KR20230050313A - 지질 나노입자 - Google Patents

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KR20230050313A
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peg
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상느 비버스
스테파안 디 코커
레이몬드 미셸 쉬펠러스
산더 알렉산더 안토니우스 쿠이즈만스
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이더알엔에이 이뮤노테라피스 엔브이
브리제 유니버시타이트 브루셀
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Abstract

본 발명은 지질 나노입자(LNP); 보다 구체적으로 이온화 지질, 인지질, 스테롤, PEG 지질 및 하나 이상의 핵산을 포함한다. 본 발명의 LNP는 약 1 몰% 미만의 C14-PEG2000 지질; 뿐만 아니라 특정 비율의 다른 지질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 핵산 분자, 특히 mRNA의 면역원성 전달을 위한 LNP의 용도를 제공하는 것으로서, 암이나 전염성 질병의 치료 등, 백신에 사용하기에 매우 적합합니다. 마지막으로, 이러한 LNP를 제조하는 방법이 제공된다.

Description

지질 나노입자
본 발명은 지질 나노입자(LNP); 보다 구체적으로 이온화(ionizable) 지질, 인지질, 스테롤, PEG 지질 및 하나 이상의 핵산을 포함한다. 본 발명의 LNP는 약 1 몰% 미만의 C14-PEG2000 지질 뿐만 아니라 특정 백분율의 다른 지질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 핵산 분자, 특히 mRNA의 면역원성 전달을 위한 LNP의 용도로서, 백신, 예컨대 암 또는 전염성 질병의 치료용으로 사용하기에 매우 적합한 용도를 제공한다. 마지막으로, 이러한 LNP를 제조하는 방법이 제공된다.
생물학적 활성 물질의 표적 전달 분야에서 주요 과제 중 하나는 불안정성이 많고 세포 침투 잠재력이 낮다는 것이다. 이것은 특히 핵산 분자, 특히 (m)RNA 분자의 전달의 경우에 그러하다. 따라서, 적절한 패키징은 적절한 보호 및 전달을 위해 매우 중요하다. 따라서, 핵산과 같은, 생물학적 활성 물질을 패키징하기 위한 방법 및 조성물이 지속적으로 요구되고 있다.
이와 관련하여, 리포플렉스 및 리포솜과 같은 지질 기반 나노입자 조성물은 생물학적 활성 물질을 세포 및/또는 세포내 구획으로 수송하기 위한 패키징 비히클로 사용되어 왔다. 이러한 지질-기반 나노입자 조성물은 일반적으로 (Reichmuth et al., 2016에서 검토된 바와 같이) 양이온성 지질, 이온화 지질, 인지질, 구조적 지질(예컨대, 스테롤 또는 콜레스테롤), PEG(폴리에틸렌 글리콜) 지질 등과 같은 다양한 지질의 혼합물을 포함한다.
양이온성 또는 이온화 지질, 인지질, 스테롤 및 PEG화 지질의 4가지 지질의 혼합물로 구성된 지질 기반 나노입자는 전신 투여 후 간으로 siRNA 및 mRNA의 비면역 전달을 위해 개발되었다. 많은 이러한 지질 조성물이 당업계에 공지되어 있지만, 생체내(in vivo) mRNA 전달에 사용되는 것들은 전형적으로 적어도 1.5 몰의 PEG 지질 수준을 포함하고, 약 1:1: 내지 약 5:1과 같이, 낮은 비율(ratio)의 이온화 지질:인지질을 갖는다.
그러나, 본 출원인은 놀랍게도 적은 양(즉, 약 1 몰% 미만)의 PEG 지질을 사용하면, LNP의 전신 주입 시 mRNA의 면역원성 전달에 매우 적합한 나노입자가 생성된다는 것을 밝혀냈다. 이러한 효과는 낮은 수준의 PEG 지질과 비교적 높은 수준의 이온화 지질(즉, 55 내지 70 몰%) 및 비교적 낮은 수준의 인지질(즉, 약 10 몰% 미만)의 조합에 의해 훨씬 더 증강되며, 이에 따라 비교적 높은 이온화 지질:인지질 비율(즉, 6:1 내지 11:1)을 갖는 LNP의 경우 그러한 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 일부 실시형태는 낮은 백분율의 스테롤(즉, 약 30 몰% 미만, 예컨대, 약 25 몰%)을 특징으로 한다.
제1 양태에 있어서, 본 발명은 지질 나노입자(LNP)로서,
- 이온화 지질;
- 인지질;
- 스테롤;
- PEG 지질; 및
- 하나 이상의 mRNA 분자,
를 포함하고,
- 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
- 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
- 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
추가 양태에 있어서, 본 발명은 지질 나노입자(LNP)로서,
- 이온화 지질;
- 인지질;
- 스테롤;
- PEG 지질; 및
- 하나 이상의 mRNA 분자,
를 포함하고,
- 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
- 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
- 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 또는 그 이상인 것,
을 특징으로 하는 지질 나노입자를 제공한다.
본 발명의 추가의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는 약 0.5 몰% 내지 약 0.9 몰%의 상기 PEG 지질을 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서 있어서, 상기 인지질의 몰 백분율은 약 10 몰% 미만; 바람직하게는 약 5 몰%이다.
본 발명의 추가 실시형태에 있어서, 이온화 지질 대 인지질의 비율은 5:1 이상; 바람직하게는 약 6:1 내지 11:1; 가장 바람직하게는 약 11:1이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서 있어서, 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 55 내지 60 몰%이다.
본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 C14-PEG 지질은 디미리스토일 지질, 즉 2개의 C14 지방산 꼬리를 갖는 것, 예컨대 상기 C14-PEG2000 지질은 바람직하게는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000) 또는 2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 글리콜-2000(DMPE-PEG2000)을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시형태에서 있어서, 상기 이온화 지질은 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되며,
- 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일) 비스(도데칸-2-올)(C12-200);
- 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA); 또는
- 하기 화학식 (I)의 화합물,
Figure pct00001
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; X는
Figure pct00002
및
Figure pct00003
을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서 있어서, 상기 이온화 지질은 RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00004
인, 화학식 (I)의 지질이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서 있어서, 상기 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 이들의 혼합물; 특히 DOPE, DOPC 및 이들의 혼합물을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서 있어서, 상기 스테롤은 콜레스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 옥시스테롤, 안트로스테롤, 데스모스테롤, 니카스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 바람직하게는 콜레스테롤이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는 약 5 내지 15 몰%의 상기 인지질을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 내지 70 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 5 내지 15 몰%의 인지질;
- 약 0.5 내지 0.9 몰%의 상기 PEG 지질; 및
잔량의 상기 스테롤,을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 LNP는,
- 약 50 내지 60 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 5 내지 15 몰%의 인지질;
- 약 0.5 내지 0.9 몰%의 상기 PEG 지질; 및
잔량의 상기 스테롤,을 포함한다.
본 발명의 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 10 몰%의 DOPE;
- 약 39.5 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,
을 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 56.5 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 5 몰%의 DOPE;
- 약 38 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,
을 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 65 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 9.5 몰%의 DOPE;
- 약 25 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,
을 포함한다.
보다 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 하나 이상의 mRNA 분자는 면역조절 폴리펩타이드-인코딩 mRNA 및/또는 항원-인코딩 mRNA를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 상기 면역조절-인코딩 mRNA는, 예를 들어, CD40L, CD70 및 caTLR4를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다.
추가로 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 하나 이상의 지질 나노입자 및 허용가능한 약제학적 담체를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 인간 또는 수의학 의약에서 사용하기 위한; 특히 암이나 전염성 질병의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 지질 나노입자, 약제학적 조성물 또는 백신을 제공한다.
이제 도면을 참조하여 상세히 설명하는데 있어서, 도시된 특정 요소들은 예시적인 것이고, 단지 본 발명의 상이한 실시형태들을 예시적으로 논의하기 위한 것임을 강조한다. 이들은 본 발명의 원리 및 개념적 양태에 대해 가장 유용하고 이해사기 쉽다고 여겨지는 설명을 제공하기 위해 제시된다. 이런 점에서, 본 발명의 구조적 세부사항을 본 발명의 근본적인 이해를 위해 필요한 것 이상으로 더 자세히 나타내려고 하는 것은 아니다. 도면과 함께 설명을 보면, 본 발명의 여러 형태가 실제적으로 어떻게 구현되는지에 대해서 당업자에게 명확하게 될 것이다.
도 1: 나타낸 몰비에서 SS-EC/DOPE/chol/DMG-PEG2000으로 구성된 E7 mRNA LNP로 3회 정맥내 면역접종(immunization)한 결과를 나타낸다.
도 2: 나타낸 몰비에서 SS-EC/DOPE/chol/DMG-PEG2000으로 구성된 E7 mRNA LNP로 3회 정맥내 면역접종한 결과를 나타낸다.
도 3: 낮은 백분율의 PEG LNP(50/10/39.5/0.5 이온화 지질/DOPE/콜레스테롤/PEG-지질)에 패키징된 10 ㎍ ADPGK mRNA 또는 50 ㎍ ADPGK 합성 긴 펩티드(SLP)로 4회 정맥 투여한 결과를 나타낸다.
