CN115252582B - 红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用 - Google Patents
红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用，属生物技术领域。制备时由全血中分离红细胞，提取红细胞膜，按表面积比，红细胞膜：人工脂质膜＝1:(8‑32)，将人工脂膜水化后加入红细胞膜，混匀，室温下水化获得红细胞膜杂合pH敏感性脂质体水溶液，按溶质质量与病毒粒子数比，红细胞膜杂合脂质体：溶瘤病毒粒子＝0.3：109，单位mg：VP，将二者混匀后，冰浴超声处理挤出获得红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂。该制剂中红细胞膜杂合pH敏感性脂质体能够有效掩蔽溶瘤病毒表面的抗原，延长溶瘤病毒在外周血中的循环时间，提高溶瘤病毒的抗皮下瘤和转移瘤疗效。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用，该红细胞膜杂合pH脂质体能够有效掩蔽溶瘤病毒表面的抗原，延长溶瘤病毒在外周血中的循环时间，提高溶瘤病毒的抗皮下瘤和转移瘤疗效。
背景技术：
溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)是目前临床上针对恶性肿瘤的一种全新治疗药物，主要由自然界中致病性较弱的病毒进行基因改造而来，包括疱疹病毒、痘病毒、腺病毒等。在保障安全性的情况下，溶瘤病毒能够特异性感染并杀伤肿瘤细胞从而达到抗肿瘤效果。除直接溶解细胞外，溶瘤病毒还能够刺激抗肿瘤免疫反应。一方面，溶瘤病毒可以直接影响肿瘤免疫。被感染的肿瘤细胞可以激发干扰素或Toll样受体的反应，或被免疫识别后通过肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和干扰素IFN(Interferon,IFN)相关因子以及视黄酸诱导基因1启动级联反应，从而激活JAK/STAT通路，进而激活蛋白激酶R。后者可感知细胞内病毒成分并阻止蛋白质转录，最终促进细胞凋亡。另一方面，溶瘤病毒能够调节肿瘤微环境并提高免疫细胞在肿瘤组织中的富集。溶瘤病毒可以靶向肿瘤微环境中与其发生发展相关的细血管内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞等，并导致其裂解，进而直接调节肿瘤免疫微环境。溶瘤病毒也能够诱导肿瘤细胞裂解，并释放特异性肿瘤相关性抗原，促进T细胞识别肿瘤抗原从而建立肿瘤特异性T细胞免疫。同时，溶瘤病毒能够抑制免疫微环境中调节性T细胞和髓源抑制性细胞的富集，从而克服肿瘤微环境中的肿瘤免疫抑制。溶瘤病毒还可以通过诱导IFN-α，IL-12，TNF-α和IL-6等细胞因子以及损伤相关分子模式(damageassociated molecular patterns，DAMPs)、病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecular patterns，PAMP)等因子，招募并活化树突状细胞以及自然杀伤细胞等免疫细胞，进而提高肿瘤组织中免疫细胞的浸润。此外，溶瘤病毒还具有抑制肿瘤血管生成，提高细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein,CTLA-4)或程序性死亡受体1(programmed cell deathprotein 1,PD-1)抑制剂疗效等诸多功能。目前，全世界已有多种溶瘤病毒被批准用于临床，其中较为著名的两种是我国于2005年批准的5型腺病毒(Ad5)H101和美国及欧洲批准的可用于瘤内和胸腹腔注射的T-VEC病毒。
溶瘤病毒需要通过合适的给药方式送入肿瘤组织，并在肿瘤组织内复制进而产生抗肿瘤效果。目前溶瘤病毒递送的主要方式为瘤内注射及静脉注射，但均存在较大问题。溶瘤病毒瘤内注射给药虽然能够提高肿瘤部位的病毒浓度，但是由于肿瘤组织结构致密，肿瘤间质压力较大，导致给药后病毒在肿瘤组织内扩散不良，治疗效果也难以保证。此外，瘤内注射给药往往需要使用超声、计算机断层扫描、核磁共振成像等技术辅助引导给药，操作繁琐复杂，具有一定的风险，且费用昂贵。
溶瘤病毒的静脉递送是目前最为方便的递送方式，但亦存在明显缺点。首先，溶瘤病毒的静脉递送与其他药物的静脉递送一样，由注射部位到肿瘤部位的运输过程中，容易与全身其他组织脏器结合，造成严重的副反应。此外，由于溶瘤病毒往往需要多次给药才能达到治疗目的，而多次给药易导致患者血清中产生大量病毒中和抗体及补体，抗体补体的中和作用以及人体外周循环系统中的巨噬细胞等免疫细胞对病毒的吞噬与清除作用将大大影响病毒静脉递送的效率，进而影响疗效。
根据以上背景，本发明构建了一种新型的红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒静脉递送系统(或称杂合膜包被病毒)。与普通溶瘤病毒相比，杂合膜包被病毒在外周血中具有更长的循环时间，并且具有更好的抗肿瘤疗效。具体地，首先从全血中分离红细胞，并提取红细胞膜。将其与磷脂材料进行融合，制备成红细胞膜杂合pH敏感性脂质体并对溶瘤病毒进行包被。最后通过体内体外实验验证该发明的有效性。
