CN107913249B - 一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物研发领域,尤其涉及一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用。本发明提供了一种组合物,所述组合物的原料包括:多西紫杉醇、中药单体以及载体;所述中药单体包括:槲皮素、姜黄素、大黄素、蛇床子素、芹菜素、黄芩素、山奈酚以及水飞蓟素中的一种或多种;本发明还提供了一种含有上述组合物的纳米胶束的制备方法,本发明还提供了上述组合物或上述制备方法得到的产品在抑制肿瘤细胞增殖和/或存活中的应用。经实验测定可得,本发明提供的技术方案制得的产品,口服给药后具有明显的抗肿瘤活性,生物利用度高、可明显降低给药量,还可克服多西紫杉醇单独使用时产生的耐药性。
Description
技术领域
本发明属于药物研发领域,尤其涉及一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用。
背景技术
多西紫杉醇(docetaxel,DTX)是由浆果紫杉针叶中提取的前体物经半合成得到的紫杉烷类抗癌药物,其抗肿瘤机制与紫杉醇相同,是微管解聚抑制剂,对多种癌症如卵巢癌、乳腺癌以及非小细胞肺癌和前列腺癌都有良好疗效。
多西紫杉醇的溶解性较差,口服生物利用度低。市售多西紫杉醇注射剂(Taxotere)采用非离子表面活性剂吐温-80和乙醇增加其溶解度,然而,该溶剂系统会导致神经毒性、肌肉骨骼毒性和中性粒细胞减少等严重不良反应,同时药物的分布无选择性,具有较大的毒副作用。
第二,多西紫杉醇的口服生物利用度差,是阻碍多西紫杉醇口服制剂的开发研究的瓶颈问题。研究表明,多西紫杉醇的口服生物利用度差除了其水溶性差之外,主要由于胃肠道中P-糖蛋白(P-gp)的外排以及肠或肝上细胞色素P-4503A4酶的代谢,使得多西紫杉醇很难跨过胃肠道屏障。P-gp的外排泵作用使多西紫杉醇吸收入血减少。研究者们采用了很多策略来提高多西紫杉醇的生物利用度,但是目前仍没有理想的多西紫杉醇口服剂型。
第三,多西紫杉醇对多种类型的肿瘤病人复发后治疗上表现出明显的多药耐药性,主要是由于ABC转运蛋白家族的过度表达(尤其是P-糖蛋白),使得抗肿瘤药物被耐药肿瘤细胞外排后,从而降低了肿瘤细胞内的药物浓度。
随着中药在临床方面研究的深入,中药单体作为P-gp、CYP抑制剂或者诱导剂的运用,具有其低毒副作用的特点,有利于与多西紫杉醇配伍组合成复方口服制剂。虽然有中药单体与多西紫杉醇配伍制成的复方制剂(药物组合物)的报道,但是基本是单体药物的简单混合,由于中药单体活性成分和多西紫杉醇的本身的难溶性,影响了疗效的发挥。也有文献报道制备成脂质体纳米粒、固体纳米粒提高其溶解度,但是载药量过低或不稳定,不能很好发挥其疗效。
因此,研发出一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用,用于解决现有技术中,多西紫杉醇类抗肿瘤药物存在着生物利用度低、毒性大以及易出现耐药性的技术缺陷,成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用,用于解决现有技术中,多西紫杉醇类抗肿瘤药物存在着生物利用度低、毒性大以及易出现耐药性的技术缺陷。
本发明提供了一种组合物,所述组合物的原料包括:多西紫杉醇、中药单体以及载体;
所述中药单体包括:槲皮素、姜黄素、大黄素、蛇床子素、芹菜素、黄芩素、山奈酚以及水飞蓟素中的一种或多种;
所述载体为第一载体和/或第二载体,所述第一载体为聚乙二醇-聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯(商品名soluplus),所述第二载体为聚乙二醇1000-维生素E-琥珀酸酯(商品名TPGS1000)。
优选地,以质量份计,所述组合物的原料包括:多西紫杉醇1~10份、中药单体1~20份以及载体10~200份。
优选地,以质量份计,所述中药单体包括:槲皮素0~30份、姜黄素0~30份、大黄素0~30份、蛇床子素0~30份、芹菜素0~30份、黄芩素0~30份、山奈酚0~30份以及水飞蓟素0~30份中的一种或多种;
以质量份计,第一载体第二载体的投料比为(10~100):(0.01~2)。
本发明还提供了一种包括以上任意一项所述组合物的纳米胶束的制备方法,所述制备方法为:
步骤一、溶解:多西紫杉醇、中药单体以及载体混合后,溶解于有机溶剂中,得第一产物;
