CN110898231A - 一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用。实验结果表明，本发明提供的功能化拉洛他赛脂质体制剂具有良好的物理化学性质、均一性好、包封率高，在显著提升拉洛他赛治疗耐药性乳腺癌药效的同时，降低了注射拉洛他赛时的全身性毒副作用。

Description

一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种脂质体，具体涉及一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用。
背景技术
拉洛他赛(larotaxel,XRP9881,RPR109881)是通过半合成方法得到的一种新型紫杉烷类细胞周期特异性化疗药，具有较广抑瘤谱。到目前为止，该药在国内外均未上市。在我国，山西振东药业正在进行拉洛他赛脂质微球注射剂的新药开发，并获得国家食品药品监督管理局批准，目前正开展临床试验研究。与其它紫杉烷类化疗药相似，拉洛他赛可作用于细胞分裂过程中纺锤体微管蛋白，与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定微管并抑制微管解聚，从而抑制癌细胞的有丝分裂。初步研究显示，拉洛他赛区别于其他紫杉烷类抗肿瘤药，其可杀伤耐药性癌细胞，还可透过血脑屏障，表现出很好的抗肿瘤应用前景[1-4]。体外研究表明，拉洛他赛的抗肿瘤活性强于紫杉醇，对多药耐药性肿瘤细胞展现出较强的抑制和杀伤作用[5-7]。并且，现有的临床研究结果表明，拉洛他赛了作为二线治疗或补救治疗药物，在治疗转移性乳腺癌中其疗效优于多西他赛和多柔比星[8-10]。文献报道显示，国外用于临床试验的拉洛他赛制剂中，一般加入表面聚山梨酯作为增溶剂，以增加拉洛他赛的溶解度[11]。例如，Sanofi-Aventis 公司用于二期临床试验的拉洛他赛注射剂中，采用了聚山梨酯(吐温-80)作为增溶剂。
肿瘤的传统化学治疗大多使用小分子细胞毒性药物进行静脉注射，多次反复给药会造成药物血浆浓度快速升高后又快速下降，难以长时间维持药物治疗窗浓度，而且极易使肿瘤产生耐药性。此外，小分子化学治疗药物在体内的分布没有选择性，往往导致骨髓抑制、免疫力显著下降和对正常组织的毒副作用等全身性的化疗综合征。
脂质体(liposomes)是由一种脂质双分子层构成的纳米制剂，粒径在25～1000nm不等，是纳米载体递送系统的典型代表。脂质体具有以下三点要素：闭合的囊泡、包合的内水相以及由脂分子构成的双层膜。近年来，人们对脂质体应用于抗肿瘤治疗方面的研究做了大量工作并取得一定进展，已先后有多种脂质体药物成功上市或处于临床研究阶段。相比于传统的化学治疗，脂质体由于其小粒径、大比表面积和高活性等特性，可以减少体内网状内皮系统(Reticuloendothelial system,RES)对药物的摄取作用，并可通过肿瘤部位的“透过及滞留增强效应”(Enhanced permeability and retention effect,EPR)和脂质体递送系统预设的路径提高药物在肿瘤区域的蓄积，从而体现靶向性，在对肿瘤造成最大限度的杀伤的同时最大限度地减少化疗药物的毒副作用。此外，修饰了长循环材料的脂质体可以改变药物在体内的半衰期从而延长作用时间。因此，脂质体可以达到提高药效，降低副作用的给药目标。
适配体，作为抗体(Antibodies,Abs)的替代物，可应用于靶向递送纳米材料的表面修饰。适配体是通过称为配体的指数富集系统进化(Systematic Evolution of Ligandsby Exponential enrichment,SELEX)的体外选择过程产生的单链寡核苷酸。核酸适配体具有与抗体类似的高亲和力和强选择性，同时具备安全、廉价、稳定等优势。
发明内容
为了避免采用增溶剂可能导致的患者过敏、减少拉洛他赛的全身性毒副作用、增强药物对肿瘤组织的主动靶向性聚集，本发明提供一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用。该功能化拉洛他赛脂质体以拉洛他赛为模型药物包封于脂质体中，表面修饰以功能性长循环材料二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-AS1411 (distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol，DSPE-PEG2000-AS1411)，能够在体内实现对肿瘤组织的靶向给药，在保证安全性的前提下抑制肿瘤体积增长，克服其耐药性并延长荷瘤裸鼠的生存时间。