도 4: 최대 T 세포 반응을 위한 LNP 조성의 DOE-기반(driven) 최적화. A, DOE 라이브러리의 E7 mRNA LNP로 3회 면역접종(매주 간격) 후의 혈액 내 E7-특이적 T 세포. B. DOE 라이브러리의 11개 LNP에 대한 DMG-PEG2000 %의 함수로 나타낸 E7-특이 CD8 T 세포 반응. C, 예상된 최적 LNP34 및 비최적 LNP35로 3회 면역접종(매주 간격) 후의 혈액 내 E7-특이적 T 세포, 평균 ± SD로 나타나 있다. 통계는 Sidak의 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산분석(One-Way ANOVA)으로 평가했다. ***p<0.001
도 5: 최적화된 mRNA LNP 백신은 정성적인 T 세포 반응과 강력한 항종양 효능을 유도한다. A, 혈액 내 E7-특이적 CD8+ T 세포의 동역학. B, 반복 면역접종에 따라 혈청 내 IFN-γ 증가 C. 3회 면역접종 후 비장에서 비장 CD8+ E7-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ 및 TNF-α 생성 D LNP34 면역접종 마우스에서의 평균 TC-1 종양 성장 E, LNP34 면역접종된 마우스의 생존. F, LNP34로 2회 면역접종 후 TC-1 종양 침윤 림프구(TIL). G, TIL의 E7-특이성. A, B, F, G, 평균 ± SD로 나타나 있다. C, 평균 ± SEM으로 나타나 있다. D, 통계를 Mantel-Cox 로그 순위 순위 테스트로 평가했다. F, G, 통계는 Tukey의 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산분석(One-Way ANOVA)으로 평가했다. **,p<0.01, ***p<0.001, ns=유의하지 않음
도 6: LNP는 다양한 (선천적) 면역 세포에 흡수되어 이들을 활성화시킨다. A. 총 루시퍼라제 활성에 대한 %로 나타낸 신장, 폐, 심장, 간 및 비장에서의 루시퍼라제 활성. B. TBS 완충제를 주사한 마우스에 대한 LNP 주사한 마우스에서 Cy5 MFI의 차이로 측정된 다수의 세포 유형에서의 LNP의 흡수 C. 총 루시퍼라제 활성에 대한 %로 나타낸 신장, 폐, 심장, 간 및 비장에서의 루시페라제 활성. 최적 LNP34는 비최적 LNP(LNP35)에 비해 비장에서 증가된 루시퍼라제 활성을 나타냈다. D. 최적 LNP34의 세포 흡수는 비최적 LNP35에 비해 더 높다. E. 혈청에서 IFN-α 및 IP-10 사이토카인의 일시적인 증가가 관찰되었다(LNP 투여 후 24시간에 비해 6시간). F. cDC1 및 cDC2 상의 CD86 발현은 비최적 LNP35에 의해 약하게 상향조절되고 최적 LNP34 A-D에 의해 강력하게 상향조절된다. 평균 ± SD로 나타나 있다. D, 통계는 Sidak의 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산분석(One-Way ANOVA)으로 평가했다. **,p<0.01, ***p<0.001, ns=유의하지 않음.
도 7: 다른 최적(LNP59) 및 비최적(LNP53) DMG-PEG2000 LNP로 2회 면역접종(매주 간격) 후의 혈액 내 E7-특이적 T 세포, 평균 ± SD로 나타나 있다. 통계는 Sidak의 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산분석(One-Way ANOVA)으로 평가했다. ***p<0.001.
본 명세서에서 이미 상술한 바와 같이, 본 발명은 비교적 적은 양(예를 들어, 약 1 몰% 미만)으로 존재하는 C14-PEG 지질(예를 들어, C14-PEG2000 지질)을 포함하는 LNP를 제공하며, 본 출원인은 놀랍게도 이들이 핵산, 특히 mRNA의 면역원성 전달에 매우 적합하다는 것을 밝혀냈다.
본 발명의 맥락에 있어서, "핵산 분자의 면역원성 전달(immunogenic delivery of nucleic acid molecules)"은 핵산 분자를 세포로 전달하여 그로 인해 세포와의 접촉, 내재화 및/또는 상기 핵산 분자의 세포 내 발현이 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다.
따라서, 제1 양태에 있어서, 본 발명은 지질 나노입자(LNP)로서,
- 이온화 지질;
- 인지질;
- 스테롤;
- PEG 지질; 및
- 하나 이상의 mRNA 분자,
를 포함하고,
- 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
- 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
- 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
추가 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자(LNP)로서,
- 이온화 지질;
- 인지질;
- 스테롤;
- PEG 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고,
- 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
- 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
- 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
본 발명의 추가의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는 약 0.5 몰% 내지 약 0.9 몰%의 상기 PEG 지질을 포함한다.
지질 나노입자(LNP)는 일반적으로 서로 다른 지질의 조합으로 구성된 나노 크기의 입자로 알려져 있다. 많은 상이한 유형의 지질이 이러한 LNP에 포함될 수 있지만, 본 발명의 LNP는 전형적으로 이온화 지질, 인지질, 스테롤 및 PEG 지질의 조합으로 구성된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "나노입자(nanoparticle)"는, 특히 핵산의 전신, 특히 정맥내 투여에 적합한 입자로 만드는 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭하며, 전형적으로 직경이 1000 나노미터(nm) 미만, 바람직하게는 500 nm 미만, 더욱 바람직하게는 200 nm 미만, 예컨대, 예를 들어, 50 내지 200 nm; 바람직하게는 80 내지 160nm이다.
본 발명의 맥락에 있어서, 용어 "PEG 지질(PEG lipid)" 또는 대안적으로 "PEG화된 지질(PEGylated lipid)"은 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 기로 변형된 임의의 적합한 지질을 지칭한다. 본 발명의 PEG 지질은 C14-PEG 지질인 것을 특징으로 한다. 이러한 지질은 지질의 분자량을 정의하는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 비롯하여 14개의 C 원자를 포함하는 지방산 꼬리를 포함한다. 특정 실시형태에서 있어서, 상기 C14-PEG2000 지질은 디미리스토일에 기반하며, 즉 2개의 C14 꼬리를 가지며, (디미리스토일 기반)-PEG2000 지질, 예컨대 DMG-PEG2000 지질(1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000) 또는 2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 글리콜-2000(DMPE-PEG2000)을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 맥락에 있어서, 화합물 또는 지질의 맥락에서 용어 "이온화(ionizable)"(또는 대안적으로 양이온성)은 해리되어 이온(일반적으로 H+ 이온)을 생성하고 그에 따라 그 자체가 양전하를 띠게 되는 상기 화합물 또는 지질 내의 임의의 하전되지 않은 그룹의 존재를 의미한다. 대안적으로, 상기 화합물 또는 지질의 임의의 하전되지 않은 그룹은 전자를 생성할 수 있고 그에 따라 음전하를 띠게 될 수 있다.
본 발명의 맥락에 있어서 임의의 유형의 이온화 지질을 적절하게 사용할 수 있다. 특히, 적합한 이온화 지질은 S-S 결합을 통해 연결된 2개의 동일하거나 상이한 꼬리를 포함하는 이온화 아미노 지질이며, 각각의 상기 꼬리는
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
으로 나타내는 것과 같은 이온화 아민을 포함한다.
특정 실시형태에서 있어서, 상기 이온화 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물이다:
Figure pct00009
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; X는
Figure pct00010
및
Figure pct00011
을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
이러한 이온화 지질은 구체적으로 다음 화학식 중 하나로 나타낼 수 있다:
Figure pct00012
상기 지질 중 후자는 실시예 부분에서 사용된 바와 같은 Coatsome SS-EC를 나타낸다.
보다 구체적으로, 상기 이온화 지질은 RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00013
인, 화학식 (I)의 지질,
예컨대,
Figure pct00014
로 나타낼 수 있다.
다른 적합한 이온화 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200); 및 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA)으로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00015
따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자로서,
- 하기 화학식 (I)의 화합물,
Figure pct00016
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; X는
Figure pct00017
및
Figure pct00018
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
- 인지질;
- 스테롤;
- PEG 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
- 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
- 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자로서,
- 하기 화학식 (I)의 화합물,
Figure pct00019
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; X는,
Figure pct00020
및
Figure pct00021
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
- 인지질;
- 스테롤;
- PEG 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
- 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
- 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
바람직한 실시형태에서 있어서, 상기 이온화 지질은 RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고 X가
Figure pct00022
인, 화학식 (I)의 지질이다.
본 발명의 맥락에 있어서, 용어 "인지질(phospholipid)"은 2개의 소수성 지방산 "꼬리(tails)" 및 인산기로 구성된 친수성 "머리(head)"로 구성된 지질 분자를 의미한다. 두 성분은 대부분 글리세롤 분자에 의해 함께 결합되므로, 본 발명의 인지질은 바람직하게는 글리세롤-인지질이다. 또한, 인산 그룹은 종종 콜린(즉, 포스포콜린으로 변환) 또는 에탄올아민(즉, 포스포에탄올아민으로 변환)과 같은 단순한 유기 분자로 변형된다.
본 발명의 맥락에 있어서 적합한 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 Lyso PC), 1,2- 딜리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3- 포스포에트 하놀아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨염(DOPG), 스핑고미엘린, 및 이들의 혼합물을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 인지질을 DSPC로 선택하는 경우, 이온화 지질은 유리하게는 DLin-MC3-DMA일 수 있다.
보다 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 이들의 혼합물; 특히 DOPE, DOPC 및 이들의 혼합물을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자로서,
- 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00023
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00024
및
Figure pct00025
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤숙시노일이고, X가
Figure pct00026
인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 스테롤;
- 약 1 몰% 미만으로 존재하는 C14-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 이온성 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자로서,
- 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00027
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00028
및
Figure pct00029
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤숙시노일이고, X가
Figure pct00030
인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 스테롤;
- 약 1 몰% 미만으로 존재하는 C14-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 이온성 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
본 발명의 맥락에 있어서, 스테로이드 알코올로도 알려진 용어 "스테롤(sterol)"은 식물, 동물 및 진균에서 자연적으로 발생하거나, 또는 일부 박테리아에 의해 생성될 수 있는 스테로이드의 하위 그룹이다. 본 발명의 맥락에 있어서, 콜레스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 옥시스테롤, 안트로스테롤, 데스모스테롤, 니카스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤을 포함하는 목적으로부터 선택되는, 임의의 적합한 스테롤; 바람직하게는 콜레스테롤을 사용할 수 있다.
