CN103768046B

CN103768046B - 一种注射用紫杉醇纳米晶体及其制备方法

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Publication number: CN103768046B
Application number: CN201410059118.1A
Authority: CN
Inventors: 郑爱萍; 张慧; 杨茜; 高静; 李迎; 孙建绪; 魏丽莎; 张晓燕
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2034-02-21
Also published as: CN103768046A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种紫杉醇药物组合物及其制备方法。具体地，本发明涉及一种注射用紫杉醇纳米晶体制剂及其制备方法，以及该制剂用于制备抗肿瘤的药物中的用途。本发明的紫杉醇纳米晶体属于纳米制剂，粒径较小，稳定性好，且不易析出，紫杉醇的溶解度显著提高，且体内研究证明了紫杉醇纳米晶体具有一定的靶向性，能够用于抗肿瘤治疗。

Description

一种注射用紫杉醇纳米晶体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种紫杉醇药物组合物及其制备方法。具体地，本发明涉及一种注射用紫杉醇纳米晶体制剂及其制备方法，以及该制剂用于制备抗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中提取的一种复杂的次生代谢产物，化学名为5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。

紫杉醇是微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂,是目前所了解的惟一一种能控制癌细胞生长的植物药（Schiff PB,Fant J,Horwitz SB.Promotion of microtubule assemblyin vitro by Taxol.Nature,1979,277(5698):665-667；Schiff PB,Horwitz SB.Taxolstabilizes microtubes in mouse fibroblast cells.Proc Natl Acad Sci USA,1980,77:1561-1565）。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌，而且对食管癌、头颈癌等其他一些恶性肿瘤也有一定疗效,是目前临床化疗药物的一线用药（Spencer C,Faulds D.Paclitaxel-a review of its pharmacodynamic andpharmacokinetic properties and therapeutic potential in the treatment ofcancer.Drugs,1994,48(5):794-847）。

然而，紫杉醇在水中溶解度极小，临床应用的主要是紫杉醇注射液，是将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油(Cremophore EL)与无水乙醇(1:1)的混合溶剂中制成的。但是大量研究表明，紫杉醇注射液中的聚氧乙烯蓖麻油易引起胃肠道反应、过敏反应、低血压、肾毒性、心脏毒性和骨髓抑制等多种毒性反应，极大地限制了临床应用。现在临床上在给药前进行抗过敏预处理，在给药前口服地塞米松、肌注或口服苯海拉明、静脉注射西咪替丁或雷尼替丁等，因此使患者被动接受了大剂量激素带来了不良反应。尽管如此，不同程度的过敏反应仍时有发生，不良反应发生率仍可高达30%。

目前，不含聚氧乙烯蓖麻油注射紫杉醇白蛋白混悬液（ABI-007，Abraxane）于2005年由FDA批准上市。Abraxane不需要在给药前进行抗过敏预处理，毒性较低。然而，有研究表明，ABI-007在乳腺癌治疗的Ⅲ期临床实验中，体现出了较非ABI-007治疗组更高的感觉神经病变率。且应用Abraxane的整体价格较传统的紫杉醇注射液更昂贵，目前应用仍然不够广泛。注射用PTX脂质体(paclitaxel liposome for injection，L-PTX)于2003年由CFDA批准在国内上市，但紫杉醇脂质体相关载药体系在国外主要处于临床试验和临床前研究阶段。且紫杉醇脂质体存在包封率低，紫杉醇易泄露等问题。近年来的研究又发现，脂质体较大的粒子半径及其脂质双分子层中大量的胆固醇能够激活体内的补体系统，引起补体系统介导的假变态反应CARPA（complement activation-related pseudoallergy）。这种反应在临床上多表现为心肺功能的损伤，因此限制了紫杉醇脂质体在临床上的应用。

因此，设计安全有效且使用方便的紫杉醇新制剂具有重要的临床价值。

在20世纪末，纳米系统发展起来了一种纳米微粒药物传递系统:纳米晶体药物。其特点为：1.不受包封率的制约，药物剂量可调范围宽：因为将药物直接纳米化，无需借助载体材料，所以不存在包封率及载药量的障碍，容易满足临床需求，大剂量药物（治疗剂量>500mg）亦可制备成纳米制剂；2.剂型多样化：纳米晶体混悬液通过喷雾干燥、冷冻干燥和流化床干燥可进一步固化，制备成胶囊、片剂等固体剂型，或冻干粉剂等注射剂型；3.纳米粒径精确可控：粒径大小是纳米制剂的重要参数，与增溶效果、口服吸收生物利用度密切相关。由于药物自身纳米化，实测值为药物粒子的粒径，可真实反映纳米化药物的粒子大小；4.制备方法操作简单，易于工业化大生产，常规设备如高压均质机、高压微射流或湿磨机等均可以制备纳米晶体药物。