本发明提供的功能化拉洛他赛脂质体，以拉洛他赛为模型药物包封于脂质体中，表面修饰DSPE-PEG2000-AS1411。
所述功能化拉洛他赛脂质体中，所述拉洛他赛与构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材的质量比为1:18-22；具体为1：20；
所述DSPE-PEG2000-AS1411中，DSPE、PEG2000与AS1411的摩尔比为60：40：5；
所述功能化拉洛他赛脂质体的粒径为131.03±2.15nm，多分散系数为0.142±0.067， zeta电位为0.07±0.014mV，包封率为81.74±2.50％。
本发明提供的制备所述功能化拉洛他赛脂质体的方法，包括：
1)将构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材和拉洛他赛于溶剂中溶解，减压蒸发除去所述溶剂，得到脂膜；
构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材为DPPC、Chol和DSPE-PEG2000-AS1411；
所述DPPC代表二棕榈酰磷脂酰胆碱；
所述Chol代表胆固醇；
所述DSPE-PEG2000-AS1411中，DSPE、PEG2000与AS1411的摩尔比为60：40：5；
2)将所述脂膜水化，依次进行水浴超声和探头超声，得到含有脂质体的液体；
3)再将所述含有脂质体的液体依次过大孔径和小孔径的膜，得到所述功能化拉洛他赛脂质体。
上述方法的步骤1)中，所述拉洛他赛与构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材的质量比为1:18-22；具体为1：20；
所述溶剂由氯仿和甲醇组成；所述氯仿和甲醇的体积比具体为2.5-3.5:1；具体为3:1；
所述减压蒸发步骤中，温度为30-50℃；具体为40℃；
所述步骤2)所述水化步骤中，水化所用水化剂为PBS溶液；所述PBS溶液的 pH值为7.5；
所述水浴超声步骤中，时间为2-3min；超声功率为190-210W；具体为200W；
所述探头超声步骤中，设置超声工作时间为1s；间歇时间为1s；全程时间为10min；保护温度为30-40℃；具体为35℃；功率为190-210W；具体为200W；
所述步骤3)过大孔径和小孔径的膜步骤中，所用膜均为聚碳酸酯膜；
所述大孔径的膜的孔径为380-420nm；具体为400nm；
所述小孔径的膜的孔径为180-220nm；具体为200nm；
所述过大孔径和小孔径的膜的步骤重复若干次；具体为3次。
所述DSPE-PEG2000-AS1411按照包括如下步骤的方法制得：
将DSPE-PEG2000与氨基修饰后的核酸适配体AS1411-C6-NH2于有机溶剂中溶解，调节pH值为7.5-8.0，进行反应后透析，而得。
所述有机溶剂为PBS和DMF；所述PBS的pH值为7.5；
所述PBS和DMF的体积比为1:1；
所述DSPE-PEG2000与氨基修饰后的核酸适配体AS1411-C6-NH2的用量比为 0.4mg：32-34nmol；具体为0.4mg：33.8nmol；
所述PBS和DMF与DSPE-PEG2000的用量比均为2mL：0.3-0.5mg；具体为2mL： 0.4mg；
所述反应步骤中，温度为室温；时间为3-5小时；具体为4小时；
所述透析步骤中，透析袋的截留分子量为7500-8500Da；具体为8000Da；透析时间为40-50小时；具体为48小时；所述透析为用去离子水透析。
上述本发明提供的功能化拉洛他赛脂质体在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用及含有所述功能化拉洛他赛脂质体的预防和/或治疗肿瘤的产品也属于本发明的保护范围。其中，所述肿瘤为乳腺恶性肿瘤；
所述肿瘤细胞为癌细胞、耐药性癌细胞、耐阿霉素癌细胞、耐药性乳腺癌细胞或耐阿霉素乳腺癌细胞；
所述产品为药物或药物制剂。
