CN104398504A - 一种去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物及其制备方法和制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物及其制备方法和制剂。一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，该组合物包括去氧鬼臼毒素类药物和透明质酸-5β胆烷酸，所述的透明质酸-5β胆烷酸以胶束形式包裹去氧鬼臼毒素类药物。本发明还公开了药物组合物的制备方法和应用。本发明的药物良好的肿瘤靶向性，很好的安全性，降低毒副作用，提高疗效，可用于静脉注射，具有良好的应用，在肿瘤靶向性给药体系的研究以及肿瘤的治疗具有良好的应用前景。

Description

一种去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物及其制备方法和制剂

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物及其制备方法和制剂。

背景技术

《2014年世界癌症报告》显示无论在发达国家还是发展中国家，癌症都是导致人们死亡的主要“杀手”之一。新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居世界第一位。目前，化疗、手术治疗、放疗是治疗癌症的主要手段。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖和促进肿瘤细胞的分化的一种治疗方式，它是一种全身性治疗手段对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用，但是常规化疗药物对肿瘤组织和细胞几乎无选择性，因此在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞和免疫(抵抗)细胞一同杀灭，所以化疗是一种"玉石俱焚"的治疗方法.例如化疗早期会出现不同程度的恶心，呕吐，过敏反应，流感样综合征等，尤其是中后期会引起重要器官，系统的损伤，免疫抑制等毒副作用。因此研发长效，水溶和靶向性抗肿瘤药物制剂室当今研究的重点。

一种新型含有去氧鬼臼毒素类药物(DPT)是从传统植物“桃儿七”中的提取纯化而得的化合物；去氧鬼臼毒素类药物(DPT)的结构式如下：

DPT和紫杉醇、多西他赛同属一类药物，作用机制相似，且与紫杉醇相比，DPT抗肿瘤活性毫不逊色，尤其是在够抑制浅表性上皮瘤(如多发性浅表性或浸润性基底细胞上皮瘤，鳞状细胞上皮瘤和基底鳞状细胞上皮瘤等)方面有很好的效果。同时，早在上世纪90年代有实验报道，证明DPT对P-388白血病、人肺癌A-549及结肠癌HT-29的细胞株具有体外抑制作用，但仅仅停留在体外活性试验阶段。十多年来之所以没有体内活性的试验报道，其主要原因是由于该化合物DPT在水中的溶解度约为0.5mg/L，近乎不溶，无法制成可供静脉注射的制剂。上世纪70年代利用鬼臼毒素4位羟基合成了一系列糖苷衍生物，其中著名的有依托泊苷(Etopside)和替尼泊苷(Teniposide)，并已成功应用于临床。然而DPT的4位不存在羟基，无法制成糖苷类衍生物。如何改进DPT的水溶性稳定性并增强其治疗效果、能够进一步应用于临床，成为科学家研究的重大课题。

中国发明专利申请(申请号：201110004251.3申请日：2011-01-07)公开了一种脱氧鬼臼毒素类化合物，以及这类化合物的制备方法和用途。该发明的化合物的结构式如式I所示,

式I中的取代基NR1R2为式II所示的哌嗪类化合物,或NR1R2为式III所示的氨基酸酰胺类化合物；

该发明的化合物与去氧鬼臼毒素类药物(DPT)具有相同的活性，可在制备抗肿瘤药物中的应用。

在疾病治疗、诊断、监控以及生物系统控制等方面应用纳米技术研制的药物称为纳米药物，其表面经过生物或理化修饰后可具靶向性，即称为靶向纳米药物。靶向性纳米药物具有以下几个优点：(1)缓释药物，提高血药浓度，延长药物作用时间；(2)减少药物降解，提高药物稳定性；(3)与肿瘤细胞主动或被动结合，达到靶向输送的目的；(4)在保证药物作用的前提下，减少给药剂量，从而进一步减少或避免药物的毒副作用。

1934年，Meyer及其同事第一次从牛眼睛的玻璃体中分离出了透明质酸(hyaluronicacid，HA)。后来研究发现透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖与D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线性多糖。HA的分子量通常非常大并且存在大量的羟基而具有亲水性。近年来，随着人们对HA更加深入的研究发现HA广泛应用于多个领域，如组织工程，药物转运，分子成像等。

