CN104225612A

CN104225612A - 一种基于天然p-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备及其应用

Info

Publication number: CN104225612A
Application number: CN201410214718.0A
Authority: CN
Inventors: 姚静; 周建平; 王晓颖
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明涉及一种基于天然P-糖蛋白(P-gp)抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备方法及其应用。其制备方法为：通过化学偶联，将具有P-gp外排抑制作用的天然小分子接枝到壳聚糖衍生物上，合成了一种具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促进剂。其具有以下特征：(1)具有P-gp外排抑制作用的小分子与壳聚糖衍生物偶联后，合成的偶联物具有P-gp外排抑制功能，能够通过抑制P-gp的外排促进药物在胃肠道的吸收。(2)合成的偶联物可以单独作为高分子新药。(3)合成的偶联物具有两亲性，可以在水中自组装形成胶束，包载疏水性抗肿瘤药物，增加药物水溶性，增加胃肠道对药物的摄取，提高药物生物利用度。本发明制备方法简单，成本较低，适用于大规模连续生产。

Description

一种基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备及其应用

技术领域：本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备方法及其在促进抗肿瘤药口服吸收中的应用。

背景技术：

随着社会的城市化、工业化发展，环境污染及各类食品添加剂的增多，以及人们不良生活方式和行为习惯的影响，恶性肿瘤已成为严重威胁人类生命健康及带给家庭、社会沉重负担的重大疾病之一。恶性肿瘤的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势。目前，化疗的给药方式以静脉注射为主，而由于受到药物生物利用度低的限制，口服给药发展较缓慢。

口服给药使用方便，顺应性好，易于被患者接受，尤其需长期治疗的疾病，口服给药是首选的给药方式。但口服给药易受到药物的溶解性、渗透性、胃肠道环境、肠道P-糖蛋白(P-gp)外排及肝脏代谢系统等影响。提高药物的溶解度，确保药物在胃肠道pH及各种生物酶环境中稳定，以及抑制P-gp外排是提高口服疗效的有效方法。P-gp是由多药耐药基因mdr-1的表达、位于细胞膜上的药物外排泵，其大量存在于肠道上皮细胞及肿瘤细胞表面，是抗肿瘤药物口服生物利用度低、肿瘤治疗中产生多药耐药性的主要原因。利用P-gp抑制剂可以明显减少肠道细胞对药物的外排，可以提高体内血药浓度。综合以上，具有P-gp抑制作用的口服吸收促进剂成为提高口服药物生物利用度、增强抗肿瘤效果的有效方法。

自然界中存在多种天然的P-gp抑制剂。槲皮素是广泛存在于茶、洋葱、红酒及各类果蔬中的天然黄酮类化合物。近年来体外实验及动物实验研究表明，槲皮素能显著抑制多种癌细胞的生长的同时，还竞争性抑制MDR家族，P-gp，MRP1和BCRP的数量，及细胞色素P-450的CYP3A亚家族。槲皮素不仅可降低MDR细胞P-gp的表达量，并且可抑制P-gp的功能，从而达到对P-gp的表达和功能的双重抑制。研究显示，槲皮素可以通过直接抑制P-gp活性和表达，并对人宫颈癌KB-V₁耐药细胞株的P-gp进行抑制，从而提高了细胞对长春碱和紫杉醇的敏感。槲皮素也被证明可通过有效地干扰信号通路而下调P-gp的表达。大黄素属蒽醌类衍生物，是蓼科植物大黄、虎杖等中药的有效成分，具有众多生物活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等。大黄素可抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡并逆转肿瘤细胞多药耐药性。大黄素是活性氧生成器，通过产生活性氧和下调多药抗性相关蛋白1(MRP1)能提高顺铂对胆囊癌SGC-996细胞的灵敏度。大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用与抑制核苷转运及降低P-gp的功能和表达相关。大黄素通过下凋P-gp、凋亡抑制蛋白和存活素增强了A2780/taxol细胞对紫杉醇的敏感性。大黄素对QBC₉₃₉/ADM细胞的多药耐药性有逆转作用，其作用机理可能与人胆管癌细胞P-gp的表达有关，通过与化疗药物竞争性结合P-gp的结合位点发挥疗效。黄芩素是黄芩的干燥根中提取的有效成分之一，有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤等药理作用。黄芩素在非细胞毒剂量时能逆转A2780/ADM对ADM的耐药性，其逆转作用可能与降低P-gp药物外排功能、增加细胞内药物浓度有关。研究表明黄芩素衍生物4’-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌耐药细胞具有显著的耐药逆转作用，这种逆转作用可能是通过降低耐药基因表达、促进细胞凋亡实现的。白藜芦醇是存在于葡萄、花生和多种传统中药中的多酚类化合物，降血脂，抗炎，抗氧化，抑制肿瘤细胞增殖、转移和凋亡等生物学功能。白藜芦醇的抗MDR活性则是通过干预一系列的细胞内信号通路来实现的。白藜芦醇能下调核转录因子HIF-1α和多药耐药基因mdrl、MRPl的表达，并有浓度依赖性，提示缺氧环境中白藜芦醇可以下调多药耐药基因从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。白藜芦醇通过下调mdrl/P-gp表达逆转K562/ADM多药耐药细胞的凋亡抑制。白藜芦醇体外能诱导K562/AO₂细胞的凋亡，且呈一定的浓度依赖性，其作用机制可能与逆转mdrl mRNA基因表达有关。