本发明提供的功能化拉洛他赛脂质体以拉洛他赛为模型药物包封于脂质体中，表面修饰以功能性长循环材料二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-AS1411(distearoylphosphatidyl ethanolamine-polyethylene glycol，DSPE-PEG2000-AS1411)。实验结果表明，本发明提供的功能化拉洛他赛脂质体制剂具有良好的物理化学性质、均一性好、包封率高，在显著提升拉洛他赛治疗耐药性乳腺癌药效的同时，降低了注射拉洛他赛时的全身性毒副作用，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为DSPE-PEG2000与AS1411的合成产物的变性PAGE电泳结果1.AS1411 (28nt)2.DSPE-PEG2000-AS1411。
图2为脂质体的透射电镜图像A1.拉洛他赛脂质体(200nm)A2.拉洛他赛脂质体(100nm)B1.功能化拉洛他赛脂质体(200nm)B2.功能化拉洛他赛脂质体(100nm)。
图3为耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠使用不同剂型治疗后的抗肿瘤效果(a，vs生理盐水；b，vs拉洛他赛；c，vs拉洛他赛脂质体，P<0.05，数据用均值±标准差表示，n＝ 5)。
图4为乳腺癌荷瘤裸鼠治疗后的小鼠体重变化(数据用均值±标准差表示，n＝5)。
图5为耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠接受不同剂型治疗后主要器官的组织观察(心、肝、脾、肺、肾，标尺为100μm；a,生理盐水组；b,拉洛他赛组；c,功能化拉洛他赛脂质体组)。
图6为不同DiR制剂在耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠中的分布(A)实时体内荧光分布 (B)48h时主要代谢器官和肿瘤组织中的荧光分布(a,DiR标记的功能化脂质体组； b,DiR标记的普通脂质体组；c,游离DiR组；d,生理盐水组)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。下述实施例中，核酸适配体AS1411碱基序列为5`-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3`(28nt)，能形成富含鸟嘌呤脱氧核苷酸的二聚体，并靶向核仁素(Nucleolin)蛋白。在肿瘤细胞中，其靶标核仁素蛋白在细胞膜表面高表达，且预示着肿瘤的高恶性增殖能力和较差的预后表现。
实施例1、
功能化拉洛他赛脂质体的制备方法如下：
(一)功能化材料的合成
精密称取0.4mg DSPE-PEG2000并加入10OD(此处OD的含义如下：在波长260nm 紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为 40μg/ml；寡核苷酸为20μg/ml。10OD相当于200μg/ml浓度的核酸适配体AS1411-C6-NH2)氨基修饰后的核酸适配体AS1411-C6-NH2(33.8nmol)，加入2mL PBS (pH7.5)及2ml无水DMF溶解，利用三乙胺调节酸碱度至pH值为7.5-8.0。室温搅拌反应4小时后转移至透析袋中(截留分子量8000Da)，用去离子水透析48小时，除去反应溶剂和未反应样品。将样品冷冻干燥后放于-20℃冰箱中保存备用。
(二)功能化材料的电泳表征
利用尿素变性的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表征DSPE-PEG2000-AS1411 的合成。电泳电压为80V，电泳时间为2h。电泳完成后用Gel-Red试剂染色20min，而后使用凝胶成像系统进行成像。
(三)脂质体的制备