发明内容

本发明的一个目的是研发一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其中包含HANP纳米颗粒和新型抗癌药物DPT两个部分，该组合物能够有效的改善DPT水溶性和稳定性，增加药物的对肿瘤细胞的投入量，降低毒副作用，实现高效，低毒治疗肿瘤的目的。本发明的第二个目的是提供上述的药物组合物的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述的药物组合物的制剂。本发明还公开了透明质酸-5β胆烷酸化合物及其制备方法和应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，该组合物包括去氧鬼臼毒素类药物和透明质酸-5β胆烷酸，所述的透明质酸-5β胆烷酸以胶束形式包裹去氧鬼臼毒素类药物；

所述的去氧鬼臼毒素类药物包括以下化合物的一种或多种：

1)结构式Ⅰ的化合物

2)结构式Ⅰ的化合物中一个或多个基团由其他基团代替的化合物，并具有结构式Ⅰ的化合物相同活性的化合物；

所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物具有以下结构单元Ⅱ：

所述的m为大于等于1的正整数；作为优选，m为1～200，再优选，m为1～50。

作为优选，所述透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒和去氧鬼臼毒素类药物的重量比1：0.1-1:0.7，再优选为1：0.2-1:0.4。

作为优选，对于结构式Ⅰ的化合物中一个或多个基团由其他基团代替的化合物，基团为三个-CH₃中的一个或多个。典型的化合物(如申请号：201110004251.3申请日：2011-01-07所示)的结构式如式I所示：

式I中的取代基NR₁R₂为式II所示的哌嗪类化合物，或NR₁R₂为式III所示的氨基酸酰胺类化合物；

式II、式III结构所示的哌嗪类化合物中，R₃为甲基，或乙基，或丙基，或丁基，或异丙基，或环丙基，或环丁基，或环戊基，或环己基，或环庚基，或硝基苯基，或氟苯基，或羟基苯基，或甲苯基，或二甲苯基，或环丙基苯基，或环丁戊基苯基，或环戊基苯基，或环己基苯基。式III所示的氨基酸酰胺类化合物中，R₄可以是氢，或甲基，或异丙基，或甲硫亚甲基，或新丁基，或异丁基，或苄基，或羟甲基，或2-羟基乙基，或对羟基苄基等；式III所代表氨基酸的构型可以是L-构型，或D-构型。

作为优选，所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物的结构式如下：

所述的m和n均为大于等于1的正整数。作为再优选，m为1～200，n为1～200。作为最优选，m为1～50，n为1～50。

作为优选，所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物的结构式如下：

所述的m、n和o均为大于等于1的正整数。作为再优选，m为1～200，n为1～200，o为1～200。作为最优选，m为1～50，n为1～50，o为1～50。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种制备上述的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：

1)将透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒(HANP)在水中溶解，得到透明质酸-5β胆烷酸纳米胶束；

2)将治疗有效量的去氧鬼臼毒素类药物用药学上可接受溶剂溶解，与所述的纳米胶束混合后，经超声或高压均质机处理，溶液用透析法分离取出有机溶剂和小分子，将该溶液冷冻干燥所述的药物组合物。

作为优选，将透明质酸纳米颗粒溶解于超纯水中，终浓度为1-10mg/mL，在超声条件下：功率49-59W，时间20～40分钟，温度4℃-7℃；超声开始时逐滴加入溶于DPT的二甲基亚砜溶液；超声完毕后转移至透析袋中透析3～5小时，冷冻干燥即可制得药物组合物。超声载药具有方便，快速，操作性较强的优点，但同时载药量和载药效率不高。

作为优选，将透明质酸纳米颗粒(HANP)溶解于超纯水中，终浓度为1-10mg/mL，搅拌超声辅助溶解；利用均质仪匀浆透明质酸溶液，控制压力在2000～2500psi，循环3-5分钟；而后将DPT溶解于少量二甲基亚砜，缓慢滴加到均质仪中，保持压力为2000～2500psi，循环25～40次，反应产热，尽量保持低温；将均质仪处理后的产物装入透析袋，在纯水中透析4-6小时后，冷冻干燥，即可制得药物组合物。采用均质仪载药的方法具有高产，高效，快捷，但操作方法不及超声方便。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种去氧鬼臼毒素类药物的药物制剂，该药物制剂由上述的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物加入或不加入药学上可接受药物辅料制备得到。优选，所述的药物制剂注射剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂。

本发明所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物，该化合物具有以下结构单元：

所述的m为大于等于1的正整数。

作为优选，m为1～200，再优选，m为1～50。

作为优选，该化合物的结构式如下：

所述的m和n均为大于等于1的正整数。作为再优选，m为1～200，n为1～200。作为最优选，m为1～50，n为1～50。

作为优选，该化合物的结构式如下：

所述的m、n和o均为大于等于1的正整数。作为再优选，m为1～200，n为1～200，o为1～200。作为最优选，m为1～50，n为1～50，o为1～50。

一种制备所述的透明质酸-5β胆烷酸的方法，该方法包括以下的步骤：

1)5β-胆烷酸溶于甲醇，加入浓盐酸反应；然后加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗，干燥，获得白色粉末状胆烷酸甲酯；

