CN113041224A - 一种纳米人工红细胞及其在制备治疗细菌感染药物中的用途 - Google Patents

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CN113041224A CN202011475463.5A CN202011475463A CN113041224A CN 113041224 A CN113041224 A CN 113041224A CN 202011475463 A CN202011475463 A CN 202011475463A CN 113041224 A CN113041224 A CN 113041224A
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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种纳米人工红细胞及其在制备治疗细菌感染药物中的用途，该纳米药物为红细胞膜蛋白整合到人工脂质膜形成的红细胞膜蛋白脂质体，其中，所述的脂质膜由磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成。本发明所述纳米药物通过模拟红细胞将成孔毒素吸附于其表面，中和毒素的毒性，实现抗毒力因子治疗，从而提高抗细菌感染治疗尤其是耐药细菌感染的效果。

Description

一种纳米人工红细胞及其在制备治疗细菌感染药物中的用途
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种纳米人工红细胞及其在制备治疗细菌感染药物中 的用途，尤其涉及一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米人工红细胞及其在制备治疗细菌 感染药物中的用途；该纳米药物通过模拟红细胞将成孔毒素吸附于其表面，中和毒素的毒 性，实现抗毒力因子治疗，从而提高抗细菌感染治疗尤其是耐药细菌感染的效果。
背景技术
现有技术公开了血液是体内的一种液体结缔组织，在维持机体稳态和调节免疫方面 发挥着极其重要的作用。红血球又称为红细胞，是血液中的最常见的细胞类型，每毫升血 液中有4-6×109个红细胞；正常的红细胞呈双凹圆饼状，直径为7.5-8.7μm，成熟的红细胞不含有线粒体和细胞核(Diez-Silva,M.；Dao,M.；Han,J.；Lim,C.；Suresh,S.,Shape andBiomechanical Characteristics of Human Red Blood Cells in Health andDisease.MRS Bulletin 2010,35,382-388.)；红细胞具有较强的柔韧性(杨氏模量为0.1-0.2kPa)，可以变形通 过狭窄的微血管(Goldsmith,H.；Marlow,J.,Flow Behaviour ofErythrocytes.I.Rotation and Deformation in Dilute Suspensions.Proceedings ofthe Royal Society of London.Series B, Biological Sciences 1972,182(1068),351-384.)。红细胞的平均寿命为100-200天，衰老的 红细胞最终被位于肝和脾的单核巨噬细胞系统从血液中清除(Kim HC,Schwartz E. Unstable hemoglobins.In:Beutler E,Lichtman MA,Coller BS,Kipps TJ,eds.Williams Hematology.5th ed.New York,NY:McGraw-Hill；1995:L33.)。
现有技术中，仿生策略指的是通过模拟生物体的结构或性质来获得生物体的独特功 能(Discher,D.E.；Mitragotri,S.；Irvine,D.J.；Yoo,J.,Bio-inspired,bioengineered and biomimetic drug delivery carriers.Nature Reviews DrugDiscovery 2011,10,521-535.)。红 细胞的主要功能是利用血红蛋白为氧载体，通过全身血液循环将氧气运输至体内各个细 胞。近年来，基于纳米技术和材料工程的医用仿生红细胞引起了研究者的广泛关注(Sen Gupta,A.,Bio-inspired nanomedicine strategiesfor artificial blood components.Wiley Interdisciplinary Reviews:Nanomedicineand Nanobiotechnology 2017,9(6),1-33.)；目前主 要有三类仿生红细胞氧载体系统，包括：基于血红蛋白的氧载体，基于全氟化碳的氧载 体，含亚铁离子卟啉，有的氧载体系统已经进入临床前和临床研究阶段。近年来的一些仿 生红细胞的研究着重于红细胞形状、尺寸和机械柔韧性的模拟(Sen Gupta,A.,Bio- inspired nanomedicine strategies forartificial blood components.Wiley Interdisciplinary Reviews:Nanomedicine andNanobiotechnology 2017,9(6),1-33.)。