精密称取二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇(Chol)、DSPE-PEG2000-AS1411 (60/40/5,μmol/μmol/μmol)和拉洛他赛(药：脂材＝1:20，w/w)置于茄形瓶中，加入适量氯仿-甲醇(3:1，v/v)溶液溶解，然后在40℃水浴减压蒸发除去有机试剂，在瓶底和内壁形成一层均匀的脂膜。加入适量PBS溶液水化，先在水浴中超声2-3min形成乳白色均匀的粗脂质体，然后转移到超声波细胞粉碎机中进行探头超声，设置超声工作时间为1s，间歇时间为1s，全程时间为10min，保护温度为35℃，功率为200W。探头超声结束后，形成带有弱蓝色乳光的半透明液体，再将所得脂质体依次通过孔径为400nm，200nm的聚碳酸酯膜，各3次，即得功能化拉洛他赛脂质体。
功能化拉洛他赛脂质体的理化表征方法如下：
(一)拉洛他赛的测定方法
使用高效液相色谱法(HPLC)对拉洛他赛进行测定。色谱条件如下：色谱柱为 ODS-C18柱(5μm,250×4.6mm)；测定温度为25℃；流动相为乙腈—水(75：25， v/v)；流速为1.0ml/min；进样量为10μl；检测波长为230nm。
(二)包封率的测定和计算
取新制备的拉洛他赛脂质体500μl，使之通过Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱，以磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)为流动相，分离未包封于脂质体的游离拉洛他赛，收集分离后的脂质体，加甲醇破坏，然后用高效液相色谱法进行测定。另外，取未过凝胶柱的拉洛他赛脂质体，适当稀释后加入流动相破坏，然后用上述高效液相色谱法进行测定。
拉洛他赛在脂质体中的包封率用下面的公式计算：包封率％＝过凝胶柱脂质体中测得拉洛他赛量/未过凝胶柱脂质体中测得拉洛他赛量×100％。按照外标法，平行测定拉洛他赛对照溶液中药物量，作为参比标准，计算拉洛他赛在脂质体中的包封率。
(三)粒径和Zeta电位的测定
取新制得的拉洛他赛脂质体各1ml，加磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)适当稀释，利用激光散射粒径测定仪测定。测试时，测定温度设定为25℃，每个样品测定20次，记录其粒径、多分散系数和Zeta电位值，计算平均值。
(四)形态观察
以去离子水作为分散介质，适当稀释拉洛他赛脂质体，将稀释后拉洛他赛脂质体液再经200nm的微孔滤膜过滤，然后，将铺有碳膜的铜网漂放在脂质体溶液上，1min 后取出，用滤纸吸干，将俘获有脂质体粒子的铜网漂放在1％醋酸双氧铀水溶液上，1 min后取出，滤纸吸干、静置过夜，然后置于透射电镜下观察。
功能化拉洛他赛脂质体用于耐药性乳腺癌治疗的动物实验方法如下：
(一)耐药性乳腺癌移植瘤裸鼠模型的建立
准备雌性BALB/c裸鼠，起始体重约为18-20g。将2×107个乳腺癌MCF-7/adr 细胞混悬于200μl不含血清的RPMI1640培养基中，而后皮下注射接种至裸鼠腋下，每天观察裸鼠腋下的肿瘤生长情况，利用游标卡尺测量肿瘤大小。
(二)对耐药性乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制效应
1.给药方案
当肿瘤体积普遍达到100mm3时，将荷瘤裸鼠随机分组，每组5只，共计5组。于接种后第12天开始，分别给与以下各组制剂进行药物治疗：
(1)生理盐水组；
(2)紫杉醇组(5mg/kg)；
(3)拉洛他赛组(5mg/kg)；
(4)拉洛他赛脂质体组(5mg/kg)；
(5)功能化拉洛他赛脂质体组(5mg/kg)。
每隔一天给药一次，共给药五次，即于接种后第12、14、16、18、20天进行给药，给药方式为尾静脉推注。
2.耐药性乳腺癌肿瘤体积的测定
用游标卡尺测量肿瘤瘤块的长径和宽径(mm)，用肿瘤体积(tumor volume)来评价各个给药组对肿瘤的治疗效果。肿瘤体积(V)用以下公式计算：
V＝长径×宽径2×0.5(mm3)
3.耐药性乳腺癌肿瘤体积变化率及抑瘤率的计算
上述各处理组的荷瘤裸鼠，在给药开始前，肿瘤自然生长，其体积变化率均为1；在肿瘤接种后第12天至第23天期间，用游标卡尺测量肿瘤，采用以下公式计算给药后第n天的肿瘤体积变化率：
Figure 1
其中Vn表示第n天肿瘤的体积，V12表示第12天肿瘤的体积，通过肿瘤体积变化率即可绘制出各制剂组裸鼠移植瘤体积的生长变化曲线。然后利用以下公式计算给药治疗后各制剂组的肿瘤抑制率：
Figure BDA0002271248970000072