步骤二、成膜:蒸发除去所述第一产物中的有机溶剂,得第二产物,所述第二产物在反应所用容器壁上成膜;
步骤三:水化处理:向所述第二产物加入去离子水,水化处理,得纳米胶束产品。
优选地,所述制备方法还包括:过滤,所述过滤步骤在所述步骤三之后进行;
水化处理完成后,再经过滤步骤,得纳米胶束产品;所述过滤步骤的方法为0.2μm孔径过滤。
优选地,步骤一中,所述有机溶剂选自:氯仿、二氯甲烷、甲醇或丙酮中的任意一种;
多西紫杉醇、中药单体以及载体三者的混合物与所述有机溶剂的投料比为(1~10):(15~50)g/ml。
优选地,步骤三中,所述水化处理的方法为:涡旋,在室温下磁力搅拌0.3~48h。
优选地,所述纳米胶束产品的粒径为65nm。
本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的组合物或以上任意一项所述制备方法得到的产品在抑制肿瘤细胞增殖和/或存活中的应用。
优选地,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。
综上所述,本发明提供了一种组合物,所述组合物的原料包括:多西紫杉醇、中药单体以及载体;所述中药单体包括:槲皮素、姜黄素、大黄素、蛇床子素、芹菜素、黄芩素、山奈酚以及水飞蓟素中的一种或多种;所述载体为第一载体和/或第二载体,所述第一载体为聚乙二醇-聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯,所述第二载体为聚乙二醇1000-维生素E-琥珀酸酯。本发明还提供了一种含有上述组合物的纳米胶束的制备方法,本发明还提供了上述组合物或上述制备方法得到的产品在抑制肿瘤细胞增殖和/或存活中的应用。经实验测定可得,本发明提供的技术方案制得的产品,口服给药后具有明显的抗肿瘤活性,生物利用度高、可明显降低给药量,还可克服多西紫杉醇单独使用时产生的耐药性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中,多西紫杉醇的化学结构式;
图2为本发明实施例中,载体soluplus的化学结构式;
图3为本发明实施例中,载体TPGS1000的化学结构式;
图4为实施例4中,MCF-7/Adr细胞对不同纳米制剂的摄取;
图5为实施例5中,功能化多西紫杉醇复方纳米胶束与其它对照制剂对人耐药性乳腺癌细胞MCF-7/adr细胞诱导凋亡效应。
具体实施方式
本发明提供了一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用,用于解决现有技术中,多西紫杉醇类抗肿瘤药物存在着生物利用度低、毒性大以及易出现耐药性的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
为了更详细说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种组合物及含有该组合物的纳米胶束与应用,进行具体地描述。
实施例1
10g多西紫杉醇、5g中药单体1以及200g载体1混合均匀后,溶解于50ml有机溶剂1中,得第一产物1。旋转蒸发除去第一产物中1的有机溶剂1,得第二产物1,第二产物1在反应所用容器壁上形成薄膜。向第二产物1加入去离子水10ml,室温下磁力搅拌10h进行水化处理,得纳米胶束产品1。在制备产品1中,中药单体1为姜黄素(CUR),载体1由196g soloplus和4g TPGS1000混合组成;所得产品1的粒径为62.04±0.16nm。
5g多西紫杉醇、6g中药单体2以及150.2g载体2混合均匀后,溶解于40ml有机溶剂2中,得第一产物2。旋转蒸发除去第一产物中2的有机溶剂2,得第二产物2,第二产物2在反应所用容器壁上形成薄膜。向第二产物2加入去离子水10ml,室温下磁力搅拌40h进行水化处理后,过0.2μm滤膜过滤,过得纳米胶束产品2。在制备产品2中,中药单体2为1.5g大黄素、1.5g芹菜素和3g水飞蓟素混合组成,载体2由150g soloplus和0.2g TPGS1000混合组成;所得产品2的粒径为60.08±0.09nm。
5g多西紫杉醇、10g中药单体3以及100g载体3混合均匀后,溶解于30ml有机溶剂3中,得第一产物3。旋转蒸发除去第一产物中3的有机溶剂3,得第二产物3,第二产物3在反应所用容器壁上形成薄膜。向第二产物3加入去离子水10ml,室温下磁力搅拌20h进行水化处理,得纳米胶束产品3。在制备产品3中,中药单体3由3g槲皮素、1g黄岑素和2g山奈酚组成,载体3由98g soloplus和2g TPGS1000混合组成;所得产品3的粒径为59.89±0.22nm。
