CN117731616A - 一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，涉及生物医药技术领域。本发明的纳米材料包括与亲核靶向肽连接的肿瘤抑制基因siRNA和在细胞内谷胱甘肽浓度下分解的PDPA聚合物。本发明的纳米材料到达肿瘤部位并被肿瘤细胞内吞后,胞浆内高浓度的GSH会使纳米载体的解散并使LCN2‑siRNA快速释放，显著提高LCN2的基因沉默效率和抑制肿瘤生长的效果；本发明的纳米材料制备过程简单，药物材料相对简单，成本较低。

Description

一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料。

背景技术

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部的最常见的恶性肿瘤之一。OSCC对周围组织的侵袭发生率很高，最常见的转移部位是颈部淋巴结，并且在Ⅰ/Ⅱ期即可高发隐匿性的颈部淋巴结转移，显著降低了OSCC患者的生存率。远处转移是OSCC预后差的重要原因，并且OSCC患者复发恶性肿瘤的风险较高，其中远处转移以肺部最为常见，其他器官，如纵隔淋巴结、肝脏和骨骼，也有报道。由于生长快，浸润性强，早期易发生淋巴结转移等特点，OSCC的总体预后不良并且存活率低，五年生存率大约为50％～60％，中晚期(TNM临床分期为Ⅲ、Ⅳ期)的患者更低，仅为27％，占恶性肿瘤死亡率的3％。预后差的另一个重要原因是OSCC大多早期无症状，确诊常在晚期，微小转移灶部位隐秘，难以察觉。近20年来，尽管有大量研究探索OSCC更佳的治疗方法，但其5年生存率并未有明显的提高。因此，寻找新的OSCC诊断和治疗相关因子仍然是目前研究的主要焦点。

表皮生长因子受体(EGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，也被称为HER1或erbB1，可以通过介导细胞增殖、迁移和分化，参与细胞再生、内环境稳态以及肿瘤的发生和发展。目前，基于EGFR的靶向药物已被临床应用于抗肿瘤治疗，如西妥昔单抗、阿法替尼、厄洛替尼等，使患者生存期延长10-20％。小分子药物EGFR-TKIs发挥治疗EGFR的方式是通过作用于细胞内酪氨酸激酶区，可以阻断EGFR信号通路，从而抑制肿瘤的发生和发展。有研究报道EGFR在OSCC中的表达率为36％-100％，抗EGFR药物在OSCC治疗中的应用取得了良好的效果，有研究报道EGFR-TKIs可以对抑制OSCC转移、增殖等发挥明显效果。然而，与其他类型的肿瘤相似，在OSCC的治疗中EGFR的耐药问题尤为突出，大约80％的应答者出现耐药。EGFR最初分布在细胞膜上，当它受到刺激时，可以进入细胞并激活MEK磷酸化，启动下游ERK信号，促进肿瘤转移。癌症中EGFR的不适当激活可能是由于EGFR的刺激增强，配体增多；EGFR的降解减少，激酶抑制反馈调节异常；EGFR下游的激活途径异常激活等，目前有报道发现EGFR的异常激活也可能源于受体内吞和转运的异常。EGFR的回收增多，内吞/循环加快是通过突变的RTKs捕获内吞体，改变其信号特性，改变的内吞/转运基因增强信号的持续时间和程度。事实上，在几种侵袭性癌症中已经发现受体循环/降解之间的平衡改变。另一种可能是依赖于参与RKTs内吞和循环的基因的过表达和扩增，包括一些属于Rab家族的GTPases，它们控制囊泡运输。内吞噬/循环分子表达的增加延长了信号的传播和/或在特定的膜位点重新定位RKTs和粘附受体，主要参与了癌细胞的侵袭。例如，乳腺SYNJ2的升高促进了表皮生长因子受体的再循环，刺激细胞运动和肿瘤形成。紫外线辐射、顺铂、炎症细胞因子(TNF-α)和抗生素大茴香霉素，都能触发p38-MAPK激活，这是不依赖配体的EGFR内化所必需的。EGFR一旦内化，就会聚集在MVBs的亚群中，这与EGF诱导的MVB池不同，在MVB池中，它们被困在腔内囊泡(ILVs)中而没有被降解。这个过程是可逆的，因为在p38-MAPK抑制的情况下，ILV包裹的EGFR可以恢复到限制MVB膜上，并从那里回收到细胞膜。

