JP2023545886A - 脂質ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、脂質ナノ粒子(LNP)、より具体的にはイオン性脂質と、リン脂質と、ステロールと、PEG脂質と、1つ以上の核酸とを含む脂質ナノ粒子(LNP)の分野に関する。本発明のLNPは、約1mol%未満のC14-PEG2000脂質及び特定の割合の他の脂質を含むことを特徴とする。本発明は、核酸分子、具体的にはmRNAの免疫原性送達のためのLNPの使用を提供し、それによって、LNPがワクチンでの使用、例えば癌又は感染性疾患の治療に非常に適したものとなる。最後に、そのようなLNPを調製する方法を提供する。【選択図】図1JPEG2023545886000059.jpg70168
Description
本発明は、脂質ナノ粒子(LNP)、より具体的にはイオン性脂質と、リン脂質と、ステロールと、PEG脂質と、1つ以上の核酸とを含む脂質ナノ粒子(LNP)の分野に関する。本発明のLNPは、約1mol%未満のC14-PEG2000脂質と特定の割合の他の脂質とを含むことを特徴とする。本発明は、核酸分子、具体的にはmRNAの免疫原性送達のためのLNPの使用を提供し、それによって、LNPがワクチンでの使用、例えば癌又は感染性疾患の治療に非常に適したものとなる。最後に、そのようなLNPを調整する方法を提供する。
生物活性物質の標的化送達の分野における大きな課題の1つは、多くの場合、それらの不安定性及び低い細胞透過能である。これは、具体的には核酸分子、特に(m)RNA分子の送達の場合である。したがって、適したパッケージングが適切な保護及び送達のために極めて重要である。したがって、核酸等の生物活性物質のパッケージングのための方法及び組成物が引き続き必要とされている。
その点において、リポプレックス及びリポソーム等の脂質ベースのナノ粒子組成物が、細胞及び/又は細胞内区画への輸送を可能にする生物活性物質のパッケージングビヒクルとして使用されている。これらの脂質ベースのナノ粒子組成物は、典型的には、カチオン性脂質、イオン性脂質、リン脂質、構造脂質(ステロール又はコレステロール等)、PEG(ポリエチレングリコール)脂質等の種々の脂質の混合物を含む(非特許文献1に概説される)。
カチオン性又はイオン性脂質、リン脂質、ステロール及びPEG化脂質の4つの脂質の混合物から構成される脂質ベースのナノ粒子が、全身投与後の肝臓へのsiRNA及びmRNAの非免疫原性送達のために開発されている。そのような脂質組成物の多くは当該技術分野において既知であるが、invivoでのmRNA送達に使用されるものは、典型的には、少なくとも1.5 molのPEG脂質のレベルを含み、低いイオン性脂質:リン脂質の比、例えば約1:1~約5:1を有する。
しかしながら、現在、驚くべきことに、少量(すなわち、約1 mol%未満)でのPEG脂質の使用が、LNPの全身注射によるmRNAの免疫原性送達に非常に適したナノ粒子をもたらすことを見出した。これらの効果は、そのような低レベルのPEG脂質と、比較的高レベルのイオン性脂質(すなわち、55mol%~70 mol%)及び比較的低レベルのリン脂質(すなわち、約10 mol%未満)との組み合わせによって、したがってLNPが、イオン性脂質:リン脂質の比較的高い比(すなわち、6:1~11:1)を有する場合に、更により顕著であることが判明した。さらに、本発明のいくつかの実施の形態は、低い割合のステロール(すなわち、約30mol%未満、例えば約25 mol%)を特徴とする。
Reichmuth et al., 2016
第1の態様において、本発明は、
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
更なる態様において、本発明は、
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
本発明の更なる特定の実施の形態において、前記LNPは、約0.5 mol%~約0.9mol%の前記PEG脂質を含む。
別の特定の実施の形態において、前記リン脂質のモル百分率は、約10 mol%未満、好ましくは約5mol%である。
本発明の更なる実施の形態において、イオン性脂質対リン脂質の比は、5:1超、好ましくは約6:1~11:1、最も好ましくは約11:1である。
本発明のまた更なる実施の形態において、前記イオン性脂質のモル百分率は、約55 mol%~60 mol%である。
本発明の特定の実施の形態において、前記C14-PEG脂質は、ジミリストイル脂質であり、すなわち、2つのC14脂肪酸尾部を有し、例えば前記C14-PEG2000脂質は、好ましくは、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000(DMG-PEG2000)、又は2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミングリコール-2000(DMPE-PEG2000)を含むリストから選択される。
本発明の別の特定の実施の形態において、前記イオン性脂質は、
1,1'-((2-(4-(2-((2-(ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)エチル)アザンジイル)ビス(ドデカン-2-オール)(C12-200)、
ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、又は、
式(I)の化合物:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
及び
を含むリストから選択される)を含むリストから選択される。
1,1'-((2-(4-(2-((2-(ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)エチル)アザンジイル)ビス(ドデカン-2-オール)(C12-200)、
ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、又は、
式(I)の化合物:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
を含むリストから選択される)を含むリストから選択される。
好ましい実施の形態において、前記イオン性脂質は、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質である。
本発明のまた更なる実施の形態において、前記リン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)及びそれらの混合物、特にDOPE、DOPC及びそれらの混合物を含むリストから選択される。
本発明のまた更なる実施の形態において、前記ステロールは、コレステロール、エルゴステロール、カンペステロール、オキシステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール(nicasterol)、シトステロール及びスチグマステロールを含むリストから選択され、好ましくはコレステロールである。
本発明のまた更なる実施の形態において、前記LNPは、約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質を含む。
本発明の特定の実施の形態において、前記LNPは、
約50 mol%~70 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質と、
約0.5 mol%~0.9 mol%の前記PEG脂質と、
を含み、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
約50 mol%~70 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質と、
約0.5 mol%~0.9 mol%の前記PEG脂質と、
を含み、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
本発明の特定の実施の形態において、前記LNPは、
約50 mol%~60 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質と、
約0.5 mol%~0.9 mol%の前記PEG脂質と、
を含み、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
約50 mol%~60 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質と、
約0.5 mol%~0.9 mol%の前記PEG脂質と、
を含み、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
本発明の非常に具体的な実施の形態において、前記LNPは、
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約10 mol%のDOPEと、
約39.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約10 mol%のDOPEと、
約39.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施の形態において、前記LNPは、
約56.5 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%のDOPEと、
約38 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約56.5 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%のDOPEと、
約38 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施の形態において、前記LNPは、
約65 mol%の前記イオン性脂質と、
約9.5 mol%のDOPEと、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約65 mol%の前記イオン性脂質と、
約9.5 mol%のDOPEと、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
より具体的な実施の形態において、前記1つ以上のmRNA分子は、免疫調節ポリペプチドをコードするmRNA及び/又は抗原をコードするmRNAを含むリストから選択される。前記免疫調節をコードするmRNAは、例えば、CD40L、CD70及びcaTLR4をコードするmRNA分子を含むリストから選択され得る。
また更なる態様において、本発明は、本明細書に記載の1つ以上の脂質ナノ粒子と、許容される薬学的担体とを含む、薬学的組成物又はワクチンを提供する。
本発明はまた、人間医学又は獣医学において使用される、特に癌又は感染性疾患の治療で使用される本明細書に記載の脂質ナノ粒子、薬学的組成物、又はワクチンを提供する。
これより図面を具体的に参照するが、示される詳細は、例として、本発明の種々の実施形態の例示的な説明のみを目的とするものであることが強調される。これらの図面は、本発明の原理及び概念的態様の最も有用で容易な説明であると考えられるものを提供するために提示される。この点に関して、本発明の基礎的理解に必要とされるものよりも詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされていない。この説明は、図面とともに本発明のいくつかの形態を実際に具体化し得る方法を当業者に明らかとするものである。
本明細書において上記で既に詳述したように、本発明は、比較的少量(例えば、約1 mol%未満)で存在するC14-PEG脂質(例えば、C14-PEG2000脂質)を含むLNPを提供し、これについて、驚くべきことに、これらが核酸、特にmRNAの免疫原性送達に非常に適していることが見出された。
本発明の文脈において、「核酸分子の免疫原性送達」は、細胞への核酸分子の送達を意味し、それによって、前記核酸分子の細胞との接触、細胞内での内在化及び/又は発現が免疫応答の誘導をもたらす。
したがって、第1の態様において、本発明は、
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
更なる実施形態において、本発明は、
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
本発明の更なる特定の実施形態において、前記LNPは、約0.5 mol%~約0.9mol%の前記PEG脂質を含む。
脂質ナノ粒子(LNP)は、異なる脂質の組み合わせから構成されるナノサイズ粒子として一般に知られている。多くの異なるタイプの脂質がそのようなLNPに含まれ得るが、本発明のLNPは、典型的には、イオン性脂質、リン脂質、ステロール及びPEG脂質の組み合わせから構成される。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を特に核酸の全身投与、特に静脈内投与に適したものにする直径を有し、典型的には、1000ナノメートル(nm)未満、好ましくは500nm未満、更により好ましくは200 nm未満、例えば、50 nm~200 nm等の直径を有する任意の粒子を指し、好ましくは80 nm~160 nmである。
本発明の文脈において、「PEG脂質」又は代替的には「PEG化脂質」という用語は、PEG(ポリエチレングリコール)基で修飾された任意の好適な脂質であることを意味する。本発明のPEG脂質は、C14-PEG脂質であることを特徴とする。これらの脂質は、脂質の分子量を規定するポリエチレングリコール部分と、14個のC原子を有する脂肪酸尾部とを含有する。特定の実施形態において、前記C14-PEG2000脂質は、ジミリストイル系であり、すなわち、2つのC14尾部を有し、例えば、(ジミリストイル系)-PEG2000脂質、例えばDMG-PEG2000脂質(1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000)又は2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミングリコール-2000(DMPE-PEG2000)を含むリストから選択される。