따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자로서,
- 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00031
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00032
및
Figure pct00033
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00034
인, 화학식 (I)의 이온화 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 콜레스테롤;
- 약 1 몰% 미만으로 존재하는 C14-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 이온성 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 또는 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 발명은 지질 나노입자로서,
- 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00035
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00036
및
Figure pct00037
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00038
인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 콜레스테롤;
- 약 1 몰% 미만으로 존재하는 C14-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 이온성 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 이상인 것,
을 특징으로 하는, 지질 나노입자를 제공한다.
본 발명의 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 지질 나노입자는,
- 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00039
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00040
및
Figure pct00041
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고 X가
Figure pct00042
인 것인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 콜레스테롤;
- 약 1 몰% 미만으로 존재하는 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 이온성 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 이상인 것,
을 특징으로 한다.
본 발명의 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 지질 나노입자는,
- 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00043
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00044
및
Figure pct00045
를 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00046
인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 콜레스테롤;
- 약 1 몰% 미만으로 존재하는 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자; 특히 mRNA 분자,
를 포함하고;
- 상기 이온성 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
- 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 이상인 것,
을 특징으로 한다.
또한 본 출원인은 본 발명의 LNP의 면역원성 효과가 낮은 수준의 PEG 지질과 상대적으로 높은 수준의 이온화 지질(즉, 50 내지 70 몰%; 예컨대 50 내지 65 몰% 또는 55 내지 60 몰%) 및 상대적으로 낮은 수준의 인지질(즉, 약 10 몰% 미만)의 조합을 이용하여 심지어 더 증가될 수 있음을 발견하였으며, 그에 따라 LNP의 경우 상대적으로 높은 이온화 지질:인지질 비율(즉, 5:1 내지 10:1; 또는 약 6:1 내지 약 11:1)를 갖는다. 따라서 높은 수준의 이온화 지질은, 예를 들어, 약 50 몰%, 약 51 몰%, 약 52 몰%, 약 53 몰%, 약 54 몰%, 약 55 몰%, 약 56 몰%, 약 57 몰%, 약 58 몰%, 약 59 몰%, 약 60 몰%, 약 61 몰%, 약 62 몰%, 약 63 몰%, 약 64 몰%, 약 65 몰%; 약 66 몰%, 약 67 몰%, 약 68 몰%, 약 69 몰%; 약 70 몰%일 수 있다.
따라서, 또 다른 특정 실시형태에서 있어서, 상기 인지질의 몰 백분율은 약 5 내지 15 몰%의 인지질; 특히 약 5 내지 10 몰%; 더 특별하게는 약 10 몰% 미만; 예컨대, 약 9 몰%, 약 8 몰%, 약 7 몰%, 약 6 몰%; 약 5 몰%; 바람직하게는 약 5 몰%이다.
본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는 이온화 지질 대 인지질의 비율이 약 5:1 이상; 바람직하게는 약 6:1 이상; 더 바람직하게는 8:1 이상, 가장 바람직하게는 약 10:1; 대안적으로 약 6:1 내지 11:1; 가장 바람직하게는 약 11:1, 예컨대 약 10.76:1이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서 있어서, 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 예컨대 50 내지 65 몰%, 특히 약 55 내지 60 몰%이다.
스테롤은 전형적으로 균형자 지질(balancer lipid)로 사용되며 일부 실시형태에서 있어서 약 25 몰% 이상, 예컨대 약 25 몰%, 약 26 몰%, 약 27 몰%, 약 28 몰% 약 29 몰%의 양이다. 대안적으로 이는 약 30 몰% 이상; 예컨대, 약 30 몰%; 약 31 몰%; 약 32 몰%; 약 33 몰%; 약 34 몰%; 약 35 몰% 등의 양이다. 특정 실시형태에서 있어서 콜레스테롤의 양은 약 25 몰% 내지 29 몰%이다. 따라서, 스테롤의 농도는 일반적으로 전체 100%를 구성하기 위해 다른 지질의 농도에 대해 계량된다. 따라서, 스테롤의 양은 100 몰% - 인지질의 몰% - PEG 지질의 몰% - 이온화 지질의 몰%로 계산될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 다음 중 하나 이상이 적용된다:
- 상기 LNP는 약 50 몰% 내지 70 몰%; 대안적으로 약 50 내지 65 몰%; 또는 50 내지 60 몰%; 예컨대 약 55 내지 60 몰%의 상기 이온화 지질을 포함하고;
- 상기 LNP는 약 5 몰% 내지 15 몰%; 바람직하게는 약 10 몰% 미만; 가장 바람직하게는 약 5 몰%의 상기 인지질을 포함하고;
- 상기 LNP는 약 0.5 몰% 내지 0.9몰%의 상기 PEG 지질을 포함하고;
상기 스테롤의 양으로 균형을 맞춘다.
따라서, 본 발명의 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 내지 70 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00047
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고;
X는,
Figure pct00048
및
Figure pct00049
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00050
인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 약 5 내지 15 몰%의 인지질;
- 균형을 맞추기 위한 콜레스테롤;
- 약 0.5 내지 0.9 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,
를 포함한다.
따라서, 본 발명의 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 내지 60 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질;
Figure pct00051
여기서,
RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 또한
X는
Figure pct00052
및
Figure pct00053
을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것임;
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고 X가
Figure pct00054
인 것인, 화학식 (I)의 지질;
- DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 약 5 내지 15 몰%의 인지질;
- 균형을 잡기 위한 콜레스테롤;
- 약 0.5 내지 0.9 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,
를 포함한다.
본 발명의 맥락에 있어서 몰%가 사용되는 경우, 이는 비어 있는 나노입자, 즉 핵산이 없는 특정 성분의 몰%인 것을 의미한다. 이는 성분의 몰%가 상기 LNP에 존재하는 이온화 지질, 인지질, 스테롤 및 PEG 지질의 총량에 대해 계산됨을 의미한다.
본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 내지 60 몰%의 상기 이온화 지질;
- 인지질 약 5 내지 15 몰%;
- 약 0.5 내지 0.9 몰%의 상기 DMG-PEG2000 지질을 포함하고; 또한
상기 스테롤의 양으로 균형을 맞춘다.
본 발명의 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 56.5 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 5.25 몰%의 DOPE;
- 약 37.75 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,을 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 10 몰%의 DOPE;
- 약 39.5 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,를 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 11 몰%의 DOPE;
- 약 38.5 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,을 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 특정한 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 7.76 몰%의 DOPE;
- 약 41.66 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.58몰%의 DMG-PEG2000,을 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 65 몰%의 상기 이온화 지질;
- 약 9.5 몰%의 DOPE;
- 약 25 몰%의 콜레스테롤; 및
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,을 포함한다.
따라서, 본 발명의 매우 특정한 실시예에서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00055
여기서,
특히, RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00056
임;
- 약 10 몰%의, DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 약 39.5 몰%의 콜레스테롤;
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,를 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 56.5 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질;
Figure pct00057
여기서,
RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00058
임;
- 약 5.25 몰%의, DOPC 및 DOPE 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 약 37.75 몰%의 콜레스테롤;
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,를 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 65 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00059
여기서,
RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00060
임;
- 약 9.5 몰%의, DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 약 25 몰%의 콜레스테롤;
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,를 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시예에서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질,
Figure pct00061
여기서,
RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00062
임;
- 약 11 몰%의, DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 약 38.5 몰%의 콜레스테롤;
- 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,를 포함한다.
본 발명의 또 다른 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 상기 LNP는,
- 약 50 몰%의 하기 화학식 (I)의 이온화 지질
Figure pct00063
여기서,
RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
Figure pct00064
임;
- 약 7.76 몰%의, DOPC 및 DOPE, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 인지질;
- 약 41.66 몰%의 콜레스테롤;
- 약 0.58 몰%의 DMG-PEG2000 지질; 및
- 하나 이상의 핵산 분자, 특히 mRNA 분자,를 포함한다.
본 발명의 맥락에 있어서 다른 특히 적합한 LNP의 조성은 표 1(적합한 LNP의 조성)에 나타나 있다.