脂质运载蛋白-2，也被称为中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白(NGAL)，属于Lipocalin超家族，LCN2是一种25kda分泌的糖蛋白，在多种炎症和病理刺激下表达。目前有较多的研究报道了LCN2通过多种调控机制参与恶性肿瘤的复发及转移的行为调控。分子机制方面，LCN2可以与MMP-9(基质金属蛋白酶-9)结合并且形成LCN2-MMP9复合物，减少MMP-9降解，加速重塑细胞外基质促进血管生成。此外，LCN2高表达和EMT、肿瘤侵袭和转移行为密切相关，还参与调控细胞周期相关蛋白，促进其在侵袭性乳腺癌(Invasive Breast Cancer,IBC)肿瘤中的致瘤作用。但在不同肿瘤的微环境下，LCN2可以发挥不同的、甚至相反的作用。最近的一项研究证明了LCN2在抑制原癌细菌Alitipes spp.的生长方面具有重要作用。而在肠道肿瘤中，LCN2降低了远端肠肿瘤的大小，但增加了十二指肠肿瘤的大小和多样性，说明LCN2在不同的部位可能通过不同的调节通路发挥促进或者抑制肿瘤的不同作用，其具体功能和机制仍然需要大量深入的研究。目前已经有一些研究报道了LCN2在头颈部肿瘤中的作用。在食管癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和鼻咽癌的研究中发现，LCN2通过ERK1/2通路等促进ESCC迁移侵袭，并且可以通过调节鼻咽癌细胞的DNA修复能力诱导其耐辐射能力。口腔肿瘤中，Hiromoto的研究表明，LCN2的表达在分化不良的OSCC组织中明显上调，LCN2表达阳性与患者不良预后、总体生存时间缩短有关。

目前有效杀伤肿瘤细胞的方法，大致分为以下几类：化学治疗：由于癌细胞与正常细胞最大的不同处在于快速的细胞分裂及生长，所以抗癌药物的作用原理通常是借由干扰细胞分裂的机制来抑制癌细胞的生长，但多数的化疗药物都没有专一性，所以会同时杀死进行细胞分裂的正常组织细胞，这也是化疗副作用的来源。放射线治疗；也称放疗、辐射疗法，是使用辐射线杀死癌细胞，缩小肿瘤。放射治疗可经由体外放射治疗或体内接近放射治疗。由于癌细胞的生长和分裂都较正常细胞快，借由辐射线破坏细胞的遗传物质，可阻止细胞生长或分裂，进而控制癌细胞的生长。不过放射治疗的效果仅能局限在接受照射的区域内。靶向治疗：与化疗一样可以有效治疗癌症，但是副作用与化疗相较之下减少许多，原理是使用具有特异性对抗癌细胞的不正常或失调蛋白质的小分子。免疫治疗：利用人体内的免疫机制来对抗肿瘤细胞。中医中药治疗：配合手术、放化疗可以减轻放化疗的毒副作用，促进患者恢复，增强对放化疗的耐受力。综上，手术治疗是目前的主要手段，但是辅助疗法同样不能忽视。我们希望寻找新的EGFR调控策略，而这一领域的研究结果可以提高疗效，克服或延迟治疗耐药性的发生，从而为口腔鳞癌患者提供新的治疗靶点及临床上可行的精准靶向治疗方法。小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)又称为短干扰RNA(shortinterfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，主要参与RNA干扰(RNAi)现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。当siRNA进入细胞后，它被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)。作为RISC复合物的一部分，在细胞内扫描并找到siRNA互补的mRNA(靶mRNA)，并与其结合诱导靶mRNA切割，导致mRNA的降解，阻止mRNA翻译成氨基酸然后转化为蛋白质，从而沉默编码该mRNA的基因或蛋白表达。RNAi技术是目前细胞生物学及功能研究的热点，在临床医疗中也有广泛的应用前景。特别是肿瘤治疗领域，随着对肿瘤生物学的分子机制研究的深入，通过siRNA技术，下调肿瘤中恶性调控基因，可以达到抑制肿瘤转移、抑制肿瘤细胞化疗耐药、促进肿瘤凋亡等的效果。因此，一系列肿瘤恶性调控基因作为肿瘤治疗的潜在靶点被发觉。部分靶点已经作为靶向药应用于抗肿瘤治疗当中，但是目前应用的单抗制作成本高，并且siRNA在体内极易通过肝肾代谢清除，在体内的半衰期较短，常规的递送方式无法很好到达所有肿瘤的特定部位，故而在临床推广上仍然受到限制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，所述纳米材料包括与亲核靶向肽连接的肿瘤抑制基因siRNA和在细胞内谷胱甘肽浓度下分解的PDPA聚合物。