其中Ri表示第i组制剂在治疗结束时的肿瘤体积变化率，R0表示空白对照组的肿瘤体积变化率。
(三)制剂安全性评价
1.裸鼠体重变化
用电子天平称量裸鼠的体重，观察裸鼠的体征和行为活动。用裸鼠体重的变化来评价各个给药组的毒性。
2.裸鼠组织器官安全性评价
在给药结束后，每组取三只裸鼠，裸鼠颈椎脱位处死后，取出各实验组裸鼠的肿瘤组织和主要脏器组织(心、肝、脾、肺和肾)，新鲜分离的器官组织置于10％中性缓冲福尔马林中进行苏木素-伊红(HE)染色。
HE染色：将器官组织浸泡在4％多聚甲醛中4h，转移到70％乙醇中。将每片脏器组织置于处理盒中，加入低浓度到高浓度酒精梯度脱水，加入二甲苯替换出组织块中的酒精，再进行浸蜡包埋。将组织块置于已熔化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。染色之前，在切片机上将脏器组织切成5μm厚度的切片。染色前，在二甲苯脱去切片中的石蜡，加入高浓度到低浓度酒精水化，并用PBS (pH7.4)清洗。将切片放入苏木精水溶液中染色数分钟，放入酸性水溶液及氨水中分色数秒钟，流水冲洗1小时后入蒸馏水，在70％和90％酒精中脱水各10分钟，放入伊红的酒精染色液中染色2-3分钟。染色后，切片通过增加乙醇和二甲苯的浓度进行脱水透明，使用倒置显微镜进行拍摄。
(四)对耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠的活体成像研究
1.DiR标记的功能化脂质体
DiR是一种近红外脂溶性荧光探针，具有毒性低，发光成像不需要组织化学处理，不易从载体泄露等优点，能够使体内生物膜性物质染色，是理想的活体成像示踪剂。因此，本研究选用DiR作为小动物活体成像的荧光探针。根据以上处方，精密称取 DPPC、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-AS1411适量作为载体材料，与相应适量DiR(DiR:脂材＝1:300,w/w)混合。置于茄形瓶中，加入适量氯仿/甲醇溶液溶解，于37℃下旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层均匀的薄膜。再向茄形瓶中加入适量PBS溶液进行水化，初步超声后转移至超声波细胞粉碎机中进一步超声，设置超声工作时间为5s，间歇时间为5s，全程时间为10min，保护温度为25℃，功率为300 W。然后依次过400nm和200nm的微孔滤膜，最后过除菌滤膜除菌备用，即得DiR 标记的功能化脂质体。
同法以等摩尔量的胆固醇替换硬脂酰胺，等摩尔量的DSPE-PEG2000替换 DSPE-PEG2000-AS1411制备DiR标记的普通脂质体。
2.给药方案
选择肿瘤体积达到600mm3的荷瘤裸鼠12只，随机分成4组，每组3只。分别给予以下DiR制剂，每只裸鼠剂量为1μg DiR：
(1)生理盐水组；
(2)游离DiR组；
(3)DiR标记的普通脂质体组；
(4)DiR标记的功能化脂质体组。
3.活体成像研究
静脉给予各DiR制剂后分别于第1h、3h、6h、9h、12h、24h和36h，利用IVIS 光谱成像系统进行荧光成像。于第36h后，脱臼处死，立即解剖获取肝、脾、肾和肿瘤组织，并对离体组织进行成像分析。
实验结果
功能化拉洛他赛脂质体的制备结果如下：
(一)功能化材料的电泳表征
使用尿素变形的10％PAGE电泳对合成后的功能化材料进行确证，结果如图1所示。
(二)脂质体的制备与表征结果
1.脂质体的制备与理化表征
成功制备拉洛他赛脂质体和功能化拉洛他赛脂质体，脂质体均带有微弱淡蓝色乳光。在这两种脂质体中，由于拉洛他赛是脂溶性药物，与脂质体膜材一起溶解然后成膜，故拉洛他赛被包载于磷脂双分子层中。通过激光粒度仪分析，结果显示，拉洛他赛脂质体的平均粒径105.73±2.30nm，多分散系数为0.190±0.072，zeta电位为0.24 ±0.015mV，包封率为87.73±2.70％；功能化拉洛他赛脂质体的平均粒径131.03±2.15 nm，多分散系数为0.142±0.067，zeta电位为0.07±0.014mV，包封率为81.74±2.50％，结果见表1。
由结果可知，该实施例所制备的功能化拉洛他赛脂质体具有纳米粒径、分布均一、包封率高、略带正电，由于其表面修饰了功能化材料DSPE-PEG2000-AS1411且该材料略带负电，相比于普通脂质体，功能化拉洛他赛脂质体粒径更大且正电性更小，具有更好的均一度。