1g多西紫杉醇、1g中药单体4以及10g载体4混合均匀后,溶解于20ml有机溶剂4中,得第一产物4。旋转蒸发除去第一产物中4的有机溶剂4,得第二产物4,第二产物4在反应所用容器壁上形成薄膜。向第二产物4加入去离子水10ml,室温下磁力搅拌0.5h进行水化处理,得纳米胶束产品4。在制备产品4中,中药单体4为大黄素,载体4由9.95g soloplus和0.05g TPGS1000混合组成;所得产品4的粒径为61.37±0.15nm。
5g多西紫杉醇、8g中药单体5以及120g载体5混合均匀后,溶解于40ml有机溶剂5中,得第一产物5。旋转蒸发除去第一产物中5的有机溶剂5,得第二产物5,第二产物5在反应所用容器壁上形成薄膜。向第二产物5加入去离子水10ml,室温下磁力搅拌48h进行水化处理,得纳米胶束产品5。在制备产品5中,中药单体5由3g蛇床子素和3g芹菜素组成,载体5由100g soloplus和20g TPGS1000混合组成;所得产品5的粒径为63.27±0.06nm。
本实施例所得的产品1~5中,产品的粒径均小于65nm,可明显提高多西紫杉醇的细胞内摄取,所制得的产品1~5均可以穿透肿瘤细胞。
实施例2
本实施例为测定实施例1制得的产品1~产品5物理性质的具体实施例。2.1外形观察
采用纳米粒径测定仪测定产品1~产品5的Zeta电位,采用透射电镜观察制备的产品1~产品5的形状。
2.2胶束中多西紫杉醇的含量
胶束中多西紫杉醇的含量用高效液相色谱法测定。用十八烷硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(Phenomenex;4.6×250mm,5μm),乙腈-水(47:53,v/v)为流动相,温度为30℃,检测波长为227nm,流速为1mL/min测定。精密量取制备的产品1~产品5,用9倍体积的甲醇破坏。取出20μL进样,用HPLC法测定胶束中多西紫杉醇的含量。
2.3包封率及载药量
包封率%=(纳米胶束产品中多西紫杉醇的量/多西紫杉醇加入量)×100%
载药量%=[纳米胶束产品中多西紫杉醇的量/(多西紫杉醇加入量+纳米胶束载体材料)]×100%。
2.4释放速率
产品1~产品5从纳米胶束产品中的释放速率用释放百分数来表示,采用透析法测定。产品加入1mL蒸馏水混匀后放入透析袋(截留分子量为12,000-14000)内,将透析袋两端扎紧后置于150.0mL释放介质中,在37℃、100rpm的条件下在摇床上振荡。释放介质分别为pH1.2溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液和pH7.4磷酸盐缓冲液,分别于0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h和48h时取出0.5mL释放介质,并每次取样后立即补入同等体积的新鲜释放介质。此处,pH1.2溶液即为模拟不含酶的胃液环境,pH6.8和pH7.4溶液即为模拟不含酶的肠液环境。
按照上述释放速率的测定方法,同时测定产品1~产品5制成注射剂的释放速率。(以上市注射剂Taxotere产品,作为对照)
以释放液为空白对照,HPLC测定多西紫杉醇含量,并用下式计算多西紫杉醇的释放率:释放率%=(Wi/Wtotal)×100%,Wi为第i个时间点在释放介质中测得的多西紫杉醇量,Wtotal为释放实验前加入的多西紫杉醇总量。
2.5实验结果与分析
所得实验结果请参阅表1和表2。
表1
表2为产品1~产品5在的体外释放曲线。
表2
从表2中可以得出,在前2h内,产品1-产品5纳米胶束在释放介质中的释放率不到6%,48h内在释放介质中的释放率不超过35%。然而,Taxotere注射剂12h内在释放介质中的释放率75%。相对于Taxotere注射剂,产品1-产品5纳米胶束均有明显的缓释行为。纳米胶束剂型的缓释率小于注射剂。
从本实施例所得的数据可以得出,本发明制得的产品,具有明显的缓释特性,将使制备的纳米制剂在体内缓慢释放,降低药物的毒副作用优点。
实施例3
本实施例为产品1~产品5的细胞毒性试验测定。
取对数生长期的人源乳腺癌MCF-7细胞和耐药人源乳腺癌MCF-7/Adr细胞,0.25%胰酶消化后,用培养基洗涤2遍,以5×103个/孔的量(180μL细胞悬液)接种到96孔细胞培养板上,设6个复孔,于37℃、5%CO2的培养箱孵育24h。
按下述方式加药,其中,下述内容括号中的浓度都指加到96孔板中被稀释后的终浓度。