但是，由于纳米晶体混合液中的紫杉醇纳米晶体容易析出，会发生团聚现象难以复溶或粒径增大，无法达到提高溶解度和生物利用度的目的。因此，目前尚难以得到稳定的纳米晶体混悬液。

发明内容

本发明人通过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种紫杉醇药物组合物特别是一种注射用紫杉醇纳米晶体。本发明人惊奇地发现，通过例如选择合适的配方特别是合适的稳定剂组方，得到紫杉醇纳米晶体的粒径较小，稳定性好，且不易析出，紫杉醇的溶解度显著提高。本发明人还在体内研究中惊奇地发现，本发明的紫杉醇药物组合物（紫杉醇纳米晶体制剂）具有一定的靶向性。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种紫杉醇药物组合物，其包含紫杉醇、稳定剂以及适量的水。其中，紫杉醇为药效成分或有效成分。

在本发明的一个实施方案中，所述紫杉醇药物组合物，其由紫杉醇、稳定剂以及适量的水组成。

所述药物组合物亦为药用组合物；具体地，为紫杉醇纳米分子药用组合物或者紫杉醇纳米晶体药用组合物；在本发明的一个实施方案中，其为注射用紫杉醇纳米晶体（制剂），例如紫杉醇纳米晶体混悬液或其冻干制剂（紫杉醇纳米晶体冻干制剂）。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，紫杉醇（或紫杉醇晶体）的平均粒径为10－800nm；优选为50－500nm；更优选为100－400nm、100－350nm、100－300nm，例如，100－200nm、100－250nm、200－300nm、150－250nm、150－200nm、200－250nm。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其PDI（polydispersity index，多分散指数）小于0.5。在本发明的一个实施方案中，所述PDI为0.1－0.5、0.1－0.4、0.1－0.3、0.2－0.5、0.2－0.4、0.3－0.3、0.15－0.2、0.15－0.25、0.2－0.25。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，紫杉醇的含量为0.1%－5%（W/V，g/ml）；优选为0.2%－2%（W/V，g/ml）；更优选为0.5%－1.5%（W/V，g/ml）；特别优选为0.5%－1%（W/V，g/ml）或0.5%－0.8%（W/V，g/ml）。例如0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%（W/V，g/ml）。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，紫杉醇与稳定剂的重量配比为（1－10）：（1－20）；优选为（1－10）：1－10）；更优选为（1－5）：（1－10）；特别优选为（1－5）：（1－5）。例如，5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5，以及这些具体比例任意两两之间构成的数值范围。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，所述稳定剂包括稳定剂1和稳定剂2，或单用稳定剂1，其中，

所述稳定剂1选自羟丙甲纤维素、普朗尼克、聚维酮、泊洛沙姆、羟丙纤维素、阿拉伯胶、西黄蓍胶、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素和糖类（例如葡萄糖、果糖或蔗糖）中的任意一种或多种，所述稳定剂2选自十二烷基硫酸钠、多库酯钠和精氨酸盐中的任意一种或多种；

优选地，所述稳定剂1选自羟丙甲纤维素、泊洛沙姆和羟丙纤维素中的任意一种或多种，所述稳定剂2选自十二烷基硫酸钠/多库酯钠和精氨酸盐中的任意一种或多种；

更优选地，所述稳定剂1选自羟丙甲纤维素和/或泊洛沙姆，所述稳定剂2为多库酯钠。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，稳定剂1与稳定剂2的的重量配比为（1－20）：（1－10）；优选为（1－20）：（1－5），更优选为（1－10）：（1－5）；特别优选为（1－5）：（1－2）。例如，（5－8）：2、5：2、5：1、4：1、3：1、2.5：1、2：1、1：1、1：2，以及这些具体比例任意两两之间构成的数值范围。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其处方组成如下：

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其为注射用紫杉醇纳米晶体制剂、紫杉醇纳米晶体混悬液或紫杉醇纳米晶体冻干制剂。