本発明の文脈において、化合物又は脂質との関連における「イオン性」(又は代替的にはカチオン性)という用語は、イオン(通常はH+イオン)を得て、それ自体が正電荷を有するようになることで解離することが可能な前記化合物又は脂質中の任意の非荷電基の存在を意味する。代替的には、前記化合物又は脂質中の任意の非荷電基は、電子を得て、負電荷を有するようになってもよい。
本発明の文脈において、任意のタイプのイオン性脂質を好適に使用することができる。具体的には、好適なイオン性脂質は、S-S結合を介して連結した2つの同一の又は異なる尾部を含み、前記尾部のそれぞれが、
又は
で表されるようなイオン性アミンを含むイオン性アミノ脂質である。
で表されるようなイオン性アミンを含むイオン性アミノ脂質である。
特定の実施形態において、前記イオン性脂質は、式(I):
の化合物であり、
式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される。
式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される。
そのようなイオン性脂質は、具体的には、以下の式:
のいずれかで表され得る。
上記の脂質の後者は、実施例の部分で使用されるCoatsome SS-ECを表す。
より具体的には、前記イオン性脂質は、式(I)の脂質であり、式中、RCOOは、α-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
で表されるような、
である。
他の好適なイオン性脂質は、1,1'-((2-(4-(2-((2-(ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)エチル)アザンジイル)ビス(ドデカン-2-オール)(C12-200)、及びジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)から選択されてもよい。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、
式(I)の化合物:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
及び
を含むリストから選択される)と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
式(I)の化合物:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
を含むリストから選択される)と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、
式(I)の化合物:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
及び
を含むリストから選択される)と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
式(I)の化合物:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
を含むリストから選択される)と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
好ましい実施の形態において、前記イオン性脂質は、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質である。
本発明の文脈において、「リン脂質」という用語は、2つの疎水性脂肪酸「尾部」と、リン酸基からなる親水性「頭部」とからなる脂質分子であることを意味する。これら2つの成分は、ほとんどの場合、グリセロール分子によって結合されるため、本発明のリン脂質においては、好ましくはグリセロール-リン脂質である。さらに、リン酸基は、多くの場合、単純な有機分子で修飾され、例えばコリン(すなわち、ホスホコリンにする)又はエタノールアミン(すなわち、ホスホエタノールアミンにする)で修飾される。
本発明の文脈内で好適なリン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジウンデカノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DUPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0Diether PC)、1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、1-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16 Lyso PC)、1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(ME16.0 PE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)ナトリウム塩(DOPG)、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含むリストから選択することができる。
本発明の特定の実施形態において、リン脂質がDSPCとなるように選択される場合、イオン性脂質は有利にはDLin-MC3-DMAとなり得る。
より具体的な実施形態において、前記リン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)及びそれらの混合物、特にDOPE、DOPC及びそれらの混合物を含むリストから選択される。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、
式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
ステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
ステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、
式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
ステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
ステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
本発明の文脈において、ステロイドアルコールとしても既知の「ステロール」という用語は、植物、動物及び真菌において天然に存在するか、又はいくつかの細菌によって産生され得るステロイドの亜群である。本発明の文脈において、任意の好適なステロール、例えばコレステロール、エルゴステロール、カンペステロール、オキシステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、シトステロール及びスチグマステロールを含むリストから選択されるステロールを使用することができ、好ましくはコレステロールである。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、
式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、
式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するC14-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子であって、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子を提供する。
本発明の非常に具体的な実施形態において、前記脂質ナノ粒子は、
式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする。
式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする。
本発明の非常に具体的な実施形態において、前記脂質ナノ粒子は、
式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする。
式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
DOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
コレステロールと、
約1 mol%未満で存在するDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする。
さらに、本発明のLNPの免疫原性効果は、低レベルのPEG脂質と、比較的高レベルのイオン性脂質(すなわち、50mol%~70 mol%、例えば50 mol%~65 mol%又は55 mol%~60 mol%)及び比較的低レベルのリン脂質(すなわち、約10 mol%未満)の組み合わせを使用することによって、したがってLNPが、イオン性脂質:リン脂質の比較的高い比(すなわち、5:1~10:1、代替的には約6:1~約11:1)を有する場合に、更に高めることさえできることを見出した。したがって、高レベルのイオン性脂質は、例えば、約50mol%、約51 mol%、約52 mol%、約53 mol%、約54 mol%、約55 mol%、約56 mol%、約57 mol%、約58 mol%、約59mol%、約60 mol%、約61 mol%、約62 mol%、約63 mol%、約64 mol%、約65 mol%;約66 mol%、約67 mol%、約68mol%、約69 mol%;約70 mol%であり得る。
したがって、別の特定の実施形態において、前記リン脂質のモル百分率は、約5mol%~15 mol%のリン脂質;具体的には約5 mol%~10 mol%;より具体的には約10 mol%未満;例えば約9 mol%、約8 mol%、約7mol%、約6 mol%;約5 mol%;好ましくは約5 mol%である。
本発明の特定の実施形態において、前記LNPは、約5:1超、好ましくは約6:1超、より好ましくは8:1超、最も好ましくは約10:1;代替的には約6:1~11:1;より好ましくは約11:1、例えば約10.76:1のイオン性脂質対リン脂質の比を含む。
本発明のまた更なる実施形態において、前記イオン性脂質のモル百分率は、約50mol%~70 mol%;例えば50 mol%~65 mol%、具体的には約55 mol%~60 mol%である。
ステロールは、典型的にはバランサー脂質として使用され、いくつかの実施形態において、約25mol%超、例えば約25 mol%、約26 mol%、約27 mol%、約28 mol%、約29 mol%の量になる。代替的に、ステロールは、約30 mol%超;例えば約30mol%;約31 mol%;約32 mol%;約33 mol%;約34 mol%;約35 mol%等の量になる。特定の実施形態において、コレステロールの量は、約25mol%~29 mol%である。したがって、ステロールの濃度は通常、完全に100%となるようにするために、他の脂質の濃度に対して計量される。したがって、ステロールの量は、100mol%からリン脂質のmol%を引き、そこからPEG脂質のmol%を引き、そこからイオン性脂質のmol%を引いたものとして計算することができる。
したがって、本発明の特定の実施形態において、以下:
前記LNPは、約50 mol%~70 mol%、代替的には約50mol%~65 mol%、又は50 mol%~60 mol%、例えば約55 mol%~60 mol%の前記イオン性脂質を含む;
前記LNPは、約5 mol%~15 mol%、好ましくは約10 mol%未満、最も好ましくは約5mol%の前記リン脂質を含む;
前記LNPは、約0.5 mol%~0.9 mol%の前記PEG脂質を含む;
のうちの1つ以上が適用され、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
前記LNPは、約50 mol%~70 mol%、代替的には約50mol%~65 mol%、又は50 mol%~60 mol%、例えば約55 mol%~60 mol%の前記イオン性脂質を含む;
前記LNPは、約5 mol%~15 mol%、好ましくは約10 mol%未満、最も好ましくは約5mol%の前記リン脂質を含む;
前記LNPは、約0.5 mol%~0.9 mol%の前記PEG脂質を含む;
のうちの1つ以上が適用され、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
したがって、本発明の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%~70 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
約5 mol%~15 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
バランスを保つためのコレステロールと、
約0.5 mol%~0.9 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約50 mol%~70 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
約5 mol%~15 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
バランスを保つためのコレステロールと、