(a)、取不加药等量培养基,加入到96孔培养板中,作为空白对照;
(b)、加入一系列浓度的空白纳米胶束(Blank-TPGS-PMs)(0、0.01、0.1、1、5、10、20mg/mL);
(c)、加入一系列浓度的游离多西紫杉醇(DTX)(0、0.01、0.1、1、2、5、10μM);
(d)、加入一系列浓度的游离姜黄素(CUR)(0、0.01、0.1、1、2、5、10μM);
(e)、加入一系列浓度的游离多西紫杉醇和姜黄素混合物(DTX+CUR)(0、0.005+0.005、0.05+0.05、0.5+0.5、1+1、2.5+2.5、5+5μM);
(f)、加入一系列浓度的普通多西紫杉醇纳米胶束(DTX-PMs)(0、0.01、0.1、1、2、5、10μM);
(g)、加入一系列浓度的抗耐药多西紫杉醇纳米胶束(DTX-TPGS-PMs)(0、0.01、0.1、1、2、5、10μM);
(h)、加入一系列浓度的产品1(DTX-CUR-TPGS-PMs)(0、0.005+0.005、0.05+0.05、0.5+0.5、1+1、2.5+2.5、5+5μM)。
细胞孵育48h结束后,取出培养板,弃去培养液,每孔加入200μL预冷的三氯乙酸(TCA,10%),在4℃冰箱中放置1h固定细胞。然后培养板各孔用蒸馏水洗涤5遍,以去除三氯乙酸。在空气中自然干燥后,每孔加0.4%的SRB染液100μL,室温下放置20min,弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍,以去除未结合的染料,空气中干燥后每孔加入10mmol/LTrisbase(pH10.5)200μL溶解,在平板振荡器(脱色摇床)上振荡30min,至染料全部溶解。
将96孔板放入酶标仪中,于540nm波长下测定每孔光密度值(opticaldensity,OD)。采用经过加药培养以后细胞的存活百分数(Cellsμrvivalrate,%)来评价各种各制剂组对两种乳腺癌细胞的毒性作用。细胞存活百分数按照如下公式计算:Cellsμrvivalrate(%)=(药物处理后的吸光度值540nm)/(空白对照孔的吸光度值540nm)×100%。
表3 MCF-7的细胞存活率
表4 MCF-7/Adr的细胞存活率
从表3和表4可以得出,在乳腺癌MCF-7细胞系中,与多西紫杉醇和姜黄素单独或联合应用对MCF-7细胞和MCF-7/adr细胞的生长抑制作用相比,产品1对MCF-7细胞均具有明显的抑制效应,其中纳米胶束产品1在不同浓度下均表现出对MCF-7细胞更强的抑制效应。
在耐药性乳腺癌MCF-7/adr细胞系中,除产品1外,其余组别对MCF-7/Adr细胞的增殖几乎没有抑制作用,显示了明显的耐药性,而产品1可以在很大程度上克服MCF-7/Adr细胞的多药耐药,在不同浓度下均表现出对MCF-7/Adr细胞具有最强的抑制效应。
对产品2~产品5依次重复上述实验,可得到与产品1类似的实验效果,在此不再赘述。
从本实施例可以得出,本发明制得的产品,具有抗肿瘤作用,尤其是对于耐药细胞,也具有良好的抗肿瘤效果。
实施例4
本实施例为测定MCF-7/Adr对产品1~产品5摄取研究
4.1激光共聚焦摄取实验
罗丹明-123(Rh123)是一种常见的细胞染料,可以定向富集活细胞线粒体,呈现黄绿色荧光。由于其良好的生物相容性,Rh123对细胞生长无明显的抑制作用,此外,Rh123也是P-糖蛋白(P-gp)的底物。此实验中,采用Rh123替代多西紫杉醇,作为模型药物,考察制剂对细胞摄取的影响。
采用激光共聚焦法研究MCF-7/Adr乳腺癌细胞对纳米胶束的定性摄取。将MCF-7/Adr细胞接种于玻底培养皿中,在37℃、5%CO2培养箱中孵育24h,贴壁生长至60%汇集。
在不同的玻底培养皿中分别加入游离罗丹明(Rh123)、Rh123+CUR、Rh123-PMs、Rh123-TPGS-PMs和Rh123-CUR-TPGS-PMs,其中,单药制剂中Rh123终浓度均为10.0μM,双药制剂中Rh123终浓度均为5.0μM,CUR终浓度均为5.0μM;空白培养基作为空白对照。
置二氧化碳培养箱中,37℃培养4h,依次用冰冷PBS漂洗三次,然后用10.0μM的Hoechst33342(激发波长350nm,发射波长461nm)进行细胞核染色30min,PBS漂洗三次。
用激光共聚焦显微镜(LeicaTCSSP2)以488nm波长的激光束激发ADM(激发波长488nm,发射波长510-540nm)进行图像分析。