壳聚糖是一种含氨基的多糖，化学名为β-(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有无毒、来源丰富、良好的生物相容性和生物可降解性等优点，作为生物材料在各领域中具有很大的吸引力，尤其在生物医学领域有着极广阔的前景。壳聚糖及其衍生物也是一种较好的口服吸收促进剂。大量实验证明壳聚糖具有黏膜黏附性，并通过对细胞内的F-actin和紧密联接蛋白ZO-1的重新分配调节对上皮细胞的紧密连接，对药物跨上皮黏膜细胞的透过有很强的促进作用。在作为药物载体时，其可以控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用。由壳聚糖和O-羧甲基壳聚糖组成的聚电解质复合物能够增强阿霉素在全部小肠段内的吸收，特别是空肠和回肠。羧甲基壳聚糖可以通过剥夺粘着连接中的C_a ²⁺产生瞬间可逆的细胞旁通透性的增强，因此能够作为一个吸收促进剂使用，其在胃肠道中的促吸收作用比壳聚糖还高1.7～3.3倍。

通过化学偶联的方法，将天然的具有P-gp外排抑制作用的天然小分子接枝到壳聚糖及其衍生物，合成了一种两亲性高分子偶联物，该偶联物由于构成材料的自身特点而同时具有P-gp抑制作用、生物黏附作用以及对药物跨上皮细胞调节作用，从而可促进药物在胃肠道的吸收，成为一种口服吸收促进剂。另外，由于该偶联物具有两亲性，能在水中自组装成纳米级聚合物胶束，可物理包载疏水性药物，增强药物的水溶性、在肠道中的渗透性，并且其在胃肠道中可被肠道上皮细胞和M细胞内吞而被吸收，进而提高药物生物利用度，增强药物疗效。该系统具有高效、低毒及缓释等特征，为抗肿瘤药的口服给药系统的发展起到推动作用。

