人的意图是以与本文具体描述的方式不同的方式来实践本发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包含对所附权利要求书所叙述的主题的所有修改和等效物。此外，本发明涵盖以上描述的要素在其所有可能的变体中的任意组合，除非另外在本文中指出或另外明确地与上下文相矛盾。
此外，本说明书中对专利、印刷出版物、杂志文章和其它书面文本(本文中的参考资料)进行了大量参考。每个参考材料单独以全文引用的方式并入本文中，以供参考教学之用。
应当理解，本文公开的本发明的实施例是对本发明原理的说明。可以采用的其它修改也在本发明的范围内。因此，作为实例而非限制，根据本文的教导，可以利用本发明的替代性配置。因此，本发明不限于精确地如所示出和描述的那样。
本文示出的细节仅作为实例，并且仅用于本发明的优选实施例的说明性讨论，并且是为了提供被认为是对本发明的各个实施例的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述而呈现的。在此方面，并未试图以比对基本理解本发明所需的细节更详细地示出了本发明的结构细节，结合附图和/或实例进行的描述使得本领域技术人员清楚如何可以将本发明的若干种形式体现在实践中。
除非在实例中明确地修改，或者当含义的应用使任何构造无意义或基本上无意义时，本公开中使用的定义和解释意在并旨在控制任何未来的构造。如果术语的构造会使其无意义或本质上无意义，则定义应取自韦氏词典(Webster's Dictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的词典，如牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology)(安东尼·史密斯(Anthony Smith)编辑,牛津的牛津大学出版社(Oxford University Press,Oxford),2004)。
序列表
<110> 俄勒冈健康与科学大学(OREGON HEALTH AND SCIENCE UNIVERSITY)
PDX制药公司(PDX Pharmaceuticals, LLC)
<120> 免疫治疗构建体以及其使用方法
<130> 51127-004WO2
<150> US 62/873,762
<151> 2019-07-12
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧碱基
<400> 1
ggaucuagaa cagaaaaugt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feat
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧碱基
<400> 2
cauuuucugu ucuagaucct g 21
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
cacguuugag uccaugccca auu 23
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
uugggcaugg acucaaacgu guu 23
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
ugguuuacau gucgacuaa 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
uuagucgaca uguaaacca 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

Claims (60)