从图像分析中可以看出,对于MCF-7/Adr细胞,游离罗丹明-123的荧光强度最弱,几乎检测不到;相比之下,在三种Rh123标记的纳米胶束中,给予Rh123标记的产品1的MCF-7/Adr细胞内荧光信号最强。
对产品2~产品5依次重复上述实验,所得结果与产品1相同。
4.2流式摄取实验
采用流式细胞仪探究乳腺癌MCF-7/Adr细胞中对纳米胶束的摄取情况。
将MCF-7/Adr细胞以3×105个/孔的浓度接种到12孔细胞培养板中,培养液体积为1.8mL,并在5%CO2、37℃的条件下培养24h。在不同孔中分别加入游离Rh123、Rh123-CUR、Rh123-PMs、Rh123-TPGS-PMs和Rh123-CUR-TPGS-PMs,其中,单药制剂中Rh123终浓度均为10.0μM,双药中Rh123终浓度均为5.0μM,CUR终浓度均为5.0μM,空白培养作为空白对照,孵育细胞4h。
给药孵育后,吸取培养基,放入15mL离心管中,用冷的PBS洗两次,弃去洗液,将细胞用0.25%胰蛋白酶0.5mL消化1.5min,加培养基1.5mL终止消化。
吸取溶液转移上述15mL离心管中,再用PBS洗2次,将洗液倒入上述15mL离心管中,1000rpm离心5min,收集细胞,在15mL离心管中加入冰0.3mLPBS吹打成细胞悬液,过筛网,转移到流式管中。
细胞摄取量用流式细胞仪测定,荧光强度(测定的激发波长为468nm,发射波长为560nm)表示细胞摄取量的大小。每个样品收集细胞数104个,每个实验重复三次。
其结果见图4。MCF-7/Adr细胞对不同纳米制剂的摄取。从图4中可以看出,在孵育时间为4h时,MCF-7/Adr细胞给予游离Rh123、Rh123+CUR、Rh123-PMs、Rh123-TPGS-PMs和Rh123-CUR-TPGS-PMs后,细胞内Rh123的摄取量比其他制剂分别提高了108.72,189.57,54.73和0.97倍。结果表明,MCF-7/Adr细胞对功能化多西紫杉醇复方纳米胶束的摄取量最大。
对产品2~产品5依次重复上述实验,所得结果与产品1相同,在此不再赘述。
从本实施例所得的数据可以得出,本发明制得的产品,克服了P-gp抑制作用,促进细胞对药物的摄取,可克服多药耐药性,具有适用于多药耐药肿瘤优点。
实施例5
本实施例为测定产品1~产品5对肿瘤细胞凋亡效应的具体实施例。
采用流式细胞仪探究制剂诱导MCF-7/Adr细胞凋亡情况。将MCF-7/Adr细胞以3×105个/孔的浓度接种到6孔细胞培养板中,培养液体积为1.8mL,并分别在5%CO2、37℃的条件下培养24h。
每孔加入0.2mL培养液,孵育细胞12h,分别加入游离DTX、游离DTX+CUR、DTX-PMs、DTX-TPGS-PMs和产品1,其中,单药制剂中DTX终浓度均为5.0μM,双药制剂中DTX终浓度均为2.5μM,CUR终浓度均为2.5μM。空白培养基作为空白对照组。
给药孵育后,吸取培养基,PBS洗涤2遍,弃去洗液,不含EDTA胰酶消化细胞,收集细胞,分散于300ul的Bindingbuffer中,加入10ul的AnnexinV-kFluor647,室温避光孵育15min,上机前10min加入10ulSYTOXGreen,使其终浓度合适,尽快使用流式仪测量104个细胞内的荧光强度。
本实施例中,使用2mM双氧水处理细胞2h作为阳性对照,并用AnnexinV-kFluor647与SYTOXGreen单标。使用单标样本数据在流式分析软件上设置合理的十字门,并进行数据处理。
图5所示为功能化多西紫杉醇复方纳米胶束与其它对照制剂对人耐药性乳腺癌细胞MCF-7/adr细胞诱导凋亡效应。
本实施例中,产品1诱导细胞凋亡的效果是其他制剂的54.75、28.08、15.26、22.47和1.99倍。
对产品2~产品5依次重复上述实验,所得结果与产品1相同。
从本实施例所得的数据可以得出,本发明制得的产品,具有较强的诱导MCF-7/Adr细胞诱导凋亡作用优点。
实施例6
本实施例为测定产品1~产品5对肿瘤细胞凋亡效应的具体实施例。
6.1 7,12-二甲基苯蒽(DMBA)诱发乳腺癌模型建立
给雌性SD大鼠(45-50天,150g)灌胃7,12-二甲基苯蒽(DMBA)诱发乳腺癌。将DMBA溶于大豆油中配制为10mg·mL-1,以45mg·kg-1剂量,每间隔3周灌胃1次,共3次。实验开始第2周用手触摸检查乳腺组织,以发现可触及的乳腺肿块,记录肿瘤出现的时间和数目。用游标卡尺测量肿块的长度和宽度,计算肿瘤体积。
6.2动物分组及给药