約0.5 mol%~0.9 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
したがって、本発明の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%~60 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
及び
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
である式(I)の脂質と、
約5 mol%~15 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
バランスを保つためのコレステロールと、
約0.5 mol%~0.9 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約50 mol%~60 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
を含むリストから選択される)、特に、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
約5 mol%~15 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
バランスを保つためのコレステロールと、
約0.5 mol%~0.9 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
本発明の文脈において、mol%が使用される場合、それは、空のナノ粒子、すなわち、核酸を含まないナノ粒子に対する特定の成分のmol%であることを意味する。これは、成分のmol%が、前記LNP中に存在するイオン性脂質、リン脂質、ステロール及びPEG脂質の総量に対して計算されることを意味する。
本発明の特定の実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%~60 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質と、
約0.5 mol%~0.9 mol%の前記DMG-PEG2000脂質と、
を含み、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
約50 mol%~60 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%~15 mol%の前記リン脂質と、
約0.5 mol%~0.9 mol%の前記DMG-PEG2000脂質と、
を含み、
前記ステロールの量によってバランスが保たれる。
本発明の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約56.5 mol%の前記イオン性脂質と、
約5.25 mol%のDOPEと、
約37.75 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約56.5 mol%の前記イオン性脂質と、
約5.25 mol%のDOPEと、
約37.75 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約10 mol%のDOPEと、
約39.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約10 mol%のDOPEと、
約39.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約11 mol%のDOPEと、
約38.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約11 mol%のDOPEと、
約38.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
本発明の更に別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約7.76 mol%のDOPEと、
約41.66 mol%のコレステロールと、
約0.58 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約50 mol%の前記イオン性脂質と、
約7.76 mol%のDOPEと、
約41.66 mol%のコレステロールと、
約0.58 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約65 mol%の前記イオン性脂質と、
約9.5 mol%のDOPEと、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
約65 mol%の前記イオン性脂質と、
約9.5 mol%のDOPEと、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む。
したがって、本発明の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
である)と、
約10 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約39.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約50 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
約10 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約39.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約56.5 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
である)と、
約5.25 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約37.75 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約56.5 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
約5.25 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約37.75 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約65 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
である)と、
約9.5 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約65 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
約9.5 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
である)と、
約11 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約38.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約50 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
約11 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約38.5 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
本発明の別の非常に具体的な実施形態において、前記LNPは、
約50 mol%の式(I)のイオン性脂質:
(式中、
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
である)と、
約7.76 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約41.66 mol%のコレステロールと、
約0.58 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
約50 mol%の式(I)のイオン性脂質:
RCOOはα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xは、
約7.76 mol%のDOPC及びDOPE、又はそれらの混合物から選択されるリン脂質と、
約41.66 mol%のコレステロールと、
約0.58 mol%のDMG-PEG2000脂質と、
1つ以上の核酸分子、特にmRNA分子と、
を含む。
本発明の文脈における他の特に好適なLNPの組成を表1に示す。
他の特に好適なLNPは、
50/10/39.5/0.5
56.5/5/38/0.5
50/11/38.5/0.5
50/7.76/41.66/0.58
65/9.5/25/0.5
のイオン性脂質/リン脂質/ステロール/C14-PEG2000脂質比を特徴とする。
50/10/39.5/0.5
56.5/5/38/0.5
50/11/38.5/0.5
50/7.76/41.66/0.58
65/9.5/25/0.5
のイオン性脂質/リン脂質/ステロール/C14-PEG2000脂質比を特徴とする。
本発明者らは、本発明のLNPが、核酸の免疫原性送達に特に好適であることを見出した。したがって、本発明は、1つ以上の核酸分子、例えばDNA又はRNA、より具体的にはmRNAを含むLNPを提供する。
前記LNP中の核酸の量は、典型的には、モル比、すなわち、RNAのリン酸に対するカチオン性脂質(イオン性脂質)の比で表される。本発明の文脈において、LNPのモル比は、約4:1~16:1である。
前記LNP中の核酸の量は、代替的には、N/P比、すなわち、核酸中のリン酸基に対するイオン性脂質中の窒素原子の比で表すことができる。本発明の文脈において、LNPのN/P比は、約4:1~16:1である。
本発明の文脈における「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)又は好ましくはリボ核酸(RNA)、より好ましくはmRNAである。核酸には、本発明によれば、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換えによって作製された分子及び化学的に合成された分子が含まれる。核酸は、本発明によれば、一本鎖又は二本鎖であり、線状又は共有結合閉環状(closedcovalently to form a circle)である分子の形態であり得る。核酸は、例えば、DNA鋳型からin vitro転写によって作製され得るRNAの形態で細胞への導入、すなわち、細胞のトランスフェクションに用いることができる。RNAは、更に、配列の安定化、キャッピング、及び/又はポリアデニル化によって、適用前に修飾することができる。
本発明の文脈において、「RNA」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に、又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成されている分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β-D-リボフラノシル基の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語には、二本鎖RNA、一本鎖RNA、単離RNA、例えば部分的に精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換えによって作製されたRNA、並びに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は変化によって天然に存在するRNAとは異なる修飾RNAが含まれる。そのような変化としては、例えばRNAの末端(複数の場合もある)への、又は内部での、例えば、RNAの1つ以上のヌクレオチドでの非ヌクレオチド物質の付加を挙げることができる。RNA分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば天然に存在しないヌクレオチド、又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドもまた含むことができる。これらの変化したRNAは、アナログと称される場合がある。核酸は、ベクターに含まれていてもよい。本明細書で使用される「ベクター」という用語には、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体等の人工染色体ベクター、又は天然に存在するRNAのアナログを含む当業者に既知の任意のベクターが含まれる。
本発明によれば、「RNA」という用語は、「mRNA」を含み、好ましくは「mRNA」に関し、「mRNA」は、「メッセンジャーRNA」を意味し、鋳型としてDNAを使用して作製することができ、ペプチド又はタンパク質をコードする「転写物」に関する。mRNAは、典型的には、5'非翻訳領域(5'-UTR)、タンパク質又はペプチドのコード領域及び3'非翻訳領域(3'-UTR)を含む。mRNAは、細胞内及びinvitroで限られた半減期を有する。好ましくは、mRNAは、DNA鋳型を使用したin vitro転写によって作製される。本発明の一実施形態において、RNAは、invitro転写又は化学合成によって得られる。in vitro転写の方法論は、当業者に既知である。例えば、様々な市販のin vitro転写キットがある。
本発明の特定の実施形態において、前記mRNA分子は、免疫調節タンパク質をコードするmRNA分子である。