根据以上设计思路，本专利通过化学偶联的方法，将具有P-gp外排抑制作用的天然小分子接枝到壳聚糖衍生物上，合成了一种具有P-gp外排抑制作用的两亲性偶联物。该偶联物具有以下特征：(1)具有P-gp外排抑制作用的小分子与壳聚糖衍生物偶联后，合成的高分子偶联物具有P-gp外排抑制功能，能够通过抑制P-gp的外排促进药物在胃肠道的吸收。(2)合成的具有P-gp外排抑制功能的高分子偶联物可以促进抗肿瘤药物的口服吸收。(3)将疏水性天然具有P-gp外排抑制功能的小分子物质接枝在壳聚糖衍生物的主链上可以增加其溶解度，生成的高分子偶联物可以单独作为高分子新药。(4)壳聚糖衍生物与疏水性具有P-gp外排抑制作用天然活性小分子物质偶联后，形成两亲性偶联物，可以在水中自组装形成胶束，可以物理包载疏水性抗肿瘤药物，增加药物水溶解，促进抗肿瘤药物等在胃肠道的吸收，提高生物利用度。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂。通过化学偶联的方法将具有P-gp外排抑制作用的天然活性小分子物质接枝到壳聚糖衍生物的主链上。由于壳聚糖衍生物本身具有促进药物口服吸收的作用，因此将天然的疏水性的具有P-gp外排抑制作用的小分子接枝到壳聚糖衍生物的主链上形成的两亲性高分子偶联物，兼具P-gp抑制作用、生物黏附作用及肠道上皮细胞的调节作用，成为一种口服吸收促进剂，既能增强了抗肿瘤药物在胃肠道内的吸收，同时也能够改善该类活性小分子物质的溶解性，并且可以提高该类活性小分子物质的抗肿瘤活性和P-gp抑制作用。本发明使具有口服吸收促进作用的壳聚糖衍生物和天然的具有P-gp外排抑制作用的小分子物质的应用具有更广阔的产业化前景。

本发明的另一个目的是提供上述基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂在促进抗肿瘤药物口服吸收的应用。

为了达到上述发明目的，本发明提供一种基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂，该口服吸收促进剂是在壳聚糖衍生物的羧基或经过衍生化形成的羧基上，通过化学偶联的方法，引入天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物质，所形成的高分子偶联物可促进抗肿瘤药物口服吸收，成为口服吸收促进剂，同时改善了天然活性小分子物质的溶解性。由于在带羧基的亲水性壳聚糖衍生物的主链上引入了疏水基团，增强了其两亲性，故该高分子偶联物能在水性介质中自组装成稳定的纳米胶束，可用作难溶性抗肿瘤药物的增溶载体或吸收促进剂，提高抗肿瘤药物的生物利用度。

所述的具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促进剂，其中天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物质，选自黄酮类槲皮素和黄芩素，蒽醌类物质大黄素，以及酚类物质白藜芦醇。

所述的壳聚糖衍生物包括：带羧基的壳聚糖衍生物(O-羧甲基壳聚糖，N，O-羧甲基壳聚糖，羧乙基壳聚糖、季铵化羧甲基壳聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖)。

所述的具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促进剂的制备使用下列方法：

含有羧基的壳聚糖衍生物溶于水，将具有P-gp外排抑制作用的小分子物质溶于适当的溶剂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，通过酯化反应将具有P-gp外排抑制作用的小分子物质接枝到天然高分子物质上。

所述的制备方法中，其中适当溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，四氢呋喃，二甲基亚砜或者上述溶剂的混合溶剂。

所述的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂，其中天然活性小分子物质具有P-gp外排抑制作用，在增加药物口服吸收利用度方面，尤其在促进P-gp底物药物的口服吸收方面，具有重要作用；高分子物质通过生物黏附及肠道上皮细胞的调节作用而具有口服吸收促进作用；二者结合后从不同角度促进口服抗肿瘤药物的胃肠道吸收。并且可以解决小分子物质溶解度小、生物利用度低等问题。

所述的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的合成以及胶束的具体制备方法如下：

一、基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的合成

将含有羧基的壳聚糖衍生物溶于水，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，活化天然高分子物质结构上的羧基；将具有P-gp外排抑制作用的小分子物质溶于适当的溶剂后加入上述高分子物质水溶液中；控制反应条件至反应完全，适当溶剂沉淀，抽滤得沉淀物，将沉淀物溶于水，探头超声分散、离心、过0.8μm的滤膜后置透析袋中，于水中透析72h，透析后的产物再次近探头超声、离心、过0.8μm的滤膜后，冷冻干燥，得基于天然P-gp抑制剂构建的口服吸收促进剂。

合成路线通式如下：

R₁＝CH₂，CH₂CH₂；R₂＝H，CH₂COOH，CH₂CH₂COOH，R₃＝H₂，HCH₂COOH，HCH₂CH₂COOH，H(CH₂)₆CH₃，(CH₃)₃；A-OH为槲皮素，黄芩素，大黄素，白藜芦醇。