1.一种免疫治疗构建体，其包括：
递送系统，所述递送系统包括至少一种治疗剂，其中所述治疗剂引起肿瘤抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境；以及至少一种佐剂，
其中所述免疫治疗构建体不包括肿瘤特异性抗原或卵清蛋白。
2.根据权利要求1所述的免疫治疗构建体，其中所述递送系统包括脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒或其混合物。
3.根据权利要求2所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂是脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒或涂覆有聚合物或脂质的无机颗粒。
4.根据权利要求3所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂是无机颗粒并且包括以下中的一或多种：介孔二氧化硅颗粒、金颗粒、铝颗粒、银颗粒、氧化铁颗粒、磷酸钙颗粒或抗氧化剂颗粒。
5.根据权利要求4所述的免疫治疗构建体，其中所述无机颗粒包括包含氧化铈的抗氧化剂颗粒。
6.根据权利要求4所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂包括介孔二氧化硅颗粒。
7.根据权利要求1所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂包括以下中的一或多种：富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支化和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、硅、二氧化硅和聚合物微球和纳米球、二氧化硅壳、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金颗粒、氧化铈颗粒、氧化锌颗粒、银颗粒、铝颗粒、碳颗粒、铁颗粒、氧化铁颗粒、佐剂颗粒和/或经修饰的胶束。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂是包括以下中的一或多种的聚合物颗粒：PLGA、PLL、葡聚糖、树枝状大分子、聚精氨酸、PEG、PEI或壳聚糖。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体的流体动力学尺寸为5nm到999nm。
10.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，所述免疫治疗构建体的流体动力学尺寸为1微米到1000微米。
11.根据权利要求6所述的免疫治疗构建体，其中所述递送媒剂包括尺寸为约5-200nm的介孔二氧化硅纳米颗粒。
12.根据权利要求11所述的免疫治疗构建体，其中所述介孔二氧化硅纳米颗粒涂覆有交联聚乙烯亚胺和聚乙二醇。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA、DNA、sgRNA(CRISPR-cas9元件)、寡核苷酸、多核苷酸、肽、蛋白质、化学治疗药物、毒素、抗氧化剂、小分子抑制剂、抗体或放射治疗剂。
14.根据权利要求13所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA或DNA。
15.根据权利要求14所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括siRNA。
16.根据权利要求15所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抑制以下各项的表达或活性的siRNA：STAT3、CD39、CD73、TGF-β、PD-L1、PD1、CTLA4、MIF、PLK1、HIF、NOX1-4、HER2、EGFR、BCL2、AKT1、HIF1-α、NOX1-4、AR、MYC、BRAF、BRAF V600E或MTDH。
17.根据权利要求15或16所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抑制STAT3的表达或活性的siRNA。
18.根据权利要求15到17中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抑制HER2的活性的表达的siRNA。
19.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂抑制以下各项的表达或活性：STAT3、CD39、CD73、TGF-β、PD-L1、PD1、CTLA4、MIF、PLK1、HIF、NOX1-4、HER2、EGFR、BCL2、AKT1、HIF1-α、NOX1-4、AR、MYC、BRAF、BRAF V600E或MTDH。
20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括一或多种选自以下的抗癌剂：抗生素、植物碱、PLK1抑制剂、有丝分裂激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、基于铂的化学治疗剂、HER2小分子抑制剂、抗EGFR抗体和抗HER2抗体。
21.根据权利要求20所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括免疫检查点抑制剂，并且所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1、PD1或CTLA4的抗体。
22.根据权利要求21所述的免疫治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括PLK1抑制剂。
24.根据权利要求23所述的免疫治疗构建体，其中所述PLK1抑制剂是沃拉色替。
25.根据权利要求1到24中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括多西他赛、米托蒽醌或卡巴他赛中的一或多种。
26.根据权利要求1到25中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述至少一种治疗剂包括抗EGFR抗体，
27.根据权利要求26所述的免疫治疗构建体，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
28.根据权利要求1到25中任一权利要求所述的免疫治疗抗体，其中所述至少一种治疗剂包括抗HER2抗体。
29.根据权利要求28所述的免疫治疗抗体，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
30.根据权利要求1到29中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述佐剂具有免疫刺激活性并且包括以下中的一或多种：CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNA TLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNA TLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物。
31.根据权利要求1到30中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述佐剂包括CpG寡核苷酸、咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特、polyI:C、polyICLC、dSLIM或EnanDIM。
32.根据权利要求1到31中任一权利要求所述的免疫治疗构建体，其中所述佐剂包括CpG寡核苷酸。
33.一种组合物，其包括：
根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体；以及
至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或其混合物。
34.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
37.一种治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物接触。
38.一种治疗从表现出癌症或另一种过度增殖性病症的症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物接触。
39.一种治疗从表现出癌症或另一种过度增殖性病症的症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使细胞离体与治疗有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物接触。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
41.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述细胞不是癌细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
43.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述细胞是永生化的。
44.根据权利要求37到43中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将至少一个经治疗的细胞施用返回至受试者。
45.一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状或具有发展此类疾病或病状的高风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求33所述的组合物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
48.根据权利要求45到47中任一权利要求所述的方法，其中所述过度增殖性疾病或病状包括癌症、癌前病变或癌症转移中的一或多种。
49.根据权利要求权利要求45到48中任一权利要求所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包括以下中的一或多种：黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、结直肠癌、淋巴瘤、胃癌、结肠癌、肝癌或罕见癌症。
50.根据权利要求45到49中任一权利要求所述的方法，其中所述施用包括：
注射到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处注射；
局部输注到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处局部输注；
对所述受试者进行全身注射；
对所述受试者进行全身输注；或者
局部应用于所述受试者。
51.根据权利要求45到50中任一权利要求所述的方法，其中所述施用包括对所述受试者进行微针应用。
52.一种增强抗癌疗法在有需要的受试者中的效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下：
有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物；以及
至少一种抗癌剂。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗癌剂是化学治疗剂或靶向治疗剂。
54.一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者中的检查点阻断免疫疗法效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下：
有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物；以及
至少一种免疫检查点抑制剂。
55.一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者中的放射疗法效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下：
有效量的根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体或根据权利要求33所述的组合物；以及
至少一种放射疗法。
56.根据权利要求52到55中任一权利要求所述的方法，其中所述免疫治疗构建体或组合物以及所述抗癌疗法依次或同时施用。
57.根据权利要求52到56中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
59.一种试剂盒，其包括：
根据权利要求1到32中任一权利要求所述的免疫治疗构建体；以及
至少一种抗癌剂。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
CN202080049397.7A 2019-07-12 2020-07-13 免疫治疗构建体以及其使用方法 Pending CN114096274A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962873762P 2019-07-12 2019-07-12
US62/873,762 2019-07-12
PCT/US2020/041844 WO2021011496A1 (en) 2019-07-12 2020-07-13 Immunotherapeutic constructs and methods of their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114096274A true CN114096274A (zh) 2022-02-25