发明内容：
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用，该制剂为高效的可静脉注射的制剂。其表面膜成分由天然红细胞膜和pH敏感性脂质材料组合而成，该红细胞膜杂合pH敏感性脂质体通过对溶瘤病毒进行包被，掩蔽病毒表面抗原，延长了病毒在外周血中的循环时间，提高了溶瘤病毒的抗肿瘤疗效。
本发明为临床实践提供了一种新型的可静脉注射的溶瘤病毒制剂，具体涉及将人工脂质囊泡和天然红细胞膜进行融合构建稳定的红细胞膜杂合pH敏感性脂质体，包被溶瘤病毒后用于临床肿瘤治疗中。
本发明中，纳米材料包括磷脂材料和红细胞膜，其中，磷脂材料为磷脂酰胆碱，DSPE-PEOz，和/或胆固醇。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，红细胞膜杂合pH脂质体制备
全血中分离红细胞，提取红细胞膜，按表面积比，红细胞膜：人工脂质膜＝1:(8-32)，将人工脂膜水化后加入红细胞膜，混合均匀，水化反应，获得红细胞膜杂合pH敏感性脂质体(RM-PLs)水溶液，所述的水化反应在室温下进行，水化反应时间为0.5-2h；
步骤2，红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂制备
按溶质质量与病毒粒子数比，即红细胞膜杂合脂质体(RM-PLs)：溶瘤病毒粒子＝0.3：109(mg：VP)，将红细胞膜杂合脂质体(RM-PLs)水溶液与溶瘤病毒混合均匀后，进行冰浴超声处理后，挤出获得红细胞膜杂合脂质体包被ad11(Ery-ad11)悬液，即为红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂，其中，所述的超声时间为8-12min，冰浴温度为0-8摄氏度。
所述的步骤1中，人工脂质膜由pH敏感磷脂材料制备而成，所述的pH敏感磷脂材料具体由磷脂酰胆碱(PC)、DSPE-PEOz磷脂，和/或胆固醇构成，三者质量比为3.6：0.4：(0-2.6)。
质量比优选为3.6：0.4：1.2，胆固醇的最佳质量分数为23％。
人工脂质膜制备过程为：将磷脂酰胆碱(PC)、DSPE-PEOz磷脂，和/或胆固醇混合溶解于有机溶剂，室温旋蒸除去有机溶剂，制得人工脂质膜。
所述的步骤2中，用脂质体挤出器先后过400nm与200nm微孔膜挤出，得到红细胞膜杂合脂质体包被ad11(Ery-ad11)悬液。
所述的步骤2中，溶瘤病毒为腺病毒11亚型。
所述的步骤2中，制备的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的粒子粒径为90-120nm。
经检测，所述的制剂中红细胞膜杂合脂质体成功包被溶瘤病毒，RM-PL成功包被ad11；
所述的步骤2中，制备的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂经体外抗巨噬细胞内吞能力检测，巨噬细胞对Ery-ad11的相对摄取量为0.34-0.99；经中和抗体结合能力检测，中和抗体对Ery-ad11的相对结合量为29.09-63.98％。
本发明的检测方法中：
采用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight，NTA)以及扫描电子显微镜对红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被病毒进行表征。
体外水平通过细胞摄取实验以及免疫共沉淀实验验证红细胞膜杂合pH敏感性脂质体对溶瘤病毒的表面抗原的掩蔽效果。
采用荧光标记红细胞膜杂合pH敏感性脂质体和qPCR实验，研究制剂在体内的循环时间及在体内的生物分布情况。
采用流式细胞学检测红细胞膜杂合pH敏感性脂质体在pH6.5的条件下的裂解情况。
通过考察皮下瘤体积和转移瘤荧光强度来评价制剂的抗肿瘤效果。
本发明提供了一种可以静脉注射的红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用，该纳米药物可以极大提高溶瘤病毒经静脉注射后的抗肿瘤疗效。本发明中具体实施方式以溶瘤腺病毒11亚型(adenovirus 11,ad11)为例，验证该制剂的体内体外功能。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种可以静脉注射的红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用，该纳米药物可以极大提高溶瘤病毒经静脉注射后逃避免疫系统识别以及避免在血液循环中被清除的能力，增强溶瘤病毒对肿瘤部位的靶向能力，从而增强溶瘤病毒的抗肿瘤疗效。
附图说明：