2)将胆烷酸甲酯溶于DMF中，缓慢加入EDA反应；然后加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗干燥，获得白色粉末状CA-NH2；

3)将透明质酸溶解于甲酰胺中，加入EDC，室温下反应，而后加入NHS；然后将CA-NH2溶于DMF，并缓慢滴入到HA/EDC/NHS反应液中反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。

作为优选，上述的制备方法中，5β-胆烷酸与盐酸的摩尔比为1：1-1.5。

作为优选，上述的制备方法中，5β-胆烷酸与乙二胺EDA的摩尔比为1：40-45。

作为优选，上述的制备方法中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与透明质酸摩尔比为1:1.2。

作为优选，上述的制备方法中，透明质酸与5β-胆烷酸的摩尔比为1:5～20。

一种制备所述的透明质酸-5β胆烷酸的方法，该方法包括以下的步骤：

1)将透明质酸溶解于去离子水中，加入四丁基氢氧化铵反应制得HA-TBA；

2)将HA-TBA溶解于二甲基亚砜中，而后加入5β-胆烷酸、EDC和NHS反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。

作为优选，透明质酸与四丁基氢氧化铵摩尔比为1：600-3000。

作为优选，上述的制备方法中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与透明质酸摩尔比为1:1.2。

作为优选，上述的制备方法中，透明质酸与5β-胆烷酸的摩尔比为1:5～20。

一种制备所述的透明质酸-5β胆烷酸的方法，该方法包括以下的步骤：

1)将透明质酸-5β胆烷酸，溶解于甲酰胺中，加入EDC，室温下反应，而后加入NHS制备得到反应溶液；

然后将溶于DMF，并缓慢滴入到上述制得反应溶液反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒，该纳米颗粒由上述任意一项技术方案所述的透明质酸-5β胆烷酸制备得到。

为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种制备透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒的方法，该方法将制备得到透明质酸-5β胆烷酸反应体系依次在甲醇，甲醇/水溶液，氯化钠纯水溶液和纯水中充分透析，每次透析8～20小时；充分透析除去有机溶剂后，干燥获得透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒。

作为优选，所述的甲醇/水溶液的体积比为1:1，氯化钠纯水溶液的浓度为12.5mg/ml。

本发明使用5β-胆烷酸(CA)对HA进行疏水性改造使之形成双亲性的胶束。HA亲水外壳可逃避单核巨噬细胞的吞噬，延长药物在循环系统中的循环时间。抗癌药物DPT与透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒(HANP)结合的方法可选用非共价键包埋的物理方法，避免了接枝步骤，方便制备，同时DPT的释放无需通过化学键降解，释放速度较快，利于迅速起效。通知大分子的HA不仅能促进肿瘤细胞的迁移和黏附，使其避免人体免疫系统的攻击，而且还有抑制血管生成和抗炎作用。但HA降解后的低聚糖小片段则能够抑制活体内肿瘤细胞的形成。皮下注射HA低聚糖也可以抑制肿瘤细胞的生长，这是由于HA低聚糖与内源性高Mr的HA竞争性的与受体结合，以低亲和力、低效价的反应代替高亲和力、高效价的受体反应，从而通过改变肿瘤细胞生长和侵袭所需要的黏性环境来实现的。而且，对HA进行降解能够破坏肿瘤细胞表面的HA外壳，降低自身的黏附性，同时也有利于药物进入肿瘤细胞内发挥治疗作用。由于HA具有的这些优势，近年来，许多专家致力于研究基于透明质酸的纳米载体，使得透明质酸在纳米医学领域飞速的发展。HANP/DPT纳米药物具有许多优点：免疫原性低、生物相容性良好、可降解，延长DPT在血液中半衰期，增加药物靶向性，呈现更好的疗效。同时HANP纳米颗粒在医药领域得要巨大的关注是因为明质酸纳米载药颗粒具备有肿瘤的双靶向性-主动和被动靶向。透明质酸能够与大多数肿瘤细胞表面过度表达的CD44特异性结合，通过细胞的内吞作用，主动转运到细胞体内。因此本专利采用含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，构建了一种新型肿瘤药物传递系统。通过这种方式，DPT以物理包埋的方式包裹于透明质酸纳米颗粒，并且能够和CD44分子特异性结合，实现靶向给药。增加DPT抗癌药物对肿瘤细胞的投入量，提高抗癌疗效，降低体内的毒副作用。其次，HANP具有的纳米颗粒特有的优势，即通过EPR效应，被动的进入到肿瘤部位，增加肿瘤组织的靶向性。HANP通过主动和被动靶向作用，引导靶向纳米抗癌药物(HANP/DPT)效在肿瘤细胞中主动蓄集，实现靶向给药,增加肿瘤细胞的药物投入量，提高治疗效果；同时封装DPT在透明质酸酶降解HANP后释放，减少药物全身性扩散造成的毒副作用，同时也改善了DPT的水溶性和稳定性，延长了药物的血浆半衰期。

