CN111001006A - 葫芦素b和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药的共载仿生纳米粒及其在制备治疗肿瘤转移疾病药物中的用途，该纳米粒能够消融原发肿瘤，靶向循环肿瘤细胞从而抑制肿瘤转移。所述的外泌体膜包被的共载仿生纳米粒包含葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药、纳米载体材料、外泌体膜，其中，各成分的重量百分组成是：葫芦素B占1‑2％，氧化响应抗肿瘤前药占6‑8％，纳米载体材料占60‑70％，余量为外泌体膜。所述的葫芦素B与氧化响应抗肿瘤前药的重量比为：1：4‑1：8。本发明制备的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒治疗肿瘤转移尤其指乳腺癌的肺或肝转移具有明显的效果，可以用于制备抗肿瘤药物。

Description

葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药的共载仿生纳米粒及其在制备治疗肿瘤转移疾病药物中的用途，该纳米粒能够消融原发肿瘤，靶向循环肿瘤细胞从而抑制肿瘤转移。
背景技术
转移性乳腺癌，也称为乳腺癌转移瘤，是乳腺癌的一个阶段，远端转移是90％乳腺癌病人死于乳腺癌的原因。虽然目前临床技术取得了很大的进步，但治疗效果仍然有限，远端转移的五年生存期最多只能提高几个月。这其中的一个重要原因是传统化疗药物无法靶向清除血液中的循环肿瘤细胞。
纳米药物传递系统可以通过增强肿瘤的高通透性和滞留效应而有效地靶向肿瘤，这可以提高肿瘤靶向的潜力。然而，当乳腺癌恶化到晚期时，肿瘤细胞之间的连接松散并且可能分离。大量的游离肿瘤细胞，即循环肿瘤细胞可以通过血液传播，从而形成更多的转移，这是危及生命的。因此，仅仅消除原位肿瘤收效甚微，有效捕获并清除循环肿瘤细胞以预防更多的转移仍具有临床挑战性。
近年来，前体药物和膜包被仿生技术在药物传递领域的广泛应用极大地丰富了抗肿瘤转移的药物递送策略。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质。前药策略可以通过巧妙的结构修饰来改善化疗药物的不良性质，膜包被仿生技术可以借助生物膜表面的蛋白修饰特异性追踪循环肿瘤细胞，延长化疗药物在体内的循环时间，增强药物的细胞摄取和肿瘤渗透，进而提高抗肿瘤效果并增强抑制转移能力。在此基础上，基于小分子前体药物的膜包被仿生药物递送系统将前体药物和膜包被仿生技术的优点结合到一起，以其肿瘤靶向能力强、体循环时间长、毒副作用低等优势，已成为抑制肿瘤转移研究的热点。
对于前药递送系统，智能触发药物的高效释放对于制剂的有效性至关重要。研究表明，葫芦素B能在多种肿瘤细胞中高效产生活性氧提高细胞内的氧化应激水平，从而增强氧化响应抗肿瘤前药的释放。与此同时，葫芦素B可通过抑制乳腺癌细胞的FAK/MMP信号通路显著抑制肿瘤转移，进一步增强共载仿生纳米粒的抗转移作用。
发明内容
本发明所解决的技术问题是为了克服现有技术的缺陷，同时考虑外泌体对循环肿瘤细胞的天然靶向性及靶向递送葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药触发抗转移和增强的化学治疗的双重作用，提供了外泌体膜包被葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒(EMPCs)，采用纳米药物载体共载葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药，在载体表面包被外泌体膜，通过静脉注射，可通过增强的通透性和滞留作用(EPR)在原发肿瘤中积聚，并通过增强的前药活化消融原发肿瘤。通过同源外泌体膜与肿瘤细胞膜上CD44蛋白之间的高亲和力捕获并清除血液循环中的循环肿瘤细胞。该纳米系统对乳腺癌的肺和肝转移产生显著的抑制作用。
具体地，本发明的第一个目的是，克服传统纳米药物易被免疫清除且无法靶向循环肿瘤细胞的缺点，提供一种可追踪循环肿瘤细胞抑制肿瘤转移的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒(EMPCs)。
本发明的第二个目的是，提供所述外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒的制备方法。
本发明的第三个目的是，提供所述外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：提供外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒，所述的共载仿生纳米粒为表面包被外泌体膜，内部包载葫芦素B与氧化响应抗肿瘤前药的纳米载体。
具体地，所述的外泌体膜包被的共载仿生纳米粒包含葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药、纳米载体材料、外泌体膜，其中，各成分的重量百分组成是：葫芦素B占1-2％，氧化响应抗肿瘤前药占6-8％，纳米载体材料占60-70％，余量为外泌体膜。