순번 이온화 지질
(몰%) 		인지질
(몰%) 		콜레스테롤
(몰%) 		C14-PEG2000 지질 (몰%)　
1 50 10,0 39,5 0,5
2 50 8,3 41,2 0,5
3 50 7,1 42,4 0,5
4 50 6,3 43,3 0,5
5 50 5,6 43,9 0,5
6 50 5,0 44,5 0,5
7 50 10,0 39,3 0,7
8 50 8,3 41,0 0,7
9 50 7,1 42,2 0,7
10 50 6,3 43,1 0,7
11 50 5,6 43,7 0,7
12 50 5,0 44,3 0,7
13 50 10,0 39,1 0,9
14 50 8,3 40,8 0,9
15 50 7,1 42,0 0,9
16 50 6,3 42,9 0,9
17 50 5,6 43,5 0,9
18 50 5,0 44,1 0,9
19 55 11,0 33,5 0,5
20 55 9,2 35,3 0,5
21 55 7,9 36,6 0,5
22 55 6,9 37,6 0,5
23 55 6,1 38,4 0,5
24 55 5,5 39,0 0,5
25 55 11,0 33,3 0,7
26 55 9,2 35,1 0,7
27 55 7,9 36,4 0,7
28 55 6,9 37,4 0,7
29 55 6,1 38,2 0,7
30 55 5,5 38,8 0,7
31 55 11,0 33,1 0,9
32 55 9,2 34,9 0,9
33 55 7,9 36,2 0,9
34 55 6,9 37,2 0,9
35 55 6,1 38,0 0,9
36 55 5,5 38,6 0,9
37 60 12,0 27,5 0,5
38 60 10,0 29,5 0,5
39 60 8,6 30,9 0,5
40 60 7,5 32,0 0,5
41 60 6,7 32,8 0,5
42 60 6,0 33,5 0,5
43 60 12,0 27,3 0,7
44 60 10,0 29,3 0,7
45 60 8,6 30,7 0,7
46 60 7,5 31,8 0,7
47 60 6,7 32,6 0,7
48 60 6,0 33,3 0,7
49 60 12,0 27,1 0,9
50 60 10,0 29,1 0,9
51 60 8,6 30,5 0,9
52 60 7,5 31,6 0,9
53 60 6,7 32,4 0,9
54 60 6,0 33,1 0,9
55 60 12,0 27,5 0,5
56 60 10,0 29,5 0,5
57 60 8,6 30,9 0,5
58 60 7,5 32,0 0,5
59 60 6,7 32,8 0,5
60 60 6,0 33,5 0,5
61 60 12,0 27,3 0,7
62 60 10,0 29,3 0,7
63 60 8,6 30,7 0,7
64 60 7,5 31,8 0,7
65 60 6,7 32,6 0,7
66 60 6,0 33,3 0,7
67 60 12,0 27,1 0,9
68 60 10,0 29,1 0,9
69 60 8,6 30,5 0,9
70 60 7,5 31,6 0,9
71 60 6,7 32,4 0,9
72 60 6,0 33,1 0,9
73 65 10,0 24.5 0,5
74 65 8,3 26.2 0,5
75 65 7,1 27.4 0,5
76 65 6,3 28.2 0,5
77 65 5,6 28.9 0,5
78 65 5,0 29.5 0,5
79 65 10,0 24.3 0.7
80 65 8,3 26.0 0.7
81 65 7,1 27.2 0.7
82 65 6,3 28.0 0.7
83 65 5,6 28.7 0.7
85 65 5,0 29.3 0.7
86 65 10,0 24.1 0.9
87 65 8,3 25.8 0.9
88 65 7,1 27.0 0.9
89 65 6,3 27.8 0.9
90 65 5,6 28.5 0.9
91 65 5,0 29.1 0.9
다른 특히 적합한 LNP는, 하기 비율의 이온화 지질/인지질/스테롤/C14-PEG2000 지질을 특징으로 한다:
- 50/10/39.5/0.5
- 56.5/5/38/0.5
- 50/11/38.5/0.5
- 50/7.76/41.66/0.58
- 65/9.5/25/0.5
본 발명자들은 본 발명의 LNP가 핵산의 면역원성 전달에 특히 적합하다는 것을 밝혀냈다. 따라서 본 발명은 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 DNA 또는 RNA, 보다 구체적으로 mRNA를 포함하는 LNP를 제공한다.
상기 LNP 중의 핵산의 양은 전형적으로 몰비, 즉 양이온성 지질(이온화 지질) 대 RNA 인산염의 비율로 나타낸다. 본 발명의 맥락에 있어서, LNP의 몰비는 약 4:1 내지 16:1 사이이다.
상기 LNP 중의 핵산의 양은 대안적으로 N/P 비율, 즉 이온화 지질의 질소 원자 대 핵산의 인산염 그룹의 비율로 나타낼 수 있다. 본 발명의 맥락에 있어서, LNP의 N/P 비율은 약 4:1 내지 16:1이다.
본 발명의 맥락에 있어서 "핵산(nucleic acid)"은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 바람직하게는 리보핵산(RNA), 더 바람직하게는 mRNA이다. 핵산은 본 발명에 따른 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산된 분자 및 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 핵산은 본 발명에 따라 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 선형이거나 공유적으로 폐쇄되어 원을 형성하는 분자의 형태일 수 있다. 핵산은, 예를 들어, DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA 형태로 세포 내로의 도입, 즉 형질감염에 사용될 수 있다. RNA는 또한 서열 안정화, 캡핑, 및/또는 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.
본 발명의 맥락에 있어서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 전체적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드(ribonucleotide)"는 β-D-리보푸라노실 그룹의 2'-위치에 하이드록실 그룹을 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 이 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변형에 의해 천연 생성 RNA와 다른 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의, 비-뉴클레오티드 물질의 부가, 예컨대 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로 부가되는 것을 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비-천연 생성 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은, 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체(analog)라고 지칭될 수 있다. 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공과 같은 인공 염색체 벡터, 또는 천연 생성 RNA의 유사체를 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 벡터를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA"는 "전령 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함하고 바람직하게는 이에 관한 것이며, DNA를 주형으로 사용하여 생성될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 "전사체(transcript)"에 관한 것이다. mRNA는 전형적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포와 시험관 내에서 제한된 반감기를 갖는다. 바람직하게는, mRNA는 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 본 발명의 한 실시형태에서 있어서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 얻어진다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 다양한 시험관 내 전사 키트가 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서 있어서, 상기 mRNA 분자는 면역 조절 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자이다.
본 발명의 맥락에 있어서, 용어 "면역 조절 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자(mRNA molecules encoding immune modulating proteins)"는 항원 제시 세포; 더 특별하게는 수지상 세포의 기능성을 변형시키는 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자를 의미한다. 이러한 분자는 CD40L, CD70, caTLR4, IL-12p70, L-셀렉틴, CCR7, 및/또는 4-1BBL, ICOSL, OX40L, IL-21; 더 특별하게는 CD40L, CD70 및 caTLR4 중 하나 이상을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 면역자극 인자의 바람직한 조합은 CD40L 및 caTLR4(즉, "DiMix")이다. 다른 바람직한 실시형태에서 있어서, CD40L, CD70 및 caTLR4 면역자극 분자의 조합이 사용되며, 이는 본 명세서에서 "TriMix"로도 명명된다.
또 다른 특정 실시형태에서 있어서, 상기 mRNA 분자는 항원- 및/또는 질병-특이적 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자이다.
본 발명에 따르면, 용어 "항원(antigen)"은 면역 반응을 유발하고/하거나 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 포함하고; 따라서, 항원이라는 용어는 또한 항원으로부터의 최소 에피토프를 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 정의된 "최소 에피토프(minimal epitope)"는 면역 반응을 유도할 수 있는 가장 작은 구조를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에 있어서 항원은 바람직하게는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대해 특이적인, 면역 반응을 유도하는, 선택적으로 가공 후의, 분자이다. 특히, "항원"은, 선택적으로 가공 후, MHC 분자에 의해 제시되고 T 림프구(T 세포)와 특이적으로 반응하는 분자에 관한 것이다.
특정 실시형태에서 있어서, 항원은 종양 항원, 또는 박테리아, 바이러스 또는 진균 항원일 수 있는 표적 특이적 항원이다. 상기 표적-특이적 항원은 다음 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다: (a) 표적 세포(들)로부터 분리된 총 mRNA, 하나 이상의 특이적 표적 mRNA 분자, (a) 표적 세포(들)의 단백질 용해물, (a) 표적 세포(들)로부터의 특이적 단백질, 또는 합성 표적-특이적 펩타이드 또는 단백질 및 표적-특이적 항원 또는 이의 유도된 펩타이드를 인코딩하는 합성 mRNA 또는 DNA.
어떠한 오해를 피하기 위해, 본 발명의 LNP는 단일 mRNA 분자를 포함할 수 있거나, 또는 이들은 다수의 mRNA 분자, 예컨대 면역 조절 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 분자 및/또는 항원- 및/또는 질병 특이적 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 분자의 조합을 포함할 수 있다.
매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 면역조절 분자를 인코딩하는 상기 mRNA 분자는 항원- 및/또는 질병-특이적 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 분자와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 LNP는, 항원- 및/또는 질병-특이적 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 분자와 조합하여, 면역자극 분자 CD40L, CD70 및/또는 caTLR4(예컨대, Dimix 또는 Trimix)를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 매우 구체적인 실시형태에서 있어서, 본 발명의 LNP는, 항원 및/또는 질병 특이적 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 분자와 조합하여, CD40L, CD70 및/또는 caTLR4를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다.
추가 양태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 LNP를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 약제학적 조성물은 백신으로서 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 LNP를 포함하는 백신을 제공한다.
본 발명의 맥락에 있어서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "백신(vaccine)"은 질병에 대한 적응 면역(항체 및/또는 T 세포 반응)을 제공하도록 의도된 임의의 제제(preparation)를 의미한다. 이를 위해, 본 명세서에서 의미하는 바와 같은 백신은 적응 면역 반응을 일으키는 항원을 인코딩하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 함유한다. 이 항원은 약화되거나 사멸된 형태의 미생물, 단백질 또는 펩티드, 또는 핵산을 인코딩하는 항원의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 맥락에 있어서 항원은 숙주의 면역 체계에 의해 외래인 것으로 인식되는 단백질 또는 펩티드를 의미하며, 이에 따라 이러한 항원과 싸울 목적으로 이에 대한 항체의 생산을 자극한다. 백신은 예방적(예를 들어, 임의의 천연 또는 "야생(wild)" 병원체에 의한 미래 감염의 영향을 예방 또는 완화하기 위해), 또는 치료적(예를 들어, 진행 중인 질병의 증상을 적극적으로 치료하거나 감소시키기 위해)일 수 있다. 백신을 투여하는 것을 백신접종(vaccination)이라고 한다.