本发明的有益效果：

一、本发明使用透明质酸纳米颗粒生物无毒，生物相容性好，能够跟肿瘤细胞表面过度表达的CD44分子特异性结合，具有良好的肿瘤靶向性。同时用于对疏水性药物的包载，增加血液循环的时间，亲水性的外壳减少网状内皮细胞的吞噬，具有很好的安全性。

二、本发明将DPT的抗肿瘤效果和透明质酸优点结合起来，开发并制备一种新型肿瘤靶向性纳米抗癌药物。该药物充分利用了胶束的优点：具有药物缓释功效及肿瘤靶向性，在肿瘤的治疗时可以减少药物用量和给药次数，降低毒副作用，提高疗效，具有良好的应用，在肿瘤靶向性给药体系的研究以及肿瘤的治疗具有良好的应用前景。

三、本发明提供的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物可用于静脉注射。具有很好的安全性，粒径在200nm左右，溶解性好，稳定性高。

附图说明

图1为本发明实施例1HA-CA纳米颗粒制备路线。

图2为本发明实施例2HA-CA纳米颗粒制备路线。

图3为本发明实施例3HA-CA纳米颗粒制备路线。

图4～图7分别为HA(A)，HA-TBA(B)，EtCA(C)和HA-CA(D)的H-NMR图谱，图7在0.5-1.0ppm之间出现HA-CA的吸收峰，证明了制备方法的成功。

图8为使用高效液相色谱(HPLC)在254nm测得DPT标准曲线。

图9为使用HPLC测得不同装载量HANP/DPT的吸收波峰。

图10为DPT从HANP/DPT释放的模型。

图11为HANP/DPT在超纯水，PBS和DMEM培养基中稳定性分析，72小时HANP/DPT开始出现沉淀。

图12为HANP/DPT(右)和DPT(左)对于A549肿瘤细胞的毒性试验。

图13为HANP/DPT(右)和DPT(左)关于NIH-3T3细胞的毒性试验。

具体实施方式

实施例1

HA-CA两亲性透明质酸共聚物的制备方法一，反应方程式如图1：

透明质酸钠在去离子水中透析24小时。冻干后将透明质酸(5mg，1mmol羧基)溶解于1毫升去离子水中。

将10g 5β-胆烷酸(CA)溶于50mL甲醇，加入1.80mL浓盐酸，容器薄膜封口，磁力搅拌下60℃恒温反应6小时，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗3次，真空干燥，获得白色粉末状胆烷酸甲酯。

9g胆烷酸甲酯溶于50mL DMF中，缓慢加入EDA(0.9μmol)，磁力搅拌反应6小时，磁力搅拌下130℃恒温反应6小时，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗3次，真空干燥，获得白色粉末状CA-NH₂。

HA(120mg，0.51μmol)溶解于甲酰胺(Formamide)中，加入EDC(72.8mg,379.8μmol)，室温下反应30min，而后加入NHS(43.7mg,379.7μM)。将(39.8mg，98.8μmol)CA-NH₂溶于48mL DMF，并缓慢滴入到HA/EDC/NHS反应液中，在40℃下，磁力搅拌反应过夜。反应后的体系依次在乙醇，乙醇/水(1/1)，纯水(含12.5mg/ml的氯化钠)和纯水中充分透析，每次透析12小时。充分透析除去有机溶剂后，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用。

分别将1mg透明质酸(HA)，胆烷酸(EtCA)以及上述制备的透明质酸-5β胆烷酸溶解于含有1:1比例的D₂O的相应溶液中，而后进行核磁共振图谱检测分析，结果如图4所示，HA-CA成功合成。

实施例2

HA-CA两亲性透明质酸共聚物的制备方法二，反应方程式如图2：

透明质酸钠在去离子水中透析24小时。冻干后将透明质酸(400mg，1mmol羧基)溶解于5毫升去离子水中，加入650μl(1mmol)四丁基氢氧化铵(tetrabutylammoniumhydroxide，TBA)在60℃下搅拌过夜。