所述的葫芦素B与氧化响应抗肿瘤前药的重量比为：1：4-1：8，优选为1：6。
所述的纳米载体材料可以是任何能够包载葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药的聚合物，包括聚己内酯-聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇、聚乳酸乙醇酸、聚三亚甲基碳酸酯中的一种或几种；优选的，所述的纳米载体材料为聚己内酯-聚乙二醇。
所述的氧化响应抗肿瘤前药，为含有单硫键、单硒键、酮缩硫醇键、硼酸酯键等氧化响应桥联的抗肿瘤药的前体药物，优选为含有单硫键的抗肿瘤前体药物。
所述的抗肿瘤药为含有活性羟基或氨基的抗肿瘤药物，如紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物，所述的紫杉烷类化合物选自：紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛；所述的核苷类化合物选自吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨；所述的蒽环类化合物选自多柔比星、表柔比星、柔红霉素、伊达比星；所述的喜树碱类化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱。
进一步地，所述的氧化响应抗肿瘤前药的结构通式为：
Figure BDA0002337955150000031
X＝S,Se,
Figure BDA0002337955150000032
R＝紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、多柔比星、喜树碱。
本发明优选为氧化响应紫杉醇前药，其结构式如下：所述的紫杉醇前药是以紫杉醇和亚油酸-乙二醇酯作为模拟药物，并将二者通过硫代二乙酸相连制得：
Figure BDA0002337955150000033
其中，葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药、纳米载体材料之间的重量比为：(1-2)：(6-10)：(60-80)。
当纳米载体材料为聚己内酯-聚乙二醇，氧化响应抗肿瘤前药为紫杉醇前药时，葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药、纳米载体材料之间的重量比为：(1-2)：(6-8)：(60-70)，优选为：1：6：60。
所述的纳米粒的粒径为90-110nm。
所述的外泌体膜为MDA-MB-231细胞来源的外泌体膜，从培养MDA-MB-231细胞48小时的无血清细胞培养液中提取而来。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：在包载葫芦素B与氧化响应抗肿瘤前药的纳米载体外面包被外泌体膜。所述的制备方法包括以下步骤：
(1)制备葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载纳米粒；
(2)制备外泌体膜；
(3)将外泌体膜包被于葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药纳米载体表面。
步骤(1)中所述的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载纳米粒为纳米载体材料(如聚己内酯-聚乙二醇)通过乳化溶剂挥发法制备。
即将纳米载体材料、葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药溶于丙酮中，注射到转子搅拌的去离子水中，之后旋转挥发有机溶剂。
葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药、纳米载体材料的重量比为：(1-2)：(6-10)：(60-80)；
步骤(2)中，通过收集培养MDA-MB-231细胞的无血清细胞培养液制备外泌体膜。
即收集培养MDA-MB-231细胞的无血清细胞培养液，通过多次离心先后除去肿瘤细胞、死细胞、细胞碎片，再取上清离心，去除上清，使用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬后，离心，去除上清得到底部的外泌体。低渗裂解外泌体后，离心3小时收集底部的外泌体膜。
步骤(3)中，将步骤(1)的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载纳米粒加入到步骤(2)制备的外泌体膜中，涡旋处理制备外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载纳米粒。