本発明の文脈において、「免疫調節タンパク質をコードするmRNA分子」という用語は、抗原提示細胞、より具体的には樹状細胞の機能性を変更するタンパク質をコードするmRNA分子であることを意味する。そのような分子は、CD40L、CD70、caTLR4、IL-12p70、L-セレクチン、CCR7、及び/又は4-1BBL、ICOSL、OX40L、IL-21を含むリストから選択される場合があり、より具体的にはCD40L、CD70及びcaTLR4のうちの1つ以上である場合がある。本発明の方法において使用される免疫刺激因子の好ましい組み合わせは、CD40L及びcaTLR4(すなわち、「DiMix」)である。別の好ましい実施形態において、本明細書において「TriMix」とも呼ばれるCD40L、CD70及びcaTLR4免疫刺激分子の組み合わせが使用される。
別の特定の実施形態において、前記mRNA分子は、抗原特異的及び/又は疾患特異的タンパク質をコードするmRNA分子である。
本発明によれば、「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす及び/又はそれに対して免疫応答が指向される少なくとも1つのエピトープを含む任意の分子、好ましくはペプチド又はタンパク質を含み、したがって、抗原という用語はまた、抗原からの最小エピトープを包含することを意味する。本明細書で定義される「最小エピトープ」は、免疫応答を引き起こすことができる最小構造であることを意味する。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、任意にプロセシング後に、好ましくは抗原又は抗原を発現する細胞に特異的である免疫応答を誘導する分子である。特に、「抗原」は、任意にプロセシング後にMHC分子によって提示され、Tリンパ球(T細胞)と特異的に反応する分子に関する。
特定の実施形態において、抗原は、腫瘍抗原、又は細菌抗原、ウイルス抗原若しくは真菌抗原であり得る標的特異的抗原である。前記標的特異的抗原は、標的細胞(複数の場合もある)から単離された全mRNA、1つ以上の特定の標的mRNA分子、標的細胞(複数の場合もある)のタンパク質溶解物、標的細胞(複数の場合もある)に由来する特定のタンパク質、又は合成標的特異的ペプチド若しくはタンパク質、及び標的特異的抗原若しくはその誘導ペプチドをコードする合成mRNA若しくはDNAのいずれか1つに由来し得る。
あらゆる誤解を避けるために、本発明のLNPは、単一のmRNA分子を含んでいてもよく、又は複数のmRNA分子、例えば免疫調節タンパク質をコードする1つ以上のmRNA分子、及び/又は抗原特異的及び/又は疾患特異的タンパク質をコードする1つ以上のmRNA分子の組み合わせを含んでいてもよい。
非常に具体的な実施形態において、免疫調節分子をコードする前記mRNA分子を、抗原特異的及び/又は疾患特異的タンパク質をコードする1つ以上のmRNA分子と組み合わせることができる。例えば、本発明のLNPは、抗原特異的及び/又は疾患特異的タンパク質をコードする1つ以上のmRNA分子と組み合わされた免疫刺激分子CD40L、CD70及び/又はcaTLR4(Dimix又はTrimix等)をコードするmRNA分子を含み得る。したがって、非常に具体的な実施形態において、本発明のLNPは、抗原特異的及び/又は疾患特異的タンパク質をコードする1つ以上のmRNA分子と組み合わされたCD40L、CD70及び/又はcaTLR4をコードするmRNA分子を含む。
更なる態様において、本発明は、本明細書で定義される1つ以上のLNPを含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、ワクチンとして特に好適である。したがって、本発明は、本発明による1つ以上のLNPを含むワクチンもまた提供する。
本発明の文脈において、本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、疾患に対する適応免疫(抗体及び/又はT細胞応答)をもたらすことを意図した任意の調製物であることを意味する。その目的で、本明細書において意図されるワクチンは、適応免疫応答が開始される抗原をコードする少なくとも1つのmRNA分子を含有する。この抗原は、弱毒化したか、若しくは死んだ状態の微生物、タンパク質若しくはペプチド、又は抗原をコードする核酸の形で存在し得る。本発明の文脈における抗原は、宿主の免疫系によって異物として認識され、それによって、そのような抗原に対抗する目的で、それらに対する抗体の産生を刺激するタンパク質又はペプチドであることを意味する。ワクチンは、予防ワクチン(例えば、任意の天然又は「野生」病原体による将来の感染の影響を防止又は改善する)、又は治療ワクチン(例えば、進行中の疾患の症状を積極的に治療又は軽減する)であり得る。ワクチンの投与は、ワクチン接種と呼ばれる。
本発明のワクチンは、免疫応答、特に疾患関連抗原又は疾患関連抗原を発現する細胞に対する免疫応答、例えば癌に対する免疫応答を誘導するために使用することができる。したがって、ワクチンは、疾患関連抗原又は疾患関連抗原を発現する細胞が関与する疾患、例えば癌の予防処置及び/又は治療処置に使用することができる。前記免疫応答は、T細胞応答であることが好ましい。一実施形態において、疾患関連抗原は腫瘍抗原である。本明細書に記載のナノ粒子中に含まれるRNAによってコードされる抗原は、好ましくは疾患関連抗原であるか、又は疾患関連抗原若しくは疾患関連抗原を発現する細胞に対する免疫応答を引き起こす。
本発明のLNP及びワクチンは、具体的には、静脈内投与、すなわち、静脈への液体物質の直接注入を意図している。静脈内経路は、流体及び薬剤を体全体、すなわち、全身的に送達するための最速の方法である。したがって、本発明は、静脈内ワクチン、並びに静脈内投与用の開示のワクチン及びLNPの使用を提供する。したがって、本発明のワクチン及びLNPは、静脈内投与することができる。本発明は、本発明によるワクチン及びLNPの使用もまた提供し、このワクチンは静脈内投与される。
特に、本発明のLNPの免疫原性は、複数回の免疫化によって増加することが見出された。したがって、特定の実施形態において、本明細書で定義されるLNPは、ワクチン接種目的で使用されるものであり、LNPは、特定の間隔内で少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回投与される。
本発明は、人間医学又は獣医学において使用される本発明によるLNP、薬学的組成物及びワクチンもまた提供する。人間医学又は獣医学のための本発明によるLNP、薬学的組成物及びワクチンの使用もまた意図される。最後に、本発明は、本発明によるLNP、薬学的組成物及びワクチンを、それらを必要とする対象に投与することによる、ヒト及び動物の障害の予防方法及び治療方法を提供する。
本発明は更に、前記1つ以上の核酸分子の免疫原性送達のための本発明によるLNP、薬学的組成物又はワクチンの使用を提供する。そのため、本発明のLNP、薬学的組成物及びワクチンは、いくつかのヒト及び動物の障害の治療において非常に有用である。したがって、本発明は、癌又は感染性疾患の治療に使用される本発明のLNP、薬学的組成物及びワクチンを提供する。
本発明の脂質ナノ粒子は、実施例の部分に明記されているプロトコルに従って調製することができる。より一般的には、LNPは、
前記イオン性脂質、前記リン脂質、前記ステロール、前記PEG脂質、及び好適なアルコール溶媒を含む第1のアルコール組成物を調製することと、
前記1つ以上の核酸及び水性溶媒を含む第2の水性組成物を調製することと、
前記第1の組成物及び第2の組成物をマイクロ流体混合装置内で混合することと、
を含む方法を使用して調製することができる。
前記イオン性脂質、前記リン脂質、前記ステロール、前記PEG脂質、及び好適なアルコール溶媒を含む第1のアルコール組成物を調製することと、
前記1つ以上の核酸及び水性溶媒を含む第2の水性組成物を調製することと、
前記第1の組成物及び第2の組成物をマイクロ流体混合装置内で混合することと、
を含む方法を使用して調製することができる。
更に詳細には、脂質成分は、エタノール等のアルコール性ビヒクル中で好適な濃度で組み合わされる。そこへ、核酸を含む水性組成物を添加し、続いてマイクロ流体混合装置に投入する。
マイクロ流体混合の目的は、マイクロスケール装置での複数の試料(すなわち、脂質相及び核酸相)の完全及び迅速な混合を達成することである。そのような試料混合は、典型的には、異なる種の流れ間の拡散効果を高めることによって達成される。そこへ、例えば、Leeら、2011に概説されるようないくつかのマイクロ流体混合装置を使用することができる。本発明による特に好適なマイクロ流体混合装置は、PrecisionNanosystemsのNanoAssemblrである。
本発明のLNPを調製するのに好適な他の技術には、好適な分散媒体、例えば、水性溶媒及びアルコール溶媒中に成分を分散させること、並びに以下の方法:エタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチプレス法、コール酸法、Ca2+融合法、凍結融解法、逆相蒸発法、T字管混合(T-junctionmixing)、マイクロ流体力学的フォーカシング(Microfluidic Hydrodynamic Focusing)、スタッガードヘリングボーン混合(StaggeredHerringbone Mixing)等のうちの1つ以上を適用することが含まれる。
実施例1~実施例3の材料及び方法
マウス
雌のC57BL/6マウスをCharles River Laboratories(フランス)から購入し、標準的な床敷材及びケージエンリッチメントを有する個別に換気されたケージで飼育した。動物を、動物実験のための機関(ブリュッセル自由大学(VrijeUniversiteit Brussel))及び欧州連合のガイドラインに従って維持し、処置した。マウスは餌及び水を自由に摂取することができた。実験は、マウスが生後6週~10週になったときに開始した。マウスにLNP中の10μgのmRNAを、尾静脈を介して静脈内注射した(容量200 μL)。対照マウスには200 μlのTBS(トリス緩衝生理食塩水)を同じ時間間隔で注射した。マウスの体重を2日毎にモニターした。
マウス
雌のC57BL/6マウスをCharles River Laboratories(フランス)から購入し、標準的な床敷材及びケージエンリッチメントを有する個別に換気されたケージで飼育した。動物を、動物実験のための機関(ブリュッセル自由大学(VrijeUniversiteit Brussel))及び欧州連合のガイドラインに従って維持し、処置した。マウスは餌及び水を自由に摂取することができた。実験は、マウスが生後6週~10週になったときに開始した。マウスにLNP中の10μgのmRNAを、尾静脈を介して静脈内注射した(容量200 μL)。対照マウスには200 μlのTBS(トリス緩衝生理食塩水)を同じ時間間隔で注射した。マウスの体重を2日毎にモニターした。
ADPGK合成長鎖ペプチド(SLP)によるワクチン接種の場合において、マウスに200μlのPBS中の50 μgのADPGK SLP(GIPVHLELASMTNMELMSSIVHQQVFPT(配列番号3)、Genscript)、50 μgの抗CD40Mab(クローンFJK45、BioXCell)及び100 μgのpIC HMW(InvivoGen)の組み合わせを同一の時間間隔で腹腔内注射した。
mRNAの合成及び精製
キャッピングされた非ヌクレオシド修飾E7及びADPGK mRNAは、国際公開第2015071295号に記載されているプロトコルに従って、eTheRNAプラスミドpEthernaからのinvitro転写(IVT)により、eTheRNAによって調製された。HPV16-E7又はADPGKタンパク質をコードする配列を、ヒトDC-LAMPのシグナル配列と膜貫通領域及び細胞質領域との間にインフレームでクローニングした。このキメラ遺伝子を、5'末端の翻訳エンハンサー及び3'末端のRNA安定化配列で強化されたpEthernaプラスミド中にクローニングした。IVT後に、dsRNAをセルロース精製により除去した。セルロース粉末はSigmaから購入し、16%のエタノールを含む1×STE(塩化ナトリウム-トリス-EDTA)バッファー中で洗浄した。IVTmRNA(16%のエタノールを含む1×STEバッファー中)を、洗浄したセルロースペレットに添加し、室温で20分間振盪した。次いで、この溶液を真空フィルター(Corning)にかけた。溶出液は、ssRNA画分を含有しており、これを全ての実験に使用した。mRNA品質は、キャピラリーゲル電気泳動(Agilent、ベルギー)によってモニターした。
キャッピングされた非ヌクレオシド修飾E7及びADPGK mRNAは、国際公開第2015071295号に記載されているプロトコルに従って、eTheRNAプラスミドpEthernaからのinvitro転写(IVT)により、eTheRNAによって調製された。HPV16-E7又はADPGKタンパク質をコードする配列を、ヒトDC-LAMPのシグナル配列と膜貫通領域及び細胞質領域との間にインフレームでクローニングした。このキメラ遺伝子を、5'末端の翻訳エンハンサー及び3'末端のRNA安定化配列で強化されたpEthernaプラスミド中にクローニングした。IVT後に、dsRNAをセルロース精製により除去した。セルロース粉末はSigmaから購入し、16%のエタノールを含む1×STE(塩化ナトリウム-トリス-EDTA)バッファー中で洗浄した。IVTmRNA(16%のエタノールを含む1×STEバッファー中)を、洗浄したセルロースペレットに添加し、室温で20分間振盪した。次いで、この溶液を真空フィルター(Corning)にかけた。溶出液は、ssRNA画分を含有しており、これを全ての実験に使用した。mRNA品質は、キャピラリーゲル電気泳動(Agilent、ベルギー)によってモニターした。
mRNAの脂質ベースのナノ粒子の生成