在60℃搅拌条件下，将120毫克HA-TBA溶解于12毫升二甲基亚砜(DMSO)中，而后加入5β-胆烷酸(CA，39.8mg，98.8μmol)，)EDC(72.8mg，379.8μmol)和NHS(43.7mg，379.7μM)。待各个试剂溶解后，将反应置于40℃下搅拌过夜。反应后的体系依次在甲醇，甲醇/水(1/1)，纯水(含12.5mg/ml的氯化钠)和纯水中充分透析，每次透析12小时。充分透析除去有机溶剂后，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用。

分别将1mg透明质酸(HA)，胆烷酸(EtCA)以及上述制备的透明质酸-5β胆烷酸溶解于含有1:1比例的D₂O的相应溶液中，而后进行核磁共振图谱检测分析，结果如图4所示，HA-CA成功合成。

实施例3

HA-CA两亲性透明质酸共聚物的制备方法三，反应方程式如图3：

将实施例1所示的方法制备得到的透明质酸-5β胆烷酸，溶解于甲酰胺中，加入EDC，室温下反应，而后加入NHS制备得到反应溶液；然后将溶于DMF，并缓慢滴入到上述制得反应溶液反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。反应后的体系依次在甲醇，甲醇/水(1/1)，纯水(含12.5mg/ml的氯化钠)和纯水中充分透析，每次透析12小时。充分透析除去有机溶剂后，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用。

实施例4

将透明质酸纳米颗粒溶解于超纯水中，终浓度为8mg/mL，在超声条件下：功率49-59W，时间30分钟(超声15分钟，停10分钟，继续超声15分钟)，温度5℃。超声开始时逐滴加入溶于DPT的二甲基亚砜溶液。超声完毕后转移至透析袋中透析4小时截(留量为12-14kMWCO)，冷冻干燥即可制得靶向性纳米抗癌药物(HANP/DPT)。

实施例5

将透明质酸纳米颗粒溶解于超纯水中，终浓度为5mg/mL，搅拌超声辅助溶解；利用均质仪匀浆透明质酸溶液，控制压力在2000～2500psi，循环3-5分钟。而后将DPT溶解于少量二甲基亚砜，缓慢滴加到均质仪中，保持压力为2000～2500psi，循环30次，反应产热，尽量保持低温。(均质仪要求反应液最小体积为10mL)；将均质仪处理后的产物装入透析袋，在纯水中透析4-6小时后，冷冻干燥，得到白色粉末，即为靶向性纳米抗癌药物。

实施例6

肿瘤靶向性纳米抗癌药物粒径分析

称取1mg HANP和1mg HANP/DPT分别溶于1mL超纯水中。在超声条件下：功率49-59W，时间30分钟(超声15分钟，停10分钟，继续超声15分钟)，温度4℃-7摄氏度。超声后使用0.45um滤膜过滤，等梯度稀释三次，使用动态光散射仪测量其粒径大小，每个样品测量三次。

表1：动态光散射测得HANP和HANP/DPT的粒径。

样本	粒径(nm)
		HANP	197±9.2
HANP/DPT	215.2±53.6

由表一结果可以看到HANP的平均粒径为197.0±39.2nm.该粒径属于正常胶束范围内，同时也满足EPR效应。HANP/DPT的平均粒径为215.2±53.6nm。相比纳米颗粒而言之增加了8nm左右，不影响纳米材料所特有的属性。总之，靶向性抗癌药物粒径符合纳米胶束的级别且没有产生较大的改变。

实施例7

装载量和包封率的测定

使用高效液相色谱(HPLC)对HANP/DPT纳米复合粒子进行药物装载量和包封率的测试。

色谱条件：分析柱为C18(Thermal scientific，C18，5μm,250×4.6mm，室温)；流动相为乙腈-水(20：80，各含0.1％TFA)；流速为1.0mL/min，样品经0.45μm滤器过滤，进样量为20μL，检测波长为254nm。

DPT标准液配制和标准曲线：精确称取羟基喜树碱标准品2mg，用乙腈超声溶解，得到1mg/mLDPT标准液，并用乙腈：水(1:1)梯度稀释至1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg/mL的标准样品。之后由稀至浓进行HPLC分析，以峰面积(A)对浓度(C)作图，得到DPT浓度标准曲线。