本发明还提供了氧化响应抗肿瘤前药的合成方法，包括如下步骤：
首先将亚油酸与乙二醇成酯，然后与硫代二乙酸酐成酯得到中间产物，中间产物与抗肿瘤药物成酯，得到终产物。
具体地，本发明提供了系列紫杉醇-亚油酸前药的合成方法：
先由亚油酸与乙二醇发生单酯化反应，柱层析分离得到亚油酸-乙二醇酯，然后与硫代二乙酸酐发生酯化反应，并通过柱层析分离得到关键中间体((2-氧代-2-(2-((Z)-亚油酰基)乙氧基)乙硫基)乙酸)；将中间体(2-氧代-2-(2-((Z)-亚油酰基)乙氧基)乙硫基)乙酸、EDCI、HOBt溶于无水二氯甲烷中，冰浴1-2小时，然后加入紫杉醇，室温条件下搅拌48小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
亚油酸-乙二醇酯可以用其他含有不饱和键和活性羟基的碳链替代，如油酸-乙二醇酯、油醇、亚麻醇或亚油醇所代替。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种靶向循环肿瘤细胞抑制肿瘤转移的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒在制备治疗肿瘤转移的药物中的应用。
所述的肿瘤转移尤其指乳腺癌的肺或肝转移。
本发明制备了外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒EMPCs，并对其性质进行了考察，同时制备了外泌体膜EM，未包被外泌体膜的纳米粒PCNPs以及单载葫芦素B的EMCs、单载氧化响应抗肿瘤前药的EMPs纳米粒作为对照，详细考察内容如下：
1)合成葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药纳米载体，制备外泌体膜，通过涡旋和挤出将外泌体膜包被于葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药纳米载体表面，对其理化性质进行表征，如粒径、电位、形态、SDS-PAGE及Western Blot表征蛋白情况、包封率、药物释放曲线等。
2)考察外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的细胞毒性及细胞摄取。
3)考察外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒(EMPCs)在后背部接瘤的Balb/c裸鼠体内的行为及抗转移治疗效果。
4)考察外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒(EMPCs)在右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的Balb/c裸鼠体内的行为及抗转移治疗效果。
结果表明，本发明制备的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒治疗肿瘤转移尤其指乳腺癌的肺或肝转移具有明显的效果，可以用于制备抗肿瘤药物，尤其是抗肿瘤转移药物。
附图说明
图1为单硫键桥连的紫杉醇-亚油酸前药(PTX-S-LA)的1H NMR谱图和质谱图。
图2：外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的表征：
A：提取的外泌体的电镜图和外泌体标志蛋白的检测。
B：外泌体膜和包膜制剂的SDS-PAGE蛋白电泳分析。
C：纳米粒的电镜图。
D：纳米粒的粒径和Zeta电位。
E：MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231细胞膜、外泌体膜和EMPCs上CD44和CD47蛋白的Western Blotting分析。
图3为外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的粒径-存储时间图。
图4为外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的体外释放图、细胞毒性图、ROS产生图和细胞内释放图：
A：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)在不同浓度H2O2中的累积释放率-时间曲线。
B：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)对MDA-MB-231细胞的48小时细胞毒性图。
C：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)对MDA-MB-231细胞的72小时细胞毒性图。
D：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)对肿瘤细胞内ROS水平影响图。
E：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的6小时和24小时肿瘤细胞内母药释放图。