脂質ベースのナノ粒子は、酢酸ナトリウムバッファー(100mM、pH4)中のmRNA溶液と脂質溶液とを2:1の体積比で9 mL/分の速度でNanoAssemblr Benchtop(PrecisionNanosystems)を使用してマイクロ流体混合することによって製造した。脂質溶液は、CoatsomeSS-EC(NOF corporation)、DOPE(Avanti)、コレステロール(Sigma)及びDMG-PEG2000(C14脂質)(SunbrightGM-020、NOF corporation)の混合物を含有していた。4種の脂質を異なるモル比で混合した。LNPを、slide-a-lyzer透析カセット(20KMWCO、3 mL、ThermoFisher)を使用して、TBS(TBS容量はLNP容量よりも10000倍多い)に対して透析した。
脂質ベースのナノ粒子は、酢酸ナトリウムバッファー(100mM、pH4)中のmRNA溶液と脂質溶液とを2:1の体積比で9 mL/分の速度でNanoAssemblr Benchtop(PrecisionNanosystems)を使用してマイクロ流体混合することによって製造した。脂質溶液は、CoatsomeSS-EC(NOF corporation)、DOPE(Avanti)、コレステロール(Sigma)及びDMG-PEG2000(C14脂質)(SunbrightGM-020、NOF corporation)の混合物を含有していた。4種の脂質を異なるモル比で混合した。LNPを、slide-a-lyzer透析カセット(20KMWCO、3 mL、ThermoFisher)を使用して、TBS(TBS容量はLNP容量よりも10000倍多い)に対して透析した。
フローサイトメトリー
免疫化後の約6日目に、処置マウス及び対照マウスから血液を採取した。赤血球を溶解し、残りの白血球を、製造業者の取扱説明書(MBLInternational)に従って、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体(配列番号1)又はADPGK(ASMTNMELM)-四量体(配列番号2)で染色した。過剰な四量体は洗い流した。その後、表面分子に対する抗体混合物(表2に記載)を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。LSRFortessaサイトメーターでデータを取得し、Flow Joソフトウェアで分析した。
免疫化後の約6日目に、処置マウス及び対照マウスから血液を採取した。赤血球を溶解し、残りの白血球を、製造業者の取扱説明書(MBLInternational)に従って、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体(配列番号1)又はADPGK(ASMTNMELM)-四量体(配列番号2)で染色した。過剰な四量体は洗い流した。その後、表面分子に対する抗体混合物(表2に記載)を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。LSRFortessaサイトメーターでデータを取得し、Flow Joソフトウェアで分析した。
結果
実施例1.マウスにSS-EC/DOPE/コレステロール/DMG-PEG2000から構成されるE7 mRNALNPを、示したモル比で3回静脈内免疫化した。それぞれのmRNA LNP組成物によって誘発されたE7特異的CD8 T細胞の割合は、各免疫化後にフローサイトメトリーによって血液において評価した。図1から明らかなように、0.5mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPは、1 mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPと比較して、はるかに高いE7特異的CD8T細胞応答を誘発した。
実施例1.マウスにSS-EC/DOPE/コレステロール/DMG-PEG2000から構成されるE7 mRNALNPを、示したモル比で3回静脈内免疫化した。それぞれのmRNA LNP組成物によって誘発されたE7特異的CD8 T細胞の割合は、各免疫化後にフローサイトメトリーによって血液において評価した。図1から明らかなように、0.5mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPは、1 mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPと比較して、はるかに高いE7特異的CD8T細胞応答を誘発した。
実施例2.マウスにSS-EC/DOPE/コレステロール/DMG-PEG2000から構成されるE7 mRNALNPを、示したモル比で3回静脈内免疫化した。それぞれのmRNA LNP組成物によって誘発されたE7特異的CD8 T細胞の割合は、各免疫化後にフローサイトメトリーによって血液において評価した。図2から明らかなように、0.5mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPは、2 mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPと比較して、はるかに高いE7特異的CD8T細胞応答を誘発し、この効果は3回の免疫化後に更により顕著であった。
実施例3.マウスに低割合PEG LNP(50/10/39.5/0.5のイオン性脂質/DOPE/コレステロール/PEG-脂質)にパッケージ化された10μgのADPGK mRNA又は50 μgのADPGK合成長鎖ペプチド(SLP)を4回静脈内投与した。血液中のADPGK特異的CD8+T細胞の割合を、4回目の免疫化後6日目に決定した。0.5mol%のDMG-PEG2000にて配合したmRNA LNPは、SLPと比較して、抗原特異的免疫応答の誘発において優れていた(図3)。
実施例4~実施例8の材料及び方法
動物
全てのマウス実験は、UMCユトレヒトのユトレヒト動物福祉団体(UtrechtAnimal Welfare Body)又はゲント大学の動物倫理委員会による承認を得て実施された。動物の管理は、定められたガイドラインに従った。全てのマウスは、水及び標準的な実験動物用飼料を無制限に摂取できた。雌のC57Bl/6Jマウスは、CharlesRiver Laboratories, Inc.(ドイツ/フランス)から入手した。
動物
全てのマウス実験は、UMCユトレヒトのユトレヒト動物福祉団体(UtrechtAnimal Welfare Body)又はゲント大学の動物倫理委員会による承認を得て実施された。動物の管理は、定められたガイドラインに従った。全てのマウスは、水及び標準的な実験動物用飼料を無制限に摂取できた。雌のC57Bl/6Jマウスは、CharlesRiver Laboratories, Inc.(ドイツ/フランス)から入手した。
mRNAの合成及び精製
コドン最適化E7、TriMix及びルシフェラーゼmRNAは、eTheRNAプラスミドからのinvitro転写(IVT)により、eTheRNAによって調製された。ヌクレオチド修飾は使用しなかった。DOEで使用したE7 mRNAは、ARCAキャッピングした。その後の全ての実験は、CleanCapでキャッピングされたmRNA(CleanCappedmRNAs)を使用して実施した。IVT後に、dsRNAをセルロース精製により除去した。mRNA品質は、キャピラリーゲル電気泳動(Agilent、ベルギー)によってモニターした。Cleancap(商標)Cy5標識Fluc mRNA(5-メトキシウリジン修飾及びシリカ精製)は、TriLink Biotechnologiesから購入した。
コドン最適化E7、TriMix及びルシフェラーゼmRNAは、eTheRNAプラスミドからのinvitro転写(IVT)により、eTheRNAによって調製された。ヌクレオチド修飾は使用しなかった。DOEで使用したE7 mRNAは、ARCAキャッピングした。その後の全ての実験は、CleanCapでキャッピングされたmRNA(CleanCappedmRNAs)を使用して実施した。IVT後に、dsRNAをセルロース精製により除去した。mRNA品質は、キャピラリーゲル電気泳動(Agilent、ベルギー)によってモニターした。Cleancap(商標)Cy5標識Fluc mRNA(5-メトキシウリジン修飾及びシリカ精製)は、TriLink Biotechnologiesから購入した。
LNPの製造及び特性評価
生体内分布及び細胞取り込み試験では、LNPにホタルルシフェラーゼ(Fluc)をコードするmRNA(eTheRNA免疫療法NV)とCleancap(商標)Cy5標識Fluc mRNA(TriLinkBiotechnologies)との混合物を1:1の比でロードした。DoE免疫原性試験では、LNPにE7mRNAをロードした。他の全ての試験は、E7、マウスCD40L、マウスCD70及び構成的活性型TLR4 mRNAの混合物を3:1:1:1の比で用いて実施した。mRNAを100mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH4)に希釈し、脂質をエタノールに溶解し、希釈した。mRNA及び脂質溶液を、NanoAssemblr Benchtopマイクロ流体混合システム(PrecisionNanosystems)を使用して混合し、続いてトリス緩衝生理食塩水(TBS、20 mMのトリス、0.9%のNaCl、pH7.4)に対して一晩透析した。LNPの濃縮には、Amicon超遠心フィルター(10kD)を使用した。Zetasizer Nano(Malvern)を用いて、サイズ、多分散指数及びゼータ電位を測定した。mRNA封入効率は、リボグリーンアッセイ(ThermoFisher)により決定した。全てのLNPの組成を、表2に要約する。
生体内分布及び細胞取り込み試験では、LNPにホタルルシフェラーゼ(Fluc)をコードするmRNA(eTheRNA免疫療法NV)とCleancap(商標)Cy5標識Fluc mRNA(TriLinkBiotechnologies)との混合物を1:1の比でロードした。DoE免疫原性試験では、LNPにE7mRNAをロードした。他の全ての試験は、E7、マウスCD40L、マウスCD70及び構成的活性型TLR4 mRNAの混合物を3:1:1:1の比で用いて実施した。mRNAを100mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH4)に希釈し、脂質をエタノールに溶解し、希釈した。mRNA及び脂質溶液を、NanoAssemblr Benchtopマイクロ流体混合システム(PrecisionNanosystems)を使用して混合し、続いてトリス緩衝生理食塩水(TBS、20 mMのトリス、0.9%のNaCl、pH7.4)に対して一晩透析した。LNPの濃縮には、Amicon超遠心フィルター(10kD)を使用した。Zetasizer Nano(Malvern)を用いて、サイズ、多分散指数及びゼータ電位を測定した。mRNA封入効率は、リボグリーンアッセイ(ThermoFisher)により決定した。全てのLNPの組成を、表2に要約する。
T細胞応答
マウスを週間隔で選択したLNP中の10 μgのmRNAで尾静脈を介して静脈内免疫化した。フローサイトメトリー染色のための血液を、免疫化後5日目~7日目に採取した。赤血球の溶解後、細胞をFcRブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体を添加し、室温で30分間インキュベートした。過剰な四量体を洗い流し、表面分子CD3及びCD8に対する抗体混合物を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。試料を、3レーザーAtuneNxtフローサイトメーター又は4レーザーBDLSRFortessaフローサイトメーターで取得した。
マウスを週間隔で選択したLNP中の10 μgのmRNAで尾静脈を介して静脈内免疫化した。フローサイトメトリー染色のための血液を、免疫化後5日目~7日目に採取した。赤血球の溶解後、細胞をFcRブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体を添加し、室温で30分間インキュベートした。過剰な四量体を洗い流し、表面分子CD3及びCD8に対する抗体混合物を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。試料を、3レーザーAtuneNxtフローサイトメーター又は4レーザーBDLSRFortessaフローサイトメーターで取得した。
脾臓における細胞内サイトカイン産生を、3回目の免疫化後7日目に決定した。脾臓を破砕し、赤血球を溶解し、試料を40μMのセルストレーナーで濾過することによって、脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。200.000細胞/ウェル/試料を、96ウェルプレートに2回播種した。4 μgのE7ペプチド(Genscript)を添加し刺激してから、細胞を37℃でインキュベートした。ペプチド刺激の1時間後、GolgiPlug(BDCytofix/Cytoperm kit(BD Biosciences))を添加した。細胞を更に4時間インキュベートした。その後、細胞をFcRブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体を添加し、室温で30分間インキュベートした。過剰なデキストラマーを洗い流し、表面分子CD3及びCD8に対する抗体混合物を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。更なる工程は、BDCytofix/Cytoperm kit(BD Biosciences)の製造業者の取扱説明書に従った。透過処理後、細胞をIFN-γ及びTNF-αについて染色した。試料を4レーザーBDLSRFortessaフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェアを使用して行った。
炎症性サイトカイン