所述紫杉醇纳米晶体冻干制剂通过加入生理盐水或葡萄糖复溶之后可用于静脉注射。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，所述紫杉醇纳米晶体冻干制剂的冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖中的任意一种或多种；优选地，所述冻干保护剂选自葡糖糖和/或甘露醇；更优选地，所述冻干保护剂选自甘露醇。

根据本发明任一项所述的紫杉醇药物组合物，其中，冻干保护剂的用量为紫杉醇纳米晶体混悬液的0.5%－10%（W/V，g/ml）；优选为1%－10%（W/V，g/ml），更优选为1%－5%；特别优选为2%－5%。例如，2%、3%、4%或5%。

本发明制备得到的紫杉醇纳米晶体混悬液无晶体析出并且不分层，混悬液稳定性好。不拘于理论的限制，本发明的纳米晶体混悬液直接将药物本身纳米化，无需载体材料，是将纯药物形成亚微米颗粒的胶状分散体系。

不拘于理论的限制，紫杉醇纳米晶体是单一的化合物，紫杉醇纳米晶体混悬液是混合物，由紫杉醇纳米晶体、稳定剂和水组成，其中稳定剂的应用对于获得物理稳定的纳米晶体混悬剂至关重要。稳定剂主要分为电荷保护剂和立体保护剂，在稳定剂的保护下才能够形成稳定的纳米晶体混悬液，否则获得的纳米晶体容易聚集使粒径变大，甚至析出，无法达到提高溶解度和生物利用度的目的。

本发明的另一方面涉及本发明的紫杉醇药物组合物的制备方法，包括将紫杉醇、稳定剂和水制成纳米晶体混悬液的步骤；具体地，将紫杉醇、稳定剂和水采用沉淀法制成紫杉醇纳米晶体混悬液；更具体地，包括下述步骤：

（1）在室温条件下，将含有稳定剂的水性混合物在500rpm－1500rpm之间高速搅拌混匀，作为水相；

（2）将紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，然后在500rpm－1500rpm之间高速搅拌的条件下，向上述水相中加入1%－20%（V/V）的有机相，之后继续在500rpm－1500rpm之间高速搅拌1－60min；

（3）将步骤（2）中得到的产物在20W－360W之间超声1－60min；

可选地，还包括下面的步骤（4）至（6）：

（4）向步骤（3）中得到的产物中加入0.5%－10%（W/V，g/ml）的冻干保护剂；

（5）混匀后进行灭菌处理；

（6）在-40℃至-80℃之间冷冻，并最终在+5℃至+25℃之间的稳定下加热升华，得到紫杉醇纳米晶体冻干制剂。

紫杉醇纳米晶体冻干制剂通过加入生理盐水或葡萄糖复溶之后用于静脉注射。

实验例1的结果表明，本发明的紫杉醇纳米晶体冻干制剂在复溶后，紫杉醇仍然是纳米晶体的形式，粒径基本与原先的紫杉醇纳米晶体混悬液相同。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的紫杉醇药物组合物在制备抗肿瘤的药物或者抑制癌细胞的药物或者预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途；具体地，所述癌症为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌或头颈癌；具体地，所述癌细胞为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、食管癌细胞或头颈癌细胞。

本发明的再一方面涉及一种在体内或者体外抑制癌细胞的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的紫杉醇药物组合物的步骤；具体地，所述癌细胞为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、食管癌细胞或头颈癌细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述在体外抑制癌细胞的方法是非治疗目的的。

本发明的再一方面涉及一种抗肿瘤或者治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的紫杉醇药物组合物的步骤；具体地，所述癌症为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌或头颈癌。

本发明中的粒径（或平均粒径）以及PDI可以本领域人员知晓的方法进行测定，例如通过Malvern纳米粒度仪和/或ZETA电位仪（NANO-ZS90）测得。

本发明中，各成分的含量，如果没有特别说明，均是指重量/体积（w/v）（g/100ml）。

本发明中，术语“纳米晶体”是意译，由nanocrystal翻译而来，强调“纳米”状态，而非强调“晶体”形式，只是自然界中大部分药物以晶体形式存在，但是不排除非晶体形式，如无定形态。国内也有将其翻译为纳米分子药物，这种名称相对于纳米载体药物可能更具有对比性。