透射电镜图像结果显示，两种脂质体均呈圆球形的囊状结构，见图2。由图可知，功能化拉洛他赛脂质体粒径稍大于普通脂质体，与上述表征结果一致。
表1、脂质体的理化表征
Figure BDA0002271248970000091
Data are presented as the mean±standard deviation(n＝3)
功能化拉洛他赛脂质体用于治疗耐药性乳腺癌的结果
(一)对耐药性乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制效应
各组制剂在耐药性乳腺癌移植瘤模型中的治疗效果如图3所示。结果显示，以生理盐水组作为对照，从肿瘤接种后第17天开始体现出显著性差异，在肿瘤接种后第 22天，紫杉醇的抑瘤率是17.70％，拉洛他赛的抑瘤率是43.54％，拉洛他赛脂质体的抑瘤率是63.48％，功能化拉洛他赛脂质体的抑瘤率是91.57％。结果表明，各组制剂对耐药性乳腺癌的治疗效应顺序为功能化拉洛他赛脂质体>拉洛他赛脂质体>拉洛他赛>紫杉醇，其中，功能化拉洛他赛脂质体的抑瘤率高达90％以上，显著高于其他各组，证明其有明显的治疗耐药性乳腺癌的潜力。
(二)制剂安全性评价
1.裸鼠体重变化
给药期间荷瘤裸鼠的体重变化如图4所示，结果显示，各组制剂对裸鼠体重均没有显著影响，但拉洛他赛组的裸鼠体重持续低于其他各组，且功能化拉洛他赛脂质体组的裸鼠体重最接近于空白对照组。该结果表明，在该给药剂量下，紫杉醇在裸鼠体内毒性较低，但游离的拉洛他赛可能在裸鼠体内出现一定的毒性反应。然而，拉洛他赛脂质体组及其功能化脂质体组均在裸鼠体内未见明显毒性，这表明将拉洛他赛制备成脂质体制剂可以很好地解决其潜在毒性的问题。
2.裸鼠组织器官安全性评价
通过对各实验组裸鼠进行心、肝、脾、肺、肾等主要组织器官的病理学检测，对功能化脂质体的安全性进行了初步评价，结果如图5所示。结果显示，与对照组相比，功能化拉洛他赛脂质体组中，裸鼠的各主要组织器官并未出现明显的病理改变；而拉洛他赛组中，裸鼠的肝组织可见明显组织断裂和破损，肺组织中无完整肺泡，只可见肺泡碎片，表明裸鼠的肝、肺组织出现了不同程度的损伤。结果表明，游离的拉洛他赛在裸鼠体内可能会产生一定毒性，导致其主要器官不同程度的损伤，与上述结论一致。然而，功能化拉洛他赛脂质体组裸鼠的主要器官均未出现明显病理性变化和损伤迹象，安全性良好。这表明，将拉洛他赛制备成脂质体制剂可以很好地解决其潜在毒性的问题，与上述结论一致。
(三)对耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠的活体成像研究
图6所示为各制剂在荷瘤裸鼠体内的分布和蓄积情况。图6(A)为尾静脉注射游离DiR、DiR标记的普通脂质体和DiR标记的功能化脂质体后裸鼠体内的荧光分布；图6(B)为48h后裸鼠的肝、脾、肾和肿瘤组织的体外成像结果。肝、脾和肾是主要的药物代谢器官，活体成像可以很好地体现药物在体内的代谢和分布情况。
结果显示，尾静脉注射后，在DiR标记的功能化脂质体和DiR标记的普通脂质体组中，荧光分布在全身，且在肝脏和肿瘤组织部位具有较强的荧光信号，可以持续至 48h。在游离DiR组中，肝脏有极强的荧光信号，而肿瘤部位几乎没有荧光分布，这表明游离的DiR很难达到肿瘤部位，绝大部分在肝脏中快速代谢。各主要代谢器官和肿瘤组织离体成像结果同样显示，DiR标记的功能化脂质体组的肿瘤组织具有最强的荧光信号，DiR标记的普通脂质体组的肿瘤组织荧光信号强度弱于功能化脂质体组，游离DiR组的肿瘤组织的荧光强度最弱。结果表明，尾静脉注射功能化脂质体和普通脂质体均可延长药物在裸鼠体内的循环时间，并可在肿瘤组织中蓄积药物，提升肿瘤部位的药物浓度以达到更好的治疗效果。此外，功能化脂质体体现出的长循环效应和肿瘤部位蓄积效应均优于普通脂质体。

Claims (10)

1.一种功能化拉洛他赛脂质体，以拉洛他赛为模型药物包封于脂质体中，表面修饰DSPE-PEG2000-AS1411。
2.根据权利要求1所述的功能化拉洛他赛脂质体，其特征在于：所述功能化拉洛他赛脂质体中，所述拉洛他赛与构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材的质量比为1:18-22；具体为1：20；