步骤中所述的适当的有机溶剂，优选自N，N-二甲基甲酰胺，甲酰胺，四氢呋喃，二甲基亚砜，更优选为N，N-二甲基甲酰胺。

步骤中所述的控制反应条件，优选为冰浴反应30min，然后升至室温，反应12～72h，更优选为24h。根据天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物质对光的耐受性，选择是否避光反应。

步骤中所述的滤液的适当的沉淀溶剂，优选自丙酮，乙醇，甲醇，更优选为丙酮。

步骤中所述的天然活性小分子物质与高分子物质的适当比例优选为1∶0.5～2，更优选为1∶1。

步骤中所述的EDC·HCl和NHS的比例优选为1∶0.5～3，更优选为1∶1.4。

步骤中所述的探头超声时间优选为20～60min，更优选为30min。

步骤中所述的离心时间优选为5～20min，更优选为10min；离心转数优选为2000～4000rpm，更优选为3500rpm。

步骤中所述的所述的透析时间，优选为1～4d，更优选为3d。

二、基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备方法

将基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂与药学活性或药理活性分子或其制剂均匀混合，所述的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂在作为药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂的应用中的质量浓度为0.1～90％，优选为0.1～35％。

三、基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂胶束的制备方法

按每1ml水中溶解3～30mg的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的比例，将制得的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的纳米胶束。

四、以基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂作为载体制备含难溶性药物的胶束的制备方法

按每1ml水中溶解3～30mg的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的比例，将制得的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂溶于水中，搅拌下，将治疗有效量的难溶或微溶于水的药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明根据天然活性小分子物质结构的特征，利用简单的酯化反应，将天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物质接枝到壳聚糖衍生物的主链上，制备过程简单，操作容易，减少成本，提高效率，容易实现工业化。

(2)本发明将天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物质与亲水性的壳聚糖衍生物接枝在一起，合成高分子偶联物，两者从不同角度上促进抗肿瘤药物的吸收，可以达到协同的目的，具有更好的促吸收功能。

(3)本发明将疏水性的天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物质接枝到亲水性的壳聚糖衍生物的主链上，改善了天然小分子物质的溶解性，增加其生物利用度，可使其更好地发挥P-gp外排抑制作用。

(4)本发明提供的具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促进剂，可单独用作高分子新药，也可用作药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂，还可用作注射或口服给药的药学活性或药理活性分子的载体。所述药学活性或药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、黄酮类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类、维A酸类、环孢素类、二氢吡啶类、小檗碱类抗肿瘤药物中的任一物质或其衍生物。

附图说明：

图1：载抗紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的抗肿瘤活性考察(MTT法)

图2：羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物对紫杉醇的在体肠收的影响(n＝3)

*P＜0.05与紫杉醇对照组相比；**P＜0.01与紫杉醇对照组相比

图3：口服各PTX制剂(紫杉醇对照组，紫杉醇+维拉帕米，紫杉醇+羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物，紫杉醇+羧甲基壳聚糖和载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束)的血药浓度-时间曲线(n＝5)

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的合成

称取适量的羧甲基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入槲皮素的DMF溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶1.4)，反应30min后室温下反应，避光搅拌24h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析72h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物。

实施例2羧甲基壳聚糖-大黄素偶联物的合成

称取适量的羧甲基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入大黄素的乙醇溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶2)，反应30min后室温下反应，避光搅拌24h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析72h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得羧甲基壳聚糖-大黄素偶联物。

实施例3羧甲基壳聚糖-黄芩素偶联物的合成

称取适量的羧甲基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入黄芩素的DMF溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶3)，反应30min后室温下反应，避光搅拌12h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析72h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得羧甲基壳聚糖-黄芩素偶联物。

实施例4羧甲基壳聚糖-白藜芦醇偶联物的合成

称取适量的羧甲基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入白藜芦醇的甲醇溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶2)，反应30min后室温下反应，避光搅拌36h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析48h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000pm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得羧甲基壳聚糖-白藜芦醇偶联物。