所述非球形的仿生红细 胞颗粒在血流动力学、循环时间和与组织细胞相互作用等方面表现出特殊的行为(Ibid., Role of particlesize,shape,and stiffness in design of intravascular drug delivery systems:insights from computations,experiments,and nature.Wiley InterdisciplinaryReviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology 2016,8,255-270.)；如有研究者利用非润湿模板的粒 子复制技术(particle replication in nonwetting templates，PRINT)制备了饼状仿红细胞微 粒，该颗粒在体内显示出很长的循环时间(Merkel,T.J.；Jones,S.W.；Herlihy,K.P.； Kersey,F.R.；Shields,A.R.；Napier,M.；Luft,J.C.；Wu,H.；Zamboni,W.C.；Wang,A.Z.； Bear,J.E.；DeSimone,J.M.,Using mechanobiologicalmimicry of red blood cells to extend circulation times of hydrogelmicroparticles.Proceedings of the National Academy of Sciences 2011,108,586-591.)。
成孔毒素是最大的一类细菌毒性蛋白，是重要的细菌毒力因子。在细菌感染过程中，成孔毒素通过破坏内皮屏障和免疫细胞协助细菌定殖、生长和传播，在细菌致病机制中发挥着极其重要的作用(Dal Peraro,M.；van der Goot,F.G.,Pore-forming toxins:ancient, but never really out of fashion.Nature reviews.Microbiology 2016,14,77-92.)；因此，细菌 毒力因子是治疗细菌感染的重要靶点，抗毒力因子治疗是细菌感染治疗的重要策略，正在 成为抗细菌感染研究的热点。与抗生素治疗相比，上述治疗策略不直接产生细菌杀灭作 用，不易诱导细菌耐药(Cegelski,L.；Marshall,G.R.；Eldridge,G.R.；Hultgren,S.J.,The biology and future prospects of antivirulencetherapies.Nature Reviews Microbiology 2008,6, 17-27.)。在后抗生素时代，抗毒力因子治疗被认为能有效缓解耐药细菌感染(Rasko,D. A.；Sperandio,V.,Anti-virulencestrategies to combat bacteria-mediated disease.Nature Reviews Drug Discovery2010,9,117-128.)。
由于可在体外溶解红细胞，许多成孔毒素也被称为溶血素(溶红细胞素)(Otto,M., Staphylococcus aureus toxins.Current Opinion in Microbiology 2014,17,32-37.)；成孔毒素 通过与红细胞膜表面特异性受体相互作用，在受体的帮助下聚集、折叠和组装、插入细胞 膜，在细胞膜上形成孔道，从而改变细胞膜的通透性，造成红细胞溶血，因此，红细胞是 众多成孔毒素的重要靶细胞。根据成孔毒素与红细胞膜的相互作用机制，有研究设计了一 系列的仿红细胞纳米药物，用于成孔毒素清除和细菌感染的治疗，如，加州大学的张良方 教授课题组采用红细胞膜包被聚合物纳米粒(又名纳米海绵)，用于多种成孔毒素的清除 和细菌感染的治疗(Hu,C.J.；Fang,R.H.；Copp,J.；Luk,B.T.；Zhang,L.,Abiomimetic nanosponge that absorbs pore-forming toxins.Nature Nanotechnology2013,8,336-340.)；庞 志清课题组将红细胞膜与人工脂质膜融合，构建了红细胞膜融合脂质体，用于成孔毒素的 高效清除和细菌感染的治疗(He,Y.；Li,R.；Li,H.；Zhang,S.；Dai,W.；Wu,Q.；Jiang,L.； Zheng,Z.；Shen,S.；Chen,X.；Zhu,Y.；Wang,J.；Pang,Z.,Erythroliposomes:Integrated Hybrid Nanovesicles Composed of ErythrocyteMembranes and Artificial Lipid Membranes for Pore- Forming ToxinClearance.ACS Nano 2019,13,4148-4159.)；所述纳米海绵和红细胞膜融 合脂质体均能有效清除成孔毒素和治疗细菌感染，但其制备过程复杂，很难保持红细胞膜 的原有完整结构，容易被体内单核巨噬细胞清除，且临床应用受到红细胞资源缺乏和血型 配对要求的限制。