본 발명의 백신은 면역 반응, 암에 대한 면역 반응과 같은, 특히 질병-관련 항원 또는 질병-관련 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 백신은 암과 같은 질병-관련 항원을 발현하는 세포 또는 질병 관련 항원을 포함하는 질병의 예방적 및/또는 치료적 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 면역 반응은 T 세포 반응이다. 한 실시형태에서 있어서, 질병-관련 항원은 종양 항원이다. 본 명세서에 기재된 나노입자에 포함된 RNA에 의해 인코딩되는 항원은 바람직하게는 질병-관련 항원이거나, 또는 질병-관련 항원 또는 질병-관련 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 LNP 및 백신은 특히 정맥내 투여, 즉 액체 물질을 정맥으로 직접 주입하기 위한 것이다. 정맥 경로는 체액과 약물을 몸 전체에, 즉 전신적으로 전달하는 가장 빠른 방법이다. 따라서 본 발명은 정맥내 투여를 위한 개시된 백신 및 LNP의 용도 뿐만 아니라 정맥내 백신을 제공한다. 따라서 본 발명의 백신 및 LNP는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 백신 및 LNP의 용도를 제공하며; 여기서 백신은 정맥내로 투여된다.
본 발명의 LNP의 면역원성은 특히 다중(multiple) 면역접종 시 증가하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 특정 실시형태에서 있어서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 LNP는 백신접종 목적으로 사용하기 위한 것이며, 여기서 LNP는 특정 간격 내에서 적어도 2회, 바람직하게는 적어도 3회 투여된다.
본 발명은 또한 인간 또는 수의학 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 LNP, 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 인간 또는 수의학 의약을 위한 본 발명에 따른 LNP, 약제학적 조성물 및 백신의 사용이 또한 의도된다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 LNP, 약제학적 조성물 및 백신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 인간 및 수의학적 장애의 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 하나 이상의 핵산 분자의 면역원성 전달을 위한 본 발명에 따른 LNP, 약제학적 조성물 또는 백신의 용도를 제공한다. 이와 같이 본 발명의 LNP, 약제학적 조성물 및 백신은 여러 인간 및 수의과 장애의 치료에 매우 유용하다. 따라서, 본 발명은 암 또는 감염성 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 LNP, 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다.
본 발명의 지질 나노입자는 실시예 부분에 명시된 프로토콜에 따라 제조될 수 있다. 보다 일반적으로, LNP는 다음 단계를 포함하는 방법을 이용하여 제조될 수 있다:
- 상기 이온화 지질, 상기 인지질, 상기 스테롤, 상기 PEG 지질 및 적합한 알코올성 용매를 포함하는 제1 알코올성 조성물을 제조하는 단계;
- 상기 하나 이상의 핵산 및 수성 용매를 포함하는 제2 수성 조성물을 제조하는 단계;
- 미세유동(microfluidic) 혼합 장치에서 상기 제1 및 제2 조성물을 혼합하는 단계.
보다 구체적으로, 지질 성분은 에탄올과 같은 알코올성 비히클에서 적절한 농도로 조합된다. 여기에, 핵산을 포함하는 수성 조성물을 첨가하고, 이어서 미세유동 혼합 장치에 로딩한다.
미세유동 혼합의 목적은 미세규모 장치에서 여러 샘플(즉, 지질상 및 핵산상)을 완전하고 신속하게 혼합하는 것이다. 이러한 샘플 혼합은 일반적으로 서로 다른 종 흐름 사이의 확산 효과를 증강시켜 달성된다. 이에는, 예를 들어, 문헌[Lee et al., 2011]에서 검토된 것과 같은, 여러 미세유동 혼합 장치가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 특히 적합한 미세유동 혼합 장치로는 Precision Nanosystems의 NanoAssemblr가 있다.
본 발명의 LNP를 제조하는데 적합한 다른 기술은 성분을 적합한 분산 매질, 예를 들어, 수성 용매 및 알코올성 용매에 분산시키는 단계, 및 하기 방법 중 하나 이상을 적용하는 단계를 포함한다: 에탄올 희석법, 단순 수화법, 초음파 처리, 가열, 볼텍싱, 에테르 주입법, 프렌치프레스법, 콜산법, Ca2+ 융합법, 동결-해동법, 역상 증발법, T-정션 혼합, 미세유동 수력학 포커싱(Microfluidic Hydrodynamic Focusing), 엇갈린 헤링본 혼합(Staggered Herringbone Mixing) 등.
실시예
실시예 1 내지 3의 재료 및 방법
마우스
암컷 C57BL/6 마우스를 Charles River Laboratories(프랑스)에서 구입하여 표준 사육 재료를 사용하고 강화 케이지를 구비한 개별 환기 케이지에 수용했다. 동물을 기관(Vrije Universiteit Brussel) 및 동물 실험에 대한 유럽 연합 지침에 따라 유지하고 처치했다. 마우스는 음식과 물에 자유롭게(ad libitum) 접근할 수 있게 하였다. 생후 6 내지 10주에 실험을 시작했다. 마우스는 꼬리 정맥을 통해 LNP(200 ㎕ 부피) 중의 10 ㎍ mRNA로 정맥 주사를 받았다. 대조군 마우스에 동일한 시간 간격으로 TBS(Tris Buffered Saline) 200 ㎕를 주사했다. 마우스의 체중을 2일마다 모니터링했다.
ADPGK SLP(Synthetic Long Peptide) 백신접종의 경우, 200 ㎕의 PBS 중의, 50㎍ ADPGK SLP(GIPVHLELASMTNMELMSSIVHQQVFPT, (서열번호 3) Genscript), 50 ㎍ 항-CD40 Mab(클론 FJK45, BioXCell) 및 100 ㎍ pIC HMW(InvivoGen)의 배합물을 동일한 시간 간격으로 마우스에게 복강내 주사했다.
mRNA 합성 및 정제
WO2015071295에 설명된 프로토콜에 따라, eTheRNA 플라스미드 pEtherna로부터 시험관 내 전사(IVT)에 의해 캡핑된 비-뉴클레오사이드 변형 E7 및 ADPGK mRNA를 eTheRNA를 통해 제조했다. HPV16-E7 또는 ADPGK 단백질을 인코딩하는 서열을 신호 서열과 인간 DC-LAMP의 막관통 및 세포질 영역 사이에 인프레임(in-frame)으로 클로닝했다. 5' 말단에 번역 인핸서가 풍부하고 3' 말단에 RNA 안정화 서열이 풍부한 pEtherna 플라스미드에 이 키메라 유전자를 클로닝했다. IVT 후, 셀룰로오스 정제로 dsRNA를 제거했다. 셀룰로오스 분말을 Sigma에서 구입하여 16% 에탄올이 포함된 1xSTE(Sodium Chloride-Tris-EDTA) 완충액으로 세척했다. IVT mRNA(16% 에탄올이 포함된 1xSTE 완충액 중)를 세척된 셀룰로오스 펠릿에 첨가하고 실온에서 20분 동안 진탕시켰다. 그런 다음 이 용액을 진공 필터(Corning)로 옮겼다. 용리액은 ssRNA 분획을 함유했고, 이것을 모든 실험에 사용했다. mRNA 품질을 모세관 겔 전기영동(Agilent, Belgium)으로 모니터링했다.
mRNA 지질-기반 나노입자의 생성
지질 기반 나노입자를 NanoAssemblr Benchtop(Precision Nanosystems)을 이용하여 아세트산나트륨 완충액(100 mM, pH4) 중의 mRNA 용액과 지질 용액을 2:1 부피비로 9 ㎖/분의 속도로 미세유동 혼합하여 생성했다. 지질 용액은 CoatsomeSS-EC(NOF Corporation), DOPE(Avanti), 콜레스테롤(Sigma) 및 DMG-PEG2000(C14 지질)(Sunbright GM-020, NOF Corporation)의 혼합물을 함유했다. 4가지 지질을 상이한 몰비로 혼합했다. LNP를 슬라이드-어-라이저(slide-a-lyzer) 투석 카세트(20K MWCO, 3mL, ThermoFisher)를 이용하여 TBS(LNP 부피보다 10000배 더 많은 TBS 부피)에 대해 투석했다.
유세포분석
면역접종 대략 6일 후에 처치된 마우스 및 대조군 마우스로부터 혈액을 수집했다. 적혈구를 용해시키고 잔여 백혈구를 제조업체의 지침(MBL International)에 따라 APC 표지된 E7(RAHYNIVTF)-테트라머(서열번호 1) 또는 ADPGK(ASMTNMELM)-테트라머(서열번호 2)로 염색했다. 과량의 테트라머를 씻어냈다. 이후, 표면 분자에 대한 항체 혼합물(표 2에 열거됨)을 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. LSR Fortessa 세포측정기에서 데이터를 수집하고 Flow Jo 소프트웨어로 분석했다.
결과
실시예 1. 마우스를 나타낸 몰비로 SS-EC/DOPE/chol/DMG-PEG2000으로 구성된 E7 mRNA LNP로 3회 정맥내 면역접종했다. 각각의 mRNA LNP 조성물에 의해 유발된 E7-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 각각의 면역접종 후 유세포측정기로 혈액에서 평가했다. 도 1에 나타난 바와 같이, 0.5 몰% DMG-PEG2000로 제형화된 mRNA LNP는 1 몰% DMG-PEG2000에서 제형화된 mRNA LNP와 비교하여 훨씬 더 높은 E7-특이적 CD8 T 세포 반응을 유도했다.
실시예 2.
마우스를 표시된 몰비에서 SS-EC/DOPE/chol/DMG-PEG2000으로 구성된 E7 mRNA LNP로 3회 정맥 면역접종했다. 각각의 mRNA LNP 조성물에 의해 유발된 E7-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 각각의 면역접종 후 유세포측정기로 혈액에서 평가했다. 도 2에 나타난 바와 같이, 0.5 몰% DMG-PEG2000로 제형화된 mRNA LNP는 2 몰% DMG-PEG2000로 제형화된 mRNA LNP와 비교하여 훨씬 더 높은 E7-특이적 CD8 T 세포 반응을 유도했으며, 효과는 3회 면역접종 후 훨씬 더 두드러졌다.