不同浓度DPT装载量和装载率的测定：使用均质仪分别装载不同理论装载量的HANP/DPT(10％,20％和40％)，冷冻干燥待用。精确称取不同HANP/DPT纳米冻干复合物1mg，加入0.5mL甲醇超声辅助溶解，而后加入等量的去离子水配成1mg/mL的样品溶液，用高效液相色谱检测其峰面积，根据游离DPT的标准曲线计算HANP/DPT的装载量和包封率。包封率％＝载药纳米复合物中DPT的质量/DPT的投药量*100％。

如图5所示，根据1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg/mL浓度的标准样品所对应的的标准峰面积，绘制散点图，并在散点图的基础上做出标准曲线。得到标准曲线为y＝58.07x-0.14，R2＝0.98413。

如图9所示，通过HPLC测量不同装载量HANP/DPT的吸收波峰。能够看到HANP/DPT在28分钟出现一个较大的吸收波峰，这与DPT出现的波峰时间相一致。

表2装载不同量DPT的HANP/DPT实际装载量和装载效率。

如表2所示，根据DPT标准曲线公式(y＝58.07x-0.14)和包封率计算公式(载药纳米复合物中DPT的质量/DPT的投药量*100％)。装载不同量DPT的HANP/DPT实际包封率都非常高，尤其是HANP/DPT(40％)的包封率能够达到95.44％。说明HANP/DPT具有较高的装载量，能够很高效率的装载40％的DPT，进而在提高治疗效果的基础上，最大限度的降低DPT的用药量和用药次数。

实施例8

HANP/DPT的体外药物释放试验

DPT从HANP纳米颗粒中释放出来通过酶标仪进行测量，进而计算出释放量。称取20mgHANP/DPT溶于2mL的1×PBS溶液(PH＝4.23)中，在超声条件下：功率49-59W，时间30分钟(超声15分钟，停10分钟，继续超声15分钟)，温度4℃-7摄氏度。

分别取出1mL的上述溶液倒入透析袋中(留量为12-14k MWCO),随机选取一组为实验组，另一组为对照组。在实验组的透析液中加入2000U透明质酸酶；对照组加入与透明质酸酶体积相同的PBS。再将透析袋分别沉浸在20mL PBS溶液(PH＝4.23)中并以每分钟100转轻微摇动。

每一个时间点(1,3,6,9,12,24和48小时)，从20mL PBS溶液中取出0.2mL上清液待用，并添加0.2mL新鲜PBS溶液。通过酶标仪测量每个时间点上清液的紫外吸收波长。DPT的释放量由450nm紫外光谱确定。

图10所示实验组在6小时的药物释放量为45％左右，而对照组在6小时的药物释放效率为35％左右。表明实验组和对照组在前6小时对DPT的释放效果差别不大，可能由于透明质酸酶对透明质酸的分解效率在短时间内没有达到较好的效果。然而从6小时到9小时能够观察到实验组的释放量急剧增加到70％，在48小时实验组的药物释放量达到90％作用，而对照组达到了65％。因此我们可以认为从9小时开始实验组和对照组的药物释放效果具有明显的差异性。这归功于透明质酸酶在PBS溶液中对透明质酸的分解作用。

实施例9

HANP/DPT稳定性分析

称取6mg HANP/DPT溶于0.6mL的超纯水中，在超声条件下：功率49-59W，时间30分钟(超声15分钟，停10分钟，继续超声15分钟)，温度4℃-7摄氏度。

取出三个1.5mL的EP管，向每个EP管中分别加入900uL的超纯水，PBS和DMEM(含有10％胎牛血清和1％抗生素)，然后分别取出100uL上述溶液随机加入到三个1.5mL的EP管中，水浴超声10分钟。

超声后，静止于超净台中，分别于24，48和72小时观察有无沉淀析出并用相机拍摄图片。图11所示通过相机拍摄的照片可以看出，在24小时和48小时内，超纯水，PBS和DMEM培养基中均未出现沉淀。然而72小时在三个EP管中都发现有沉淀析出。HANP/DPT具有很好的稳定性能够在上述溶液中保存较长时间不至于析出，说明HANP/DPT能够有效改善DPT水溶性和稳定性。

实施例10

HANP/DPT细胞毒性测试

取出在生长对数期，生长状况较好的A549细胞铺于96孔板，每孔100uL，约8000个细胞。37℃、5％CO₂、95％相对湿度的恒温箱孵育过夜。称取适量的DPT和HANP/DPT溶于含血清培养基中。在超声条件下：功率49-59W，时间30分钟(超声15分钟，停10分钟，继续超声15分钟)，温度4℃-7摄氏度。于无菌环境中取出适量的上述药物培养基稀释至100、50、10、1、0.1、0.01、0.001uM药物浓度。