基于现有技术的基础与现状，本发明拟构建一种新型的纳米人工红细胞—红细胞膜 蛋白脂质体，用于成孔毒素的高效吸附清除和细菌感染的治疗。本发明制备的红细胞膜蛋 白脂质体体内应用上不受血型配对限制，对是否保持红细胞膜的原有完整结构没有要求， 且制备红细胞膜蛋白脂质体过程中可以按需添加膜蛋白提高解毒效果；此外，红细胞膜蛋 白脂质体还可以载药，将药物递送和解毒融为一体，提高抗细菌感染效果，更具临床应用 价值。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的基础与现状，提供一种纳米人工红细胞及其在制 备治疗细菌感染药物中的用途，尤其涉及一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米人工红细 胞及其在制备治疗细菌感染药物中的用途；该纳米药物通过模拟红细胞清除成孔毒素，实 现抗细菌毒力因子治疗，从而提高细菌感染治疗的效果。
本发明中，首先采用脂质材料(磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和/或胆固醇)制备脂质体；从全血中分离红细胞，提取红细胞膜蛋白，然 后将红细胞膜蛋白与脂质体进行融合，制备成红细胞膜蛋白脂质体；其中提取红细胞膜蛋 白过程中可去除血型蛋白。
本发明所述的纳米人工红细胞为红细胞膜蛋白整合到人工脂质膜形成的红细胞膜蛋 白脂质体；
所述的脂质膜由磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成；
所述的红细胞膜蛋白与脂质的质量比1：16～1：1，优选1：8～1：2；
所述的红细胞膜蛋白整合在脂质体上的方法为挤压过膜法，高压均质法或微射流法 中的一种；
所述红细胞膜蛋白脂质体的粒径在70～200nm，优选80～100nm；
所述的脂质膜中聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占脂质质量的比例为5％～15％，优 选10％；
所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿， 优选2000道尔顿；
所述的磷脂酰胆碱和胆固醇的质量和占脂质质量的85％～95％；
所述的红细胞膜蛋白为去除血型蛋白后的红细胞膜蛋白；
所述的红细胞膜蛋白为去除血型蛋白后的红细胞膜蛋白。
所述的纳米人工红细胞可用于制备治疗成孔毒素相关疾病药物；所述成孔毒素相关 疾病包括但不限于耐药细菌感染。
具体的，
本发明提供了一种采用纳米人工红细胞清除成孔毒素，用于保护受试者不受成孔毒素 影响的方法；本发明还提供了有效量的纳米人工红细胞用于制造保护受试者不受成孔毒素 影响的药物的用途。
本发明中治疗成孔毒素相关的疾病或病症，包括但不限于：细菌感染，传染病，寄生 虫病，中毒，肿瘤。
本发明进一步提供了一种包含本发明的纳米人工红细胞的药物组合物。在本发明的实 施例中，所述的药物组合物进一步包含一种或多种药物和/或药学上可接受的赋形剂，其 可与本发明的纳米人工红细胞一起或组合施用；药物可以载入纳米人工红细胞进行施用， 也可以与空白纳米人工红细胞一起或组合施用。
本发明进一步提供了一种用于使用本发明的纳米人工红细胞在有需要的受试者中治疗 疾病或病状的方法；在某些实施例中，经由任何适合的施用途径施用纳米人工红细胞或其 药物组合物；如，可经由经鼻腔、口腔黏膜、肺吸入、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、或皮内途径施用纳米人工红细胞或其药物组合物。
本发明中，所述成孔毒素可以是细菌(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus))、植 物、真菌或动物毒素；所述纳米人工红细胞可与抗菌药物联合使用进一步提高细菌感染的 治疗效果。
本发明中，所述红细胞膜蛋白脂质体由红细胞膜蛋白和脂质材料组成；其中，所述脂 质材料为磷脂酰胆碱，DSPE-PEG，和/或胆固醇；所述红细胞膜蛋白中可添加特定的膜蛋白如成孔毒素受体以提高毒素的清除效果，也可去除红细胞膜蛋白中的特定膜蛋白如血型蛋白，降低纳米红细胞的免疫反应，提高其临床应用价值；所述红细胞膜蛋白的用量对纳米人工红细胞吸附毒素的影响很大，因此，本发明中所述红细胞膜蛋白与脂质的质量比 1：16～1：1，优选1：8～1：2；
所述红细胞膜蛋白整合在脂质体上的方法为挤压过膜法，高压均质法或微射流法中的 一种；
所述DSPE-PEG对纳米人工红细胞的稳定性有很重要的影响，其占总脂质的质量比为5％～15％，优选10％；
所述DSPE-PEG中聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿，优选2000道尔顿；
所述磷脂酰胆碱是纳米人工红细胞脂质双分子层的重要组成部分；所述胆固醇有利于 纳米人工红细胞脂质双分子层内脂阀的形成，添加胆固醇有助于提高纳米人工红细胞吸附 毒素的能力；所述磷脂酰胆碱和脂固醇的质量和占脂质总量的85％～95％；所述纳米人工 红细胞粒径在70～200nm，优选80～100nm。
进一步，本发明所述纳米药物通过以下步骤清除成孔毒素和治疗细菌感染：
(1)采用脂质材料制备脂质体，从红细胞中提取红细胞膜蛋白，将适量红细胞膜蛋白与脂质体融合制备红细胞膜蛋白脂质体；
(2)采用差式扫描量热法(DSC)，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)法对红细胞膜蛋 白脂质体内的膜蛋白整合情况进行分析；
(3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹法(Western blot)、非标 定量蛋白组学、免疫荧光标记法对红细胞膜蛋白脂质体内的膜蛋白组成及朝向进行分析；
(4)对红细胞膜蛋白脂质体的理化性质进行表征，如采用动态光散射法测定其粒径、多分散系数和电位，透射电镜观察其形态，大小，并考察其放置稳定性与冻干稳定 性；