图5为外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒的细胞摄取图。
图6为外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的(A)肿瘤球实验图、(B)划痕实验图、(C)Western Blotting实验图和(D)血药浓度-时间曲线图。
图7为外泌体膜包被仿生纳米粒在后背部接瘤的Balb/c裸鼠体内的组织分布图。
图8为各组制剂对背部接瘤的异位肿瘤的治疗结果：
A：解剖后各组小鼠肿瘤图像。
B：各组小鼠肿瘤体积随时间变化曲线。
C：解剖后各组小鼠肿瘤质量图。
D：解剖后各组小鼠肺部Bouin’s液固定后的图片以及肺部和肝部的H&E染色图片。
E：各组小鼠体重随时间变化曲线。
图9为各组制剂对背部接瘤的异位肿瘤治疗后心、脾、肾、瘤的H&E染色图片。
图10为外泌体膜包被的仿生纳米粒在右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的Balb/c裸鼠体内的组织分布图。
图11为各组制剂对右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的原位肿瘤的治疗结果：
A：各组小鼠肿瘤体积随时间变化曲线。
B：解剖后各组小鼠肿瘤质量图。
C：解剖后各组小鼠肿瘤图像。
D：解剖后各组小鼠肺部Bouin’s液固定后的图片以及肺部和肝部的H&E染色图片。
E：各组小鼠体重随时间变化曲线。
图12为各组制剂对右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的原位肿瘤治疗后心、脾、肾、瘤的H&E染色图片。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：单硫键桥连的紫杉醇-亚油酸小分子前药(PTX-S-LA)的合成
将适量乙二醇加入到50mL三颈瓶中，加入少量对甲苯磺酸，加热至110℃，将甲苯溶解的油酸缓缓滴注到反应瓶中，反应2h，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量硫代二乙酸酐和少量三乙胺、HOBT、EDCI，室温条件下搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴2小时，然后加入适量紫杉醇，在室温下再搅拌48小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.10(d,2H),7.72(d,2H),7.55(t,1H),7.47(m,3H),7.37(d,4H),7.27(t,3H),6.23(s,1H,10-H),6.21(s,1H,13-H),6.00(dd,1H,3'-H),5.63(d,1H 2-H),5.43(d,1H,2'-H),5.30-5.40(m,4H,-CH＝CH-),4.92(d,1H,5-H),4.40(m,1H,7-H),4.25-4.30(m,4H,-O-CH2CH2-O-),4.22(d,1H,20β-H),3.76(d,1H,3-H),3.17-3.54(m,4H,-CH2-S-CH2-),2.71(t,2H,-CH＝CH-CH2-CH＝CH-),2.52(m,1H,-H),2.48(s,3H,4-COCH3),2.41(q,2H,14α-H,14β-H),2.31(t,2H,-CH2CO-),2.22(s,3H,10-COCH3),1.96(d,4H,-CH2CH＝CH-CH2-CH＝CH-CH2-),1.71(s,3H,19-H),1.62(s,2H,-CH2CH2CO-),1.28-1.31(m,14H,LA),1.24(s,3H,17-H),1.17(s,3H,16-H),0.83(t,3H,-CH3).MS(ESI)m/z forC71H89NO19S[M+H]+:1292.5658[M+Na]+:1314.5474.
实施例2：葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米内核(PCNPs)制备方法的优化
本实施例采用三种不同的方法和PEG-PCL、PEG-PLA两种不同的聚合物材料制备葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米内核，通过对比得出最优的制备方法。
乳化溶剂挥发法：精密称取紫杉醇前药PTX-S-LA 6mg，葫芦素B1mg，PEG-PCL或PEG-PLA 60mg，溶于1ml丙酮中，将油相倒入滴加入4mL转子搅拌的去离子水中，旋蒸除去丙酮，过滤膜除去未被包裹的游离药物，即得葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒。