Family

ID=74102552

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080049397.7A Pending CN114096274A (zh) 2019-07-12 2020-07-13 免疫治疗构建体以及其使用方法

Country Status (8)

Country Link
US (3) US20220249389A1 (zh)
EP (1) EP3999111A4 (zh)
JP (1) JP2022540867A (zh)
KR (1) KR20220035160A (zh)
CN (1) CN114096274A (zh)
AU (1) AU2020315590A1 (zh)
CA (1) CA3139722A1 (zh)
MX (1) MX2022000544A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115060777A (zh) * 2022-07-08 2022-09-16 江苏理工学院 同时检测马拉硫磷和氧化乐果的比率电化学适配体传感器及制备方法和应用
CN117085001A (zh) * 2023-10-18 2023-11-21 中国医学科学院药用植物研究所 一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3996750A4 (en) 2019-07-12 2024-01-03 Univ Oregon Health & Science THERAPEUTIC CONSTRUCTS FOR SIMULTANEOUS ADMINISTRATION OF MITOTIC HIBITOR AND IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR
US20240066119A1 (en) * 2021-01-13 2024-02-29 University Of Maryland, College Park Methods and platforms for eliciting an immune response in the treatment of cancer and compositions and vaccines relating thereto
WO2024049734A1 (en) * 2022-08-29 2024-03-07 Celanese Eva Performance Polymers Llc Implantable device for intratumorally administering a therapeutic agent
CN117731616A (zh) * 2023-12-18 2024-03-22 中山大学孙逸仙纪念医院 一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180071387A1 (en) * 2009-08-12 2018-03-15 Sigmoid Pharma Limited Immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oil phase
US20180155189A1 (en) * 2010-07-13 2018-06-07 The Regents Of The University Of California Cationic polymer coated mesoporous silica nanoparticles and uses thereof
US20180200196A1 (en) * 2013-11-01 2018-07-19 Yale University Modular Particulars for Immunotherapy
US20180312536A1 (en) * 2017-04-14 2018-11-01 Solstice Biologics, Ltd. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
US20190008962A1 (en) * 2013-01-25 2019-01-10 Nanobiotix Inorganic nanoparticles compositions in combination with ionizing radiations for treating cancer