本发明中，给药的对象为受试者，例如哺乳动物，包括但不限于：人、猴子、猪、牛、羊，等等。

在本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

发明的有益效果

本发明的紫杉醇纳米晶体混悬液显著提高了紫杉醇的溶解度和稳定性良好，具有对肿瘤的靶向性，其在肿瘤部位的紫杉醇浓度要高于紫杉醇市售注射液，并且紫杉醇纳米晶体混悬液在肿瘤部位能够在较长的时间维持较高的浓度。体内组织分布显示了紫杉醇纳米晶体混悬液在心、肾的药物浓度要低于紫杉醇市售注射液，说明紫杉醇纳米晶体混悬液能够降低心毒性和肾毒性，有利于减轻药物不良反应。本发明具有良好的应用前景。此外，本发明还克服了现有技术的紫杉醇制剂在临床应用中所存在的严重不良反应。

附图说明

图1（A-B）：实施例1制备的紫杉醇纳米晶体混悬液测得的粒径。

图2（A-B）：实施例7制备的紫杉醇纳米晶体冻干粉末加水复溶后测得的粒径。

图3：BALB/c-nu荷瘤裸鼠静脉注射给药后，各时间点的血浆及组织浓度随时间变化的曲线。图3A为紫杉醇纳米晶体混悬液在体内的药物浓度随时间变化的曲线；图3B为紫杉醇市售注射液在体内的药物浓度随时间变化的曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：紫杉醇纳米晶体混悬液（1）的制备

处方组成：

制备方法：

按上述配比，在室温条件下，将泊洛沙姆和多库酯钠两种稳定剂溶于10ml水中，形成的水性混合物在1200rpm下高速搅拌混匀，作为水相。将适量紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，浓度为50mg/ml。然后在1200rpm高速搅拌的条件下，向上述水相中加入1ml的有机相，之后继续在1200rpm下高速搅拌20min，大部分乙醇被除去。然后得到的紫杉醇纳米晶体混悬液在100W下超声20min使其充分稳定。紫杉醇纳米晶体混悬液粒径可达200.9nm。

实施例2：紫杉醇纳米晶体混悬液（2）的制备

处方组成：

制备方法：

按上述配比，在室温条件下，将泊洛沙姆和多库酯钠两种稳定剂溶于10ml水中，形成的水性混合物在1000rpm下高速搅拌混匀，作为水相。将适量紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，浓度为100mg/ml。然后在1000rpm高速搅拌的条件下，向上述水相中加入0.5ml的有机相，之后继续在1000rpm下高速搅拌30min，大部分乙醇被除去。然后得到的紫杉醇纳米晶体混悬液在100W下超声30min使其充分稳定。紫杉醇纳米晶体混悬液粒径可达217.5nm。

实施例3：紫杉醇纳米晶体混悬液（3）的制备

处方组成：

制备方法：

按上述配比，在室温条件下，将羟丙甲纤维素和十二烷基硫酸钠两种稳定剂溶于10ml水中，形成的水性混合物在800rpm下高速搅拌混匀，作为水相。将适量紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，浓度为100mg/ml。然后在800rpm高速搅拌的条件下，向上述水相中加入1ml的有机相，之后继续在800rpm下高速搅拌60min，大部分乙醇被除去。然后得到的紫杉醇纳米晶体混悬液在120W下超声10min使其充分稳定。紫杉醇纳米晶体混悬液粒径可达264.5nm。

实施例4：紫杉醇纳米晶体混悬液（4）的制备

处方组成：

制备方法：

按上述配比，在室温条件下，将羟丙甲纤维素和多库酯钠两种稳定剂溶于10ml水中，形成的水性混合物在1500rpm下高速搅拌混匀，作为水相。将适量紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，浓度为100mg/ml。然后在1500rpm高速搅拌的条件下，向上述水相中加入0.8ml的有机相，之后继续在1500rpm下高速搅拌10min，大部分乙醇被除去。然后得到的紫杉醇纳米晶体混悬液在80W下超声20min使其充分稳定。紫杉醇纳米晶体混悬液粒径可达258.9nm。

实施例5：紫杉醇纳米晶体混悬液（5）的制备

处方组成：

制备方法：

按上述配比，在室温条件下，将羧甲基纤维素钠和十二烷基硫酸钠两种稳定剂溶于10ml水中，形成的水性混合物在1300rpm下高速搅拌混匀，作为水相。将适量紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，浓度为100mg/ml。然后在1300rpm高速搅拌的条件下，向上述水相中加入1ml的有机相，之后继续在1300rpm下高速搅拌20min，大部分乙醇被除去。然后得到的紫杉醇纳米晶体混悬液在60W下超声30min使其充分稳定。紫杉醇纳米晶体混悬液粒径可达326.8nm。