实施例5羧乙基壳聚糖-大黄素偶联物的合成

称取适量的羧乙基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入姜黄素的甲醇溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶2.5)，反应30min后室温下反应，避光搅拌36h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析72h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得羧乙基壳聚糖-大黄素偶联物。

实施例6N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖-黄芩素偶联物的合成

称取适量的N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入槲皮素的甲醇溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶1.4)，反应30min后室温下反应，避光搅拌24h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析72h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心15min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖-黄芩素偶联物。

实施例7季铵化羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的合成

称取适量的季铵化羧甲基壳聚糖置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶涨过夜。冷水浴、搅拌下加入槲皮素的甲醇溶液，再加入DMAP(反应物质量的5％)，EDC和NHS(EDC∶NHS＝1∶3)，反应30min后室温下反应，避光搅拌24h。反应结束后，用丙酮沉淀反应产物，抽滤得沉淀，并用丙酮洗沉淀物至无色，然后用无水乙醇洗反应产物至无色。抽干溶剂后将反应产物溶解于水中，冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液转置于透析袋(MWCO 14000)中透析72h。透析结束后，将产物水溶液再次冰浴条件下探头超声20min后，3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得季铵化羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物。

实施例8基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂纳米胶束的制备与CMC值测定

1、基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂纳米胶束的制备：根据天然活性小分子物质的性质，考虑是否需要避光的条件下，该口服吸收促进剂18mg溶解在3ml水中，于室温搅拌0.5h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，即得。

2、芘是一种具有较强疏水性的稠环芳烃类化合物，其在水中的溶解度极小，约为1.0 10^-7mol/L。芘对环境极性的变化极敏感。当两亲性分子的浓度在CMC以下时，其在溶液中不能形成胶束，极微量的芘溶解在水的极性环境中；当两亲性分子的浓度达到CMC以上时，胶束形成，芘进入胶束疏水内核的非极性环境中，其荧光光谱会发生一系列变化，如荧光强度的增加，发射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure ofthe emission spectra)的变化，激发光谱中(0，0)波段红移，从333nm移至338nm。因此，通过以芘的激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃的比值对两亲性分子的对数浓度作图，图中斜率发生变化的点(即曲线拐点)即为形成胶束的临界点，所对应的浓度即为两亲性分子形成胶束的CMC值。结果见表1。由表可知，由疏水性的天然具有P-gp外排抑制作用的小分子与壳聚糖衍生物构建成的偶联物形成的纳米胶束，与小分子表面活性剂相比，临界胶束浓度很低，使其在生理条件下具有很好的稳定性，同时纳米级的粒径，可以使易于通过胃肠屏障及逃脱网状内皮系统，延长血浆半衰期。

表1基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂纳米胶束的表征

实施例9羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的取代度考察

羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物上接枝的槲皮素的含量通过紫外分光光度法测定。以甲醇为溶剂，于检测波长255nm处，绘制槲皮素含量与紫外吸收关系的标准曲线。精密称取羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物5mg，加蒸馏水溶解定容于5mL容量瓶中，吸取1mL，用甲醇稀释并定容至10mL，于255nm处测定其吸光度，代入标准曲线中，推算出取代度。羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的取代度用公式(1)计算得到：

其它口服吸收促进剂按相似方法进行测定取代度，测定结果见表2。

表2基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的取代度(w/w)

实施例10基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的溶解度考察

基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的溶解度考察方法：避光条件下，称取研成细粉的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂适量溶解在1mL水中，室温搅拌观察是否能完全溶解。

表3基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的溶解度

注：-几乎不溶++可以溶解+++溶解度较好++++易溶

实施例11包载药学活性或药理活性分子的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂纳米胶束的表征

1、基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂纳米胶束的制备：避光条件下，高分子偶联物18mg溶解在3ml水中，于室温搅拌0.5h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，即得。

2、粒径：将1制备得到纳米胶束，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(Malvem Instruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表4。

3、包载药学活性或药理活性分子的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂的载药量测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行载药量测定。色谱柱为Inertsil ODS-SP(4.6x250mm，5μm)，流动相为甲醇-水(65∶35)，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为227nm，进样量20μL。以公式(2)(3)计算载药胶束的包封率及载药量。结果见表4。