siRNA发挥基因沉默作用的关键是保持肿瘤部位的聚集和稳定，传统纳米载体仍不能完全克服siRNA体内递送时所面临的诸多生理屏障，尤其是无法解决肿瘤组织穿透能力弱、肿瘤细胞摄取量低及内涵体逃逸能力差等难题。本发明设计并合成了负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，所述纳米材料能够在肿瘤部位富集并能深度穿透肿瘤组织，能够在肿瘤组织中高效的释放肿瘤抑制基因siRNA发挥基因沉默作用，发挥抗肿瘤作用。

作为本发明所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的优选实施方式，所述亲核靶向肽的序列为：

C₁₇H₃₄-CONH-PKKKRKVRRRR-CONH₂。

作为本发明所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的优选实施方式，所述肿瘤抑制基因siRNA包括LCN2-siRNA。

作为本发明所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的优选实施方式，所述PDPA聚合物的制备方法为：取溴代聚乙二醇、2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯和N,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺，加入有机溶剂和引发剂，冷冻-解冻三次除去氧气后，在氮气氛下加入催化剂，40℃聚合24小时后，加入有机溶剂稀释产物，并去除催化剂；收集滤液进行透析，冷冻干燥得所述PDPA聚合物。

作为本发明所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的优选实施方式，所述纳米材料的粒径分布范围为50～500nm。

作为本发明所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的优选实施方式，所述纳米材料的表面电势为-14.4mV。

本发明还提供所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将溶于有机溶剂的亲核靶向肽和溶于水的肿瘤抑制基因siRNA混合，得亲核靶向肽-siRNA复合物；

(2)将PDPA聚合物溶于有机溶剂中，再与亲核靶向肽-siRNA复合物混合，得混合物；所述亲核靶向肽-siRNA复合物与PDPA的体积比为1：4。

(3)将混合物滴加到去离子水中，离心，得所述纳米材料。

优选地，所述步骤(1)具体为：将溶于有机溶剂DMSO的浓度为5mg/ml的亲核靶向肽和溶于水的肿瘤抑制基因siRNA以50μl：1nmol的比例混合，得亲核靶向肽-siRNA复合物。

优选地，所述步骤(2)中的溶于有机溶剂的PDPA聚合物的浓度为20mg/ml；所述

本发明还提供所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本申请发明人通过细胞层面和动物模型(裸鼠移植瘤模型)均证明了本发明的负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料可以抑制肿瘤的生长以及颈部淋巴结转移。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述肿瘤包括口腔鳞状细胞癌。

本发明还提供特异性抑制LCN2转录或翻译或特异性抑制LCN2蛋白的表达或活性的核酸分子在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

本发明从EGFR-TKIs耐药和OSCC的转移出发，明确LCN2在口腔鳞癌中发挥的是促进作用：一方面体现在体内外实验中LCN2可以促进OSCC的EGFR-TKIs耐药，另一方面体现在LCN2高表达与OSCC淋巴结转移、低分化、生存期差相关。证实了LCN2通过EGFR发挥促肿瘤的作用，并明确了具体分子机制：LCN2-EGFR蛋白互作，调控EGFR激活水平；EGFR/MEK/ERK信号通路磷酸化激活调控；LCN2通过影响EGFR再循环利用过程调控其膜分布水平。因此，抑制LCN2转录或翻译能够应用于治疗肿瘤的药物的研究和开发。