实施例6：紫杉醇纳米晶体混悬液（6）的制备

处方组成：

制备方法：

按上述配比，在室温条件下，将羟丙基纤维素和精氨酸盐两种稳定剂溶于10ml水中，形成的水性混合物在1200rpm下高速搅拌混匀，作为水相。将适量紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，浓度为50mg/ml。然后在1200rpm高速搅拌的条件下，向上述水相中加入1ml的有机相，之后继续在1200rpm下高速搅拌20min，大部分乙醇被除去。然后得到的紫杉醇纳米晶体混悬液在80W下超声20min使其充分稳定。紫杉醇纳米晶体混悬液粒径可达298.5nm。

实施例7：紫杉醇纳米晶体冻干粉末及其制备方法

制备方法：

在洁净条件下，按照实施例1所述的制备方法，水相选择注射用水作为溶剂，制备紫杉醇纳米晶体混悬液，再加入2%的冻干保护剂葡萄糖，混合均匀后，经粗滤、超滤，得无热源的溶液，置于管制抗生素瓶中，在-80℃下冷冻，并最终在+10℃稳定下加热升华，得到0.1g/瓶的紫杉醇纳米晶体冻干粉末。

实施例8：紫杉醇纳米晶体冻干粉末及其制备方法

制备方法：

在洁净条件下，按照实施例2所述的制备方法，水相选择注射用水作为溶剂，制备紫杉醇纳米晶体混悬液，再加入5%的冻干保护剂甘露醇，混合均匀后，经粗滤、超滤，得无热源的溶液，置于管制抗生素瓶中，在-70℃下冷冻，并最终在+15℃稳定下加热升华，得到0.1g/瓶的紫杉醇纳米晶体冻干粉末。

实验例1：粒径测量实验（1）

1.实验材料

样品：实施例1制备的紫杉醇纳米晶体混悬液、纯水。

仪器：Malvern纳米粒度仪及ZETA电位仪。

2.实验方法

取0.4ml制备的紫杉醇纳米晶体混悬液于西林瓶中，加入1.6ml纯水稀释五倍，得到有蓝色乳光的澄清溶液，用Malvern纳米粒度仪及ZETA电位仪测定粒径（平均粒径）和PDI。

3.实验结果

实施例1制备的紫杉醇纳米晶体混悬液测得的粒径见图1A和图1B。

结果显示，本发明的紫杉醇纳米晶体混悬液的粒径为200.9nm，PDI为0.179，制得的紫杉醇纳米晶体混悬液较稳定。

实验例2：粒径测量实验（2）

1.实验材料

样品：实施例7制备的紫杉醇纳米晶体冻干粉末、生理盐水。

仪器：Malvern纳米粒度仪及ZETA电位仪。

2.实验方法

取一瓶紫杉醇纳米晶体冻干粉末产品，规格为0.1g/瓶，加入2ml生理盐水复溶，超声使分散均匀，得到有蓝色乳光的澄清溶液，用Malvern纳米粒度仪及ZETA电位仪测定粒径和PDI。

3.实验结果

实施例7制备的紫杉醇纳米晶体冻干粉末加水复溶后测得的粒径见图2A和图2B。

结果显示，本发明的紫杉醇纳米晶体混悬液的粒径为202.7nm，PDI为0.157，制得的紫杉醇纳米晶体混悬液较稳定。

可见，制备成固体制剂时，紫杉醇仍然是纳米晶体的形式。

实验例3：稳定性实验

1.实验材料

试验用样品：实施例1－6制备的紫杉醇纳米晶体混悬液、纯水。

仪器：Malvern纳米粒度仪及ZETA电位仪。

2.实验方法

实施例1－6制备的紫杉醇纳米晶体混悬液，室温条件下分别放置0天、1天、3天、5天、7天，用Malvern纳米粒度仪及ZETA电位仪测定粒径和PDI。

测量前，分别取0.4ml实施例1－6制备的紫杉醇纳米晶体混悬液于西林瓶中，加入1.6ml纯水稀释五倍，得到有蓝色乳光的澄清溶液，用Malvern纳米粒度及ZETA电位仪测定粒径和PDI。