薄膜分散法：精密称取紫杉醇前药PTX-S-LA 6mg，葫芦素B1mg，PEG-PCL或PEG-PLA60mg，溶于6ml乙腈中，旋转蒸发除去有机溶剂，加入去离子水水化，探头超声5min，过滤膜除去未包载的游离药物，即得葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒。
透析法：精密称取紫杉醇前药PTX-S-LA 6mg，葫芦素B1mg，PEG-PCL或PEG-PLA60mg，溶于5mL N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中，再把聚合物的DMF溶液转入到透析袋中，用1.5L去离子水透析24h，离心后进行冷冻干燥，即得葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒。
由表1-3可知，乳化溶剂挥发法制备的PEG-PCL共载纳米粒具有最高的载药量和包封率，故优选乳化溶剂挥发法为葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒的制备方法。如表1所示，乳化溶剂挥发法制备的PEG-PCL纳米粒粒径都在80nm左右，粒径分布小于0.1。通过透射电子显微镜测定薄膜分散法制备的共载纳米粒的粒径和形态，结果如图3，透射电镜图表明共载纳米粒为均一的球形，粒径在80nm左右。
表1.乳化溶剂挥发法制备的共载纳米粒的粒径、粒径分布、载药量和包封率
Figure BDA0002337955150000091
表2.薄膜分散法制备的共载纳米粒的粒径、粒径分布、载药量和包封率
Figure BDA0002337955150000092
表3.透析法制备的共载纳米粒的粒径、粒径分布、载药量和包封率
Figure BDA0002337955150000093
Figure BDA0002337955150000101
实施例3：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇氧化前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的制备及其表征
将60mg PEG-PCL、1mg葫芦素B、6mg紫杉醇氧化前药溶于1mL丙酮中，之后滴入到转子搅拌的4ml去离子水中。旋转蒸发除去有机溶剂，过滤膜除去未包载的游离药物。收集培养MDA-MB-231细胞48小时的无血清细胞培养液，300g离心10分钟除去肿瘤细胞，取上清2000g离心10分钟除去死细胞，取上清10,000g30分钟除去细胞碎片，取上清100,000g离心70分钟，去除上清，使用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬后，100,000g离心70分钟，去除上清得到底部的外泌体。低渗裂解外泌体后，100,000g离心3小时收集底部的外泌体膜并用PBS重悬，之后加入共载纳米颗粒溶液中涡旋进行膜包被。此混合物用200nm聚碳酸酯膜挤出器挤出，反复12次后即得EMPCs。EMPs、EMCs制备方法同上。
EMPCs是典型的核壳结构(图2C)，ζ电位显示为-21.3mV。我们使用SDS-PAGE和western-blot分析EMPCs上的关键蛋白，如图2B和图2E所示，它们都显示相同的蛋白质组分，表明外泌体中的关键蛋白质在制备过程中被有效保留。纳米粒的粒径小于110nm，可以通过增强的通透性和保留效应(EPR)蓄积到肿瘤区域。
实施例4：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇氧化前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的制备
参考实施例3的制备方法制备外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇氧化前药共载仿生纳米粒，其中，葫芦素B、氧化响应抗肿瘤前药、纳米载体材料之间的重量比为：1：10：80、2：10：80、1：8：70、2：6：70，所制备的纳米粒的粒径、ζ电位、前药载药量、前药封率如下：
Figure BDA0002337955150000102
Figure BDA0002337955150000111
实施例5：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的胶体稳定性试验
将实施例3中制备的外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒取出1mL，加入到20mL含有或不含10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育24小时，并且在预定的时间点(0,2,4,6,8,12和24小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图3所示，共载纳米粒具有较好的胶体稳定性，在24小时内粒径没有发生明显的变化。