本发明的有益效果：本发明提供一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，本发明的纳米材料到达肿瘤部位并被肿瘤细胞内吞后,胞浆内高浓度的GSH会使纳米载体的解散并使LCN2-siRNA快速释放，显著提高LCN2的基因沉默效率和抑制肿瘤生长的效果；本发明的纳米材料制备过程简单，药物材料相对简单，成本较低。

附图说明

图1为有和没有淋巴结转移的T2期OSCC患者标本测序结果。

图2为LCN2、PRAL和TNFSF18在WT和ER的OSCC细胞系中表达情况。

图3为患者标本LCN2和EGFR免疫组化分析结果。

图4为WB和qPCR验证成功构建siLCN2及LCN2-ov的OSCC细胞系。

图5为Wild Type以及EGFR-TKI耐药的OSCC细胞总蛋白的WB实验结果图。

图6为CAL-27ER细胞Transwell实验结果图。

图7为LCN2对EGFR/MEK/ERK信号通路的影响。

图8为LCN2共免疫沉淀分析结果图。

图9为LCN2质谱分析结果图。

图10为LCN2促进EGFR激活的速度和强度。

图11为TGF-α刺激后EGFR和LCN2的分布。

图12为TGF-α刺激后EGFR和LCN2随时间变化的分布。

图13为转染LCN2的细胞的免疫荧光(IF)检测结果图。

图14为Meo-PEG-Br的核磁共振氢谱图。

图15为Meo-PEG-b-PDPA的核磁共振氢谱图。

图16为纳米粒子NT-NPs的粒径分布图。

图17为纳米粒子NT-NPs的电势图。

图18为纳米粒子NT-NPs的TEM图。

图19为纳米粒子NT-NPs在不同pH条件下的释放曲线。

图20为纳米粒子加入稳定转染的HN-6-Endo14-GFP细胞的激光共聚焦图。

图21为纳米粒子NT-NPs的药代动力学曲线。

图22为纳米粒子NT-NPs的中的生物分布情况，其中左图为小鼠尾静脉注射NT-NPs24小时后的体内分布成像；中图为离体脏器的荧光成像；右图为量化分析。

图23为NPs递送siLCN2抑制OSCC细胞侵袭转移；其中A为使用RNAi Max转染试剂和NPs-siLCN2递送的方法进行OSCC细胞敲低LCN2，免疫印迹检测发现两种转染的方法的LCN2表达；B为Transwell实验；C为划痕愈合实验检测。

图24为实施例1制备得到的NT-NPs递送siLCN2对OSCC原位瘤的治疗；其中A为小鼠舌原位肿瘤模型构建、体内成像观察、纳米粒子注射和材料取样示意图；B为小鼠体重的变化；C为小鼠肿瘤重量的比较；D为四组异种移植物和颈部淋巴结的HE染色；E、F为小鼠舌中原位肿瘤和淋巴结的解剖图像和最终IVIS图像；G为LCN2、p-EGFR和Ki67的肿瘤免疫组织化学染色。

图25为实施例1制备得到的NT-NPs递送siLCN2对EGFR-TKIs耐药PDX模型生长的抑制；其中A为OSCC PDX模型的处理示意图；B为第20天收集的异种移植物的照片；C为各组肿瘤增殖情况；D为最后一天(第20天)肿瘤重量的比较；E为肿瘤组织中HE、LCN2、p-EGFR和Ki67的组织学检测；F为肿瘤匀浆的免疫印迹检测。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