将荷瘤小鼠随机分为模型对照组(生理盐水Saline,灌胃)、阳性对照组Taxotere(TAX,10mg/kgDTX,静脉注射)、产品1-TPGS-PMs(5mg/kgDTX,口服)、产品2-TPGS-PMs(5mg/kgDTX,口服)、产品3-TPGS-PMs(5mg/kgDTX,口服)、产品4-TPGS-PMs(5mg/kgDTX,口服)以及产品5-TPGS-PMs(5mg/kgDTX,口服)共7组,每组7只。最后一次给DMBA10周后灌胃给药治疗,共给药30天,记录肿瘤大小。
造模后,给药前测量肿瘤的体积大小,第一天记录为100%,给药后隔天测量一次肿瘤的体积变化,考察30天,比较不同组老鼠负载肿瘤体积的变化,计算抑瘤率。同时,记录考察大鼠体重的变化,考察药物毒性的影响。
6.3实验结果
以DMBA诱导法在体内建立乳腺癌肿瘤模型,对各组老鼠的肿瘤体积比较并计算各组的抑瘤率,所得抑瘤率结果请参阅表2。
表5
产品1 | 产品2 | 产品3 | 产品4 | 产品5 | 阳性对照药 | 空白对照 | |
抑瘤率 | 75.56 | 74.67 | 74.86 | 75.13 | 74.63 | 74.41 | / |
从表2可以得出,产品1~产品5对肿瘤生长的抑制效果明显,其抑瘤作用要强于阳性对照药Taxotere。
观察给药期间荷瘤大鼠的体重变化,阳性对照药组的体重明显低于实验组,实验组的大鼠的体重并没有显著下降,说明本发明制得的产品能一定程度地降低化疗药物的毒性,产品1~产品5在大鼠体内毒性较低。
值得一提的是,实施例6中,实验组中,DTX给药量为注射剂的给药量的一半,而且口服后抗肿瘤效果与注射Taxotere无显著性差异,同时实验组还大大降低了药物的毒副作用。
从本实施例所得的数据可以得出,本发明制得的产品,具有良好的抗肿瘤效果,同时降低了药物给药量,进一步地,降低了药物的毒副作用。
实施例7
本实施例为测定药物代谢情况的具体实施例。
将250g雌性SD大鼠10只随机分成2组,每组5只;第1组大鼠口服灌胃产品1,第2组大鼠口服灌胃Taxotere(自制,20mg,DTX用Tween80溶后再加入13%乙醇溶解,给药前再用生理盐水稀释至合适浓度),各组按DTX的50mg/kg剂量给药。
在给药后的0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h各时间点依次从大鼠眼眶静脉丛取血,0.3ml~0.5ml/次,取出的血置于已肝素化的1.5ml EP管中,于3000rpm离心15min,上清液转移至新的EP管并置于-20℃冰箱中冷冻保存,待测。
色谱条件:色谱柱:依利特(C18,5μm,4.6mm×250mm);流动相:乙腈-水(47:53);柱温:室温;检测波长:230nm;进样量:40ul;流速:1.0
血浆样品的处理方法:取120ul含药物血浆样品于离心管中,加入1ml叔丁基甲醚,涡旋5min,于高速离心机中12000rpm离心15min,将上清移入新的离心管中,并挥去叔丁基甲醚,残余物加入120ul甲醇复溶,涡旋5min,于12000rpm离心15min,取上清40ul进样分析。
计算给药后不同取样时间点的药物浓度,所得结果请参阅表6。
表6
从表6可得出:(1)、产品1组的血药浓度都高于Taxotere组,表明产品1可提高药物的生物利用度;(2)、产品1组在给药36h后依然可测出血浆药物浓度,而Taxotere组检测不出给药8h后的药物浓度,这是因为产品1可延长药物在体内的释放,减少药物的代谢,从而延长药物的体内循环时间。
对产品2~产品5重复上述实验,得到与产品1类似的实验结果,在此不再赘述。
利用药代动力学分析软件DAS2.0对测得的各时间点对应的血药浓度进行分析、处理,得到表7所示的各组药代动力学参数,从而更清楚的了解产品1在大鼠体内的药代动力学情况。
表7药物代谢动力学参数(Mean±SD,n=5)
Parameters | Taxotere | 产品1 |
T<sub>max</sub>(h) | 1.8±0.45 | 1.8±0.45 |
C<sub>max</sub>(ng/mL) | 490.3±91.53 | 632.1±61.09<sup>*</sup> |
AUC(h·ng/mL) | 5402.2±2073.39 | 31029.4±367.69<sup>*</sup> |
T<sub>1/2</sub>(h) | 7.5±3.78 | 44.6±27.81 |
MRT(h) | 12.7±4.71 | 67.2±38.00 |