(5)体外溶血实验评价红细胞膜蛋白脂质体的体外毒素吸附能力；
(6)采用荧光标记红细胞膜蛋白脂质体，研究其在体内的循环时间及在体内的生物 分布情况；
(7)通过考察红细胞膜蛋白脂质体对局部皮肤毒素吸附情况来评价其体内局部解毒 效果；
(8)通过考察红细胞膜蛋白脂质体对体内血液中毒素吸附情况来评价其全身解毒效 果；
(9)通过皮肤细菌感染实验考察红细胞膜蛋白脂质体及载药红细胞膜蛋白脂质体的 体内抗细菌感染效果；
(10)考察红细胞膜蛋白脂质体的体内安全性。
本发明提供了一种纳米人工红细胞及其在治疗细菌感染中的用途，该纳米人工红细 胞可以高效吸附细菌成孔毒素；进一步，本发明为临床实践提供了一种针对细菌感染的干 预策略，该策略包括将红细胞膜蛋白整合在脂质体上构建红细胞膜蛋白脂质体，实现成孔 毒素的中和以及体内清除，从而改善抗细菌感染治疗的效果。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要 特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1，纳米人工红细胞的结构及其吸附成孔毒素保护细胞的示意图：将红细胞膜蛋白 整合在PEG化脂质体上得到红细胞膜蛋白脂质体(以下简称RP-PLs)；RP-PLs模拟红 细胞将细菌成孔毒素(如：α-溶血素)吸附在其表面，从而保护红细胞不被破坏溶血。
图2，RP-PLs的膜蛋白整合情况、组成及朝向分析。红细胞膜囊泡(RMVs)作为参照；图A为RP-PLs的DSC测定结果，图B为RP-PLs的傅里叶变换红外光谱图，图C为 RP-PLs的SDS-PAGE分析，图D为RP-PLs中CD47和ADAM10的Western blot分析结 果，图E为红细胞膜糖蛋白在RP-PLs的保留和朝向分析。
图3为RP-PLs中膜蛋白的组成及表达水平(非标定量蛋白组学法)；图A为RP- PLs、RP(红细胞膜蛋白溶液)和RMVs的蛋白种类统计，图B为RP-PLs、RP和RMVs 典型蛋白表达情况的热点图。
图4，红细胞膜蛋白脂质体的理化性质表征结果，普通PEG化脂质体(PLs)作为参照；图A为RP-PLs的透射电镜照片，图B为RP-PLs的粒径分布(上图为PLs，下图为 RP-PLs)，图C为RP-PLs的Zeta电位值，图D为放置稳定性实验结果，图E为RP-PLs 冻干前后粒径变化。
图5，RP-PLs的体外吸附毒素效果；图A为溶血实验结果照片(生理盐水组为溶剂阴性对照组，Triton X-100为全溶血阳性对照组，Saline+Hlα为毒素组，PLs+Hlα为普通 脂质体组，Free RP+Hlα为游离红细胞膜蛋白组，RP-PLs+Hlα为红细胞膜蛋白脂质体 组)，图B是图A的定量分析结果，*P<0.01，与RP-PLs+Hlα组比较，图C为固定量 RP-PLs(10μg)与不同量毒素孵育吸附后的溶血结果，*P<0.01，与3μg Hlα组比较， 图D为不同量的RP-PLs与定量毒素孵育吸附后的溶血结果，*P<0.01，与10μg RP-PLs 组比较，图E为采用ADAM10抗体阻断RP-PLs表面ADAM10蛋白(Hlα的受体)后 RP-PLs的吸附毒素能力；*P<0.01，与Anti-Hlα或RP-PLs组比较。
图6，RP-PLs的体内循环和组织分布；图A为RP-PLs体内药物动力学(n＝6)，图 B和C为RP-PLs体内分布结果(n＝6)。
图7，RP-PLs的体内解毒效果；图A为RP-PLs局部皮肤解毒效果照片，图B为图 A皮肤损伤面积定量统计结果(n＝3)，*P<0.001，与Saline或PLs组比较，图C为注射 部位皮肤和附近肌肉组织样品切片的H&E染色和TUNEL染色显微镜照片(Scale bar＝ 500μm)，图D为先静脉注射RP-PLs后静脉注射致死剂量毒素的小鼠生存曲线，图E先 静脉注射致死剂量毒素后静脉注射RP-PLs的小鼠生存曲线。
图8，RP-PLs的抗细菌感染治疗效果；**P<0.001，与Saline，RBC-NP或PLs组比较；##P<0.001，与RP-PLs组比较。
图9，RP-PLs的体内安全性评价；图A和B分别为给药后小鼠的血常规和血生化结果，图C为给药后小鼠的主要脏器切片H&E染色结果。
具体实施方式
本实施例选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分泌的主要成孔毒素α-溶血素(Hlα)为成孔毒素代表，探讨红细胞膜蛋白脂质体对成孔毒素的吸附清除作用(如图1 所示)和抗细菌感染的效果。以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步 ANOVA法，两组比较采用双侧t检验法。
实施例1：红细胞膜蛋白脂质体的构建
本实施例中首先从全血中提取红细胞，并利用低渗法和离心法分离纯化出红细胞膜，再提取红细胞膜蛋白。具体操作：六周龄雄性ICR小鼠摘眼球取血，全血用肝素钠 抗凝，4℃条件下，700g离心10分钟，弃去上层血浆和白膜层(白细胞和血小板)，再 用含有1mMEDTA的PBS溶液重悬底部红细胞，重复洗涤三次。收集底部红细胞并加 入等体积含1mMEDTA的PBS溶液，配成红细胞悬液，每250μL加至1.5mL EP管 中，再加入950μL 0.2mM EDTA水溶液，混合均匀后涡旋破碎红细胞，而后加入50μL 20×PBS调节至等渗。4℃条件下，20000g离心10分钟，弃去上清。重复上述步骤，得 到类白色红细胞膜，用0.25mM EDTA水溶液重悬，定容至与前述红细胞悬液等体积， 分装后-80℃保存待用。取红细胞膜悬液1mL，4℃下20000g离心10min，弃去上清后 用1mL膜蛋白提取缓冲液(7.8mM DDM，750mM己糖胺，0.5mM EDTA加入50mM Tris-HCl)溶解完全。4℃下20000g离心10min，收集上清。接着用蛋白脱盐柱 (HiTrap)进行纯化，过磁力架除去血型蛋白，最终的膜蛋白浓度采用BCA法测定。膜蛋白溶液分装后-80℃保存待用。