所述DSPE-PEG2000-AS1411中，DSPE、PEG2000与AS1411的摩尔比为60：40：5；
所述功能化拉洛他赛脂质体的粒径为131.03±2.15nm，多分散系数为0.142±0.067，zeta电位为0.07±0.014mV，包封率为81.74±2.50％。
3.一种制备权利要求1或2所述功能化拉洛他赛脂质体的方法，包括：
1)将构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材和拉洛他赛于溶剂中溶解，减压蒸发除去所述溶剂，得到脂膜；
构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材为DPPC、Chol和DSPE-PEG2000-AS1411；
所述DPPC代表二棕榈酰磷脂酰胆碱；
所述Chol代表胆固醇；
所述DSPE-PEG2000-AS1411中，DSPE、PEG2000与AS1411的摩尔比为60：40：5；
2)将所述脂膜水化，依次进行水浴超声和探头超声，得到含有脂质体的液体；
3)再将所述含有脂质体的液体依次过大孔径和小孔径的膜，得到所述功能化拉洛他赛脂质体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述拉洛他赛与构成所述功能化拉洛他赛脂质体的脂材的质量比为1:18-22；具体为1：20；
所述溶剂由氯仿和甲醇组成；所述氯仿和甲醇的体积比具体为2.5-3.5:1；具体为3:1；
所述减压蒸发步骤中，温度为30-50℃；具体为40℃；
所述步骤2)所述水化步骤中，水化所用水化剂为PBS溶液；所述PBS溶液的pH值为7.5；
所述水浴超声步骤中，时间为2-3min；超声功率为190-210W；具体为200W；
所述探头超声步骤中，设置超声工作时间为1s；间歇时间为1s；全程时间为10min；保护温度为30-40℃；具体为35℃；功率为190-210W；具体为200W；
所述步骤3)过大孔径和小孔径的膜步骤中，所用膜均为聚碳酸酯膜；
所述大孔径的膜的孔径为380-420nm；具体为400nm；
所述小孔径的膜的孔径为180-220nm；具体为200nm；
所述过大孔径和小孔径的膜的步骤重复若干次；具体为3次。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述DSPE-PEG2000-AS1411按照包括如下步骤的方法制得：
将DSPE-PEG2000与氨基修饰后的核酸适配体AS1411-C6-NH2于有机溶剂中溶解，调节pH值为7.5-8.0，进行反应后透析，而得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为PBS和DMF；所述PBS的pH值为7.5；
所述PBS和DMF的体积比为1:1；
所述DSPE-PEG2000与氨基修饰后的核酸适配体AS1411-C6-NH2的用量比为0.4mg：32-34nmol；具体为0.4mg：33.8nmol；
所述PBS和DMF与DSPE-PEG2000的用量比均为2mL：0.3-0.5mg；具体为2mL：0.4mg；
所述反应步骤中，温度为室温；时间为3-5小时；具体为4小时；
所述透析步骤中，透析袋的截留分子量为7500-8500Da；具体为8000Da；透析时间为40-50小时；具体为48小时；所述透析为用去离子水透析。
7.权利要求1或2任一所述功能化拉洛他赛脂质体在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用。
8.含有权利要求1或2任一所述功能化拉洛他赛脂质体的预防和/或治疗肿瘤的产品。
9.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的药物，其特征在于：所述肿瘤为乳腺恶性肿瘤；
所述肿瘤细胞为癌细胞、耐药性癌细胞、耐阿霉素癌细胞、耐药性乳腺癌细胞或耐阿霉素乳腺癌细胞。
10.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的药物，其特征在于：所述产品为药物或药物制剂。
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