실시예 3. 마우스에 낮은 백분율의 PEG LNP(50/10/39.5/0.5의 이온화 지질/DOPE/콜레스테롤/PEG-지질)에 패키징된 10 ㎍ ADPGK mRNA 또는 50 ㎍ ADPGK 합성 긴 펩티드(SLP)를 4회 정맥 투여했다. 4차 면역접종 6일 후에 혈액 내 ADPGK-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 측정했다. 0,5 몰% DMG-PEG2000로 제형화된 mRNA LNP는 SLP에 비해 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 데 더 우수했다(도 3).
실시예 4 - 8에 대한 재료 및 방법
동물
모든 마우스 실험을 UMC Utrecht의 Utrecht Animal Welfare Body 또는 Ghent University 동물 윤리 위원회의 승인을 받아 수행했다. 동물 관리는 확립된 지침에 따랐다. 모든 마우스는 물과 표준 실험실 동물 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 암컷 C57Bl/6J 마우스는 Charles River Laboratories, Inc.(독일/프랑스)에서 입수했다.
mRNA 합성 및 정제
코돈 최적화된 E7, TriMix 및 루시퍼라제 mRNA를 eTheRNA 플라스미드로부터 시험관내 전사(IVT)에 의해 eTheRNA를 통해 준비했다. 뉴클레오티드 변형은 사용하지 않았다. DOE에 사용된 E7 mRNA는 ARCA 캡핑되었다. 이후의 모든 실험은 CleanCapped mRNA를 사용하여 수행했다. IVT 후, 셀룰로오스 정제로 dsRNA를 제거했다. mRNA 품질은 모세관 겔 전기영동(Agilent, Belgium)으로 모니터링했다. Cleancap® Cy5-표지된 Fluc mRNA(5-메톡시우리딘 변형 및 실리카 정제)는 TriLink Biotechnologies에서 구입했다.
LNP 생산 및 특성화
생체분배(biodistribution) 및 세포 흡수 연구를 위해, LNP에 반딧불이 루시퍼라제(Fluc) 인코딩 mRNA(eTheRNA immunotherapies NV)와 Cleancap® Cy5-표지된 Fluc mRNA(TriLink Biotechnologies)를 1:1 비율로 혼합하여 로딩했다. DoE 면역원성 연구의 경우, LNP에 E7 mRNA를 로딩했다. 다른 모든 연구는 3:1:1:1 비율의 E7, 마우스 CD40L, 마우스 CD70 및 구성적으로 활성인 TLR4 mRNA의 혼합물로 수행했다. mRNA를 100 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4)에 희석하고 지질을 에탄올에 용해 및 희석했다. mRNA 및 지질 용액을 NanoAssemblr Benchtop 미세유동 혼합 시스템(Precision Nanosystems)을 이용하여 혼합하고 이어서 Tris-완충 식염수(TBS, 20 mM Tris, 0.9% NaCl, pH 7.4)으로 밤새 투석했다. LNP의 농축을 위해 Amicon Ultra Centrifugal Filters(10kD)를 사용했다. 크기, 다분산 지수 및 제타 전위는 Zetasizer Nano(Malvern)로 측정했다. mRNA 캡슐화 효율을 리보그린(ribogreen) 분석(ThermoFisher)을 통해 결정했다. 모든 LNP의 조성은 표 2(DOE 실험에서 DMG-PEG2000 LNPs의 조성)에 요약되어 있다.
T 세포 반응
매주 간격으로 선택된 LNP 중의 10 ㎍의 mRNA를 꼬리 정맥을 통해 정맥주사하여 마우스를 면역접종했다. 유세포분석 염색을 위한 혈액을 면역접종 후 5 내지 7일에 수집했다. 적혈구의 용해 후, 세포를 FcR 블록 및 생존도 염료와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 및 세척 후, APC 표지된 E7(RAHYNIVTF)-테트라머를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 과량의 테트라머를 씻어내고 표면 분자 CD3 및 CD8에 대한 항체 혼합물을 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 샘플을 3-레이저 AtuneNxt 유세포분석기 또는 4-레이저 BD LSRFortessa 유세포분석기에서 획득했다.
세포내 사이토카인 생성을 3차 면역접종 7일 후에 비장에서 측정했다. 비장 세포의 단일 세포 현탁액은 비장을 분쇄하고, 적혈구를 용해하고 40 μM 세포 스트레이너를 통해 샘플을 여과하여 준비했다. 200.000개의 세포/웰/샘플을 96웰 플레이트에 이중으로 플레이팅했다. 세포를 37℃에서 인큐베이션하기 전에 자극을 위해 4 ㎍의 E7 펩타이드(Genscript)를 첨가했다. 펩티드 자극 1시간 후, GolgiPlug(BD Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences))를 추가했다. 세포를 추가로 4시간 동안 인큐베이션했다. 이후, 세포를 FcR 블록 및 생존성 염료와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 및 세척 후, APC 표지된 E7(RAHYNIVTF)-텍스트라머를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 과량의 덱스트라머를 씻어내고 표면 분자 CD3 및 CD8에 대한 항체 혼합물을 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 추가 단계는 BD Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences)의 제조업체 지침에 따랐다. 투과화 후, IFN-γ 및 TNF-α에 대해 세포를 염색했다. 샘플을 4-레이저 BD LSRFortessa 유세포분석기에서 획득했다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행했다.
염증성 사이토카인
각 면역접종 후 6시간(0일, 7일, 14일 및 50일)에 혈액 샘플을 겔 응고 인자(Sarstedt)가 있는 튜브에 수집했다. 응고된 혈액 샘플을 10.000g에서 5분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 샘플은 분석 전까지 -80℃에서 보관했다. ProcartaPlex 다중 분석(ThermoFisher)을 이용하여 IFN-α, IFN-γ, IP-10의 농도를 결정했다. 혈청 샘플을 분석 완충액에 3배 희석하고 형광 표지된 비드와 함께 120분 동안 인큐베이션했다. 추가 단계는 프로토콜에 따라 수행했다. 샘플은 MagPix 기기(Luminex)에서 획득했다. ProcartaPlex Analyst 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
TC-1 종양 실험
TC-1 세포를 Leiden University Medical Center에서 구입했다. 50 ㎕ PBS 중의 50만개 TC-1 세포를 마우스 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 종양 측정은 캘리퍼스를 이용하여 수행했다. 종양 체적은 (최소 직경² x 최대 직경)/2로 계산했다. Ant-PD-1 및 아이소형 대조군 항체를 마우스당 200 μL 중 200 ㎍의 농도로 PBS에서 새로 희석하고 복강내 주사했다. 마우스에 항PD-1 항체(단일요법 또는 mRNA LNP 면역접종과의 조합) 또는 아이소형 대조군(LNP 면역접종과의 조합)을 제공했다. 항체를 첫 번째 mRNA LNP 면역접종 후 3일부터 시작하여 마지막 LNP 주입 후 2주까지 3-4일마다 주입했다. 종양 침윤 림프구의 분석을 위해, 2차 mRNA LNP 면역접종 3일 후에 종양을 분리하고 MACS 조직 저장 완충액(Miltenyi Biotec)이 채워진 24-웰 플레이트에 넣었다. 종양을 잘게 썰고 규칙적인 진탕과 함께 분해 완충액에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이 후, 적혈구를 용해시키고 모든 샘플을 70μM 세포 스트레이너로 여과했다. 염색을 진행하기에 앞서 피콜-파크(ficoll-paque) 밀도 구배 정제로 림프구를 농축했다. 먼저, 세포를 FcR 블록 및 생존도 염료와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 및 세척 후, APC 표지된 E7(RAHYNIVTF)-테트라머를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 과량의 테트라머를 씻어 내고 표면 분자 CD45 및 CD8에 대한 항체 혼합물을 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이셨했다. 샘플을 3-레이저 AtuneNxt 유세포분석기 또는 4-레이저 BD LSRFortessa 유세포분석기에서 획득했다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행했다.
생체 분포 및 세포 흡수
선택된 LNP 제형에서 10 ㎍의 mRNA를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥 주사했다. 4시간 후, 마우스를 펜토바르비탈(6 mg/mL) 250 ㎕로 마취시켰다. 겔 응고 인자(Sarstedt)가 있는 튜브에 혈액 샘플을 수집했다. 이어서, 흉강을 열고, 간문맥을 절단한 후, 우심실을 통해 7 ㎖의 PBS를 마우스에 관류시켰다. 장기를 적출하고 액체 질소에서 급속 냉동했다. 간 및 비장 조직의 경우, 유세포분석기 분석을 위해 장기의 일부를 얼음처럼 차가운 PBS에 보관했다.
세포 흡수
간 및 비장 조직을 각각 1 mg/㎖ 콜라게나제 A(Roche) 또는 20 ㎍/㎖ 리베라제(Liberase) TM(Roche) 및 10 ㎍/㎖ DNAse I, 등급 II(Roche)를 함유하는 RPMI 1640 배지와 함께 페트리 접시에 넣었다. 수술용 칼날을 사용하여 조직을 잘게 자르고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 이어서, 조직 현탁액을 100 ㎛ 나일론 셀 스트레이너에 통과시켰다. 간 현탁액을 70 x g에서 3분 동안 원심분리하여 실질 세포(parenchymal cells)를 제거했다. 상청액 및 비장 현탁액을 500 x g에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화했다. 적혈구를 ACK 완충액(Gibco)에서 5분 동안 용해시키고, PBS로 불활성화시킨 후, 100 ㎛ 세포 여과기를 통과시켰다. 세포를 1% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 1640으로 세척하고 트리판 블루와 혼합하고 Luna-II 자동 세포 계수기(Logos Biosystems)를 이용하여 계수했다. 3 x 105개(간) 또는 6 x 105개(비장)의 살아있는 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 500 x g에서 5분 동안 펠릿화하고, 50% 브릴리언트 염색 완충액(BD Biosciences) 및 2μg/mL TruStain FcX(BioLegend)을 함유하는 PBS(2% PBSA) 중의 2% BSA에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하고 이중으로 적용가능한 항체 칵테일(총 3개)을 함유하는 2% PBSA와 1:1로 혼합했다. 세포를 진탕기에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 2% PBSA로 2회 세척하고, 0.25 ㎍/㎖ 7-AAD Viability Stain(BioLegend)을 함유하는 2% PBSA에 재현탁시켰다. 샘플은 4-레이저 BD LSRFortessa 유세포분석기에서 획득했다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석했다.