实施例6：实施例3制备的外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的体外释放试验
以含30％乙醇的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒的体外释放情况。将1mL实施例3中制备的葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒封装于透析袋中，然后加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的葫芦素B和紫杉醇浓度。向释放介质中加入一定浓度的双氧水(H2O2，2mM,5mM,10mM)，以考察共载纳米粒在氧化条件下的释放情况。
由图4A可知，葫芦素B和单硫桥连的紫杉醇前药共载纳米粒具有氧化响应促进释放的特性，能够在H2O2的作用下快速释放出紫杉醇，且释放速率随H2O2加入量的增加而升高。
实施例7：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的细胞毒性
采用MTT法考察实施例3制备的葫芦素B和紫杉醇前药共载纳米粒对人源乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至18000cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加泰素或实施例3中制备的纳米粒。本实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用DMEM培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加100μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48和72h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
细胞毒性结果如图4B-C所示。与泰素组相比，前药纳米粒的细胞毒性降低。这是因为紫杉醇需要一定时间从纳米粒中释放出来，限制了紫杉醇药效的发挥。相比之下，由于葫芦素B可以在MDA-MB-231细胞中高效产生ROS从而进一步加快紫杉醇的释放使得葫芦素B和单硫前药共载纳米粒的细胞毒性显著增强。实验结果表明前药纳米粒细胞毒性与紫杉醇从纳米粒中的释放速度相关，药物释放速度越快，细胞毒性越强。
实施例8：实施例3制备的外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)对肿瘤细胞内ROS水平的影响
考察前药纳米粒以及葫芦素B和前药共载纳米粒对肿瘤细胞内ROS水平的影响。分别将前药纳米粒、葫芦素B纳米粒和共载纳米粒与MDA-MB-231细胞进行孵化，2、6、12小时之后通过流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞内ROS水平的变化。
结果如图4D所示，与前药纳米粒相比，葫芦素B和前药共载纳米粒能够显著提高肿瘤细胞中ROS的表达，而ROS能进一步促进单硫键的氧化断裂。因此葫芦素B和前药共载纳米粒具有比前药纳米粒更快的母药释放速度，从而表现出了更强的细胞毒性。
实施例9：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的肿瘤细胞内药物释放
为了确定与MDA-MB-231细胞孵育后前药纳米粒释放的紫杉醇的量，在固定的时间点(6和24小时)收集细胞和培养基(紫杉醇初始当量浓度：500ng/mL)。超声处理和离心后，通过液相色谱-质谱联用仪测量上清液中游离紫杉醇的浓度。
考察了前药纳米粒在MDA-MB-231细胞中紫杉醇的释放速度。从图4E可知，细胞毒性与紫杉醇的释放速率正相关。葫芦素B和PTX-S-LA共载纳米粒释放紫杉醇的速度快于PTX-S-LA前药纳米粒。葫芦素B和PTX-S-LA共载纳米粒能够最快地释放紫杉醇，是因为葫芦素B能够在肿瘤细胞中高效产生ROS促进氧化响应单硫键的断裂从而快速释放出母药。
实施例10：香豆素-6标记的外泌体膜包被仿生纳米粒(EM@C-6NPs)的细胞摄取
采用流式细胞仪测定香豆素-6标记的PEG-PCL纳米粒在MDA-MB-231细胞中的摄取情况。将MDA-MB-231、MCF-7和NIH 3T3细胞以100000cells/mL的密度接种到12孔板上，置培养箱中孵育24h使其贴壁，待细胞贴壁后分别加香豆素-6标记的PEG-PCL纳米粒(C-6NPs)、红细胞膜包被的香豆素-6标记的PEG-PCL纳米粒(RM@C-6NPs)和外泌体膜包被的香豆素-6标记的PEG-PCL纳米粒(EM@C-6NPs)。香豆素-6的浓度为250ng/mL。在37℃孵化1h后，将细胞清洗，收集并分散在PBS中，用流式细胞仪考察细胞对香豆素-6的摄取情况。