采用薄膜水化挤出法制备红细胞膜蛋白脂质体。具体操作：磷脂酰胆碱(PC)、DSPE-PEG2000和/或胆固醇(如表1)用二氯甲烷溶解，室温下旋蒸成脂质膜。加入适量 红细胞膜蛋白溶液室温搅拌水化1h，用脂质体挤出器挤出，依次过400nm,200nm和 100nm膜，可得红细胞膜蛋白脂质体(RP-PLs)悬液。如表1所示，不同PC、RBC膜蛋 白投量比所制备的红细胞膜蛋白脂质体粒径在80～100nm之间，电位在-28～-32mV之 间。将表1的处方2按100倍比例放大，采用360mg PC，40mg DSPE-PEG2000同上成 膜水化，和200mg RBC膜蛋白混合后孵育，然后微射流法或高压均质法制备RP-PLs， 所得RP-PLs在90nm左右，电位约为-27～-32mV，显示RP-PLs可规模化生产。
表1各种处方下红细胞膜蛋白脂质体粒径和电位(n＝3)
Figure BDA0002835132260000091
。
为了便于下一步进行体外表征及体内药动学和药效学的实验，未特别指定的情况下， RP-PLs采用处方3进行制备，即采用3.6mg PC，0.4mg DSPE-PEG2000和1mg RBC膜 蛋白制备RP-PLs(终体积为2mL)；同上，不加红细胞膜蛋白，加入2mL纯水水化制 备普通脂质体悬液(PLs)，作为对照；荧光标记的脂质体制备方法同上，只需要将适量 的荧光素加入PC和DSPE-PEG2000的二氯甲烷溶液中一起成膜。
实施例2：红细胞膜蛋白脂质体内的膜蛋白整合分析分析
本实施例中首先采用差式扫描量热法对RP-PLs进行热分析(图2A)；结果表明， 与PLs相比，RP-PLs和RMVs的相转变温度(transition temperature,Tm)明显向右移，间 接证明膜蛋白整合在脂质体双层膜内。采用傅里叶变换红外光谱仪测定RP-PLs的红外光 谱；结果显示，RP-PLs和RMVs均有蛋白特征峰(1,700-1,600cm-1和1,600-1,500cm-1) (图2B)，表明RP-PLs中膜蛋白整合在脂质体上。
实施例3：红细胞膜蛋白脂质体内的膜蛋白组成及朝向分析
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定RP-PLs的蛋白质组分；用SDS样品缓冲液制备样品，Bradford法测定样品膜蛋白浓度，蛋白样品在90℃下 加热5分钟，10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)上样，120V下运行1小时，然后用 考马斯亮蓝染色、成像；Western印迹法检测RP-PLs中的某些特异性蛋白，如CD47和 ADAM10；样品用
Figure BDA0002835132260000101
1×样品缓冲液制备，如上进行SDS-PAGE分离，将蛋白转 移到硝酸纤维素膜(PALL)，分别用CD47(ABCAM，美国)和ADAM10(R&D，美 国)特异性抗体和相应的辣根过氧化物酶(HRP)结合二抗(1:200稀释，Jackson，美 国)进行检测，然后用固定化的化学发光HRP底物检测蛋白质；SDS-PAGE实验显示， 与RMVs相比，RP-PLs保留了几乎所有的细胞膜蛋白(图2C)；CD47是RBC膜上具有 免疫调节作用的自身标志物，ADAM10是成孔毒素Hlα在RBC细胞膜上的关键受体蛋 白；以CD47和ADAM10为特征性的关键蛋白进行Western印迹分析，结果显示两种蛋 白在RP-PLs和RMVs上均存在，且在RP-PLs融合过程中没有明显损失(图2D)。
利用小麦胚芽凝集素(WGA)与N-乙酰神经氨酸残基和N-乙酰氨基葡萄糖选择性结合的特点，以荧光标记的WGA为探针，对RP-PLs中红细胞膜糖蛋白进行定位，探讨膜 蛋白在RP-PLs中的分布取向；样品与Texas Red-X标记的WGA(Texas Red-X-WGA，激 发/发射＝595/615nm，Thermo Fisher Science，美国)在PBS中孵育30分钟，然后通过透 析去除未结合的Texas Red-X-WGA。荧光分光光度法测定RP-PLs的荧光强度；结果表 明，WGA可标记RP-PLs和RBC，无法标记PLs，表明RP-PLs表面糖蛋白朝向正确(图 2E)；脂质双分子层是构成质膜的基本结构，而膜蛋白负责大多数膜功能，如转运体、 受体和酶等；上述结果表明，RP-PLs与RMVs一样保留了相同的膜蛋白组成，正确取向 的蛋白质将赋予RP-PLs与RBC相似的生物功能，如与成孔毒素结合。
实施例4：红细胞膜蛋白脂质体内的膜蛋白表达分析