3.实验结果

如表1－6所示。

表1：实施例1制备的紫杉醇纳米晶体混悬液稳定性实验数据

放置时间（d）	粒径（nm）	PDI
			0	200.9	0.179
1	202.5	0.168
			3	204.8	0.169
5	207.5	0.156
			7	210.7	0.153

表2：实施例2制备的紫杉醇纳米晶体混悬液稳定性实验数据

放置时间（d）	粒径（nm）	PDI
			0	217.5	0.149
1	219.2	0.151
			3	220.8	0.153
5	222.6	0.148
			7	229.8	0.156

表3：实施例3制备的紫杉醇纳米晶体混悬液稳定性实验数据

放置时间（d）粒径（nm）	PDI
		0264.5	0.179
1267.2	0.182
		3275.8	0.178
5279.6	0.195
		7280.6	0.202

表4：实施例4制备的紫杉醇纳米晶体混悬液稳定性实验数据

放置时间（d）	粒径（nm）	PDI
			0	258.9	0.182
1	260.2	0.189
			3	263.9	0.194

5	267.2	0.204
			7	269.5	0.225

表5：实施例5制备的紫杉醇纳米晶体混悬液稳定性实验数据

放置时间（d）粒径（nm）	PDI
		0326.8	0.243
1330.4	0.245
		3332.2	0.251
5339.5	0.246
		7345.1	0.252

表6：实施例6制备的紫杉醇纳米晶体混悬液稳定性实验数据

放置时间（d）	粒径（nm）	PDI
			0	298.5	0.223
1	301.2	0.217
			3	306.8	0.236
5	310.4	0.229
			7	315.9	0.238

结果表明：实施例1－6制备的紫杉醇纳米晶体混悬液室温放置均较稳定，特别是实施例1制备的紫杉醇纳米晶体混悬液的粒径最小，是最优的组方和制备方法。

实验例4：紫杉醇纳米晶体混悬液的体内评价研究

1.实验材料

试验用样品：

（1）实施例8的紫杉醇纳米晶体冻干粉末

制备方法：

紫杉醇纳米晶体冻干粉末，其中紫杉醇的含量为10%（w/w，g/g），用生理盐水复溶，并且稀释为1mg/ml。

（2）紫杉醇市售注射液

处方组成：

紫杉醇 30mg

乙醇 2.5ml

聚氧乙烯蓖麻油 2.5ml

制备方法：

紫杉醇市售注射液购自浙江海正药业有限公司，规格为5ml:30mg，紫杉醇的浓度为6mg/ml，用生理盐水稀释至1mg/ml。

实验动物：BALB/c-nu荷瘤裸鼠，雌性，体重18-22g,60只。

2、实验方法

（1）给药方案与样品采集

雌性BALB/c-nu荷瘤裸鼠60只（18-22g），随机分为两组，每组30只，给药前禁食12h，自由饮水，分别按照10mg/kg的剂量尾静脉注射紫杉醇纳米晶体混悬液和市售紫杉醇注射液，n=6。于给药后5、30min和2、8、24h,眼眶取血约0.5ml置于肝素化EP管中，离心10min（10000rpm），取上清血浆，之后颈动脉放血处死小鼠，分离出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，用生理盐水冲洗后，以滤纸吸干水分，称重，于-70℃冷冻保存。分组和给药如下面的表7。

表7：BALB/c-nu荷瘤裸鼠给药方案

（2）血浆及组织样品的处理方法

组织样品按5ml/g加入0.1%乙酸溶液，匀浆处理。精密量取组织匀浆或血浆100μl加入1.5mL EP管中，于EP管中加入10μl多西他赛内标溶液（500ng/ml）。加入1ml甲基叔丁基醚，涡旋3min，离心5min（14000rpm）；转移上层有机相至洁净的EP管中，离心浓缩仪上37℃挥干溶剂。残渣用100μL流动相溶解，涡旋1min，离心5min（14000rpm），取上清液至自动进样器样品管中，进样LC-MS/MS分析。

（3）血浆及组织样品的测定方法

采用液-质联用色谱法，内标为多西他赛，流动相：A（0.1%乙酸：乙腈=70:30）－B（0.1%乙酸：乙腈=10:90），梯度洗脱（表2）；流速：0.4ml/min；柱温：25℃。内标：多西他赛；进样量：5μl。洗脱参数如下面的表8。

表8：梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A	流动相B（%）
			0	75	25
0.5	0	100
			1.3	0	100
1.5	75	25
			5	75	25

3、实验结果

BALB/c-nu荷瘤裸鼠静脉注射给药后，测定各时间点的血浆及组织浓度，紫杉醇纳米晶体混悬液在体内的药物浓度随时间变化的曲线见图3A，紫杉醇市售注射液在体内的药物浓度随时间变化的曲线见图3B。

体内评价结果表明：本发明的紫杉醇纳米晶体混悬液对肿瘤有靶向性，其在肿瘤部位的紫杉醇浓度要高于紫杉醇市售注射液，并且紫杉醇纳米晶体混悬液在肿瘤部位能够在较长的时间维持较高的浓度。此外，体内组织分布显示了紫杉醇纳米晶体混悬液在心、肾的药物浓度要低于紫杉醇市售注射液，说明紫杉醇纳米晶体混悬液能够降低心毒性和肾毒性，对减轻药物不良反应，增加疗效亦具有重要意义。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种紫杉醇纳米晶体药用组合物，其包含紫杉醇、稳定剂以及适量的水；紫杉醇的平均粒径为100－300nm；所述稳定剂由稳定剂1和稳定剂2组成，其中，

所述稳定剂1为泊洛沙姆，所述稳定剂2为多库酯钠；

稳定剂1与稳定剂2的重量配比为4：1。

2.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇的含量按照g/ml计算为0.1％－5％。

3.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇的含量按照g/ml计算为0.2％－2％。

4.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇的含量按照g/ml计算为0.5％－1.5％。

5.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇的含量按照g/ml计算为0.5％－1％。

6.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇与稳定剂的重量配比为(1－10)：(1－20)。

7.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇与稳定剂的重量配比为(1－10)：(1－10)。

8.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇与稳定剂的重量配比为(1－5)：(1－10)。

9.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，紫杉醇与稳定剂的重量配比为(1－5)：(1－5)。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其为注射用紫杉醇纳米晶体制剂、紫杉醇纳米晶体混悬液或紫杉醇纳米晶体冻干制剂。

11.根据权利要求10所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，所述紫杉醇纳米晶体冻干制剂的冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇和乳糖中的任意一种或多种。

12.根据权利要求11所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，所述冻干保护剂选自葡萄糖和/或甘露醇。

13.根据权利要求11所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇。

14.根据权利要求11所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，冻干保护剂的用量按照g/ml计算为紫杉醇纳米晶体混悬液的0.5％－10％。

15.根据权利要求11所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，冻干保护剂的用量按照g/ml计算为紫杉醇纳米晶体混悬液的1％－10％。

16.根据权利要求11所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，冻干保护剂的用量按照g/ml计算为紫杉醇纳米晶体混悬液的1％－5％。

17.根据权利要求11所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物，其中，冻干保护剂的用量按照g/ml计算为紫杉醇纳米晶体混悬液的2％－5％。

18.权利要求1至17中任一项所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物的制备方法，其包括将紫杉醇、稳定剂和水制成纳米晶体混悬液的步骤。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，将紫杉醇、稳定剂和水采用沉淀法制成紫杉醇纳米晶体混悬液。

20.根据权利要求18所述的制备方法，其包括下述步骤：

(1)在室温条件下，将含有稳定剂的水性混合物在500rpm－1500rpm之间高速搅拌混匀，作为水相；

(2)将紫杉醇溶于乙醇中作为有机相，然后在500rpm－1500rpm之间高速搅拌的条件下，向上述水相中加入按照体积比计算为1％－20％的有机相，之后继续在500rpm－1500rpm之间高速搅拌1－60min；

(3)将步骤(2)中得到的产物在20W－360W之间超声1－60min。

21.根据权利要求20所述的制备方法，还包括下面的步骤(4)至(6)：

(4)向步骤(3)中得到的产物中加入按照g/ml计算为0.5％－10％的冻干保护剂；

(5)混匀后进行灭菌处理；

(6)在-40℃至-80℃之间冷冻，并最终在+5℃至+25℃之间的稳定下加热升华，得到紫杉醇纳米晶体冻干制剂。

22.权利要求1至17中任一项所述的紫杉醇纳米晶体药用组合物在制备抑制癌细胞的药物或者预防和/或治疗癌症的药物中的用途；

其中，所述癌症为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌或头颈癌；

其中，所述癌细胞为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、食管癌细胞或头颈癌细胞。