本实施例通过大量的实验探究LCN2在调控口腔癌的EGFR-TKIs耐药以及肿瘤转移中的作用，具体实验方法如下：

1、LCN2参与OSCC中EGFR-TKIs耐药和淋巴结转移的调控

限制OSCC愈后的两大关键问题为转移和耐药的发生，为了寻找有效的肿瘤调控靶点，我们选取了有和没有淋巴结转移的T2期OSCC患者标本进行测序。同时，对CAL-27、HN-6和相应ER耐药株进行测序，检测转移组织和ER细胞系中表达显著差异的基因。测序结果如图1所示，存在3个基因在高转移的OSCC组织和ER的细胞系中高表达，分别为LCN2、PRAL和TNFSF18。PRAL是一种与P53调节相关的lncRNA，在肿瘤中大多以低水平表达，是一种重要的肿瘤抑制基因。TNFSF18参与肿瘤中免疫细胞的功能调节，尤其是T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，而在肿瘤细胞中表达较低或无表达。为了进一步确定三者中的哪一个是最为关键的影响因子，在细胞水平上进行了qPCR验证。结果如图2所示，LCN2表达变化最大和一致，而TNFSF18显示出非常低和可变的表达，PRAL表达趋势在序列和mRNA表达水平上有所不同。

2、OSCC中LCN2表达与EGFR表达及不良预后呈正相关

收集了2016-2018年在中山大学中山纪念医院治疗的124名OSCC患者资料，对患者标本进行LCN2和EGFR免疫组化分析，并对OSCC患者的临床特征进行相关性分析。结果如图3和表1所示，LCN2表达与EGFR表达呈正相关，并且LCN2表达与OSCC淋巴结转移、分化、T分期相关，与年龄、性别无关。

表1LCN2与OSCC患者临床特征相关

3、LCN2参与OSCC的EGFR-TKI耐药并促进其转移

为了证实LCN2对参与OSCC调控，通过转染siLCN2抑制CAL-27ER和HN-6ER细胞中LCN2的表达并且构建了过表达LCN2的OSCC细胞系(图4)。提取了Wild Type以及EGFR-TKI耐药的OSCC细胞总蛋白，并进行WB实验和Transwell实验。WB实验结果如图5所示，在EGFR-TKI耐药时LCN2的表达量也是响应较高的。Transwell实验结果如图6所示，LCN2过表达后，CAL-27ER细胞的迁移和侵袭受到显著增强，穿过Transwell上腔的细胞显著增多；LCN2表达下调后，CAL-27ER细胞的迁移和侵袭受到显著抑制，穿过Transwell上腔的细胞显著减少；即LCN2表达量与OSCC细胞转移能力正相关。

4、LCN2促进EGFR/MEK/ERK信号通路激活

通过转染siLCN2抑制CAL-27ER和HN-6ER细胞中LCN2的表达并且构建了过表达LCN2的OSCC细胞系，并检测EGFR磷酸化、下游因子MEK和ERK的表达水平。结果如图7所示，抑制LCN2后EGFR磷酸化显著降低，过表达LCN2后EGFR磷酸化增强；下游因子MEK和ERK表现出与lcn2调控的EGFR相同的趋势。但LCN2对EGFR总蛋白表达无明显影响。由上述可知，LCN2mRNA表达的改变对EGFR mRNA表达无显著影响。

通过LCN2共免疫沉淀(co-IP)和质谱分析(图8、9)可知，与LCN2相互作用的蛋白富集在ERK信号通路中，并与EGFR结合。

由上述结果推断LCN2促进EGFR再循环，增加EGFR通路激活EGFR最初分布在细胞膜上。当它被激活时，它进入细胞并激活MEK磷酸化，启动下游ERK信号，促进肿瘤转移。利用TGF-α激活OSCC细胞中的EGFR。结果表明，LCN2-ov组迅速转化生长因子-α诱导EGFR的磷酸化程度大于对照组的水平。强烈的磷酸化发生0.5h，一直持续到4h开始。在对照组，磷酸化发生从1h，并显著降低了大约4h。EGFR LCN2-si细胞慢慢回应TGF-α，EGFR磷酸化后很快就消失了(图10)。

5、LCN2通过影响EGFR再循环利用过程调控其膜分布水平

用带有mCH红色荧光的内质网标记物STIM1分别与带有绿色荧光的LCN2和EGFR共转染，结果如图11所示，在TGF-α的刺激下可以看到二者均在激活后前往内质网。

构建了LCN2-GFP和EGFR-mCherry质粒转染HEK293T细胞。结果如图12所示，EGFR最初分布在细胞膜上，而LCN2位于细胞质中。EGFR和LCN2表现出较弱的共定位。当细胞被TGF-α刺激时，EGFR迅速进入细胞质。TGF-α激活的EGFR可在内质网内进行再加工并重新附着于细胞膜上。此外，绿色荧光(LCN2)和红色荧光(EGFR)在内质网中明显共定位和聚集，这往往有助于EGFR的恢复和再加工，以完成其循环利用。