表4包载药学活性或药理活性分子的基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂纳米胶束的表征

实施例12MTT法测定载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的抗肿瘤活性

取HepG2细胞接种于96孔板中，5x10⁴个/孔，37℃孵育24h后，吸去培养液，分别加入不同浓度用培养基稀释的各种样品：紫杉醇对照组，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束，浓度分别为相当于PTX0.01、0.1、1、10、100μg/mL。在细胞培养箱中培养72h后，弃去孵育液，用PBS洗涤一次，加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃继续孵育4h，小心吸弃上清液，各孔加入150μL DMSO，用微型超声振荡器混匀，使结晶充分溶解。在酶标仪上以570nm为检测波长，测定样品吸光值(A_样品)。以不含血清的培养液孵育细胞，操作相同，作为对照(A_对照)。每个样品做6复孔。按公式(5)计算HepG2细胞株存活率及药物对肿瘤细胞生长的抑制率，求出样品的半数杀伤浓度IC₅₀，判断样品在体外对肿瘤细胞的杀伤作用。

实验结果参见附图2。从图中可以看出，在所测浓度(0.02-200μg/mL)范围内，羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物对细胞的存活率并无显著影响，而相同测定浓度范围内，紫杉醇对照组所用的溶剂聚氧乙烯蓖麻油：无水乙醇(1：1)则具有较强的细胞毒性，并随浓度的增加，毒性增大，当浓度为200μg/mL时，其细胞存活率仅为45.91％。可见，羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的细胞毒性远远低于紫杉醇对照组所用的混合溶剂，可以作为一种安全的新型载体材料使用。

通过MTT法对载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束进行细胞毒性测试，考察紫杉醇包载入羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束后其细胞毒性是否发生改变。如附图1所示，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的细胞毒作用具有浓度依赖性，即随着紫杉醇浓度的增高，细胞毒性随之增强。在所测浓度范围内，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的细胞毒作用明显高于紫杉醇对照组。结合载体细胞毒性评价结果，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的细胞毒性几乎完全由于紫杉醇引起的，并且由于羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的包载作用增强了其细胞毒性；而紫杉醇对照组的细胞毒作用部分是由于其溶剂引起的，这与之前聚氧乙烯蓖麻油在高浓度时能够明显降低细胞存活率的报道结果一致。

实施例13基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂对药学活性分子的促吸收行为考察

以实施例1为例，考察其对药学活性分子紫杉醇在体肠吸收情况的影响。

大鼠用乌拉坦麻醉后，将其固定于硬纸板，腹面向上，沿腹中线开口约3cm，先找到胃部，自胃部幽门以下2cm处作为十二指肠段的始端；空肠段从十二指肠始端以下15cm处开始；从盲肠向上2cm处作为回肠的末端，由此点向上10cm作为回肠段；结肠段为盲肠向下10cm。确定所需实验的肠段后，在该肠段的始端和末端各剪一个“V”型小口，插入输液管，并用棉线结扎，输液管做好肠段及出入口标记。缓慢推注生理盐水清洗肠管，直至流出液干净，然后接上恒流泵，用空白的K-R液预饱和灌流管路和肠管(流速约为0.2mL/min)30min后，排空管中的液体，接上药液开始灌流的实验(流速为0.2mL/min)，以充满整个管路后流出第一滴药液的时刻作为零时刻，根据需要每15min收集单向灌流的样品，收集6个时间点。实验完成后，处死大鼠，截取实验肠段，测量长度和直径。

精确配制药学活性分子紫杉醇终浓度为30μg/ml的样品，其中包括紫杉醇与羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物的物理混合物，紫杉醇与400μg·mL^-1维拉帕米物理混合物，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束。