血液試料は、各免疫化(0日目、7日目、14日目及び50日目)の6時間後にゲル凝固因子(Sarstedt)の入ったチューブに採取した。凝固した血液試料を10.000gで5分間遠心分離して血清を得た。血清試料は分析まで-80℃で保存した。ProcartaPlexマルチプレックスアッセイ(ThermoFisher)を使用して、IFN-α、IFN-γ、IP-10の濃度を決定した。血清試料をアッセイバッファーで3倍に希釈し、蛍光標識ビーズとともに120分間インキュベートした。更なる工程をプロトコルに従って実施した。試料はMagPixintstrument(Luminex)で取得した。データはProcartaPlex Analystソフトウェアを使用して分析した。
血液試料は、各免疫化(0日目、7日目、14日目及び50日目)の6時間後にゲル凝固因子(Sarstedt)の入ったチューブに採取した。凝固した血液試料を10.000gで5分間遠心分離して血清を得た。血清試料は分析まで-80℃で保存した。ProcartaPlexマルチプレックスアッセイ(ThermoFisher)を使用して、IFN-α、IFN-γ、IP-10の濃度を決定した。血清試料をアッセイバッファーで3倍に希釈し、蛍光標識ビーズとともに120分間インキュベートした。更なる工程をプロトコルに従って実施した。試料はMagPixintstrument(Luminex)で取得した。データはProcartaPlex Analystソフトウェアを使用して分析した。
TC-1腫瘍実験
TC-1細胞は、ライデン大学医療センターから入手した。50 μLのPBS中の50万個のTC-1細胞を、マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍測定は、ノギスを使用して実施した。腫瘍体積は、(最小直径2×最大直径)/2として計算した。Ant-PD-1及びアイソタイプ対照抗体を、新たにPBS中でマウス当たり200μL中200 μgの濃度まで希釈し、腹腔内注射した。マウスに抗PD-1抗体(単剤療法又はmRNA LNP免疫化との併用)か、又はアイソタイプ対照(LNP免疫化との併用)のいずれかを投与した。抗体は、最初のmRNALNP免疫化後3日目から開始し、最後のLNP注射後2週間で終了するまで、3日~4日毎に注射した。腫瘍浸潤リンパ球の分析のために、腫瘍を2回目のmRNA LNP免疫化後3日目に単離し、MACS組織保存バッファー(MiltenyiBiotec)で満たされた24ウェルプレートに入れた。腫瘍を細切し、消化バッファー中で1時間、規則的に振盪しながらインキュベートした。その後、赤血球を溶解し、全ての試料を70μMのセルストレーナーで濾過した。リンパ球をficoll-paque密度勾配精製によって濃縮してから、染色に進めた。最初に、細胞をFcRブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体を添加し、室温で30分間インキュベートした。過剰な四量体を洗い流し、表面分子CD45及びCD8に対する抗体混合物を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。試料を3レーザーAtuneNxtフローサイトメーター又は4レーザーBD LSRFortessaフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェアを使用して行った。
TC-1細胞は、ライデン大学医療センターから入手した。50 μLのPBS中の50万個のTC-1細胞を、マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍測定は、ノギスを使用して実施した。腫瘍体積は、(最小直径2×最大直径)/2として計算した。Ant-PD-1及びアイソタイプ対照抗体を、新たにPBS中でマウス当たり200μL中200 μgの濃度まで希釈し、腹腔内注射した。マウスに抗PD-1抗体(単剤療法又はmRNA LNP免疫化との併用)か、又はアイソタイプ対照(LNP免疫化との併用)のいずれかを投与した。抗体は、最初のmRNALNP免疫化後3日目から開始し、最後のLNP注射後2週間で終了するまで、3日~4日毎に注射した。腫瘍浸潤リンパ球の分析のために、腫瘍を2回目のmRNA LNP免疫化後3日目に単離し、MACS組織保存バッファー(MiltenyiBiotec)で満たされた24ウェルプレートに入れた。腫瘍を細切し、消化バッファー中で1時間、規則的に振盪しながらインキュベートした。その後、赤血球を溶解し、全ての試料を70μMのセルストレーナーで濾過した。リンパ球をficoll-paque密度勾配精製によって濃縮してから、染色に進めた。最初に、細胞をFcRブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、APC標識E7(RAHYNIVTF)-四量体を添加し、室温で30分間インキュベートした。過剰な四量体を洗い流し、表面分子CD45及びCD8に対する抗体混合物を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。試料を3レーザーAtuneNxtフローサイトメーター又は4レーザーBD LSRFortessaフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェアを使用して行った。
生体内分布及び細胞取り込み
マウスに選択したLNP配合物中の10 μgのmRNAを、尾静脈を介して静脈内注射した。4時間後、マウスを250 μLのペントバルビタール(6 mg/mL)で麻酔した。血液試料は、ゲル凝固因子(Sarstedt)の入ったチューブに採取した。続いて、胸腔を開き、門脈を切断し、マウスを、右心室を介し7 mLのPBSで灌流した。臓器を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結した。肝臓及び脾臓組織については、臓器の一部をフローサイトメトリー分析用に氷冷PBS中に保存した。
マウスに選択したLNP配合物中の10 μgのmRNAを、尾静脈を介して静脈内注射した。4時間後、マウスを250 μLのペントバルビタール(6 mg/mL)で麻酔した。血液試料は、ゲル凝固因子(Sarstedt)の入ったチューブに採取した。続いて、胸腔を開き、門脈を切断し、マウスを、右心室を介し7 mLのPBSで灌流した。臓器を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結した。肝臓及び脾臓組織については、臓器の一部をフローサイトメトリー分析用に氷冷PBS中に保存した。
細胞取り込み
肝臓及び脾臓組織を、それぞれ1 mg/mLのコラゲナーゼA(Roche)又は20 μg/mLのリベラーゼ(商標)(Roche)、及び10 μg/mLのDNase I、グレードII(Roche)を含有するRPMI 1640培地の入ったペトリ皿に入れた。組織を、外科用メスを使用して細切し、37℃で30分間インキュベートした。続いて、組織懸濁液を100 μmのナイロンセルストレーナーに通過させた。肝臓懸濁液を70×gで3分間遠心分離して、実質細胞を除去した。上清及び脾臓懸濁液を500×gで7分遠心分離して、細胞をペレット化した。赤血球を5分間ACKバッファー(Gibco)中で溶解し、PBSで不活性化し、続いて100 μmのセルストレーナーに通過させた。細胞を、1%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI1640で洗浄し、トリパンブルーと混合し、Luna-II自動セルカウンター(Logos Biosystems)を使用して計数した。3×105(肝臓)又は6×105(脾臓)の生細胞を96ウェルプレートに播種し、500×gで5分間ペレット化し、50%のBrilliant Stain Buffer(BD Biosciences)及び2 μg/mLのTruStain FcX(BioLegend)を含有するPBS(2%のPBSA)中の2%のBSA中に再懸濁した。細胞を氷上で10分間インキュベートし、適用可能な抗体カクテル(合計で3つ)を含有する2%のPBSAと1:1で2回混合した。細胞を振盪器にて室温で15分間インキュベートし、2%のPBSAで2回洗浄し、0.25 μg/mLの7-AAD Viability Stain(BioLegend)を含有する2%のPBSA中に再懸濁した。試料を4レーザーBD LSRFortessaフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェア使用して行った。
肝臓及び脾臓組織を、それぞれ1 mg/mLのコラゲナーゼA(Roche)又は20 μg/mLのリベラーゼ(商標)(Roche)、及び10 μg/mLのDNase I、グレードII(Roche)を含有するRPMI 1640培地の入ったペトリ皿に入れた。組織を、外科用メスを使用して細切し、37℃で30分間インキュベートした。続いて、組織懸濁液を100 μmのナイロンセルストレーナーに通過させた。肝臓懸濁液を70×gで3分間遠心分離して、実質細胞を除去した。上清及び脾臓懸濁液を500×gで7分遠心分離して、細胞をペレット化した。赤血球を5分間ACKバッファー(Gibco)中で溶解し、PBSで不活性化し、続いて100 μmのセルストレーナーに通過させた。細胞を、1%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI1640で洗浄し、トリパンブルーと混合し、Luna-II自動セルカウンター(Logos Biosystems)を使用して計数した。3×105(肝臓)又は6×105(脾臓)の生細胞を96ウェルプレートに播種し、500×gで5分間ペレット化し、50%のBrilliant Stain Buffer(BD Biosciences)及び2 μg/mLのTruStain FcX(BioLegend)を含有するPBS(2%のPBSA)中の2%のBSA中に再懸濁した。細胞を氷上で10分間インキュベートし、適用可能な抗体カクテル(合計で3つ)を含有する2%のPBSAと1:1で2回混合した。細胞を振盪器にて室温で15分間インキュベートし、2%のPBSAで2回洗浄し、0.25 μg/mLの7-AAD Viability Stain(BioLegend)を含有する2%のPBSA中に再懸濁した。試料を4レーザーBD LSRFortessaフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェア使用して行った。
全身分布
約50 mg~100 mgの各組織を切断し、重量を測定し、約5 mmの1.4 mmセラミックビーズ(Qiagen)の層を有する2 mLマイクロチューブに入れた。組織の各mgについて、3 μLの冷Cell CultureLysis Reagent(Promega)を添加し、Mini-BeadBeater-8(BioSpec)を使用して、4℃で60秒間、フルスピードで組織をホモジナイズした。ホモジネートを-80℃で保存し、解凍し、4℃で10分間10.000×gで遠心分離してビーズ及びデブリを除去し、上清を再度-80℃で保存した。10マイクロリットルの各溶解物を、白色の96ウェルプレートに2回分取した。インジェクターを備えたSpectraMax iD3プレートリーダーを使用して、50 μLのLuciferase Assay Reagent(Promega)を混合しながら各ウェルに分注し、続いて2秒待ち、10秒間ルシフェラーゼ発光を記録した。ルシフェラーゼ活性を、TBSを注射したマウスの臓器溶解物から得られたバックグランドシグナルに対して正規化した。
約50 mg~100 mgの各組織を切断し、重量を測定し、約5 mmの1.4 mmセラミックビーズ(Qiagen)の層を有する2 mLマイクロチューブに入れた。組織の各mgについて、3 μLの冷Cell CultureLysis Reagent(Promega)を添加し、Mini-BeadBeater-8(BioSpec)を使用して、4℃で60秒間、フルスピードで組織をホモジナイズした。ホモジネートを-80℃で保存し、解凍し、4℃で10分間10.000×gで遠心分離してビーズ及びデブリを除去し、上清を再度-80℃で保存した。10マイクロリットルの各溶解物を、白色の96ウェルプレートに2回分取した。インジェクターを備えたSpectraMax iD3プレートリーダーを使用して、50 μLのLuciferase Assay Reagent(Promega)を混合しながら各ウェルに分注し、続いて2秒待ち、10秒間ルシフェラーゼ発光を記録した。ルシフェラーゼ活性を、TBSを注射したマウスの臓器溶解物から得られたバックグランドシグナルに対して正規化した。
免疫細胞活性化
マウスに選択したLNP中の5 μgのmRNAを、尾静脈を介して静脈内注射した。脾臓をフローサイトメトリー染色のために4時間後に摘出した。脾細胞の単一細胞懸濁液を調製し、消化バッファー(DNase-1及びコラゲナーゼ-IIIを含むDMEM)とともに20分間、規則的に振盪しながらインキュベートした。その後、試料をFcブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、細胞を細胞系統マーカー及び活性化マーカーで染色した。試料を3レーザーAtuneNxtフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェアを使用して行った。
マウスに選択したLNP中の5 μgのmRNAを、尾静脈を介して静脈内注射した。脾臓をフローサイトメトリー染色のために4時間後に摘出した。脾細胞の単一細胞懸濁液を調製し、消化バッファー(DNase-1及びコラゲナーゼ-IIIを含むDMEM)とともに20分間、規則的に振盪しながらインキュベートした。その後、試料をFcブロック及び生存性色素とともにインキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、細胞を細胞系統マーカー及び活性化マーカーで染色した。試料を3レーザーAtuneNxtフローサイトメーターで取得した。分析はFlowJoソフトウェアを使用して行った。