在转染LCN2的细胞中进行免疫荧光(IF)检测，结果如图13所示，应用TGF-α后，LCN2-ov组LCN2与EGFR共定位的程度高于对照组，而LCN2-si组LCN2与EGFR共定位的程度低于对照组。

实施例2

本实施例提供一种负载肿瘤抑制基因LCN2-siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其制备方法包括以下步骤：

(1)siRNA/AUTP复合物的制备：设计并合成亲核靶向肽：C₁₇H₃₄-CONH-PKKKRKVRRRR-CONH₂，通过静电相互作用与siRNA结合后，形成的siRNA/AUTP复合物；

(2)溴代聚乙二醇(Meo-PEG-Br)的合成：将聚乙二醇(Meo-PEG-OH)和三乙胺溶于二氯甲烷中，在冰盐浴中，滴加溶于α-溴异丁酰溴；在室温下搅拌反应24小时后，分别用浓度为1mol/L的氢氧化钠和盐酸水溶液洗涤反应液，最后用去离子洗涤。收集有机相，用无水硫酸镁干燥后，浓缩溶液，加入冷乙醚沉淀出产物。反复沉淀3次后，真空干燥后收集白色粉末状产物，即Meo-PEG-Br；Meo-PEG-Br的核磁共振氢谱如图14所示；

(3)封装材料Meo-PEG-b-PDPA的合成：将2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DPA-MA,2.6g,12mmol)、Meo-PEG-Br(0.75g,0.15mmol)和N,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA,31.5μL,0.15mmol)加入到聚合管中，然后加入3mL二甲基甲酰胺和3mL 2-异丙醇溶解单体和引发剂，冷冻-解冻三次除去氧气后，在氮气氛下加入CuBr(21.6mg,0.15mmol)，并将聚合管真空密封；在40℃聚合24小时后，加入四氢呋喃稀释产物，然后使用中性三氧化二铝柱除去催化剂CuBr；收集滤液，将滤液转移至透析管中(截留分子量为5000～8000)，在去离子水继续透析3天，在真空中冷冻干燥产品，即Meo-PEG-b-PDPA；Meo-PEG-b-PDPA的核磁共振氢谱如图15所示；

(4)核靶向纳米粒子(NT-NPs)的制备：将Meo-PEG-b-PDPA溶解在N,N'-二甲基甲酰胺中以形成浓度为20mg/mL的溶液；将亲核靶向肽(AUTP)溶解在DMF中，形成浓度为5mg/mL的溶液；将siRNA溶解成1nmol的溶液(0.1nmol/μL水溶液)；取10μL的siRNA溶液与50μL的AUTP进行混合，再与100μL Meo-PEG-b-PDPA溶液混合，在搅拌器(1000rpm)下，将混合物缓慢滴加到5mL的去离子水中，随后将纳米材料分散体转移到超滤装置(EMD Millipore,MWCO100kDa)并离心以去除有机溶剂和游离化合物；用1倍体积的超纯水洗涤两次后，将所得纳米颗粒分散在1mL超纯水中，得纳米粒子NT-NPs。

实验例1

对实施例1制备得到的纳米粒子NT-NPs进行性能检测，具体如下：

1、NT-NPs的粒径、电势与形貌

通过动态光散射(DLS，Malvern Zetasizer)确定纳米粒子的尺寸和电势。随后使用透射电子显微镜(TEM)上观察NPs的形态，使用多功能酶标仪(TECAN SPARK 10M)测量荧光强度，计算载体封装效率为EE％＝(FINP/FIStandard)×100，采用EE％大于80％的NPs进行进一步试验。

通过DLS确定纳米粒子的尺寸和电势如图16、17所示，NPs的平均粒径约为95.47nm，NPs的表面电势为-14.4mV。NPs呈圆球状(图18)，粒径大小与DLS结果相符