为了进一步分析蛋白质组成和表达，利用非标定量蛋白组学法(质谱法)对RP-PLs的膜蛋白质组学进行了研究，并与RP、RMVs进行了比较；将RP-PLs溶解在裂解缓冲液 中(7.8mM N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，50mM Tris·HCl，750mM氨基己酸，0.5mM EDTA；pH 7)，加入6倍丙酮，-20℃孵育过夜，然后离心收集蛋白质沉淀；BCA定量 测定蛋白，蛋白样品用100mM三乙胺硼烷稀释成1mg/mL；胰酶37℃消化蛋白，将多 肽样品注入液相质谱仪进行分析；液相条件：Nano ACQUITY UPLC系统(Waters)；流 动相A：水(含有0.1％甲酸(V/V))，流动相B：99.9％乙腈，0.1％(V/V)甲酸；将 5μL的肽样品注入Trap柱(Thermo ScientificAcclaim PepMap C18,100μm×2cm)中， 以10μL/min的流速流动3min，然后在分析柱(Acclaim PepMap C18，75μm×25cm) 上分离；流动相以线性梯度在110分钟内从5％B上升到30％B，然后在初始条件下重新 平衡10分钟，流速保持在300nL/min，柱温保持在45℃；质谱条件：采用2kV的正电 喷雾电压，使用300℃的毛细管温度。对于Oribitrap融合MS检测，通过扫描m/z 350- 1550，分辨率为120000(m/z 200)，目标自动增益控制(AGC)值为1×106，最大注入 时间为50ms，在Orbitrap中进行前体扫描。归一化碰撞能量设置为35％，用于高能碰撞 诱导解离(HCD)；典型的质谱扫描条件如下：AGC值2×105；100毫秒的最大填充时间；碎片强度阈值50 000。MS/MS固定第一质量为110。
通过搜索Uniprot数据库，在RMVs中鉴定出150种小鼠膜蛋白，与前人研究中的目录一致(Pasini EM,Kirkegaard M,Salerno D,Mortensen P,Mann M,Thomas AW.Deepcoverage mouse red blood cell proteome:a first comparison with the human redblood cell.Mol Cell Proteomics.2008；7:1317-30.Bryk AH,WisniewskiJR.Quantitative Analysis of Human Red Blood Cell Proteome.J ProteomeRes.2017；16:2752-61.)；在膜蛋白提取液(151种蛋 白)和RP-PLs(149种蛋白)中也鉴定出了几乎所有这些膜蛋白(图3A)，表明RP-PLs 与RMV具有相同的膜蛋白种类，在膜蛋白提取和膜蛋白整合至脂质体过程中膜蛋白未发 生较大的损失；进一步对36种典型的红细胞膜蛋白进行定量分析，结果显示，RP-PLs与 RP和RMVs的蛋白丰度具有高度的一致性，结果表明RP-PLs保留了与RMVs几乎相同 的蛋白种类和相同的蛋白表达水平，如阴离子交换蛋白(Band 3(gene：Slc4a1))、细 胞骨架蛋白(例如Spectrin(gene:Spta1),Ankyrin 1(gene:Ank1),Tropomyosin 1(gene: Tpm1),Alpha-adducin(gene:Add1),Protein 4.1(gene:Epb4.1),和小鼠特异性Gamma- adducin(gene:Add3))，与自身耐受相关的白细胞表面抗原CD47、Hlα受体ADAM10(图 3B)。
实施例5：红细胞膜蛋白脂质体的理化性质表征
醋酸铀负染后采用透射电镜观察RP-PLs的形态和大小，结果显示，RP-PLs为规则球形，大小均一(图4A)；采用动态光散射法测定RP-PLs的平均粒径、多分散系数 (PDI)及其Zeta电位；结果表明(图4B、C)，RP-PLs平均粒径为84.3nm(低于PLs 112.4nm)，且粒径分布较窄，PDI为0.15；Zeta电位-31.0mV，略高于PLs(-35.0 mV)；上述结果表明，膜蛋白整合后脂质体的粒径显著下降，表面电位上升；考察红细 胞膜蛋白脂质体在PBS溶液中4℃条件下的放置稳定性，结果表明在一周的时间内，红 细胞膜蛋白脂质体粒径稳定，无明显聚集现象(图4D)，表明该纳米药物在4℃条件下 具有较好的放置稳定性；以10％蔗糖为冻干保护剂将红细胞膜蛋白脂质体进行冷冻干燥 得到冻干粉，采用适量纯水重悬，测定粒径，结果显示冻干前后粒径无显著性差异(图 4E)，表明该纳米药物具有较好的冻干稳定性，可冻干后长期储存。
实施例6：红细胞膜蛋白脂质体的体外解毒能力考察
采用体外溶血实验对红细胞膜蛋白脂质体吸附毒素能力进行了考察；具体操作如下：小鼠摘眼球取全血1mL，适量肝素钠抗凝并加入10mL PBS，700g室温离心5 min，弃去上清，重复上述步骤用PBS洗涤三次；收集底部红细胞，用PBS将红细胞配 成2.5％红细胞悬液，4℃保存待溶血实验使用。将2μg毒素与5μL RP-PLs、游离膜蛋白 溶液(Free RP)或PLs(2mg/ml)混合，10％蔗糖水溶液补足共200μL，室温孵育30 min后，加入1.8mL 2.5％红细胞悬液，37℃孵育2h，室温2000g离心5min，吸取上清 100μL，用PBS 1:1稀释后，酶标仪测定样品在540nm处的吸光度，计算溶血百分数， 计算公式如下。
Figure BDA0002835132260000121
其中，阴性对照为生理盐水溶液，阳性对照为Triton X-100溶液；结果显示，RP-PLs能吸附毒素、抵抗毒素对红细胞的溶血作用，RBC未发生溶血，而PLs和Free RP组 的红细胞均有严重的溶血情况产生(图5A、B)；上述结果表明，PLs和Free RP均不能 中和毒素分子，而RP-PLs有较好地中和Hlα毒素分子能力；将实施例5中冻干的RP-PLs 同上做解毒能力实验，结果表明，冻干的RP-PLs和新制的RP-PLs一样能有效保护红细 胞不发生溶血，有较好的中和Hlα毒素分子能力。