実施例4-最大のT細胞応答のためのLNP組成のDOE主導の最適化
LNPライブラリーは、市販のイオン性脂質CoatsomeSS-ECを、コレステロール、DOPE及びPEG化脂質と組み合わせることにより作成した。DOPEは、既に、いくつかの認可されたリポソーム製品及び研究中のmRNAワクチンの一部である。本実験では、DMG-PEG2000を含む異なるLNP組成物を調査した。
LNPライブラリーは、市販のイオン性脂質CoatsomeSS-ECを、コレステロール、DOPE及びPEG化脂質と組み合わせることにより作成した。DOPEは、既に、いくつかの認可されたリポソーム製品及び研究中のmRNAワクチンの一部である。本実験では、DMG-PEG2000を含む異なるLNP組成物を調査した。
最初のLNPライブラリーは、脂質のモル比が、静脈内mRNA-LNPワクチン接種によって誘発されるT細胞応答に影響を与えるかどうか、したがってワクチン効力を改善するために最適化することができる変数を表すかどうかを検討するために設計された。SS-EC、DOPE及びPEG-脂質のモル百分率は独立変数として見なされ、これに対して、コレステロールは100%までのモル百分率のバランスを保つためのフィラー脂質であると見なされた。DOE法を使用することにより、11のLNPを含む実験計画を作成した(表2の組成を参照)。
11の脂質比は、実験領域において均一に分配されていた(データは示されていない)。免疫原性スクリーニングでは、3回の静脈内免疫化後の血液中のE7特異的CD8T細胞の割合が、最大となる応答変数であると見なされた。この目的のために、全てのLNPは、抗原としてヒトパピローマウイルス16(HPV16)腫瘍性タンパク質E7をコードするmRNAをパッケージ化した。結果は、CD8T細胞応答の大きさがLNP組成に強く依存するという仮定を裏付ける。いくつかのmRNA-LNPワクチンは、50%を超えるE7特異的CD8 T細胞応答を引き起こしたが、他のmRNA-LNPワクチンは、ほとんど応答を誘導しなかった(図4a)。DMG-PEG2000のモル%は、E7特異的CD8T細胞応答の大きさに関連する重要なパラメータとして特定された。最大のT細胞応答を達成するためには低モル百分率のPEG-脂質が必要であった(図4c)。
ベイズ回帰モデリングをデータに適用して、或る特定のLNP組成の免疫原性を予測できる応答曲面モデル(データは示されていない)を作成した。モデルの予測値を検証するために、2つの新しいLNP組成物(表3)を評価した。
LNP34(DMG-PEG2000)で免疫化したマウスは、30%を超えるE7特異的CD8T細胞を誘発する90%を超える確率を有し(最適LNP)、これに対して、LNP35(DMG-PEG2000)は不十分なT細胞応答を生じることが予測された(非最適LNP)。実験データは予測とほぼ一致したため、モデルの検証に成功した。予測された最適LNPで免疫化した全てのマウスは、実際に30%を超えるE7特異的CD8T細胞応答を示したが、LNP35で免疫化したマウスはこの閾値を超えるT細胞応答を誘発しなかった(図4b)。
実施例5-定性的なT細胞応答を誘導するmRNAワクチン
癌免疫療法の成功は、T細胞の表現型、機能性及び腫瘍浸潤を含む、多数の因子により影響される。最初に、LNP34によって引き起こされるT細胞応答のクオリティ及びブースト可能性(boostability)を評価した。この目的のために、マウスを、0日目、7日目及び14日目に3回プライム免疫化させ、続いて50日目に最終免疫化させた。E7mRNAは、T細胞応答の強度を高める3つの免疫刺激mRNAの混合物であるTriMix(Bonehillら、2008)で補足された。
癌免疫療法の成功は、T細胞の表現型、機能性及び腫瘍浸潤を含む、多数の因子により影響される。最初に、LNP34によって引き起こされるT細胞応答のクオリティ及びブースト可能性(boostability)を評価した。この目的のために、マウスを、0日目、7日目及び14日目に3回プライム免疫化させ、続いて50日目に最終免疫化させた。E7mRNAは、T細胞応答の強度を高める3つの免疫刺激mRNAの混合物であるTriMix(Bonehillら、2008)で補足された。
E7-TriMixによる3回の免疫化の後、70%を超えるE7特異的T細胞が血液中に存在した(図5a)。3回目の免疫化後5週間、E7特異的CD8T細胞の割合は非常に高いままであった。最後の追加免疫の投与により、E7特異的エフェクターT細胞の急速な増殖が観察されたため、ワクチンがブースト可能であることが実証された(図5a)。血清中のより高濃度のIFN-yを免疫化毎に測定し(図5b)、これは、E7特異的T細胞の数の増加を反映する。
T細胞の機能性を評価するために、3回の免疫化後に細胞内サイトカイン染色を実施した。2つ以上のサイトカインを同時に産生する多機能性CD8T細胞は、感染性疾患及び腫瘍のより優れた制御と関連しており、最適なLNPのためのE7特異的CD8 T細胞の約28%を占める(図5c)。
実施例6-腫瘍縮小を誘導するmRNAワクチン
治療的抗腫瘍効果を、HPV16 E6/E7抗原を用いたレトロウイルス形質導入により作製したシンジェニックマウス腫瘍モデルTC-1で評価した。LNP34により送達された5μgのE7-TriMixによる治療は、腫瘍が平均直径55 mm3に達したときに開始された。さらに、マウスを抗PD-1(又はアイソタイプ対照抗体)で処置した。PD-1は活性化T細胞に発現し、PD-L1との相互作用によりT細胞の機能を阻害し、寛容を誘導する。PD-1チェックポイント阻害はT細胞の反応性を維持し、転移性又は切除不能な再発性HNSCC患者の一次治療として承認されている。LNP34ワクチン接種はTC-1腫瘍の著明な後退(図5d)及び生存期間の有意な延長(図5e)をもたらしたが、治療の中止後に腫瘍が再発した。抗PD1単剤療法は、TC-1担持マウスにいかなる治療効果ももたらさなかった。
治療的抗腫瘍効果を、HPV16 E6/E7抗原を用いたレトロウイルス形質導入により作製したシンジェニックマウス腫瘍モデルTC-1で評価した。LNP34により送達された5μgのE7-TriMixによる治療は、腫瘍が平均直径55 mm3に達したときに開始された。さらに、マウスを抗PD-1(又はアイソタイプ対照抗体)で処置した。PD-1は活性化T細胞に発現し、PD-L1との相互作用によりT細胞の機能を阻害し、寛容を誘導する。PD-1チェックポイント阻害はT細胞の反応性を維持し、転移性又は切除不能な再発性HNSCC患者の一次治療として承認されている。LNP34ワクチン接種はTC-1腫瘍の著明な後退(図5d)及び生存期間の有意な延長(図5e)をもたらしたが、治療の中止後に腫瘍が再発した。抗PD1単剤療法は、TC-1担持マウスにいかなる治療効果ももたらさなかった。
最後に、腫瘍床に到達するワクチン誘発T細胞の能力を評価した。それぞれのmRNA-LNPワクチンによる2回のワクチン接種は、CD8+腫瘍浸潤T細胞の腫瘍への強い浸潤をもたらし(図5f)、70%超がE7に特異的であった(図5g)。ワクチン治療への抗PD-1の添加は、腫瘍に侵入するE7特異的CD8T細胞の割合を有意に変化させなかった。
実施例7-脾臓における取り込みを増加させ、免疫細胞を活性化する最適LNP
引き起こされたT細胞応答の大きさと、臓器及び細胞型レベルでのmRNAの取り込み及び発現の生体内分布との間に相関関係が存在するかどうかを検討するために、以前に免疫原性についてスクリーニングしたDMG-PEG2000LNP中にCy5標識ホタルルシフェラーゼmRNAを封入した。ルシフェラーゼ活性を、LNP注射後4時間で摘出した肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓で測定した。予測通り、LNP組成は、mRNA発現の強度及び臓器特異性に強い影響を及ぼした。肝臓は主要な標的器官であり、続いて脾臓であったが、肝臓対脾臓比はLNP間で大きく異なった(図6a)。3回目の免疫化後のE7特異的CD8T細胞応答の大きさは、脾臓の発現と正の相関があった。脾臓への送達の重要性は、総発現とT細胞応答との間の相関関係が認められなかったことにより更に強調された(データは示されていない)。LNPサイズの間にも有意な相関関係が認められた(脂質組成と強く絡み合っている)。
引き起こされたT細胞応答の大きさと、臓器及び細胞型レベルでのmRNAの取り込み及び発現の生体内分布との間に相関関係が存在するかどうかを検討するために、以前に免疫原性についてスクリーニングしたDMG-PEG2000LNP中にCy5標識ホタルルシフェラーゼmRNAを封入した。ルシフェラーゼ活性を、LNP注射後4時間で摘出した肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓で測定した。予測通り、LNP組成は、mRNA発現の強度及び臓器特異性に強い影響を及ぼした。肝臓は主要な標的器官であり、続いて脾臓であったが、肝臓対脾臓比はLNP間で大きく異なった(図6a)。3回目の免疫化後のE7特異的CD8T細胞応答の大きさは、脾臓の発現と正の相関があった。脾臓への送達の重要性は、総発現とT細胞応答との間の相関関係が認められなかったことにより更に強調された(データは示されていない)。LNPサイズの間にも有意な相関関係が認められた(脂質組成と強く絡み合っている)。
次に、免疫原性が脾臓における早期mRNA取り込み及び特異的免疫細胞型の活性化に関連しているかどうかを評価した。LNPは主に、マクロファージ及び単球に蓄積した(図6b)。T細胞応答と、脾臓マクロファージ、単球、形質細胞様DC(pDC)及びB細胞によるLNP取り込みとの間には、強い全体的な相関関係が存在した(データは示されていない)。
脾臓におけるmRNA取り込み及び発現の重要性を更に検証するために、最適で免疫原性の高いLNP34の生体内分布及び細胞取り込みプロファイルを、非最適で免疫原性の不十分なLNP35と比較した。LNP35と比較して、LNP34は脾臓における相対的なmRNA発現(図6c)並びに脾臓におけるマクロファージ、B細胞及びDCによる取り込み(図6d)を劇的に増加させた。
それらの準最適な対応物と比較して、最適mRNA LNP組成物LNP34は、血液中のより高レベルの炎症性サイトカインを誘発し、生得的活性化(innateactivation)の増加を示した(図6e)。
実施例8-本発明の更なるDMG-PEG2000 LNP
この実施例において、更に興味深いLNPを試験した(表4を参照)。マウスに1週間間隔で2回静脈内免疫化を施した。2回目の免疫化の5日後に、血液中のE7特異的T細胞を分析した。図7に示すデータは、LNP59がLNP53よりも有意に優れていることを示しており、したがって、本発明の文脈においても非常に適している。LNP59はまた、低割合のPEG脂質、すなわち、0.5mol%を有することを特徴とするが、著しく低いコレステロールレベル、すなわち、30 mol%未満、具体的には約25 mol%も有する。
この実施例において、更に興味深いLNPを試験した(表4を参照)。マウスに1週間間隔で2回静脈内免疫化を施した。2回目の免疫化の5日後に、血液中のE7特異的T細胞を分析した。図7に示すデータは、LNP59がLNP53よりも有意に優れていることを示しており、したがって、本発明の文脈においても非常に適している。LNP59はまた、低割合のPEG脂質、すなわち、0.5mol%を有することを特徴とするが、著しく低いコレステロールレベル、すなわち、30 mol%未満、具体的には約25 mol%も有する。
結論
LNP組成は、脂質比の調節によって強い免疫原性を調整することができる。最適なLNP組成物は、脾臓における発現の増加を示し、複数のAPC集団による取り込みが強化された。最適なLNPは高レベルのI型IFNを誘導し、これは引き起こされるT細胞応答にとって重要であることが判明した。驚くべきことに、注入されたmRNA用量の大部分がB細胞と関連するようになった。B細胞は活性化された表現型を示し、抗原特異的CD8T細胞の誘導に不可欠であり、以前に確認されていなかったB細胞の役割を示した。
LNP組成は、脂質比の調節によって強い免疫原性を調整することができる。最適なLNP組成物は、脾臓における発現の増加を示し、複数のAPC集団による取り込みが強化された。最適なLNPは高レベルのI型IFNを誘導し、これは引き起こされるT細胞応答にとって重要であることが判明した。驚くべきことに、注入されたmRNA用量の大部分がB細胞と関連するようになった。B細胞は活性化された表現型を示し、抗原特異的CD8T細胞の誘導に不可欠であり、以前に確認されていなかったB細胞の役割を示した。
DoE手法は、LNP組成物が、免疫原性が高いか又は低いかを予測することに成功した。最適なLNP組成物は、A)脾臓APC、主にB細胞によるmRNAの取り込み及び発現、B)炎症性サイトカインの放出の増加及びAPC上の活性化マーカーの発現によって証明される生得的活性化、C)定着したTC-1腫瘍を後退させることができる大規模及び定性的なT細胞応答を促進した。I型インターフェロンの誘導は、静脈内投与したmRNAワクチンの有効性において重要であることが判明した。また、B細胞は、T細胞応答の誘導に重要であり、これは部分的に抗PEG抗体の産生によるものと考えられる。重要なことに、LNPに対する抗体の存在は、T細胞応答の誘発を妨げない。これは、PEG化LNPのワクチン接種後に多くの人がPEG抗体を獲得することを考えると、非常に関連性が高い。
図面訳
図1
% E7 specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
# immunizations 免疫化(回数)
図2
E7-specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞
% E7-specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