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US7375096B1 (en) 1998-12-04 2008-05-20 California Institute Of Technology Method of preparing a supramolecular complex containing a therapeutic agent and a multi-dimensional polymer network
US7098192B2 (en) * 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
US6740336B2 (en) 2002-10-04 2004-05-25 Mirus Corporation Process for generating multilayered particles
US8399025B2 (en) 2004-06-04 2013-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyamine modified particles
US20060293396A1 (en) 2005-01-14 2006-12-28 Eastman Kodak Company Amine polymer-modified nanoparticulate carriers
US20070184068A1 (en) 2005-12-14 2007-08-09 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
WO2008094254A2 (en) * 2007-01-26 2008-08-07 City Of Hope Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
US9511151B2 (en) 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
CN103958519A (zh) 2011-07-19 2014-07-30 爱达荷州大学 用于靶向核酸的探针和方法的实施方式
CA2820236C (en) 2012-06-15 2022-07-19 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Non-viral nanoparticle-based delivery system
EP3046547A4 (en) 2013-09-18 2017-05-24 Stc.Unm Core and surface modification of mesoporous silica nanoparticles to achieve cell specific targeting in vivo
WO2015077657A2 (en) 2013-11-22 2015-05-28 City Of Hope Stat3 inhibitors and uses thereof
CA2943075C (en) * 2014-03-19 2023-02-28 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds for use in the treatment of pi3k-gamma mediated disorders
JP6685924B2 (ja) 2014-04-11 2020-04-22 メディミューン，エルエルシー システイン操作抗体を含むコンジュゲート化合物
WO2016013751A1 (ko) 2014-07-22 2016-01-28 주식회사 레모넥스 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도
US20160090603A1 (en) 2014-09-30 2016-03-31 Sandia Corporation Delivery platforms for the domestication of algae and plants
WO2016149378A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Pdx Pharmaceuticals, Llc Cross-linked polymer modified nanoparticles
BR112017020491A2 (pt) 2015-03-25 2018-07-17 The Regents Of The University Of Michigan composições e métodos para distribuição de agentes de biomacromolécula.
DK3326641T3 (da) * 2015-04-22 2019-09-30 Curevac Ag Rna-holdig sammensætning til behandling af tumorsygdomme
EP3303598A4 (en) 2015-05-26 2019-01-23 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. TARGETED LIPID PARTICLES FOR SYSTEMIC DELIVERY OF NUCLEIC ACID MOLECULES TO LEUKOCYTES
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
WO2017040660A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
MX2018007406A (es) 2015-12-16 2018-08-15 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos anti-lag3 y fragmentos de enlace al antigeno.
EP4218739A3 (en) 2016-01-08 2023-08-09 The Regents of The University of California Mesoporous silica nanoparticles with lipid bilayer coating for cargo delivery
US11110168B2 (en) * 2016-03-15 2021-09-07 North Carolina State University Nanoparticles, controlled-release dosage forms, and methods for delivering an immunotherapeutic agent
AU2017266929B2 (en) 2016-05-18 2023-05-11 Modernatx, Inc. Combinations of mRNAs encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
US11554178B2 (en) * 2017-06-30 2023-01-17 City Of Hope Compositions and methods of modulating macrophage activity
US20190048049A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Cerenis Therapeutics Holding Sa Cargomers
US20190374479A1 (en) 2018-06-12 2019-12-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Particles for delivery of biomolecules
EP3996750A4 (en) * 2019-07-12 2024-01-03 Univ Oregon Health & Science THERAPEUTIC CONSTRUCTS FOR SIMULTANEOUS ADMINISTRATION OF MITOTIC HIBITOR AND IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180071387A1 (en) * 2009-08-12 2018-03-15 Sigmoid Pharma Limited Immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oil phase
US20180155189A1 (en) * 2010-07-13 2018-06-07 The Regents Of The University Of California Cationic polymer coated mesoporous silica nanoparticles and uses thereof
US20190008962A1 (en) * 2013-01-25 2019-01-10 Nanobiotix Inorganic nanoparticles compositions in combination with ionizing radiations for treating cancer
US20180200196A1 (en) * 2013-11-01 2018-07-19 Yale University Modular Particulars for Immunotherapy
US20180312536A1 (en) * 2017-04-14 2018-11-01 Solstice Biologics, Ltd. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115060777A (zh) * 2022-07-08 2022-09-16 江苏理工学院 同时检测马拉硫磷和氧化乐果的比率电化学适配体传感器及制备方法和应用
CN115060777B (zh) * 2022-07-08 2023-06-23 江苏理工学院 同时检测马拉硫磷和氧化乐果的比率电化学适配体传感器及制备方法和应用
CN117085001A (zh) * 2023-10-18 2023-11-21 中国医学科学院药用植物研究所 一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用
CN117085001B (zh) * 2023-10-18 2024-02-13 中国医学科学院药用植物研究所 一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220035160A (ko) 2022-03-21
MX2022000544A (es) 2022-04-18
JP2022540867A (ja) 2022-09-20
EP3999111A4 (en) 2024-02-28
US20220249389A1 (en) 2022-08-11
US20220096628A1 (en) 2022-03-31
US20210008198A1 (en) 2021-01-14
AU2020315590A1 (en) 2022-01-20
CA3139722A1 (en) 2021-01-21
US11235058B2 (en) 2022-02-01
EP3999111A1 (en) 2022-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11235058B2 (en) Immunotherapeutic constructs and methods of their use
WO2021011496A1 (en) Immunotherapeutic constructs and methods of their use
Peer Immunotoxicity derived from manipulating leukocytes with lipid-based nanoparticles
US11679082B2 (en) Therapeutic constructs for co-delivery of mitotic kinase inhibitor and immune checkpoint inhibitor
US20220054633A1 (en) Nanoparticles, controlled-release dosage forms, and methods for delivering an immunotherapeutic agent
US11090367B2 (en) Restoration of tumor suppression using mRNA-based delivery system
US10874621B2 (en) Cationic nanoparticles for co-delivery of nucleic acids and therapeutic agents
US9919058B2 (en) Polyketal particles including a CpG oligodeoxynucleotide for the treatment of lung cancer
WO2014165296A1 (en) Methods and formulations to achieve tumor targeted double stranded rna mediated cell death
Dacoba et al. Nano‐Oncologicals: A Tortoise Trail Reaching New Avenues
Silva et al. Tailoring drug and gene codelivery nanosystems for glioblastoma treatment
KR20210055616A (ko) 면역유도용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법
Zhu Rational Design of Spherical Nucleic Acids as Therapeutic Constructs
Peres Intracellularly-Targeted Nanoplatform to Target Dendritic Cells and for Immunomodulation
WO2023107574A2 (en) Lipid-based compositions and methods thereof
橋田充 et al. Development of Immunostimulatory Motif-containing DNA-based Delivery System for Drugs and Antigens

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination