CN104548125B

CN104548125B - 一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备及其应用

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Publication number: CN104548125B
Application number: CN201410838596.2A
Authority: CN
Inventors: 张华�; 胡宏祥; 张强; 王学清; 代文兵
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104548125A

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备及其应用。本发明的纳米晶体由聚乙二醇化的紫杉醇与紫杉醇组成，首先以亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)、紫杉醇(PTX)和小分子连接剂为起始原料，制备成聚乙二醇化紫杉醇(PEG‐PTX)，然后以此为修饰剂，制备聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)，所制备的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，粒径较小，载药量可达80％以上，具有长循环作用，增加了紫杉醇的抗肿瘤效果。

Description

一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备及其应用

技术领域：

本发明涉及一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备及其应用。本发明的纳米晶体由聚乙二醇化紫杉醇与紫杉醇组成，属于药物制剂领域。

背景技术：

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是20世纪60年代从红豆杉属植物紫杉的树干和树皮中提取并开发出的一种广谱天然抗癌药，临床首选用于乳腺癌和卵巢癌等妇科肿瘤治疗的一线化疗药物。临床常用的紫杉醇注射剂具有较多不良反应，而且患者经过首次化疗后，体内残存的肿瘤细胞易对紫杉醇产生极度耐药，这经常导致紫杉醇化疗的失败。因此开发一种能同时减少不良反应和耐药性的紫杉醇新制剂具有重要临床应用价值和意义。

但是，紫杉醇是一种溶解度极低的化合物(水中溶解度大约0.3μg/ml)，为了配制成达到临床用药浓度的紫杉醇注射剂，需要加入大量的增溶剂，商业产品就是加入了50％的聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)。Cremophor EL严重的毒副作用促使药物开发者探索紫杉醇的新剂型，比如制备水溶性前药、脂质体、胶束、纳米粒等。这些新型紫杉醇给药系统虽然克服了聚氧乙烯蓖麻油的毒副作用，但大量载体材料的引入，同样对人体具有一定的副作用。

纳米晶体药物由于没有或很少载体材料、大大提高药物的生物利用度等优点，近年来备受关注，是目前解决难溶性药物给药问题较好的手段。公开号为CN103768046的专利公开了一种注射用紫杉醇纳米晶体及其制备方法，但是所制备的紫杉醇纳米晶体进入体内以后，很容易被网状内皮系统(RES)识别，被当作异物吞噬，蓄积在RES丰富的组织，比如肝和脾，引起血药浓度的急剧降低。为了逃避RES的识别和吞噬，延长药物在体内的循环时间，将药物载体隐形化是常用的手段。这种隐形化的载体不仅能够避免网状内皮系统的吞噬，显著延长药物在体内的循环时间，同时还能借助肿瘤组织血管的透过性增强及滞留(EPR)效应被动靶向于肿瘤组织，使药物在肿瘤组织保持较高浓度，药物载体被覆聚乙二醇可以实现隐形化。

发明内容：

本发明的目的是提供一种稳定的疏水性药物与其聚乙二醇衍生物形成的纳米晶体制备方法及其应用，提高疏水性药物的载药量，减少辅料的毒性。通过纳米晶体表面被覆聚乙二醇，实现纳米晶体的隐形化，减少RES的识别和吞噬，延长纳米晶体在体内的循环时间，提高药物的作用效果。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，该晶体中，紫杉醇占总重的50～90％，聚乙二醇化紫杉醇占总重的10～50％，其粒径为100～800nm，作为晶体，其有关的X射线衍射(XRD)数据如附图1所示，该晶体在2θ为5.1,10.5,12.6,20.4,22.4处有特征峰。

本发明的纳米晶体，其中的聚乙二醇分布在纳米晶体的表面和内部。

本发明的纳米晶体由聚乙二醇化紫杉醇和紫杉醇制备而成，其表面由聚乙二醇修饰，聚乙二醇化紫杉醇可以吸附在紫杉醇纳米晶体表面，也可以是其分子结构中的紫杉醇与形成纳米晶体的紫杉醇一起结晶，使得聚乙二醇裸露在外，形成聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体。

本发明的纳米晶体，其中所述的聚乙二醇化紫杉醇可以用中国专利(公开号CN102614110)描述的方法制备，属于现有技术。

本发明的纳米晶体，其中所述聚乙二醇的平均分子量为700～10000道尔顿。

本发明的纳米晶体，其制备方法如下：

以紫杉醇和聚乙二醇化紫杉醇作为原料，通过溶剂溶解后，再进行析晶，过滤后得到晶体。

优选的，本发明的纳米晶体的制备方法采用抗溶剂沉淀法，首先将聚乙二醇化紫杉醇和紫杉醇溶解在有机相中，再注入到水相，由于溶剂的改变，紫杉醇与聚乙二醇化紫杉醇一起析出结晶。有机相选自：乙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮，优选二甲基亚砜和乙醇，更优选二甲基亚砜。

更优选的，本发明的纳米晶体的制备方法如下：紫杉醇1mg溶于0.2‐1ml有机溶剂中，在探头超声作用下注射入1‐10ml含有0.1‐5mg的PEG‐PTX水溶液中，探头超声2‐10min即得。更优选的，本发明的纳米晶体的制备方法如下：PEG‐PTX0.1‐1mg，连同1mg紫杉醇一起溶于0.2‐0.8ml有机溶剂中，将此溶液在探头超声作用下注射入1‐10ml的蒸馏水中，探头超声2‐10min即得。

本发明提供的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，可以根据产品需要，制备成适合保存和使用的药物制剂形式，如加入适当冻干保护剂做成固体冻干粉。冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖中的任意一种或多种。或者分散在经皮给药载体中，做成透皮制剂。

本发明的纳米晶体，其给药途径可以选择静脉注射给药，也可以选择口服、经皮或粘膜给药。

本发明所述的聚乙二醇化紫杉醇，其聚乙二醇可以由其他亲水性高分子化合物代替，比如短链的壳聚糖、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯。

本发明所述的聚乙二醇化紫杉醇，其紫杉醇部分可以由其他难溶性药物代替，包括但不限于：多烯紫杉醇、喜树碱、10‐羟基喜树碱、9‐硝基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、9‐氨基喜树碱、替尼泊苷、依托泊苷、环孢素A、非诺贝特、西罗莫司、阿瑞吡坦、甲地孕酮、帕潘立酮、厄洛替尼、水飞蓟素、槲皮素、伊曲康唑、萘普生、地塞米松、地奥司明、淫羊藿素、冬凌草甲素、姜黄素、葛根素、奈韦拉平、齐拉西酮。

本发明所述的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，其中的聚乙二醇端，可以连接配体，所述配体选自：叶酸、RGD及其类似物、多肽、半乳糖、转铁蛋白、抗体。

本发明所述的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，其制备方法选自：抗溶剂沉淀法、乳化法、超临界流体沉淀法，优选抗溶剂沉淀法。

本发明提供的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体具有以下优点：

1.本发明的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的载药量高，其中紫杉醇在晶体中的重量比例可达80％以上，比现有的除纳米晶体外其他紫杉醇给药系统的载药量(一般不超过20％)高。

2.本发明的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，可以混悬在水、生理盐水或葡萄糖中，形成混悬液，静脉注射或输注，因此在配制溶液剂时无需使用增溶剂，比如聚氧乙烯蓖麻油，去除了增溶剂带来的毒副作用，大大提高了制剂的安全性。

3.本发明的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，由于纳米晶体表面有聚乙二醇覆盖，形成较大的水化层，避免了网状内皮系统的吞噬，可以延长晶体在体内的循环时间，增加药物在作用部位的滞留，提高药物的作用效果。通过体内实验表明，可明显提高紫杉醇纳米晶体的抗肿瘤效果，并降低了紫杉醇商业制剂泰素的毒性，具有很好的应用价值。

附图说明

图1聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体X射线衍射图。

图2聚乙二醇5000和实施例1中合成的聚乙二醇化紫杉醇MALDI‐TOF质谱图。A：mPEG₅₀₀₀；B：PEG‐PTX

图3紫杉醇纳米晶体的粒径分布和扫描电镜图。A：紫杉醇纳米晶体的粒径分布图，B：紫杉醇纳米晶体的扫描电镜图；C：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的粒径分布图，D：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的扫描电镜图

图4聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体形成示意图

图5聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体抗肿瘤药效图。A：肿瘤生长曲线；B：给药后裸鼠体重变化曲线

图6聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体抗肿瘤药效图。A：给药结束后肿瘤大小图；B：给药后裸鼠体重变化曲线；C：不同制剂给药后生物发光的能量(越低肿瘤越小)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明和解释，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：聚乙二醇化紫杉醇的合成

首先合成mPEG‐丁二酸，将甲基化聚乙二醇5000(mPEG₅₀₀₀)、丁二酸酐和吡啶加入到氯仿中，回流48h后，减压蒸去氯仿，加入蒸馏水，抽滤除去产生的固体，将滤液以氯仿萃取三次，合并氯仿层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至一定量，加入乙醚使析出固体，抽滤，烘干，得产物为白色固体即为mPEG‐丁二酸。

然后合成PEG‐PTX，用二氯甲烷溶解mPEG‐丁二酸，冰浴下加入1‐乙基‐(3‐二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，反应20min后，加入紫杉醇(PTX)、N，N‐二异丙基乙胺(DIEA)和4‐二甲氨基吡啶(DMAP)，自然升温至室温，反应24小时。闪柱分离得粗产物，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗，水层用二氯甲烷再洗，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到产物即为聚乙二醇化紫杉醇(PEG‐PTX)。整个反应过程用薄层色谱监控，终产物用MALDI‐TOF‐MS确认。图2A为mPEG5000的MALDI‐TOF‐MS图，图2B为PEG‐PTX的MALDI‐TOF‐MS图，最大分子量为5877，显示紫杉醇已经连接在聚乙二醇上。实施例2：聚乙二醇化紫杉醇的合成

合成方法同实施例1，其中以mPEG₂₀₀₀代替mPEG₅₀₀₀，得到不同分子量的紫杉醇聚乙二醇化物。

实施例3：聚乙二醇化紫杉醇的合成

合成方法同实施例1，其中以mPEG₇₅₀代替mPEG₅₀₀₀，得到不同分子量的紫杉醇聚乙二醇化物。

实施例4：紫杉醇纳米晶体的制备与表征

紫杉醇纳米晶体(PTX‐NCs)的制备采用抗溶剂沉淀合并超声法。将0.5mL PTX的二甲基亚砜(DMSO)溶液(2.0mg/ml)在探头超声作用下，注射入10ml的0.01％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液中，探头超声5min即得。利用Malvern纳米粒度仪测定其粒度及分布；利用扫描电子显微镜观察纳米晶体的形态。结果见图3的A和B。

实施例5：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备与表征

聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)的制备采用抗溶剂沉淀合并超声法。分别称取实施例1中合成的PEG‐PTX 0.125mg、0.25mg和0.625mg，连同1mg紫杉醇一起溶于0.5ml二甲基亚砜(DMSO)中，将此溶液在探头超声作用下注射入5ml的蒸馏水中，探头超声5min即得(处方1、2、3)。粒径等相关药剂学性质见表1。

实施例6：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备与表征

聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)的制备采用抗溶剂沉淀合并超声法。分别称取实施例1中合成的PEG‐PTX 0.5mg、1.25mg和2.5mg溶于5ml去离子水中，形成PEG‐PTX溶液。称取1mg紫杉醇溶于0.5ml二甲基亚砜(DMSO)中，将此溶液在探头超声作用下注射入上述PEG‐PTX的溶液中，探头超声5min即得(处方4、5、6)。粒径等相关药剂学性质见表1。

优选4号处方的粒径分布和形态见图3的C和D。聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体形成的示意图见图4。

实施例7：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体水化层的测定

聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)的水化层的测定采用文献方法(Yasuyuki Sadzuka,Sadao Hirota Physical properties and tissue distribution ofadriamycin encapsulated in polyethyleneglycol‐coated liposomes.Adv.DrugDeliv.Rev.24(1997)257‐263)。具体地，将适量PEG‐PTX‐NCs在4℃下，10000rpm离心45分钟，得到纳米晶体的沉淀物，磷酸缓冲液清洗后，将此沉淀物用不同浓度的氯化钠溶液再分散，测定这些溶液的zeta电位ζ，水化层L与lnζ的关系如下：lnζ＝lnA‐κL，公式中的κ为Debye Huckel参数，k＝根号c/0.3，c为氯化钠溶液的浓度。方程的斜率即为水化层，测定结果见表1。

实施例8：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体中mPEG含量的测定

聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体中mPEG含量的测定采用I₂复合物‐比色法。精密配制1.0mg/ml的mPEG₅₀₀₀溶液作为储备液。储备液被去离子水稀释成浓度为5.0,10.0,20.0,30.0,40.0和50.0μg/ml的系列溶液。分别精密吸取上述溶液0.8ml，加入1.2ml去离子水混匀后，加入50μl的显色液(I₂10g/L+KI 20g/L)，系列溶液在阴暗处显色5min后,测定样品在525nm的吸光度。以质量浓度为纵坐标,吸光度为横坐标,进行回归处理,计算回归方程。按照此法测定不同溶液在525nm的吸光度，根据回归方程，计算mPEG的量。mPEG化紫杉醇纳米晶体混悬液中总mPEG记为M1，将该纳米晶体混悬液离心45min(10000rpm，4℃)，得到的上清液，同法测定得到的mPEG为M2。离心后的纳米晶体用去离子水混悬，测得的mPEG为M3，即为纳米晶体表面的mPEG，而晶体内部的mPEG可以通过公式计算出来(M＝M1‐M2‐M3)。测定结果见表1。

实施例9：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体抗肿瘤活性实验

紫杉醇纳米晶体和PEG化紫杉醇纳米晶体的体内抗肿瘤效应采用雌性nu/nu裸鼠(6周龄，18‐22g)。高转移性转染了荧光素酶的乳腺癌细胞MDA‐MB‐231/luc用于该实验。将2×10⁶/ml的细胞悬液按照200μl/只的剂量，接种于裸鼠前右侧腋下。待肿瘤达到50mm³以上时，进行抗肿瘤效果实验。将荷瘤裸鼠随机分为5组，每组6只，分别尾静脉注射生理盐水(Control)、紫杉醇商业制剂紫杉醇商业制剂紫杉醇普通纳米晶体(PTX‐NCs)和PEG化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)。给药剂量为10mg/kg，每两天给药一次，共5次。隔天测量一次裸鼠的体重，并用游标卡尺测量肿瘤长径(L)和短径(r)，计算肿瘤体积(V＝(L×r²)/2)。绘制肿瘤体积‐时间变化图。同时监测裸鼠体重变化，作为毒性的参考数据。结果见图5。

实施例10：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体抗肿瘤活性实验

紫杉醇纳米晶体和PEG化紫杉醇纳米晶体的体内抗肿瘤效应采用雌性nu/nu裸鼠(6周龄，18‐22g)。裸鼠由北京大学医学部实验动物中心提供。高转移性转染了荧光素酶的乳腺癌细胞MDA‐MB‐231/luc用于该实验。将2×10⁶/ml的细胞悬液按照200μl/只的剂量，尾静脉注射到裸鼠体内。肿瘤细胞将主要在肺部截留，在肺部形成肺转移瘤，用生物发光成像仪监测肺转移瘤的形成和大小，当肺转移瘤达到一定大小时，进行抗肿瘤效果实验。将荷瘤裸鼠随机分为4组，每组6只，分别尾静脉注射生理盐水(Control)、紫杉醇商业制剂紫杉醇普通纳米晶体(PTX‐NCs)和PEG化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)。给药剂量为10mg/ml，每两天给药一次，共5次。隔天测量一次裸鼠的体重，给药结束后1天时，裸鼠腹腔注射荧光素钾溶液(剂量为150mg/kg)，10min后用生物发光成像仪照相，计算活的肿瘤细胞与底物荧光素钾结合后产生的光强度。裸鼠体重变化等结果见图6。

实施例11：聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的载药量

称取实施例6中优化处方4所制备的PEG‐PTX‐NCs，用适量DMSO溶解，高效液相色谱测定紫杉醇的含量，结果，紫杉醇占纳米晶体总重的82％，聚乙二醇化紫杉醇占纳米晶体总重的18％。

表1不同PEG‐PTX添加模式和浓度对PEG‐PTX‐NCs的药剂学性质及其表面mPEG含量的影响。

Claims

1.一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，其特征在于，该纳米晶体由聚乙二醇化紫杉醇和紫杉醇采用抗溶剂沉淀法制备而成，其粒径为100～800nm，该晶体中，紫杉醇占总重的50～90％，聚乙二醇化紫杉醇占总重的10～50％，X射线衍射数据在2θ为5.1,10.5,12.6,20.4,22.4有特征峰，该晶体中，聚乙二醇的平均分子量为700～10000道尔顿，聚乙二醇分布在纳米晶体的表面和内部，聚乙二醇化紫杉醇溶解在有机溶剂或水中，聚乙二醇化紫杉醇吸附在紫杉醇纳米晶体表面，或是其分子结构中的紫杉醇与形成纳米晶体的紫杉醇一起结晶，使得聚乙二醇裸露在外，形成聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体。

2.根据权利要求1所述的纳米晶体，其特征在于，其中的聚乙二醇端，连接配体，所述配体选自：叶酸、RGD、多肽、半乳糖、转铁蛋白、抗体。

3.根据权利要求1所述的纳米晶体，其特征在于，其中所述的聚乙二醇化紫杉醇，其聚乙二醇由短链的壳聚糖、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的亲水性高分子化合物取代。

4.权利要求1所述的纳米晶体的制备方法，其特征在于，采用抗溶剂沉淀法，首先将聚乙二醇化紫杉醇和紫杉醇溶解在有机相中，再注入到水相，紫杉醇与聚乙二醇化紫杉醇一起析出结晶，其中有机相选自：乙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮，或者紫杉醇溶解在有机相中，再注入到含有聚乙二醇化紫杉醇的水相中。

5.权利要求4所述的制备方法，其特征在于，其中有机相选自：二甲基亚砜和乙醇。

6.权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：PEG-PTX 0.1-5mg，连同1mg紫杉醇一起溶于0.2-1ml有机溶剂中，将此溶液在探头超声作用下注射入1-10ml的蒸馏水中，探头超声2-10min即得，或者将PEG-PTX 0.1-5mg溶解在水中，其他步骤不变。

7.含有权利要求1所述纳米晶体的药物组合物，其特征在于，该纳米晶体分散在水中，或者加入适当冻干保护剂做成固体冻干粉，冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖中的任意一种或多种。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，为口服、注射、经皮或粘膜给药制剂。