전신 분포
대략 50 내지 100 mg의 각 조직을 적출하고, 무게를 재고, 1.4 mm 세라믹 비드(Qiagen)의 대략 5 mm 층이 있는 2 ㎖ 마이크로튜브에 넣었다. 각 조직 mg에 대해, 3 ㎕의 차가운 세포 배양 용해 시약(Promega)을 첨가하고, 조직을 Mini-BeadBeater-8(BioSpec)을 이용하여 4℃에서 60초 동안 최대 속도로 균질화했다. 균질액을 -80℃에 보관하고 해동하고 4℃에서 10분 동안 10.000 x g에서 원심분리하여 비드와 파편을 제거하고 상층액을 다시 -80℃에 보관했다. 각 용해물 10 마이크로리터를 흰색 96-웰 플레이트에 이중으로(duplicate) 분주했다. 인젝터가 장착된 SpectraMax iD3 플레이트 판독기를 이용하여 50 ㎕의 루시퍼라제 분석 시약(Promega)를 혼합하는 동안 각 웰에 분주한 다음, 2초간 대기하고 10초 동안 루시퍼라제 방출을 기록했다. TBS를 주사한 마우스의 장기 용해물로부터 얻은 백그라운드 신호에 대해 루시퍼라제 활성을 정규화했다.
면역 세포 활성화
선택한 LNP 중의 mRNA 5 ㎍을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥 주사했다. 유세포분석기 염색을 위해 4시간 후에 비장을 수확했다. 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 준비하고 분해 완충액(DNAse-1 및 콜라게나아제-III가 포함된 DMEM)과 함께 20분 동안 정기적으로 진탕하면서 인큐베이션했다. 이후, 샘플을 Fc 블록 및 생존 염료와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 및 세척 후, 세포를 세포 계통 마커 및 활성화 마커로 염색했다. 샘플은 3-레이저 AtuneNxt 유세포분석기에서 획득했다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행했다.
실시예 4 - 최대 T 세포 반응을 위한 LNP 조성물의 DOE-기반 최적화
상업적으로 입수가능한 이온화 지질 Coatsome SS-EC를 콜레스테롤, DOPE 및 PEG화 지질과 조합하여 LNP 라이브러리를 생성했다. DOPE는 이미 조사가 진행 중인 여러 승인된 리포솜 제품 및 mRNA-백신의 일부이다. 현재 실험을 위해, DMG-PEG2000을 포함하는 다양한 LNP 조성을 조사했다.
지질 몰비가 i.v. mRNA-LNP-백신접종에 의해 유발된 T 세포 반응에 영향을 미치고 그에 따라 백신 효능을 개선하기 위해 최적화될 수 있는 변수인지 여부를 밝히기 위해 첫 번째 LNP 라이브러리를 설계했다. SS-EC, DOPE 및 PEG-지질의 몰 백분율을 독립 변수로 간주한 반면, 콜레스테롤은 몰 백분율을 100%로 균형을 맞추기 위한 필러 지질로 간주했다. DOE 방법론을 이용하여, 11개의 LNP에 대한 실험 설계를 생성했다(표 3의 조성 참조).
LNP
번호		 지질 비율
CoatsomeSS-EC/DOPE/콜레스테롤/DMG-PEG2000
LNP1 50/15/33.75/1.25
LNP2 50/5/43.75/1.25
LNP3 40.5/12.24/46.48/0.78
LNP4 59.5/12.24/46.48/0.78
LNP5 40.5/12.24/45.54/1.72
LNP6 59.5/12.24/26.54/1.72
LNP7 36.6/7.76/54.39/1.25
LNP8 63.4/7.76/27.59/1.25
LNP9 50/7.76/41.66/0.58
LNP10 50/7.76/40.32/1.92
LNP11 50/10/38.75/1.25
11개의 지질 비율은 실험 영역에서 균일하게 분포되었다(데이터 미제시). 면역원성 스크리닝을 위해, 3회 i.v. 면역접종 후 혈액 중의 E7-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 최대화되어야 할 반응 변수로 간주했다. 이를 위해, 모든 LNP는 항원으로서 인간 유두종바이러스 16(HPV16) 종양단백질 E7을 인코딩하는 mRNA를 패키징했다. 결과는 CD8 T-세포 반응의 크기가 LNP 조성에 크게 의존한다는 본 출원인의 가정을 확인시켰다. 몇몇 mRNA-LNP-백신은 E7-특이적 CD8 T 세포 반응의 50% 이상을 야기한 반면, 다른 mRNA-LNP-백신은 거의 어떠한 반응도 유도하지 않았다(도 4a). DMG-PEG2000의 몰%는 E7-특이적 CD8 T 세포 반응의 크기와 관련하여 중요한 매개변수인 것으로 확인되었다. 최대 T-세포 반응을 달성하기 위해서는 낮은 몰 백분율의 PEG-지질이 필요했다(도 4c).
베이지안(Bayesian) 회귀 모델링을 데이터에 적용하여 특정 LNP-조성물의 면역원성을 예측할 수 있는 반응 표면 모델(데이터 미제시)을 생성했다. 모델의 예측 값을 검증하기 위해, 2개의 새로운 LNP-조성물(표 3:DOE 실험에서 DMG-PEG2000 LNP의 조성)을 평가했다.
LNP 번호 지질 비율
CoatsomeSS-EC/DOPE/콜레스테롤/DMG-PEG2000
LNP34 56.5/5.25/37.75/0.5
LNP35
(비교예)		 42/12/44.5/1.5
LNP34(DMG-PEG2000)로 면역화된 마우스는 90% 이상의 확률로 > 30%의 E7-특이적 CD8 T 세포(최적 LNP)를 유도한 반면, LNP35(DMG-PEG2000)는 빈약한 T-세포 반응(비최적 LNP)을 생성할 것으로 예측되었다. 실험 데이터는 대체로 예측과 일치하여 모델을 성공적으로 검증했다. 예측된 최적의 LNP로 면역화된 모든 마우스는 실제로 30% 이상의 E7-특이 CD8 T-세포 반응을 보인 반면, LNP35로 면역된 마우스 중 어느 것도 이 임계값 이상의 T-세포 반응을 유도하지 않았다(도 4b).
실시예 5 - mRNA 백신은 정성적 T 세포 반응을 유도한다
암 면역요법의 성공은 T 세포 표현형, 기능성 및 종양 침윤을 포함하는, 다양한 요인의 영향을 받는다. 본 출원인은 먼저 LNP34에 의해 유발된 T 세포 반응의 품질과 부스팅력(boostability)을 평가했다. 이를 위해, 마우스는 0일, 7일 및 14일에 3회의 프라이밍 면역접종을 받은 후 이어서 50일에 최종 면역접종을 받았다. E7 mRNA는, T-세포 반응의 강도를 증가시키는, 3가지 면역자극성 mRNA의 혼합인 TriMix로 보충되었다(Bonehill et al., 2008).
E7-TriMix로 3회 면역접종한 후, E7-특이적 T 세포의 70% 이상이 혈액에서 나타났다(도 5a). 3차 면역접종 5주 후에, E7-특이적 CD8 T 세포의 비율은 높게 유지되었다. 최종 부스터 면역접종 투여시 E7-특이적 이펙터 T 세포의 급속한 확대가 관찰되었고, 따라서 백신은 부스팅력이 있음이 입증되었다(도 5a). E7-특이적 T 세포의 증가하는 수를 반영하여, 모든 면역접종으로 혈청 중의 더 높은 농도의 IFN-γ가 측정되었다(도 5b).
T 세포 기능을 평가하기 위해, 3회 면역접종 후 세포 내 사이토카인 염색을 수행했다. 동시에 하나 이상의 사이토카인을 생산하는 다기능성 CD8 T 세포는 감염성 질병 및 종양의 더 나은 제어와 연관되어 있고, 최적의 LNP의 경우 CD8 E7 특이적 T 세포의 대략 28%를 차지한다(도 5c).
실시예 6 - mRNA 백신은 종양 퇴행을 유도한다
HPV16 E6/E7 항원을 이용한 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성된, 동계 마우스 종양 모델 TC-1에서 치료적 항종양 효능을 평가했다. 종양의 평균 직경이 55 ㎣에 도달했을 때 LNP34에 의해 운반되는 5 ㎍ E7-TriMix로 치료를 시작했다. 또한, 마우스를 항-PD-1(또는 아이소형 대조군 항체)로 처리했다. PD-1은 활성화된 T 세포에서 발현되며 PD-L1과 상호작용하면 T 세포 기능을 억제하고 내성을 유도한다. PD-1 체크포인트 차단은 T 세포 반응성을 유지하고 전이성 또는 절제불가능한 재발성 HNSCC 환자의 1차 치료제로 승인되었다. LNP34 백신접종은 TC-1 종양의 심대한 퇴행(도 5d)과 상당히 연장된 생존 시간(도 5e)을 초래했지만, 종양은 치료 중단 후 재발했다. 항-PD1 단일요법은 TC-1 보유 마우스에 어떠한 치료적 이점도 제공하지 못했다.