实验结果如图5所示，EM@C-6NPs处理的细胞显示出比EM@C-6NPs和C-6NPs处理的细胞更高的MDA-MB-231细胞内荧光强度，而三者处理的MCF-7和NIH 3T3细胞内荧光强度都无明显增强。由此说明，制备的外泌体膜包被的纳米粒具有比游离香豆素-6更强的同源靶向性。
实施例11：香豆素-6标记的外泌体膜包被仿生纳米粒(EM@C-6NPs)在MDA-MB-231肿瘤球的深部渗透
使用共聚焦显微镜观察三维MDA-MB-231肿瘤球中C-6NPs和EM@C-6NPs的深部渗透能力。简而言之，将悬浮在具有2.5％基质胶的DMEM中的MDA-MB-231细胞以0.5×104个/孔的密度接种到超低附着力的96孔圆底平板中，并以1000rcf离心10分钟。将细胞在37℃和5％CO2条件下培养4天，以形成致密的球体。接着将C-6溶液，C-6NPs和EM@C-6NPs分别添加到转移至共聚焦培养皿中的肿瘤球中，并在37℃下孵育8小时。将肿瘤球用冰PBS冲洗两次后用共聚焦显微镜观察。如图6A所示，EM@C-6NPs组肿瘤球的荧光明显比C-6溶液和C-6NPs更接近球心且强度更强，表明EM@C-6NPs具有最强的肿瘤深部渗透能力。
实施例12：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)对MDA-MB-231细胞迁移的抑制实验
借助划痕实验测定制剂对MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用。将105个细胞/孔接种到12孔板中。使用无菌的200μL移液枪枪头划过细胞以形成无细胞区域。然后，将细胞与EMPs，EMCs和EMPCs一起孵育并观察分析划痕愈合情况。如图6B所示，EMCs和EMPCs具有明显更强的抗肿瘤细胞迁移能力，表明包载的葫芦素B具有优异的抗转移潜质。
实施例13：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)对MDA-MB-231细胞FAK/MMP通路的抑制作用
为了进一步阐明制剂抗肿瘤转移的分子机制，我们通过Western Blot实验考察了EMPs、EMCs和EMPCs对MDA-MB-231细胞FAK/MMP通路的影响。具体地，将在6孔板中培养的MDA-MB-231细胞与EMPs，EMCs和EMPCs孵育24小时。RIPA裂解液裂解细胞获取细胞裂解液。用SDS-PAGE电泳分离蛋白质，将其转移至PVDF膜后4℃孵育一抗过夜。接着室温孵育二抗，加入化学发光试剂并用凝胶成像仪成像。如图6C所示，EMCs和EMPCs显著抑制剂了FAK/MMP通路中的关键蛋白，从而抑制了肿瘤细胞的转移。
实施例14：外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)的药代动力学研究
取体重在210-260g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射Taxol以及实施例3中制备的共载纳米材料(PCNPs)和外泌体膜包被的共载仿生纳米粒(EMPCs)。紫杉醇的剂量为4mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
实验结果如图6D所示，由于半衰期短，Taxol中的紫杉醇迅速从血液中清除，共载纳米材料(PCNPs)的体内循环时间更长。相比之下，外泌体膜包被的共载仿生纳米粒(EMPCs)的循环时间明显延长，且在体内循环过程中鲜有母药的提前泄露。
实施例15：考察外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇氧化响应前药共载仿生纳米粒(EMPCs)在后背部接瘤的Balb/c裸鼠体内的行为及抗转移治疗效果。
通过尾静脉注射将DiR标记的纳米粒(DiR NPs)和外泌体膜包被DiR标记的纳米粒(EM@DiR NPs)静脉给药到接种MDA-MB-231到背部的裸鼠体内。EM@DiR NPs在注射后24小时在肿瘤部位显示出比DiR NPs强的荧光信号，证实了EM@DiR NPs的显著靶向能力，其可以选择性结合MDA-MB-231细胞表面上的过表达的CD44受体。并且根据器官分布的结果，用EM@DiR NPs处理的肿瘤的荧光强度比用DiR NPs处理的肿瘤的荧光强度高3.6倍(图7)。
然后我们探讨了EMPCs的治疗效率。在具有不同处理的MDA-MB-231背部接瘤的BALB/c-nu小鼠上进行体内药效实验。EMPCs可引起完全的肿瘤增长抑制，治疗30天后肿瘤几乎没有变大，同时具有良好的生物相容性。(图8-9)。
为了评估EMPCs对体内主要组织的乳腺癌转移抑制作用，H&E染色结果显示其他5组有肺转移和肝转移，但EMPCs治疗组未发现明显的肿瘤转移(图8D)。因此，EMPCs可以作为体内抗肿瘤治疗的强效纳米制剂并显著抑制乳腺癌转移。
实施例15：考察外泌体膜包被的葫芦素B和紫杉醇前药共载仿生纳米粒(EMPCs)在右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的Balb/c裸鼠体内的行为及抗转移治疗效果。