图1为本发明实施例1的红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒的制备过程示意图：通过薄膜水化以及超声联合挤压法制备红细胞膜融合脂质体包被溶瘤病毒。首先，磷脂、DSPE-PEOz和或胆固醇成膜后，水化后加入红细胞膜制得红细胞膜杂合pH敏感性脂质体(以下简称RM-PL)。讲RM-PL和溶瘤病毒混匀后通过超声联合挤压法制备红细胞膜杂合脂质体包被溶瘤病毒(以下简称杂合膜包被病毒或Ery-ad11)。
图2为本发明实施例2的杂合膜包被ad11的构建及表征检测。a：超高分辨共聚焦显微镜证实RM-PL对ad11的包被成功，其中ad11为蓝色荧光的DAPI染料所标记，RM-PL由红色DiD染料标记。b：流式检测RM-PL对ad11的包封效率。c：NTA检测普通ad11(bare ad11)，Ery-ad11和RM-PL的粒径。d：利用超声联合挤压法分别利用纯红细胞膜(制剂简称RBC-ad11)，纯脂质体(制剂简称Lip-ad11)以及杂合膜对ad11进行包被后，利用扫描电镜对各组制剂进行表征。
图3为本发明实施例3的Ery-ad11的体外功能检测。a：将4组制剂(bare ad11，Lip-ad11，RBC-ad11以及Ery-ad11)分别与RAW264.7细胞(鼠源巨噬细胞系)共孵育后，检测不同浓度下的各组制剂被巨噬细胞摄取的量，结果显示Ery-ad11被巨噬细胞摄取的最少。b：检测各组制剂和抗ad11中和抗体结合的量的试验方法示意图。c：4组制剂分别与抗ad11中和抗体共孵育后，检测各组制剂未与抗ad11中和抗体结合的量。结果显示，Ery-ad11与中和抗体结合的量最少。d：检测4组制剂第一次给药后在小鼠体内的外周循环。e：检测4组制剂第二次给药(两次给药间隔为1周)后在小鼠体内的外周循环。f：检测4组制剂第二次给药(两次给药间隔为1周)，给药后1min和5min时，各组制剂在外周血中的浓度。g:ad11感染HCT116细胞后能使细胞表达GFP荧光蛋白。h：不同pH条件下Ery-ad11对肿瘤细胞的转染的效率，证实了RM-PL具有pH敏感性，能够在肿瘤组织中特异性裂解，并释放ad11感染肿瘤细胞。**P<0.01,***P<0.001,“ns”代表无统计学差异。
图4为本发明实施例6的各组制剂的分布。a-b：利用DiD对红细胞膜，脂质体以及杂合膜进行标记，检测制剂在荷TC-1皮下瘤小鼠中的分布。c：qPCR实验检测制剂在荷TC-1皮下瘤小鼠中的分布。d：小鼠肿瘤组织切片免疫荧光实验说明RM-PL具有pH敏感性。细胞核用DAPI染色，RM-PL用DiD染色，ad11用FITC标记。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,“ns”代表无统计学差异
图5为本发明实施例8的各组制剂抗肿瘤药效学检测。
图6为本发明实施例9的各组制剂抗转移瘤药效检测。a：治疗模式示意图。b-c：小动物活体成像系统检测转移瘤生长情况。d：各组转移瘤实体图片。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
红细胞膜杂合脂质体(简称RM-PLs)水溶液
红细胞膜杂合脂质体包被ad11(Ery-ad11)悬液
红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂，简称Ery-ad11制剂；
以下作为对照：
不加红细胞膜，加入2mL纯水水化制备普通脂质体悬液(PLs)，与ad11混匀后使用超声挤压法制备得到纯pH脂质体包被溶瘤病毒(Lip-ad11)制剂，简称Lip-ad11制剂，
直接取2ml提取后的红细胞膜，与ad11混匀后使用超声挤压法制备得到纯红细胞膜包被溶瘤病毒制剂，简称RBC-ad11制剂；
普通ad11，简称bare ad11；
对比例1
同实施例1，区别在于，省略红细胞膜的加入，挤压制得脂质体包被ad11悬液；。
为了便于下一步进行体外表征及体内药动学和药效学的实验，未特别指定的情况下，Ery-ad11均采用上述方法进行制备，具体投料则为3.6mg PC，0.4mg DSPE-PEOz和1.2mg胆固醇旋蒸成薄膜后加入1.85ml纯水和0.15ml红细胞膜水化制备RM-PLs，再使用超声挤压法制备得到Ery-ad11。同上，不加红细胞膜，加入2mL纯水水化制备普通脂质体悬液(PLs)，与ad11混匀后使用超声挤压法制备得到Lip-ad11作为对照。
对比例1-2
同实施例1，区别在于，省略人工脂膜的加入，直接取2ml提取后的红细胞膜，与ad11混匀后使用超声挤压法制备得到RBC-ad11作为对照。
荧光标记的脂质体制备方法同上，只需要将适量的荧光素加入PC、DSPE-PEOz和胆固醇的二氯甲烷和甲醇溶液中一起成膜。
本实施例选择溶瘤腺病毒11亚型(ad11)为代表，探讨红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒的抗肿瘤效果(如图1所示)；
以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步ANOVA法，两组比较采用双侧t检验法。