而后缓慢吸取96孔板中旧的培养基，分别加入不同浓度100ul DPT和HANP/DPT的培养基溶液。在37℃、5％CO2、95％相对湿度的恒温箱孵育24、48、72h后，每孔加入MTT(5mg/mL)10uL，并培养4小时。4小时后，吸净药液，每孔加入150uL DMSO，震动15mins后，用酶标仪测量490nm处吸光度值。

取出在生长对数期，生长状况较好的NIH-3T3鼠源正常成纤维细胞铺于96孔板，每孔100uL，约10000个细胞。37℃、5％CO2、95％相对湿度的恒温箱孵育过夜。称取适量的DPT和HANP/DPT溶于含血清培养基中。在超声条件下：功率49-59W，时间30分钟(超声15分钟，停10分钟，继续超声15分钟)，温度4℃-7摄氏度。在无菌环境下取出适量的上述药物培养基稀释至100、50、10、1、0.1、0.01、0.001uM药物浓度梯度。

其次吸取96孔板中旧的培养基，分别加入不同浓度100uL DPT和HANP/DPT的培养基溶液。在37℃、5％CO2、95％相对湿度的恒温箱孵育24、48、72h后，每孔加入MTT(5mg/mL)10uL，并培养4小时。4小时后，吸净药液，每孔加入150uL DMSO，震动15分钟后，用酶标仪测量490nm处吸光度值。

如图12所示，随药物浓度增加和作用时间的延长，A549肿瘤细胞存活率逐渐下降。100uM的DPT作用72h后，细胞存活率降至35％左右。IC50为100nM。100uM的HANP/DPT作用72h后，细胞存活率降至30％左右,是由于HA能与A549细胞上过表达的CD44受体结合，使得药物靶向性提高。IC50为100nM。HANP/DPT对A549细胞的毒性明显是高于DPT的，这是因为A549肿瘤细胞表面有过度表达的CD44F分子，透明质酸纳米颗粒能够与CD44分子特异性结合，通过细胞介导的内吞作用进入到细胞，再经由透明质酸酶的分解是的DPT在细胞质中释放出来，达到治疗肿瘤，提高疗效的目的。

如图13所示，随药物浓度增加和作用时间的延长，NIH-3T3细胞存活率逐渐下降。100uM的DPT作用72h后，细胞存活率降至68％左右。100uM的HANP/DPT作用72h后，细胞存活率降至65％左右。HANP/DPT和DPT对A549细胞的毒性没有显著地统计学差异。这是由于3T3属于正常细胞，在其细胞表面没有过度表达的CD44分子，因此HANP/DPT不能通过主动靶向进入正常细胞以实现高效治疗的目的。

Claims (26)

1.一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于该组合物包括去氧鬼臼毒素类药物和透明质酸-5β胆烷酸，所述的透明质酸-5β胆烷酸以胶束形式包裹去氧鬼臼毒素类药物；

所述的去氧鬼臼毒素类药物包括以下化合物的一种或多种：

1)结构式Ⅰ的化合物

2)结构式Ⅰ的化合物中一个或多个基团由其他基团代替的化合物，并具有结构式Ⅰ的化合物相同活性的化合物；

所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物具有以下结构单元Ⅱ：

所述的m为大于等于1的正整数。

2.根据权利要求1所述的一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于：所述透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒和去氧鬼臼毒素类药物的重量比1：0.1-1:0.7，优选为1：0.2-1:0.4。

3.根据权利要求1或2所述的一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于：m为1～200，优选，m为1～50。

4.根据权利要求1或2所述的一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于透明质酸-5β胆烷酸化合物的结构式如下：

所述的m和n均为大于等于1的正整数。

5.根据权利要求4所述的一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于：m为1～200，n为1～200，优选，m为1～50，n为1～50。

6.根据权利要求1或2所述的一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于透明质酸-5β胆烷酸化合物的结构式如下：

所述的m、n和o均为大于等于1的正整数。

7.根据权利要求6所述的一种含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物，其特征在于：m为1～200，n为1～200，o为1～200，优选m为1～50，n为1～50，o为1～50。

8.一种制备权利要求1或2所述的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)将透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒在水中溶解，得到透明质酸-5β胆烷酸纳米胶束；

2)将治疗有效量的去氧鬼臼毒素类药物用药学上可接受溶剂溶解，与所述的纳米胶束混合后，经超声或高压均质机处理，溶液用透析法分离取出有机溶剂和小分子，将该溶液冷冻干燥所述的药物组合物。