表观吸收速率常数K_a和肠壁有效渗透系数P_eff按公式(6)和(7)计算。

实验结果见附图2。实验结果显示，维拉帕米和羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物在十二指肠及空肠皆能显著促进紫杉醇的吸收(P＜0.05)，在空肠表现更为明显(P＜0.01)。维拉帕米是公认的P-gp抑制剂，紫杉醇+维拉帕米组药液因为维拉帕米抑制了P-gp外排而促进了紫杉醇的吸收，P_eff与紫杉醇对照组比有显著提高(十二指肠P＜0.05；空肠P＜0.01)。羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物对紫杉醇也有一定的促吸收作用，其原因可能是由于其自身带有具有P-gp抑制功能的槲皮素，因而也具有一定的P-gp抑制效果，而使紫杉醇的吸收增加。羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物与维拉帕米的促吸收的效果相当，统计学分析无显著差异。

与紫杉醇对照组相比，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的K_a值和P_eff值有显著提高(P＜0.01)。在十二指肠，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的K_a值是紫杉醇对照组的14.01倍，P_eff是的21.53倍，在空肠，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的K_a值是紫杉醇对照组的14.01倍，P_eff是紫杉醇对照组的28.95倍。说明载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束能够显著促进紫杉醇的吸收。

联合使用了维拉帕米后，K_a值无显著变化，P_eff有显著提高，说明维拉帕米能够进一步促进载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束药液中紫杉醇的吸收，而维拉帕米与载药胶束促吸收作用机理不完全一致。分析原因，添加了维拉帕米后K_a和P_eff有显著提高可能是由于维拉帕米对载药胶束释放出来的游离紫杉醇进行了促吸收，而载药胶束的促吸收的主要途径是通过其自身的壳-核结构、纳米级粒径、材料的生物黏附、P-gp抑制及对药物的包载进而躲避了P-gp的识别。

同样，对不同的高分子偶联物进行肠吸收实验(十二指肠和空肠)，发现高分子偶联物的K_a和P_eff值均比相应对照组的值高，结果见表5，同样说明了该类高分子偶联物能够促进药物的吸收。

表5基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂对药学活性分子的促吸收行为考察

实施例14基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂对药学活性分子的药动学影响。

以实施例1为例，考察羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物对紫杉醇的药动学影响。

选取体重180～200g的健康大鼠25只，禁食24h，随机分成5组，每组5只，分别灌胃给予各种紫杉醇制剂：(1)紫杉醇对照溶液(20mg/kg紫杉醇)；(2)载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束溶液(20mg/kg紫杉醇)；(3)紫杉醇+维拉帕米溶液(20mg/kg紫杉醇+25mg/kg维拉帕米)；(4)紫杉醇+羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物(紫杉醇20mg/kg+40mg/kg羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物)；(5)紫杉醇+羧甲基壳聚糖(20mg/kg紫杉醇+36mg/kg羧甲基壳聚糖)。给药后分别于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36h于大鼠眼底静脉丛取血。全血置于肝素钠荡过的离心管中，10000rpm离心，分离血浆，按血浆样品处理方法：在10mL玻璃离心管中加入相同浓度的(34.4μg/mL)相同体积(15μL)的多西紫杉醇内标液，挥干后精密移取150μL血浆样品置离心管中，涡旋1min混匀，定量加入4mL叔丁基甲醚，密封，涡旋5min，3000rpm离心10min。取其中叔丁基甲醚3mL，减压挥干，残渣用100μL甲醇复溶，涡旋1min，10000rpm离心10min，取上清液20μL进样，通过HPLC进行测定，记录紫杉醇与多西紫杉醇峰面积(A_PTX、A_DTX)，计算R，把R代入血浆样品PTX标准曲线方程，计算不同时间血浆中的紫杉醇浓度，绘制药-时曲线(见附图3)。用药动学软件Kinetica4.4.1，根据各紫杉醇制剂在大鼠血浆中的紫杉醇经时浓度计算各药动学参数。各参数采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。

结果表明，非房室模型分析获得的实验结果表明，载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束能显著提高紫杉醇在体内的药-时曲线下面积AUC_0-36h及达峰浓度C_max，分别是紫杉醇对照组的7.61倍和6.93倍，是紫杉醇+维拉帕米组的3.46倍和4.22倍，说明载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束能显著提高紫杉醇在体内的吸收。与其它组相比载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的MRT延长，Cl降低，说明载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束在增加体内吸收的同时，延长了在体内的循环时间，有助于增加紫杉醇的抗肿瘤疗效。