实施例1：红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒的构建
本实施例中首先从小鼠全血中分离出红细胞，再通过低渗和离心法提取红细胞膜。具体操作如下：C57BL/6雄性小鼠摘眼球取血，1ml全血用肝素钠抗凝后，700g，4℃离心收集红细胞，加入10mL含1mM EDTA的PBS溶液重悬红细胞，重复以上步骤洗涤红细胞3次，收集底部红细胞。再用PBS将红细胞配成红细胞悬液，每0.25ml分装至1.5mL EP管中，加入950μL 0.2mM EDTA水溶液，混合均匀涡旋破碎红细胞，再加入50μL 20×PBS调节至等渗，4℃下20,000g离心10min，弃去上清。再加入950μL 0.2mM EDTA水溶液，重复上述步骤直到得到类白色红细胞膜。最后加入0.25mM EDTA水溶液重悬，定容体积与红细胞悬液体积相同。-80℃冰箱保存待用。
本实施例中红细胞膜杂合pH敏感性脂质体包被溶瘤病毒制备方法为薄膜水化挤出法。具体操作如下：磷脂酰胆碱(PC)、DSPE-PEOz和胆固醇(不同质量比的配比方法见表1)用4mL二氯甲烷和0.5ml甲醇溶解后加入到50mL茄形瓶中，室温下旋转蒸发除去二氯甲烷，形成脂质薄膜。加入1.85mL纯水水化，加入适量红细胞膜混合均匀(不同比例的红细胞膜组成的杂合膜的投料比例见表1)，室温搅拌水化1h得到红细胞膜杂合脂质体(RM-PLs)水溶液。随后将得到的杂合脂质体水溶液与溶瘤病毒混匀后(脂质体与病毒粒子数对应关系为0.3mg：109VP)冰浴超声10min，用脂质体挤出器多次分别过400nm,200nm微孔膜，得到红细胞膜杂合脂质体包被ad11(Ery-ad11)悬液(如制备步骤制备过程示意图图1所示)。
为了便于下一步进行体外表征及体内药动学和药效学的实验，未特别指定的情况下，Ery-ad11均采用上述方法进行制备，具体投料则为3.6mg PC，0.4mg DSPE-PEOz和1.2mg胆固醇旋蒸成薄膜后加入1.85ml纯水和0.15ml红细胞膜水化制备RM-PLs，再使用超声挤压法制备得到Ery-ad11。同上，不加红细胞膜，加入2mL纯水水化制备普通脂质体悬液(PLs)，与ad11混匀后使用超声挤压法制备得到Lip-ad11作为对照。直接取2ml提取后的红细胞膜，与ad11混匀后使用超声挤压法制备得到RBC-ad11。荧光标记的脂质体制备方法同上，只需要将适量的荧光素加入PC、DSPE-PEOz和胆固醇的二氯甲烷和甲醇溶液中一起成膜。
实施例2：杂合膜包被ad11的验证及表征检测
为方便检测包被情况，在制剂制备过程中，用荧光染料(红色膜荧光染料DiD)标记人工脂质膜，再进行红细胞膜杂合脂质体的制备。用荧光染料(蓝色DNA荧光染料DAPI)标记ad11，制得Ery-ad11，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄，结果表明，Ery-ad11中的蓝色荧光和红色荧光100％重叠，全部共定位，说明红细胞膜杂合脂质体对ad11的包被成功(图2a)。
采用流式粒子检测技术检测RM-PL对ad11的包封效率，同样使用红色膜荧光染料DiD标记人工脂质膜，制得Ery-ad11，结果表明，有99.2％的ad11粒子带有荧光标记，同样说明RM-PL成功包被ad11(图2b)。
采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术测定红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的粒子大小，并与红细胞膜杂合脂质体泡囊进行比较。Bare ad11、Ery-ad11和RM-PL用Nanosight(NTA,LM10,Malvern,England)分析。将样品用PBS稀释后注入细胞，录制60s录像。采用NTA软件4.0，检测阈值为5，筛选增益为10对纳米颗粒的轨迹进行分析。Bare ad11在98nm处出现单峰，RM-PL在148nm处出现单峰。相比之下，Ery-ad11在146nm处有一个与RM-PL相似的峰，在110nm处有一个与RM-PL相似的峰，这进一步证实了RM-PL成功地包膜了ad11(图2c)。
最后，我们通过上述方法成功制备了RM-PL包被的ad11(Ery-ad11)、红细胞膜包被的ad11(RBC-ad11)和脂质体包被的ad11(Lip-ad11)，并在透射电镜(TEM)下进行了验证(图2d)。
实施例3：红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂体外抗巨噬细胞内吞能力及中和抗体结合能力考察
将RAW 264.7以每孔106个细胞铺板于12孔板内。以20或40pfu/cell为起始MOI分别添加不同含量的Bare ad11、Lip-ad11、RBC-ad11和Ery-ad11。孵育2h后，用PBS洗涤细胞，用Fast-pure Cell/Tissue DNAIsolation Mini Kit(Vazyme)收集DNA。采用qPCR法测定ad11被内吞的量。以bare-ad11为对照，比较巨噬细胞对bare ad11、Ery-ad11、Lip-ad11和RBC-ad11的摄取。结果显示，Ery-ad11被巨噬细胞吞噬的数量少于其他各组(图3a)。此外，为优化Ery-ad11的处方，我们检测了不同处方制备的Ery-ad11被巨噬细胞摄取的量，结果见表1(以bare ad11被巨噬细胞摄取的量作为单位1)。