마지막으로, 본 출원인은 백신 유도 T 세포가 종양상(tumorbed)에 도달하는 능력을 평가했다. 각각의 mRNA-LNP-백신으로 2회 백신접종하면 CD8+ 종양-침윤 T 세포가 종양으로 강하게 침투했으며(도 5f), 70% 이상이 E7에 특이적인 것으로 나타났다(도 5g). 백신 처리에 대한 항-PD-1의 추가는 종양에 들어가는 E7-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 유의하게 변경하지 않았다.
실시예 7 - 최적의 LNP는 비장에서 흡수를 증가시키고 면역 세포를 활성화한다.
유발된 T 세포 반응의 크기와 기관 및 세포 유형 수준에서 mRNA 흡수 및 발현의 생체분포 사이에 상관관계가 존재하는지 여부를 밝히기 위해 본 출원인은 이전에 면역원성에 대해 스크리닝된 DMG-PEG2000 LNP에서 Cy5-표지된 반딧불이 루시퍼라제 mRNA를 캡슐화했다. 루시퍼라제 활성을 LNP-주입 4시간 후에 분리된 간, 비장, 폐, 심장 및 신장에서 측정했다. 예상한 바와 같이, LNP-조성은 mRNA-발현의 강도 및 기관 특이성에 강한 영향을 미쳤다. 간이 주요 표적 기관이었고 그 다음이 비장이었지만, 간 대 비장의 비율은 LNP 간에 크게 달랐다(도 6a). 3차 면역접종 후 E7-특이적 CD8 T-세포 반응의 크기는 비장 발현과 양의 상관관계가 있었다. 비장으로의 전달의 중요성은 전체 발현과 T-세포 반응 사이의 상관관계가 없다는 점에서 더욱 강조되었다(데이터 미제시). LNP 크기(지질 조성과 강하게 연관되어 있음) 간에도 유의한 상관관계가 확인되었다.
본 출원인은 다음으로 면역원성이 초기 mRNA 흡수 및 비장에서 특정 면역 세포 유형의 활성화와 관련이 있는지를 평가했다. LNP는 주로 대식세포와 단핵구에 축적된다(도 6b). T-세포 반응과 비장 대식세포, 단핵구, 형질세포양 DC(pDC) 및 B 세포에 의한 LNP 섭취 사이에 강한 전반적인 상관관계가 존재했다(데이터 미제시).
비장에서의 mRNA-흡수 및 발현의 중요성을 추가로 검증하기 위해, 본 발명자들은 최적의 고도의 면역원성 LNP34와 비최적의 빈약한 면역원성의 LNP35의 생체분포 및 세포 흡수 프로파일을 비교했다. LNP35에 비해, LNP34는 비장에서 상대적인 mRNA 발현을 극적으로 증가시켰고(도 6c), 비장에서 대식세포, B 세포 및 DC에 의한 흡수를 증가시켰다(도 6d).
서브최적(suboptimal) 대응물과 비교하여, 최적의 mRNA LNP 조성물 LNP34는 혈액에서 더 높은 수준의 염증성 사이토카인을 유발하였으며, 이는 증가된 선천적 활성화에 대한 지표이다(도 6e).
실시예 8 - 본 발명의 추가 DMG-PEG2000 LNP
이 실시예에서 추가로 흥미로운 LNP를 테스트했다(표 4:추가 DMG-PEG2000 LNP의 조성 참조). 마우스에 1주 간격으로 2회 정맥 면역접종을 했다. 2차 면역 5일 후, 혈액 중의 E7-특이적 T 세포를 분석했다. 도 7에 나타낸 데이터는 LNP59가 LNP53에 비해 유의하게 나은 성능을 발휘한다는 증거이고; 따라서 본 발명의 맥락에 있어서 또한 매우 적합하다. LNP59는 다시 낮은 백분율의 PEG 지질, 즉 0.5 몰%를 갖는 것을 특징으로 하지만, 또한 상당히 낮은 콜레스테롤 수준, 즉 30 몰% 미만; 특히 약 25 몰%를 갖는다.
LNP 번호 지질 비율
CoatsomeSS-EC/DOPE/콜레스테롤/DMG-PEG2000
LNP53
(비교예)		 50/10/38.5/1.5
LNP59 65/9.5/25/0.5
결론
LNP 조성은 지질 비율의 조절에 의해 강한 면역원성을 위해 조정될 수 있다. 최적의 LNP 조성은 비장에서 증가된 발현을 나타냈고, 여러 APC 집단은 향상된 섭취를 나타냈다. 최적의 LNP는 높은 수준의 I형 IFN을 유도했으며, 이는 유발된 T 세포 반응에 중요한 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 주입된 mRNA 용량의 대부분은 B 세포와 연관이 있었다. B 세포는 활성화된 표현형을 나타냈고 항원-특이적 CD8 T 세포의 유도에 중요했으며, 이는 이전에 보고되지 않은 B 세포의 역할을 나타낸다.
DoE 접근법은 LNP-조성물의 면역원성이 높을지 아니면 낮을지 성공적으로 예측했다. 최적의 LNP-조성물은 A) 비장 APC, 주로 B 세포에 의한 mRNA 흡수 및 발현, B) 염증성 사이토카인의 증가된 방출 및 APC 상의 활성화 마커의 발현에 의해 입증되는 선천적 활성화, C) 확립된 TC-1 종양을 퇴행시킬 수 있는, 높은 규모와 정성적인 T-세포 반응을 촉진했다. 유형 I 인터페론의 유도가 i.v.로 투여된 mRNA 백신의 효능에 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한 B 세포가 T 세포 반응 유도에 중요했으며, 이는 부분적으로 항-PEG 항체 생산에 기인했을 수 있다. 중요한 것은 LNP에 대한 항체의 존재가 T-세포 반응을 유도하는 것을 방해하지 않는다는 것이다. 이것은 많은 사람들이 PEG화된 LNP로의 백신접종 후 PEG-항체를 얻을 수 있을 것이라는 점을 고려하면 관련성이 매우 높다.

Claims (16)

  1. 지질 나노입자(LNP)로서,
    - 이온화 지질;
    - 인지질;
    - 스테롤;
    - PEG 지질; 및
    - 하나 이상의 mRNA 분자,
    를 포함하고,
    - 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
    - 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
    - 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 70 몰%이고; 또한
    - 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 25 몰% 이상인 것,
    을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  2. 청구항 1에 있어서,
    - 이온화 지질;
    - 인지질;
    - 스테롤;
    - PEG 지질; 및
    - 하나 이상의 mRNA 분자,
    를 포함하고,
    - 상기 PEG 지질은 C14-PEG 지질이고;
    - 상기 LNP는 약 1 몰% 미만의 상기 PEG 지질을 포함하고;
    - 상기 이온화 지질의 몰 백분율은 약 50 내지 60 몰%이고; 또한
    - 상기 스테롤의 몰 백분율은 약 30 몰% 이상인 것,
    을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 LNP가 약 0.5 몰% 내지 약 0.9 몰%의 상기 PEG 지질; 바람직하게는 약 0.5 몰%를 포함하는 것인, 지질 나노입자.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인지질의 몰 백분율이 약 10 몰% 미만이고; 바람직하게는 약 5 몰%인, 지질 나노입자.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온화 지질 대 인지질의 비율이 5:1 이상; 바람직하게는 약 6:1 내지 11:1; 가장 바람직하게는 약 11:1인, 지질 나노입자.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온화 지질의 몰 백분율이 약 55 내지 60 몰%인, 지질 나노입자.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C14-PEG 지질이 C14-PEG2000 지질, 바람직하게는 DMG-PEG2000 및 DMPE-PEG2000를 포함하는 목록으부터 선택되고, 가장 바람직하게는 DMG-PEG2000인, 지질 나노입자.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온화 지질이 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는, 지질 나노입자:
    - 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일) 비스(도데칸-2-올)(C12-200);
    - 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA); 또는
    - 하기 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pct00065

    여기서,
    RCOO는 미리스토일, α-D-토코페롤석시노일, 리놀레오일 및 올레오일을 포함하는 목록으로부터 선택되고; X는
    Figure pct00066
    및
    Figure pct00067
    을 포함하는 목록으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 이온화 지질이 RCOO가 α-D-토코페롤석시노일이고, X가
    Figure pct00068
    인, 화학식 (I)의 지질이다.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인지질은 DOPE, DOPC, DSPC 및 이들의 혼합물; 특히 DOPE, DOPC 및 이들의 혼합물을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것인, 지질 나노입자.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스테롤이 콜레스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 옥시스테롤, 안트로스테롤, 데스모스테롤, 니카스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤을 포함하는 목록으로부터 선택되고; 바람직하게는 콜레스테롤인, 지질 나노입자.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LNP가,
    - 약 56.5 몰%의 상기 이온화 지질;
    - 약 5 몰%의 DOPE;
    - 약 38 몰%의 콜레스테롤; 및
    - 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,
    을 포함하는 것인, 지질 나노입자.
  12. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LNP가,
    - 약 65 몰%의 상기 이온화 지질;
    - 약 9.5 몰%의 DOPE;
    - 약 25 몰%의 콜레스테롤; 및
    - 약 0.5 몰%의 DMG-PEG2000,
    을 포함하는 것인, 지질 나노입자.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 mRNA 분자가 면역조절 폴리펩티드-인코딩 mRNA, 예컨대 CD40L, CD70 및 caTLR4를 인코딩하는 mRNA 분자로부터 선택되는 것; 및/또는 항원-인코딩 그룹으로부터 선택되는 것인, 지질 나노입자.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 지질 나노입자 및 허용가능한 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신.
  15. 인간 또는 수의학 의약에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 정의된 지질 나노입자 또는 청구항 14에 정의된 약제학적 조성물 또는 백신.
  16. 암 또는 감염성 질병의 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 정의된 지질 나노입자 또는 청구항 14에 정의된 약제학적 조성물 또는 백신.
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