如表7所示,分别对大鼠进行单剂量口服灌胃Taxotere和产品1后,测得各组药物的达峰浓度分别为(490.27±91.53)ng/mL和(632.07±61.09)ng/mL。
显然,产品1的达峰浓度比Taxotere组高,这也暗示了药物通过功能化复方纳米胶束载体提高了药物的口服生物利用度;当达到与Taxotere组具有相同的血药浓度,只需口服少半量的载药聚合物胶束就可满足.
Taxotere和产品1的半衰期分别为:(7.49±3.78)h和(44.62±27.81)h,经计算发现产品1组的半衰期为Taxotere组的6倍,这表明产品1大大降低了药物在体内的代谢速率,提高药物的体内循环时间,从而增加药物的作用时间,充分发挥药物效应。
对产品2~产品5重复上述实验,得到与产品1类似的实验结果,在此不再赘述。
从实施例2~实施例7可以得出,本发明提供的技术方案制得的产品,具有以下优点:
第一,在口服给药后对DMBA诱导乳腺癌瘤具有明显抗肿瘤活性;
第二,可有效提高多西紫杉醇的生物利用度,明显的降低多西紫杉醇给药剂量,复方中多西紫杉醇给药量是单剂量注射剂给药量的一半;
第三,可克服耐药性乳腺癌的多药耐药性,适用于多药耐药肿瘤;
第四,能在一定程度上降低不良反应,可用于众多的癌症病人;
第五,口服制剂服用方便,比当前的静脉注射剂型有更大的优越性,在肿瘤治疗领域将有广阔的应用前景。
综上所述,本发明提供了一种组合物,所述组合物的原料包括:多西紫杉醇、中药单体以及载体;所述中药单体包括:槲皮素、姜黄素、大黄素、蛇床子素、芹菜素、黄芩素、山奈酚以及水飞蓟素中的一种或多种;所述载体为第一载体和/或第二载体,所述第一载体为聚乙二醇-聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯,所述第二载体为聚乙二醇1000-维生素E-琥珀酸酯。本发明还提供了一种含有上述组合物的纳米胶束的制备方法,本发明还提供了上述组合物或上述制备方法得到的产品在抑制肿瘤细胞增殖和/或存活中的应用。经实验测定可得,本发明提供的技术方案制得的产品,口服给药后具有明显的抗肿瘤活性,生物利用度高、可明显降低给药量,还可克服多西紫杉醇单独使用时产生的耐药性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种纳米胶束产品,其特征在于,以质量份计,所述纳米胶束产品的原料包括:多西紫杉醇1~10份、中药单体1~30份以及载体10~200份;
所述中药单体包括:槲皮素、姜黄素、大黄素、蛇床子素、芹菜素、黄芩素、山奈酚以及水飞蓟素中的一种或多种;
所述载体为soloplus和TPGS1000的混合物,soloplus和TPGS1000的质量比为(10~100):(0.01~2);
所述纳米胶束产品为均匀球形,所述纳米胶束产品的粒径小于65nm。
2.根据权利要求1所述的纳米胶束产品,其特征在于,以质量份计,所述中药单体包括:槲皮素0~30份、姜黄素0~30份、大黄素0~30份、蛇床子素0~30份、芹菜素0~30份、黄芩素0~30份、山奈酚0~30份以及水飞蓟素0~30份中的一种或多种。
3.权利要求1或2所述的纳米胶束产品的制备方法,其特征在于,所述制备方法为:
步骤一、溶解:多西紫杉醇、中药单体以及载体混合后,溶解于有机溶剂中,得第一产物;
步骤二、成膜:蒸发除去所述第一产物中的有机溶剂,得第二产物,所述第二产物在反应所用容器壁上成膜;
步骤三:水化处理:向所述第二产物加入去离子水,水化处理,得纳米胶束产品。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括:过滤,所述过滤步骤在所述步骤三之后进行;
水化处理完成后,再经过滤步骤,得纳米胶束产品;所述过滤步骤的方法为0.2μm孔径过滤。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法,其特征在于,步骤一中,所述有机溶剂选自:氯仿、二氯甲烷、甲醇或丙酮中的任意一种;
多西紫杉醇、中药单体以及载体三者的混合物与所述有机溶剂的投料比为(1~10):(15~50)g/ml。
6.根据权利要求3或4所述的制备方法,其特征在于,步骤三中,所述水化处理的方法为:涡旋,在室温下磁力搅拌0.3~48h。
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Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101972480A (zh) * | 2010-01-19 | 2011-02-16 | 南京泛太化工医药研究所 | 以氨基酸为稳定剂的多西他赛聚合物胶束药物组合物 |