采用免疫沉淀法(IPA，流程如图3b所示)检测不同方法和配方制备的Ery-ad11与中和抗体的结合。由于市面上没有针对IPA的ad11抗体，我们在用ad11预免疫的小鼠血清中获得了针对IPA的中和抗体，并预先测定了ad11中和抗体的滴度。将含有ad11中和抗体的血清按1:100稀释后，与各组ad11制剂(107pfu/ml)混合，在4℃孵育1h。加入Protein G包被的琼脂糖珠(Beyotime，中国)孵育1h。最后6000rpm离心1min，收集上清液。用qPCR法测定上清液中ad11的残留量。结果显示，Ery-ad11组上清中剩余的ad11的含量明显多于其他各组(图3c)，说明杂合膜包被ad11具有最好的抵抗巨噬细胞内吞效果及中和抗体抵抗效果。此外，为优化Ery-ad11的处方，我们检测了不同处方制备的Ery-ad11结合抗ad11中和抗体的量，结果见表1。
实施例4：红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的体内循环研究
将各组制备好的ad11制剂(包括bare ad11制剂、Lip-ad11制剂、RBC-ad11制剂和Ery-ad11制剂)静脉注射至C57小鼠体内，不同时间点(1，5，30min，1，2，4，8h)眼眶取血，将全血于4℃，1500g，10min条件下离心获得血清，用qPCR法检测血清中剩余ad11的含量。结果显示，与Lip-ad11制剂、RBC-ad11制剂和bare ad11制剂相比，Ery-ad11制剂的循环时间更长(图3d)，在1min至8h内，Ery-ad11制剂在血中的浓度从56.81％下降至0.39％。而RBC-ad11和Lip-ad11的药代动力学与bare ad11相似，bare ad11制剂在1min至8h内血中的浓度从48.51％下降至0.053％。如图3d所示，在每个时间点，Ery-ad11制剂的血液剩余药物浓度百分比均高于Lip-ad11制剂、RBC-ad11制剂和bare ad11制剂。
由于ad11制剂抗肿瘤效应需要多次给药，因此Ery-ad11如果能够在首次给药后的重复给药过程中继续保持其良好的抗原掩蔽效果，会大大提升ad11制剂的抗肿瘤药效。我们接着考察了Ery-ad11、RBC-ad11、Lip-ad11和bare ad11在第二次注射后的药动学。Ery-ad11的循环时间仍明显长于RBC-ad11、Lip-ad11和bare ad11(图3e)，在1min至8h内，二次注射后，Ery-ad11制剂在血中的浓度4.965％下降至0.117％。而RBC-ad11和Lip-ad11的药代动力学与bare ad11相似，bare ad11制剂在1min至8h内血中的浓度从1.113％下降至0.037％。特别是注射后1h，血液中RBC-ad11、Lip-ad11和bare ad11的比例已经接近基线水平即qPCR仪器所能测得的ad11最小拷贝数对应的药物比例。此外，静脉注射后1min或5min时，血液中Ery-ad11浓度明显高于其他各组(图3f)，在1min时，Ery-ad11相对于bare ad11在血中剩余的ad11比例提高了4.46倍，这一数据在5min时为5.25倍，说明Ery-ad11在重复给药时相对于其他各组仍具有出色的延长制剂长循环及在体内血液循环中对ad11表面抗原的掩蔽效果。不同处方Ery-ad11的外周循环能力见表2，AUC(0-t)(ID％/mL*h)为药物-时间曲线下的面积，MRT(0-t)(h)为平均驻留时间，CL(L/h/kg)为清除率，V(L/kg)为表观分布容积，其中，第一组制备的Ery-ad11制剂采用的PC、DSPE-PEOz，胆固醇的质量比均为3.6:0.4:1.2；第二组制备的Ery-ad11制剂人工脂质膜与红细胞膜的表面积比均为16:1。
实施例5：红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的体外pH敏感性研究
考察杂合膜包被的脂质体体外对酸性pH环境的响应性释放情况，考虑到肿瘤部位广泛存在的酸性pH环境，制剂的pH敏感性释放尤为重要，红细胞膜杂合脂质体中DSPE-PEOz的加入可实现此功能。本发明中所采用的ad11具有GFP基因，ad11感染细胞后能够使细胞表达GFP蛋白，从而发出绿光。将106个HCT-116细胞接种在共聚焦皿中培养过夜使细胞贴壁，以5pfu/cell的比例向培养基中加入ad11后，在细胞培养箱中以37℃，5％CO2浓度共孵育24h。用DAPI染色液将细胞标记为蓝色，然后置于共聚焦显微镜下观察细胞表达GFP蛋白的情况，即蓝色荧光和绿色荧光的共定位情况，证明ad11感染细胞后能使细胞发出绿色荧光(图3g)。