实施例7：红细胞膜蛋白脂质体的体外解毒效率
研究RP-PLs吸附毒素的量效关系，首先固定RP-PLs的量(10μg，根据磷脂材料质量计算)，加入不同量毒素与RP-PLs孵育，同实施例6进行RBC的溶血试验；如图5C所 示，当毒素用量低于3μg，RBC不发生溶血；而当毒素用量增至4μg，RBC发生少量溶 血，当毒素用量增至6μg，大部分RBC发生溶血；固定毒素的量(2μg)，加入不同量 的RP-PLs孵育，同上进行RBC的溶血试验实验；如图5D所示，当RP-PLs用量达到10 μg，RBC不发生溶血；上述结果表明，RP-PLs具有良好的毒素吸附性能，能抵抗体外实 验中毒素的溶血作用；10μg RP-PLs即可解3μg的毒素，相当于采用1ml RBC来源的膜 蛋白(约2.0mg)制备的RP-PLs(8.0mg)可以解2400μg的毒素；按照哺乳动物红细胞 计数5.0×109/ml计算，每个RBC制备所得的RP-PLs可以清除8.76×106个Hlα毒素分子 (Hlα分子量为33,000Da)。
参考文献(Hu CM,Fang RH,Copp J,Luk BT,Zhang L.A biomimetic nanospongethat absorbs pore-forming toxins.Nat Nanotechnol.2013；8:336-40.)，制备RBC-NP，将RBC-NP 与毒素孵育，同上考察RBC-NP对毒素的吸附作用；结果表明，1mg的RBC-NP可以吸附22μg的Hlα毒素，与上述文献报道完全一致；将RBC-NP密度按1.2mg/ml计，每个 RBC-NP表面可吸附约85个Hlα毒素分子；将每个红细胞的表面积以75μm2计(R.E. Waugh,I.H.Sarelius,Effects of lost surface area on red blood cells and red bloodcell survival in mice,Am.J.Physiol.271(1996)1847-1852.)，则每个红细胞可以制备约3300个RBC- NP，因此，每个RBC制备所得的RBC-NP可以清除2.81×105个Hlα毒素分子(Hlα分子 量为33,000Da)；上述结果表明，RP-PLs具有很高的解毒效率，每个RBC制备所得的RP-PLs的解毒能力相当于相应RBC-NP的31.2倍。
将实施1制备的RP-PLs按照上述方法测定其对解毒效率，结果如表1所示，各种RP-PLs对Hlα解毒能力为100～600μg/mg(RP-PLs以脂质的质量计)，其高解毒效率与 RBC膜蛋白的量和胆固醇的量有关；增加RBC膜蛋白的量和胆固醇的量均可以一定程度 提高其解毒效力。
实施例8：红细胞膜蛋白脂质体的解毒机理探索
将10μg RP-PLs与10μL ADAM10抗体预先室温孵育30min，然后再与2μg毒素混 合，室温孵育30min，然后同实施例6进行RBC溶血试验；如图5E所示，采用抗体阻 断RP-PLs表面的ADAM10(Hlα毒素的重要受体之一)可显著降低RP-PLs的解毒能 力，RBC发生部分溶血，结果表明RP-PLs表面的ADAM10对于Hlα毒素的吸附具有很 重要的影响。
实施例9：红细胞膜蛋白脂质体的体内循环和组织分布研究
采用荧光染料DiD分别标记纳米药物(RP-PLs，PLs，RMVs)，将其静脉注射至 ICR小鼠体内，不同时间点(0，5，15，30min，1，3，6，18，24h)颌下静脉取血，酶 标仪测定全血的荧光强度(图6A)；结果显示，RP-PLs的体内循环时间与PLs相似，与 RMVs组相比，循环时间显著延长，表明红细胞膜蛋白的加入并不影响PEG修饰脂质体 的长循环性质；关于组织分布研究，采用荧光染料DiD分别标记纳米药物(RP-PLs， PLs，RMVs)，将其静脉注射至ICR小鼠体内，24h后取小鼠主要脏器(心、肝、脾、 肺、肾)，称重并匀浆，酶标仪测定组织匀浆液的荧光强度(图6B、C)；结果显示， 与大多数纳米递药系统类似，RP-PLs主要分布在肝脾，这可能是由于单核巨噬细胞系统 的截留作用；但是RP-PLs在肝、脾的分布较RMVs显著减少，这可能是因为PEG修饰 降低了单核巨噬细胞系统的摄取。
实施例10：红细胞膜蛋白脂质体的体内局部解毒能力考察
将2μg毒素与5μL RP-PL(10μg)混合，10％蔗糖水溶液补足共100μL，室温孵育30min后，注射至BALB/c裸鼠后肢皮下，saline组作为阴性对照，并与PLs组进行比 较，3天后观察裸鼠皮肤外观并拍照且进行半定量分析损伤面积(图7A、B)；结果显 示，RP-PLs组小鼠皮肤无明显损伤，而PLs和RMVs组小鼠皮肤有明显的损伤，皮肤与 saline组类似；接着处死动物后，取注射部位附近皮肤及连接肌肉组织，4％多聚甲醛固 定，并进行石蜡包埋，组织切片，进行H&E染色和TUNEL染色，显微镜拍照，观察皮 肤及连接肌肉组织的损伤和细胞凋亡情况(图7C)；结果表明，与saline组一样，PLs组 和RMVs组由于无法有效吸附毒素，注射部位附近皮肤及连接肌肉组织严重坏死，细胞 广泛凋亡；而RP-PLs组皮肤组织无明显损伤，组织结构规则完整，未见细胞凋亡；上述 结果表明，RP-PLs具有良好的局部清除毒素能力。
实施例11：红细胞膜蛋白脂质体的体内全身解毒能力考察