WO2012063182A1 (en) * | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Cadila Pharmaceuticals Limited | Pharmaceutical composition of taxoids |
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CN104844790A (zh) * | 2014-02-19 | 2015-08-19 | 沈阳药科大学 | 聚乙二醇维生素e琥珀酸酯-胆固醇碳酸酯及其制备方法和应用 |
CN105816423A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-08-03 | 福建康是美生物科技有限公司 | 依达拉奉剂型 |
CN105816427A (zh) * | 2015-01-07 | 2016-08-03 | 苏州雷纳药物研发有限公司 | 一种姜黄素胶束载药系统及其制备方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101972480A (zh) * | 2010-01-19 | 2011-02-16 | 南京泛太化工医药研究所 | 以氨基酸为稳定剂的多西他赛聚合物胶束药物组合物 |
WO2012063182A1 (en) * | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Cadila Pharmaceuticals Limited | Pharmaceutical composition of taxoids |
CN104758255A (zh) * | 2014-01-08 | 2015-07-08 | 苏州雷纳药物研发有限公司 | 一种姜黄素胶束载药系统及其制备方法 |
CN104844790A (zh) * | 2014-02-19 | 2015-08-19 | 沈阳药科大学 | 聚乙二醇维生素e琥珀酸酯-胆固醇碳酸酯及其制备方法和应用 |
CN105816427A (zh) * | 2015-01-07 | 2016-08-03 | 苏州雷纳药物研发有限公司 | 一种姜黄素胶束载药系统及其制备方法 |
CN105816423A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-08-03 | 福建康是美生物科技有限公司 | 依达拉奉剂型 |
WO2017157350A1 (zh) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 福建天泰医药科技有限公司 | 依达拉奉剂型 |
CN105884719A (zh) * | 2016-04-14 | 2016-08-24 | 沈阳药科大学 | 紫杉烷类前药的制备和应用 |
CN107308133A (zh) * | 2016-04-27 | 2017-11-03 | 周意 | 姜黄素药物制剂 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Box-Behnken效应面法优化mPEG-PDLLA多烯紫杉醇/白藜芦醇载药胶束处方;郭雄等;《沈阳药科大学学报》;20160330;第33卷(第3期);第186-193页 * |
Curcumin-Loaded Mixed Micelles: Preparation,Characterization, and In Vitro Antitumor Activity;Suping Ji等;《Journal of Nanotechnology》;20180315;文章ID9103120, 9页 * |
Novel Soluplus-TPGS mixed micelles for encapsulation of paclitaxel;Ezequiel Bernabeu等;《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》;20160107;第140卷;第403-411页 * |
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