载紫杉醇的羧甲基壳聚糖-槲皮素纳米胶束的促吸收作用机理的研究结果表明，羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物可以显著提高紫杉醇在体内的AUC_0-36h(P＜0.05)，其效果与维拉帕米接近，无显著性差异，说明羧甲基壳聚糖-槲皮素偶联物自身可以增加紫杉醇在体内的吸收，与羧甲基壳聚糖的促吸收结果相比，推测其对紫杉醇吸收的促进作用可能与P-gp的抑制作用有关。

同样，对不同的高分子偶联物进行药动学研究，结果见表6，同样说明了该类高分子偶联物能够促进药物的吸收，提高药物的血药浓度，提高药学活性分子的生物利用度。

表6基于天然P-gp外排抑制剂构建的口服吸收促进剂对药学活性分子的药动学研究

Claims

1.一种基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂，其特征在于该口服吸收促进剂是在壳聚糖衍生物的羧基上，通过酯化反应引入天然的疏水性具有P-糖蛋白抑制作用的小分子，由于构成材料的自身特点而同时具有P-糖蛋白抑制作用、生物黏附作用以及对药物跨上皮细胞调节作用，从而可促进药物在胃肠道的吸收，成为一种口服吸收促进剂。并且该口服吸收促进剂具有两亲性质，在水性介质中可自组装为纳米胶束。所述天然具有P-糖蛋白外排抑制作用的小分子物质，选自黄酮类槲皮素和黄芩素，蒽醌类物质大黄素，以及酚类物质白藜芦醇。

2.根据权利要求1所述基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂，其特征在于所述的带羧基的壳聚糖衍生物为O-羧甲基壳聚糖，N，O-羧甲基壳聚糖，羧乙基壳聚糖、季铵化羧甲基壳聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖。

3.根据权利要求1所述的基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备方法，其特征包括下列步骤：

将壳聚糖衍生物溶于水，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，活化壳聚糖衍生物结构上的羧基；将具有P-gp外排抑制作用的天然活性小分子物质溶于适当的溶剂后加入上述壳聚糖衍生物水溶液中；控制反应条件至反应完全，适当溶剂沉淀，抽滤得沉淀物，将沉淀物溶于水，探头超声分散、离心、过0.8μm的滤膜后置透析袋中，于水中透析72h，透析后的产物再次经探头超声、离心、过0.8μm的滤膜后，冷冻干燥，得基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂。

4.根据权利要求3所述的基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备方法，其特征在于所述的适当的有机溶剂，优选自N，N-二甲基甲酰胺，甲酰胺，四氢呋喃，二甲基亚砜；所述的控制反应条件，优选为冰浴反应10～60min，然后升至室温，反应12～72h，根据具有P-gp外排抑制作用的天然活性小分子物质对光的耐受性，选择是否避光反应；所述的滤液的适当的沉淀溶剂，优选自丙酮，乙醇，甲醇；所述的天然活性小分子物质与壳聚糖衍生物的适当比例优选为1∶0.5～2；所述的EDC·HCl和NHS的比例优选为1∶0.5～3；所述的探头超声时间优选为20～60min；所述的离心时间优选为5～20min；离心转数优选为2000～4000rpm；所述的透析时间，优选为1～4d。

5.权利要求1所述的基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂，其特征在于可作为药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂、制备为高分子新药、作为药学活性或药理活性分子的载体。

6.根据权利要求5所述的基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的应用，其特征在于：所述的药学活性或药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、黄酮类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类、维A酸类、环孢素类、二氢吡啶类、小檗碱类抗肿瘤药物中的任一物质或其衍生物。

7.根据权利要求5所述的的应用，其特征在于：基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂在制备药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂的质量浓度为0.1～90％，优选为0.1～35％。

8.根据权利要求5所述的基于天然P-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的应用，其特征在于：制备的药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂为口服给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂；制备的高分子新药为口服或注射给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂、注射用冻干粉针；制备药的学活性或药理活性分子的载体为口服或注射给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂、注射用冻干粉针。