9.根据权利要求8所述的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物的制备方法，其特征在于：将透明质酸纳米颗粒溶解于超纯水中，终浓度为1-10mg/mL，在超声条件下：功率49-59W，时间20～40分钟，温度4℃-7℃；超声开始时逐滴加入溶于DPT的二甲基亚砜溶液；超声完毕后转移至透析袋中透析3～5小时截，冷冻干燥即可制得药物组合物。

10.根据权利要求8所述的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物的制备方法，其特征在于：将透明质酸纳米颗粒溶解于超纯水中，终浓度为1-10mg/mL，搅拌超声辅助溶解；利用均质仪匀浆透明质酸溶液，控制压力在2000～2500psi，循环3-5分钟；而后将DPT溶解于少量二甲基亚砜，缓慢滴加到均质仪中，保持压力为2000～2500psi，循环25～40次，反应产热，尽量保持低温；将均质仪处理后的产物装入透析袋，在纯水中透析4-6小时后，冷冻干燥，即可制得药物组合物。

11.一种去氧鬼臼毒素类药物的药物制剂，该药物制剂由权利要求1或2所述的含去氧鬼臼毒素类药物的药物组合物加入或不加入药学上可接受药物辅料制备得到。

12.根据权利要求9所述的一种去氧鬼臼毒素类药物的药物制剂，其特征在于所述的药物制剂注射剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂。

13.透明质酸-5β胆烷酸化合物，该化合物具有以下结构单元：

所述的m为大于等于1的正整数。

14.根据权利要求1所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物，其特征在于：m为1～200，优选，m为1～50。

15.根据权利要求1所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物，其特征在于该化合物的结构式如下：

所述的m和n均为大于等于1的正整数。

16.根据权利要求15所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物，其特征在于：m为1～200，n为1～200，优选，m为1～50，n为1～50。

17.根据权利要求13所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物，其特征在于该化合物的结构式如下：

所述的m、n和o均为大于等于1的正整数。

18.根据权利要求17所述的透明质酸-5β胆烷酸化合物，其特征在于：m为1～200，n为1～200，o为1～200，优选m为1～50，n为1～50，o为1～50。

19.一种制备权利要求15或16所述的透明质酸-5β胆烷酸的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)5β-胆烷酸溶于甲醇，加入浓盐酸反应；然后加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗，干燥，获得白色粉末状胆烷酸甲酯；

2)将胆烷酸甲酯溶于DMF中，缓慢加入EDA反应；然后加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗干燥，获得白色粉末状CA-NH₂；

3)将透明质酸溶解于甲酰胺中，加入EDC，室温下反应，而后加入NHS；然后将CA-NH2溶于DMF，并缓慢滴入到HA/EDC/NHS反应液中反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。

20.根据权利要求19所述的制备透明质酸-5β胆烷酸的方法，其特征在于5β-胆烷酸与盐酸的摩尔比为1：1-1.5；5β-胆烷酸与乙二胺EDA的摩尔比为1：40-45；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与透明质酸摩尔比为1:1.2；透明质酸与5β-胆烷酸的摩尔比为1:5～20。

21.一种制备权利要求15或16所述的透明质酸-5β胆烷酸的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)将透明质酸溶解于去离子水中，加入四丁基氢氧化铵反应制得HA-TBA；

2)将HA-TBA溶解于二甲基亚砜中，而后加入5β-胆烷酸、EDC和NHS反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。

22.根据权利要求21所述的制备透明质酸-5β胆烷酸的方法，其特征在于作为优选，透明质酸与四丁基氢氧化铵摩尔比为1：600-3000；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与透明质酸摩尔比为1:1.2；透明质酸与5β-胆烷酸的摩尔比为1:5～20。

23.一种制备权利要求17或18所述的透明质酸-5β胆烷酸的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)将透明质酸-5β胆烷酸，溶解于甲酰胺中，加入EDC，室温下反应，而后加入NHS制备得到反应溶液；

然后将溶于DMF，并缓慢滴入到上述制得反应溶液反应制得所述的透明质酸-5β胆烷酸。

24.透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒，该纳米颗粒由权利要求13～18任意一项权利要求所述的透明质酸-5β胆烷酸制备得到。

25.一种制备权利要求24所述的透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒的方法，其特征在于该方法将制备得到透明质酸-5β胆烷酸反应体系依次在甲醇，甲醇/水溶液，氯化钠纯水溶液和纯水中充分透析，每次透析8～20小时；充分透析除去有机溶剂后，干燥获得透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒。

26.根据权利要求25所述的一种制备透明质酸-5β胆烷酸纳米颗粒的方法，其特征在于：甲醇/水溶液的体积比为1:1，氯化钠纯水溶液的浓度为12.5mg/ml。