2、NT-NPs的体外siRNA释放：

将Cy5标记的NPs分散在1mL PBS(pH 7.4)中，然后转移到Float-a-lyzer G2透析装置(MWCO 100kDa，Spectrum)中，将该装置在37℃，0mM GSH或20mM GSH的PBS缓冲液中，并在不同的时间间隔内，从透析装置中取出5μL NPs溶液与20倍DMSO混合，使用酶标仪测定Cy5标记的siRNA的荧光强度，以计算NPs的释放效果。结果如图19所示。

3、激光共聚焦显微镜观察NT-NPs中siRNA的分布：将口腔鳞状细胞癌细胞(HN-6)接种在共聚焦皿中，加入2mL含有10％ FBS的DMEM培养基(pH 7.4)中培养24h，待细胞贴壁后，用2mL新鲜无血清DMEM培养基替换原培养基后，用50nM带Cy5标记的NPs与细胞共孵育。在不同的时间点去除培养基，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤三次后，用DAPI染细胞核，并在激光共聚焦显微镜(Zeiss)下观察细胞对纳米材料的摄取与释放。结果如图20所示。可以看到在4h后纳米材料进入细胞内，6h完全从细胞内吞体中释放出来，8h后充满整个细胞浆，证明该纳米材料可以被OSCC细胞捕捉，随即在其中释放包载的siRNA。

4、NT-NPs的药代动力学：采用健康雄性NSG小鼠，随机分为两组，每组5只，并以每只小鼠1nmol siRNA的剂量分别静脉注射未被包载纳米材料的裸裸露的cy5-siRNA(naked-siRNA)和NPs。在预定的时间间隔，使用含有肝素钠的毛细管抽取眼眶静脉血(20μL)，按压伤口几秒钟以止血。通过酶标仪测定血液中cy5标记的siRNA的荧光强度。结果如图21所示，在15min、30min、1h、2h时间点时，纳米材料递送组的小鼠血液中CY5的残留量显著高于直接给与裸CY5-siLCN2的小鼠，说明纳米颗粒递送的siLCN2可以在小鼠体内驻留时间更长，缓慢代谢，有利于材料在肿瘤中的靶向调控。

5、NT-NPs的生物分布：将舌原位成瘤小鼠取完最后一个时间点后(注射后24小时)，使用Maestro 2体内成像系统(Cri Inc)对小鼠进行成像。结果如图22所示，NPs可以在在小鼠瘤体中富集；小鼠安乐死后解剖，取出脏器(心、肝、脾、肺、肾)、肌肉和肿瘤并成像，同样发现纳米材料组的瘤体中存在cy5的荧光，证明该纳米载体系统成功将siRNA递送到了肿瘤中。为了量化肿瘤和器官中纳米颗粒的积累，将上述组织打碎匀浆，并通过酶标仪检查每个器官中的荧光强度，其检测结果与体外成像结果相符。

实验例2生物学性能实验

1、本实验例通过实验验证实施例1制备得到的NT-NPs递送siLCN2抑制OSCC的细胞功能，具体实验如下：使用相同浓度的LCN2-siRNA分别采用RNAi和NPs包载递送的方法转染到CAL-27和HN-6细胞中48小时并提取蛋白质。

结果如图23所示，纳米材料递送siLCN2可以成功下调OSCC细胞中LCN2表达水平，并且与RNAi转染的效率基本一致。Transwell实验和划痕实验证实了CAL-27和HN-6中侵袭能力和迁移的能力均显著下调。

2、本实验例通过实验验证实施例1制备得到的NT-NPs递送siLCN2治疗OSCC原位瘤，具体实验如下：通过OSCC细胞(HN-6-luci)构建裸鼠舌原位肿瘤模型，利用活体成像技术检测肿瘤的形成情况。使用纳米材料包载siLCN2通过尾静脉注射的方法对小鼠进行药物治疗。治疗结束后，每周通过动物活体成像系统(IVIS)观察肿瘤生长和转移情况。