为了探究在血液循环中的行为，我们通过尾静脉将DiR NPs和EM@DiR NPs注射进荷原位MDA-MB-231-luc肿瘤的裸鼠体内。根据组织分布的结果，用EM@DiR NPs处理的肿瘤的荧光强度比用DiR NPs处理的肿瘤的荧光强度高3.1倍(图10)，表明外泌体膜包被仿生纳米粒的高效靶向能力。
然后我们探讨了EMPCs在原位模型中的治疗效率和抗转移能力。我们发现基于EMPCs的仿生纳米策略对小鼠的原发性肿瘤显示出最强的抑制作用，而且几乎没有转移(图11)。此外，它还具有良好的生物相容性(图12)。
根据H&E染色切片，用EMPCs处理的小鼠的主要组织也显示几乎没有肿瘤转移(图11D)，并且肿瘤切片体现出显著的肿瘤凋亡(图12)。因此，EMPCs可以作为用于体内治疗原位乳腺癌转移的强效纳米制剂。

Claims (10)

1.外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒，其特征在于，包含葫芦素B、氧化响应前药、纳米载体材料、外泌体膜，其中，各成分的重量百分组成是：葫芦素B占1％-2％，氧化响应前药占6％-8％，纳米载体材料占60％-70％，余量为外泌体膜。
2.如权利要求1所述的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒，其特征在于，所述的氧化响应抗肿瘤前药是含有单硫键、单硒键、酮缩硫醇键、硼酸酯键类氧化响应桥联的抗肿瘤药的前体药物，所述的抗肿瘤药为含有活性羟基或氨基的抗肿瘤药物，其结构通式为：
Figure FDA0002337955140000011
X＝S，Se，
Figure FDA0002337955140000012
R＝紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、多柔比星、喜树碱。
3.如权利要求1或2所述的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒，其特征在于，所述的氧化响应抗肿瘤前药是以紫杉醇和亚油酸-乙二醇酯作为模拟药物，并将二者通过硫代二乙酸相连得到的，其结构式为：
Figure FDA0002337955140000013
4.如权利要求1所述的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒，其特征在于，所述的纳米载体材料是能够包载葫芦素B和氧化响应前药的聚合物，选自聚己内酯-聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇、聚乳酸乙醇酸、聚三亚甲基碳酸酯中的一种或几种，述的外泌体膜为MDA-MB-231细胞来源的外泌体膜，从培养MDA-MB-231细胞的无血清细胞培养液中提取而来。
5.如权利要求1-4任何一项所述的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒，其特征在于，葫芦素B、氧化响应前药、纳米载体材料之间的重量比为：(1-2)∶(6-10)∶(60-80)，优选为：(1-2)∶(6-8)∶(60-70)。
6.如权利要求1所述的外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应前药共载仿生纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备葫芦素B和氧化响应前药纳米载体；
(2)制备外泌体膜；
(3)将外泌体膜包被于葫芦素B和氧化响应前药纳米载体表面。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将纳米载体材料、葫芦素B、氧化响应前药溶于丙酮中，滴入转子搅拌的去离子水中，之后旋蒸除去有机溶剂，葫芦素B、氧化响应前药、纳米载体材料的重量比为：(1-2)∶(6-10)∶(60-80)；步骤(2)中所述的外泌体膜为MDA-MB-231细胞来源的外泌体膜，从培养MDA-MB-231细胞的无血清细胞培养液中提取而来；步骤(3)中，将步骤(1)的葫芦素B和氧化响应前药纳米载体加入到步骤(2)制备的外泌体膜中，涡旋处理制备外泌体膜包被的葫芦素B和氧化响应前药共载仿生纳米粒。
8.权利要求1-6任何一项所述的外泌体膜包被葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒在药物传递系统中的应用。
9.权利要求1-6任何一项所述的外泌体膜包被葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-6任何一项所述的外泌体膜包被葫芦素B和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
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