接下来采用如上所述实验步骤，事先将制备好的Ery-ad11分别与pH 6.5和pH 7.4的适量PBS溶液共孵育2h，得到Ery-ad11 pH6.5和Ery-ad11 pH7.4，将Bare ad11、Ery-ad11pH6.5和Ery-ad11 pH7.4分别以2pfu/cell和5pfu/cell加入完成HCT-116细胞培养的共聚焦皿中，24h后在共聚焦显微镜下观察ad11制剂感染细胞的情况，即如上所述蓝色荧光与绿色荧光的共定位情况所显示的被ad11制剂感染后发出绿色荧光的细胞比例，结果显示在以2或5pfu/cell的ad11制剂滴度感染细胞时，与pH6.5的PBS孵育后的Ery-ad11与Bare ad11的感染细胞能力没有统计学差异，表达绿色荧光的细胞比例分别为17.21％和46.80％，且高于Ery-ad11 pH 7.4的10.28％和29.62％，说明RM-PL具有pH敏感性，能够在肿瘤组织中特异性裂解，并释放ad11感染肿瘤细胞(图3h)。
实施例6：红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的组织分布研究
对于组织分布研究，利用一种小鼠来源的肺癌TC-1细胞构建C57小鼠肩部皮下瘤模型，待肿瘤长至80-100mm3大小后认为动物模型构建成功。采用荧光染料DiD分别标记纳米药物(Ery-ad11，RBC-ad11，Lip-ad11)，将其静脉注射至C57皮下瘤小鼠体内，于不同时间点(1，2，4，8，24，48h)在小动物活体成像扫描仪下拍摄荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光图像，小动物活体荧光药物图像中由颜色所代表的荧光强度高低显示，在各个时间点，Ery-ad11组小鼠肿瘤处的制剂荧光强度均显著高于RBC-ad11和Lip-ad11组(图4a)表明Ery-ad11制剂相较于RBC-ad11制剂和Lip-ad11制剂有着最好的肿瘤靶向富集效果。
48h后取小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)以及实体肿瘤，称重并匀浆，酶标仪测定组织匀浆液的荧光强度并定量作出柱状图如图4b所示。结果显示，与大多数纳米递药系统类似，Ery-ad11主要分布在肝脾，这可能是由于网状内皮系统的截留作用。但是Ery-ad11组在肝的分布较其余两组显著减少，且Ery-ad11组在肿瘤部位的分布较其余两组明显增多，Ery-ad11在肿瘤部位的荧光强度分别为RBC-ad11和Lip-ad11的1.45倍和3.03倍，与小动物活体成像的结果保持一致。二者共同说明Ery-ad11在肿瘤处的富集量显著高于RBC-ad11组和Lip-ad11组。
采用qPCR法进一步对组织分布进行研究，用同样方法构建TC-1肩部皮下瘤小鼠模型，待肿瘤大小至80-100mm3后，分别将各组制剂(bare ad11，RBC-ad11，Lip-ad11，Ery-ad11)静脉注射入小鼠体内，8h后取小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)以及实体肿瘤，称重并匀浆，用Fast-pure Cell/Tissue DNAIsolation Mini Kit(Vazyme)收集DNA。以未注射任何ad11相关制剂的空白小鼠各脏器中ad11的拷贝数作为标准，以不同制剂组小鼠各个脏器中ad11的拷贝数相对于空白小鼠中ad11的拷贝数的倍数作为纵坐标的值，结果显示，通过qPCR法考察得到的各个制剂脏器分布情况与小动物活体成像得到的各个制剂脏器分布情况结果基本保持一致(图4c)，Ery-ad11到达肿瘤处的数量分别为bare ad11、RBC-ad11和Lip-ad11的1.55倍、1.61倍和1.63倍。说明Ery-ad11在肿瘤处的富集量显著高于其他各组。
实施例7：红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂体内释放研究
用荧光染料标记脂质膜RM-PL(红色荧光染料DiD)，再进行红细胞膜杂合脂质体的制备。用荧光染料标记ad11(绿色荧光染料FITC)，采用上述制剂技术成功完成制备后静脉注射至TC-1肩部荷瘤小鼠体内考察Ery-ad11的体内肿瘤部位的释放情况。制剂注射2h后将荷瘤小鼠的皮下瘤取出，制作肿瘤组织的免疫荧光切片，用荧光染料标记免疫荧光切片中的肿瘤细胞(蓝色荧光染料DAPI)。将制作完成的免疫荧光切片置于激光共聚焦显微镜下扫描，结果显示，可见大量绿色荧光ad11与红色荧光RM-PL脱离共定位，说明Ery-ad11在体内肿瘤组织部位存在pH响应性裂解，并由此释放出游离ad11发挥抗肿瘤效果(图4d)。
实施例8：红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的抗肿瘤效果研究