结果如图24所示，第3周终止实验后取出小鼠的舌肿瘤和颈部淋巴结用于石蜡包埋和组织匀浆用于LCN2检测。可以看到小鼠的体重在PBS组和Nano-siNC组显著呈快速下降的趋势，而在Nano-siLCN2组体重下降较慢(图24B)，同时，最后的肿瘤重量显示与体重的变化趋势相符合(图24C)。小鼠肿瘤和淋巴结标本的HE染色显示(图24D)，首先构建原位瘤模型成功，并且淋巴结中可以观察到OSCC细胞，在PBS、Naked-siLCN2和NPs-siNC组中观察到淋巴结转移，但在NPs-siLCN2组中未观察到淋巴节点转移。第3周时，取出全部的肿瘤和淋巴结组织，PBS组和Nano-siNC组全部4只小鼠均发生颈部淋巴结转移的荧光信号，Naked-siLCN2组出现了3只小鼠的颈部淋巴结转移的情况。而Nano-siLCN2组仍然尚无小鼠出现颈部淋巴结转移(图24E、F)。这些说明纳米颗粒传递siLCN2治疗显著抑制OSCC原位瘤颈部淋巴结转移。免疫组化染色和WB证实，在Nano-siLCN2组中LCN2表达被成功抑制(图24G)：相对于Nano-siLCN2治疗组的肿瘤标本，其余三组肿瘤标本切片中的P-EGFR和Ki67表达更弱，总体评分Nano-siLCN2治疗组显著较小。Ki-67在小鼠瘤体标本中的表达情况从而间接的反应肿瘤体内增殖情况。

3、本实验例通过实验验证实施例1制备得到的NT-NPs递送siLCN2抑制EGFR-TKIs耐药PDX模型的生长，具体实验如下：选择接受西妥昔单抗治疗，并因耐药导致肿瘤复发而接受手术切除的OSCC患者肿瘤组织。如图25A，将把肿瘤组织切成小块并皮下移植到NSG小鼠的右上背部，待成瘤后进行NT-NPs递送siLCN2等相关实验。

在第20天取材，NPs-siLCN2组显示出肿瘤体积最小，与其他组相比，NPs-siLCN2组对肿瘤生长的抑制作用显著(图25B、C、D)。肿瘤组织中HE、LCN2、p-EGFR和Ki67的组织学检测结果表明，当LCN2被抑制时，p-EGFR和Ki67的表达降低(图25E)。肿瘤匀浆的免疫印迹检测结果显示，在NPs递送siLCN2组中，LCN2的表达下调。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其特征在于，所述纳米材料包括与亲核靶向肽连接的肿瘤抑制基因siRNA和在细胞内谷胱甘肽浓度下分解的PDPA聚合物。

2.根据权利要求1所述的负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其特征在于，所述亲核靶向肽的序列为：

C₁₇H₃₄-CONH-PKKKRKVRRRR-CONH₂。

3.根据权利要求1所述的负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其特征在于，所述肿瘤抑制基因siRNA包括LCN2-siRNA。

4.根据权利要求1所述的负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其特征在于，所述PDPA聚合物的制备方法为：取溴代聚乙二醇、2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯和N,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺，加入有机溶剂和引发剂，冷冻-解冻三次除去氧气后，在氮气氛下加入催化剂，40℃聚合24小时后，加入有机溶剂稀释产物，并去除催化剂；收集滤液进行透析，冷冻干燥得所述PDPA聚合物。

5.根据权利要求1所述的负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其特征在于，所述纳米材料的粒径分布范围为50～500nm。

6.根据权利要求1所述的负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料，其特征在于，所述纳米材料的表面电势为-14.4mV。

7.根据权利要求1～6任一项所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将溶于有机溶剂的亲核靶向肽和溶于水的肿瘤抑制基因siRNA混合，得亲核靶向肽-siRNA复合物；

(2)将PDPA聚合物溶于有机溶剂中，再与亲核靶向肽-siRNA复合物混合，得混合物；

(3)将混合物滴加到去离子水中，离心，得所述纳米材料。

8.权利要求1～6任一项所述负载肿瘤抑制基因siRNA的谷胱甘肽响应纳米材料在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括口腔鳞状细胞癌。

10.特异性抑制LCN2转录或翻译或特异性抑制LCN2蛋白的表达或活性的核酸分子在制备治疗肿瘤的药物中的用途。