Immunizations 免疫化
図3
% ADPGK specificCD8+ cells ADPGK特異的CD8+細胞(%)
図4
A
% E7-specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞(%)
B
% E7 specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞(%)
% PEG-lipid PEG-脂質(%)
p value p値
C
% E7-specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞(%)
図5
A
%E7 specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
Time (days) 時間(日数)
B
Time (days) 時間(日数)
C
Cytokine production サイトカイン産生
% of E7 specificsplenic CD8+ T cells E7特異的脾臓CD8+T細胞(%)
D
Tumor volume (mm3) 腫瘍体積(mm3)
No treatment 治療なし
anti-PD-1 抗PD-1
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
Days post TC-1inoculation TC-1接種後の日数
E
Percent survival 生存率
No treatment 治療なし
anti-PD-1 抗PD-1
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
Start treatment 治療開始
Days post TC-1inoculation TC-1接種後の日数
F
% CD45+CD3+ (TILs) of live cells 生細胞のCD45+ CD3+(TIL)(%)
Untreated 未治療
anti-PD-1 抗PD-1
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
G
%E7 specific cellsof CD8+ TILs CD8+ TILのE7特異的細胞(%)
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
図6
A
Relative luciferaseactivity 相対ルシフェラーゼ活性
(% of totalluciferase activity in all analysed organs) (分析した全ての臓器における総ルシフェラーゼ活性の%)
Spleen 脾臓
Kidneys 腎臓
Liver 肝臓
Lungs 肺
Heart 心臓
B
Cellular LNPassociation 細胞のLNP会合
Resident monocytes 常在性単球
Inflammatorymonocytes 炎症性単球
Granulocytes 顆粒球
T cells T細胞
B cells B細胞
Macrophages マクロファージ
C
Relative luciferaseactivity 相対ルシフェラーゼ活性
(% of total luciferaseactivity in all analysed organs) (分析した全ての臓器における総ルシフェラーゼ活性の%)
Spleen 脾臓
Kidneys 腎臓
Liver 肝臓
Lungs 肺
Heart 心臓
LNP34 (optimal) LNP34(最適)
LNP35 (non-optimal) LNP35(非最適)
D
Cellularassociation 細胞会合
Macrophages マクロファージ
LNP34 (optimal) LNP34(最適)
LNP35 (not optimal) LNP35(非最適)
B cells B細胞
E
6 hours 6時間
24 hours 24時間
図7
E7-specific T cells E7特異的T細胞
%E7 specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
図1
% E7 specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
# immunizations 免疫化(回数)
図2
E7-specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞
% E7-specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
Immunizations 免疫化
図3
% ADPGK specificCD8+ cells ADPGK特異的CD8+細胞(%)
図4
A
% E7-specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞(%)
B
% E7 specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞(%)
% PEG-lipid PEG-脂質(%)
p value p値
C
% E7-specific CD8+T cells E7特異的CD8+T細胞(%)
図5
A
%E7 specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
Time (days) 時間(日数)
B
Time (days) 時間(日数)
C
Cytokine production サイトカイン産生
% of E7 specificsplenic CD8+ T cells E7特異的脾臓CD8+T細胞(%)
D
Tumor volume (mm3) 腫瘍体積(mm3)
No treatment 治療なし
anti-PD-1 抗PD-1
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
Days post TC-1inoculation TC-1接種後の日数
E
Percent survival 生存率
No treatment 治療なし
anti-PD-1 抗PD-1
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
Start treatment 治療開始
Days post TC-1inoculation TC-1接種後の日数
F
% CD45+CD3+ (TILs) of live cells 生細胞のCD45+ CD3+(TIL)(%)
Untreated 未治療
anti-PD-1 抗PD-1
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
G
%E7 specific cellsof CD8+ TILs CD8+ TILのE7特異的細胞(%)
LNP34 + isotype LNP34+ アイソタイプ
LNP34 + anti-PD-1 LNP34+ 抗PD-1
図6
A
Relative luciferaseactivity 相対ルシフェラーゼ活性
(% of totalluciferase activity in all analysed organs) (分析した全ての臓器における総ルシフェラーゼ活性の%)
Spleen 脾臓
Kidneys 腎臓
Liver 肝臓
Lungs 肺
Heart 心臓
B
Cellular LNPassociation 細胞のLNP会合
Resident monocytes 常在性単球
Inflammatorymonocytes 炎症性単球
Granulocytes 顆粒球
T cells T細胞
B cells B細胞
Macrophages マクロファージ
C
Relative luciferaseactivity 相対ルシフェラーゼ活性
(% of total luciferaseactivity in all analysed organs) (分析した全ての臓器における総ルシフェラーゼ活性の%)
Spleen 脾臓
Kidneys 腎臓
Liver 肝臓
Lungs 肺
Heart 心臓
LNP34 (optimal) LNP34(最適)
LNP35 (non-optimal) LNP35(非最適)
D
Cellularassociation 細胞会合
Macrophages マクロファージ
LNP34 (optimal) LNP34(最適)
LNP35 (not optimal) LNP35(非最適)
B cells B細胞
E
6 hours 6時間
24 hours 24時間
図7
E7-specific T cells E7特異的T細胞
%E7 specific CD8+T Cells E7特異的CD8+T細胞(%)
Claims (16)
- イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~70 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約25 mol%超であることを特徴とする、脂質ナノ粒子。 - イオン性脂質と、
リン脂質と、
ステロールと、
PEG脂質と、
1つ以上のmRNA分子と、
を含み、
前記PEG脂質が、C14-PEG脂質であり、
前記LNPが、約1 mol%未満の前記PEG脂質を含み、
前記イオン性脂質のモル百分率が、約50 mol%~60 mol%であり、
前記ステロールのモル百分率が、約30 mol%超であることを特徴とする、請求項1に記載の脂質ナノ粒子(LNP)。 - 前記LNPが、約0.5 mol%~約0.9 mol%、好ましくは約0.5 mol%の前記PEG脂質を含む、請求項1又は2に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記リン脂質のモル百分率が、約10 mol%未満、好ましくは約5 mol%である、請求項1~3のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- イオン性脂質対リン脂質の比が、5:1超、好ましくは約6:1~11:1、最も好ましくは約11:1である、請求項1~4のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記イオン性脂質のモル百分率が、約55 mol%~60 mol%である、請求項1~5のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記C14-PEG脂質が、C14-PEG2000脂質であり、好ましくはDMG-PEG2000及びDMPE-PEG2000、最も好ましくはDMG-PEG2000を含むリストから選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記イオン性脂質が、
1,1'-((2-(4-(2-((2-(ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)エチル)アザンジイル)ビス(ドデカン-2-オール)(C12-200)、
ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、又は、
式(I)の化合物:
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、Xは、
を含むリストから選択される)を含むリストから選択され、
好ましくは、前記イオン性脂質が、式中、RCOOがα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
- 前記リン脂質が、DOPE、DOPC、DSPC及びそれらの混合物、特にDOPE、DOPC及びそれらの混合物を含むリストから選択される、請求項1~8のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ステロールが、コレステロール、エルゴステロール、カンペステロール、オキシステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、シトステロール及びスチグマステロールを含むリストから選択され、好ましくはコレステロールである、請求項1~9のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記LNPが、
約56.5 mol%の前記イオン性脂質と、
約5 mol%のDOPEと、
約38 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記LNPが、
約65 mol%の前記イオン性脂質と、
約9.5 mol%のDOPEと、
約25 mol%のコレステロールと、
約0.5 mol%のDMG-PEG2000と、
を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記1つ以上のmRNA分子が、CD40L、CD70及びcaTLR4をコードするmRNA分子から選択されるような、免疫調節ポリペプチドをコードするmRNA、及び/又は抗原をコードするmRNAの群から選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載の1つ以上の脂質ナノ粒子と、許容される薬学的担体とを含む、薬学的組成物又はワクチン。
- 人間医学又は獣医学において使用される、請求項1~13のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項14に記載の薬学的組成物若しくはワクチン。
- 癌又は感染性疾患の治療に使用される、請求項1~13のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項14に記載の薬学的組成物若しくはワクチン。
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