采用生物工程化TC-1细胞作为难治性肿瘤细胞，在6周龄雄性C57小鼠右侧肩部皮下注射2×106个TC-1-hCD46细胞，构建皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到80-100mm3时，小鼠随机分为5组，每隔一天分别以108pfu ad11或等量PBS的剂量静脉注射bare ad11、RBC-ad11、Lip-ad11、Ery-ad11，共5次(1，3，5，7，9天)。肿瘤体积每隔一天测量并计算一次(0，2，4，6，8，10天)，计算公式为:体积＝长度*宽度2*π/6，直至肿瘤体积达到1500mm3以上。通过监测计算出的肿瘤体积绘制肿瘤随时间生长曲线(图5a)，由图可以看出，Ery-ad11组小鼠的肿瘤生长基本停滞，而bare ad11、RBC-ad11和Lip-ad11的肿瘤体积快速增长。于第10天监测肿瘤体积后处死动物，剖出实体瘤进行离体肿瘤大小的比较(图5b)，在实体肿瘤药效学终点处，Ery-ad11制剂组小鼠的肿瘤平均体积分别为PBS、bare ad11、Lip-ad11和RBC-ad11组小鼠肿瘤平均体积的13.55％、13.10％、27.33％和21.49％。结果表明Ery-ad11组相较于其余各组有最好的肿瘤治疗效果，基本可以抑制皮下实体肿瘤的生长。
实施例9：杂合膜包被脂质体对转移瘤的抗肿瘤效果研究
将106个TC-1-hCD46-luc细胞静脉注射到c57小鼠体内，产生肺转移瘤模型。4d后，小鼠随机分为5组，每隔一天分别以108pfu ad11或等量PBS的剂量静脉注射bare ad11、RBC-ad11、Lip-ad11、Ery-ad11，共6次(4，6，8，10，12，14天)，整个转移瘤药效学流程图如图6a所示。利用小动物活体体内成像系统(PerkinElmer,USA)对小鼠每隔一段时间进行一次生物发光成像以监测转移瘤的生长情况(4，7，10，13，18天)，处理完成的小动物活体成像系统在体肿瘤生物发光图像(图6b)由颜色所代表的生物发光强度高低显示：Ery-ad11的转移瘤进展缓慢，直到转移瘤药效学试验结束才检测到轻微的肺转移生物发光，而bare ad11、RBC-ad11、Lip-ad11组与PBS组肺转移瘤均进展迅速，在第10天甚至第7天即可看到强烈的肺转移瘤生物发光。对生物发光强度时程定量绘制曲线(图6c)，结果清晰地显示了每只小鼠的肺转移瘤进展快慢。Ery-ad11的生物发光强度时程定量曲线极其平缓，而bare ad11、RBC-ad11、Lip-ad11组与PBS组曲线较为陡峭甚至呈指数型增长趋势。第18天时Ery-ad11组小鼠的肺转移瘤平均生物发光强度分别为PBS、bare ad11、Lip-ad11和RBC-ad11组小鼠肺转移瘤平均生物发光强度的5.49％、4.31％、7.17％和7.82％。在第18天的生物发光成像监测后处死动物，心脏灌流，取出各组小鼠的肺，用Bouin’s染色液进行浸染固定后，拍照得到各组肺转移瘤实体图像(图6d)，可以通过肺表面肺转移瘤结节的密度以及个数评价肺转移瘤药效学终点处小鼠肿瘤状态。肺转移瘤实体图像清晰地显示，Ery-ad11组小鼠几乎没有转移瘤结节的形成，而其余各组小鼠肺表面均有大量的肺转移瘤结节。以上结果显示，Ery-ad11组相对于其他各组不仅对皮下实体瘤有最好的治疗效果，对于转移瘤的治疗效果也十分显著。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
表1各种处方下Ery-ad11被巨噬细胞摄取和被中和抗体结合的量(n＝3)
表2各种处方下Ery-ad11的药代动力结果(n＝3)
| Samplename | AUC(0-t)(ID％/mL*h) | MRT(0-t)(h) | CL(L/h/kg) | V(L/kg) | |
| 第一组 | Ery-ad11(0％RBC) | 2.264±2.065 | 0.361±0.438 | 2.376±2.568 | 15.577±36.352 |
| Ery-ad11(1:32RBC) | 5.381±2.297 | 0.178±0.013 | 1.157±0.509 | 6.364±5.706 | |
| Ery-ad11(1:16RBC) | 10.728±1.613 | 1.050±0.140 | 0.478±0.122 | 2.617±1.105 | |
| Ery-ad11(1:8RBC) | 8.408±5.838 | 0.673±0.352 | 0.661±0.256 | 9.931±10.488 | |
| 第二组 | Ery-ad11(0％胆固醇) | 6.767±4.561 | 0.391±0.277 | 1.050±0.745 | 21.491±7.026 |
| Ery-ad11(10％胆固醇) | 4.601±1.502 | 0.749±0.450 | 1.121±0.403 | 8.887±5.810 | |
| Ery-ad11(23％胆固醇) | 10.728±1.613 | 1.050±0.140 | 0.478±0.122 | 2.617±1.105 | |
| Ery-ad11(50％胆固醇) | 6.751±0.770 | 2.485±0.098 | 0.623±0.255 | 4.180±1.127 | |