ICR小鼠(n＝9)分别静脉注射200μL纳米药物(PLs，RP-PLs，2mg/mL)，接着 立即静脉注射5μg毒素溶液，记录每组小鼠的生存曲线(图7D)；结果显示，saline组 (对照)、PLs组小鼠在6h内全部死亡，显示PLs无解毒作用，而RP-PLs组最终有78％小鼠存活下来，表明其有较好的解毒效果；改变注射顺序，进行上述实验，即注射5 μg毒素2min后注射纳米药物(PLs，RP-PLs)，记录每组小鼠的生存曲线(图7E)。 结果显示，saline(对照)组、PLs组的动物6h内全部死亡，而RP-PLs组仍然有56％的 小鼠能够最终存活下来。上述结果表明，RP-PLs具有良好的体内全身解毒能力。
实施例12：红细胞膜蛋白脂质体的体内抗细菌感染效果
参考文献(Remote-loaded platelet vesicles for disease-targeteddelivery of therapeutics", Advanced Functional Materials 2018,28,1801032.)，将万古霉素(Vancomycin，Van)通 过主动载药法载入RP-PLs(Van-RP-PLs)中，得到Van-RP-PLs粒径为100nm，载药量 为1.0％；将实验动物分为5个组(Saline，RBC-NP，RP-PLs，RP-PLs+Van，Van-RP- PLs)。将耐药细菌MRSA252(109CFU)与100μl的saline,RBC-NP，PLs，RP-PLs(2 mg/ml)或Van-RP-PLs(2mg/ml)室温混合15min后注射至BALB/c裸鼠后肢皮下，其 中RP-PLs+Van组静脉注射万古霉素(50mg/kg)。每天观察裸鼠皮肤外观并拍照，测定 皮肤损伤的面积；结果显示(图8)，saline和PLs组皮肤损伤面积随时间增加而逐渐增 大，而RP-PLs组小鼠皮肤1天内无明显损伤，2天后皮肤损伤面积随时间缓慢增大，但 显著小于saline，RBC-NP和PLs组(P<0.01)；RP-PLs+Van组5天内皮肤仅有少量损 伤，而Van-RP-PLs组5天内皮肤表面几乎没有损伤(P<0.01)；上述结果表明，RP-PLs 具有良好的局部清除毒素能力，能较好地抵抗局部细菌感染；若RP-PLs联合万古霉素使 用，能很好地抵抗局部细菌感染。
实施例13：红细胞膜蛋白脂质体的安全性研究
ICR小鼠(n＝6)隔天静脉注射200μL RP-PLs共一周，等量注射PBS溶液组作为对照；最后一次注射后一天，取全血，测定血常规，血生化(图9A、B)及抗体表达水 平；血常规和血生化结果显示，RP-PLs组小鼠各项指标与对照组小鼠无显著性差异，血 清中IgG、IgM水平也没有显著的增加；表明RP-PLs安全性较好，无明显体内毒性作用 和免疫反应；接着处死动物，心脏灌流，取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，4％多聚 甲醛固定，并进行石蜡包埋，组织切片，进行H&E染色，显微镜拍照，观察各脏器组织 结构情况(图9C)；结果表明，与对照组相比，RP-PLs组小鼠各脏器无明显损伤，进一 步表明其安全性好。

Claims (13)

1.一种纳米人工红细胞，其特征在于，所述的纳米人工红细胞为红细胞膜蛋白整合到人工脂质膜形成的红细胞膜蛋白脂质体；所述的脂质膜由磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成；所述的红细胞膜蛋白与脂质的质量比为1：16～1：1。
2.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的红细胞膜蛋白与脂质的质量比为1：8～1：2。
3.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的红细胞膜蛋白整合在脂质体上的方法为挤压过膜法，高压均质法或微射流法中的一种。
4.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述红细胞膜蛋白脂质体的粒径为70～200nm。
5.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述红细胞膜蛋白脂质体的粒径为80～100nm。
6.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的脂质膜中聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占脂质质量的比例为5％～15％。
7.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的脂质膜中聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占脂质质量的比例为10％。
8.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿。
9.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为2000道尔顿。
10.按权利要求,1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的磷脂酰胆碱和胆固醇的质量和占脂质质量的85％～95％。
11.按权利要求1所述的纳米人工红细胞，其特征在于，所述的红细胞膜蛋白为去除血型蛋白后的红细胞膜蛋白。
12.权利要求1所述的纳米人工红细胞在制备治疗成孔毒素相关疾病药物中的用途。
13.按权利要求12所述的用途，其特征在于，所述成孔毒素相关疾病包括但不限于耐药细菌感染。
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