| RBC-ad11 | 3.063±1.049 | 0.271±0.064 | 1.858±0.721 | 23.574±11.756 | |
| Lip-ad11 | 2.299±0.814 | 0.375±0.101 | 2.340±0.964 | 36.075±20.797 | |
| Baread11 | 3.693±1.903 | 0.246±0.065 | 1.899±1.341 | 11.238±6.599 | |
| Ery-ad11(二次给药) | 1.699±0.379 | 1.106±0.651 | 3.218±0.858 | 8.004±8.323 | |
| Lip-ad11(二次给药) | 0.915±0.101 | 0.707±0.117 | 5.031±0.888 | 59.551±22.120 | |
| RBC-ad11(二次给药) | 0.867±0.100 | 0.606±0.380 | 5.251±1.626 | 52.863±32.597 | |
| Baread11(二次给药) | 0.915±0.200 | 0.845±0.453 | 5.592±2.208 | 33.431±17.185 |
Claims (6)
1.红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，红细胞膜杂合pH脂质体制备
全血中分离红细胞，提取红细胞膜，按表面积比，红细胞膜：人工脂质膜=1:(8-16)，将人工脂质膜水化后加入红细胞膜，混合均匀，水化反应，获得红细胞膜杂合pH敏感性脂质体水溶液，所述的水化反应在室温下进行，水化反应时间为0.5-2 h；所述的人工脂质膜由pH敏感磷脂材料制备而成，所述的pH敏感磷脂材料具体由磷脂酰胆碱、DSPE-PEOz磷脂和胆固醇构成，三者质量比为3.6：0.4：(1.2-2.6)；人工脂质膜制备过程为：将磷脂酰胆碱、DSPE-PEOz磷脂，和胆固醇混合溶解于有机溶剂，室温旋蒸除去有机溶剂，制得人工脂质膜；
步骤2，红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂制备
按溶质质量与病毒粒子数比，即红细胞膜杂合pH敏感性脂质体：溶瘤病毒粒子=0.3：109，单位为mg：VP，将红细胞膜杂合pH脂质体水溶液与溶瘤病毒混合均匀后，进行冰浴超声处理后，挤出获得红细胞膜杂合脂质体包被ad11悬液，即为红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂，其中，所述的超声时间为8-12min，冰浴温度为0-8摄氏度；所述溶瘤病毒为腺病毒11亚型。
2.根据权利要求1所述的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备方法，其特征在于，磷脂酰胆碱、DSPE-PEOz磷脂和胆固醇的质量比为3.6：0.4：1.2，胆固醇的质量分数为23%。
3. 根据权利要求1所述的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中，用脂质体挤出器先后过400 nm与200 nm微孔膜挤出，得到红细胞膜杂合脂质体包被ad11悬液。
4.根据权利要求1所述的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2制备的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的粒子粒径为90-120nm。
5.根据权利要求1所述的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备方法，其特征在于，经检测，所述的步骤2制备的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂中红细胞膜杂合脂质体成功包被溶瘤病毒，即RM-PL成功包被腺病毒11。
6.权利要求1制备的红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂用于临床肿瘤治疗药品的制备，所述肿瘤为宫颈癌或肺转移瘤。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Natalie Mendez等.Encapsulation of adenovirus serotype 5 in anionic lecithin liposomes using a bead-based immunoprecipitation technique enhances transfection efficiency.《Biomaterials》.2014,(第35期),9554-9561. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115252582A (zh) | 2022-11-01 |
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