CN102988999B - 姜黄素-多糖类偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及姜黄素-多糖类偶联物及其制备方法与应用。其制备方法为：首先通过酰胺反应将二胺类化合物的一端氨基接枝到多糖上，得到游离一端氨基的多糖大分子；随后以希夫碱反应在多糖骨架上引入了姜黄素。其特征包括：1通过对姜黄素的接枝改性，提高了其水溶性及体内外稳定性，生成的姜黄素-多糖类偶联物可单独用作高分子新药。2.姜黄素-多糖类偶联物具较强的口服吸收促进作用，安全性好，与其它药物联用时，能起到促进药物吸收、提高疗效、降低该纳物毒副作用等效果。3.疏水性基团姜黄素的引入使多糖分子两亲性增加，姜黄素-多糖类偶联物在水性介质中能自组装为纳米胶束，可用作难溶性药物的载体。本发明制备方法简单，成本较低，适用于大规模连续生产。

Description

姜黄素-多糖类偶联物及其制备方法与应用

技术领域：本发明属于生物医学材料领域，具体涉及姜黄素-多糖类偶联物的制备方法及应用。

背景技术：

姜黄素(curcumin)是从姜科植物的根茎中提取的一种黄酮类药物，可溶于甲醇、乙醇、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂和碱水中，而在中性至酸性水溶液中溶解度极低。姜黄素来源广泛，价格低廉，高效低毒，具有着极大的药用研究价值。除了具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用外，近年来的研究发现，姜黄素还可能通过多种机制(下调MDR1、survivinmRNA表达和P-gp、survivin蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡等)逆转肿瘤的多药耐药性。另有文献报道，姜黄素与其它药物联用时，能起到促进药物吸收、提高疗效、降低该药物毒副作用等效果。如姜黄素与紫杉醇协同可抑制人卵巢癌细胞系OC₃的增殖，二者联合化疗有增效减毒作用(刘冠嫒等，紫杉醇和姜黄素联用对人卵巢癌细胞系OC₃的抑制作用，山东大学学报(医学版)，2004，42(3)，325-328)；姜黄素也可以通过上调HO-1的表达，降低bFGF的表达来发挥对环孢素A肾毒性的保护作用(刘慎微，付艳红，姜黄素对大鼠环孢素A肾毒性的防治作用，中国药师，2007，05，39-41)。在体外实验中，用1、5、10μM姜黄素处理KB-V1细胞(耐药人宫颈癌细胞株)72h后，Western blot和RT-PCR分析结果显示姜黄素能明显降低细胞膜上的表达，并发现姜黄素处理组中P-糖蛋白底物罗丹明123在细胞内的蓄积增加以及其外排减少，进一步证实姜黄素可抑制P-糖蛋白的转运功能。在SGC7901/VCR、K562/A02中发现姜黄素亦能调节P-糖蛋白的表达和功能，即下调P-糖蛋白的表达和抑制其功能，导致化疗药物在细胞内的浓度增高，而证实姜黄素能逆转多种肿瘤耐药细胞的耐药性，并呈浓度依赖性。何鑫等探讨了姜黄素对P-糖蛋白底物他林洛尔人体药物代谢动力学的影响及其与P-糖蛋白编码基因MDR1基因多态性的关系，证实口服姜黄素能明显促进他林洛尔的吸收，抑制他林洛尔的排泄，推测姜黄素对人体内转运体P-糖蛋白具有抑制作用，且姜黄素对人体转运体P-糖蛋白的抑制与MDR1基因型无关(何鑫等，姜黄素对P-糖蛋白底物他林洛尔人体药物代谢动力学的影响及其与P-糖蛋白编码基因MDR1基因多态性的关系，Herald of Medicine，2007，26，144-145)。

由于姜黄素本身结构上具有多个活泼基团(如β-二酮结构)，导致其体内外稳定性均不佳，生物利用度很低。姜黄素对pH、温度、湿度、光照均敏感，对姜黄素体内外稳定性及其生物转化或降解产物的研究较多，结果也不尽相同。

体外研究普遍认为：姜黄素的降解产物主要为阿魏酸和阿魏酰甲烷，其降解反应为一级动力学过程；姜黄素在pH 5～6下稳定性较好，pH升高使其降解速度增加，而pH≤5时虽然姜黄素比较稳定，但溶解度很低，关于pH值对姜黄素稳定性的影响的相关文献报道较为混乱，不同的实验条件及缓冲盐体系对其t_1/2值均有较大影响；姜黄素光敏性较强，室内光线对其影响较小，但室外光照条件下会迅速降解，应避光保存；部分表面活性剂(如SDS)能提高姜黄素的稳定性，而亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠等抗氧剂则大大加快了姜黄素的降解速度。

姜黄素的口服生物利用度低，大鼠口服给药剂量为0.1～1g·kg^-1时，ρmax均低于1μg·mL^-1，而在人身上进行实验时，尽管口服药物量高达12g，其ρmax也仅仅为50ng·mL^-1左右。姜黄素口服后在肠道可生物转化为葡糖苷醛酸和磺酸复合物，但其生物转化产物的比例尚未明确。

针对以上问题，有必要对姜黄素其进行结构修饰以便提高其稳定性和溶解度。席夫碱是指含有亚甲氨基(-RC＝N-)的化合物，该类化合物可由活泼的羰基化合物与伯胺发生缩合反应制得，具有结构简单，易于反应等特点。且文献报道氨基酸、缩氨脲、缩胺以及腙等类的Schiff碱及其衍生物与金属形成的配合物具有抑菌、杀菌、抗肿瘤、抗病毒等多方面的生物活性。迄今席夫碱的合成不仅仅限于醛和简单的胺，而逐步引入了各种具有生物功能的官能团，涉及到的活泼的羰基化合物及含有氨基(-NH₂)的化合物越来越广泛。

多糖是所有生命机体的重要组成部分，它是由单糖聚合成的线性或分支的聚合物，包括糖原、淀粉、氨基聚糖(如透明质酸)和纤维素等。多糖具有优良的生物相容性、易在生物体内被吸收代谢，此外由于多糖主链结构上存在大量的活性基团(如羧基和氨基等)，可以通过化学修饰改善其理化性质。

多糖高分子材料因其优良的生物活性在药物制剂领域的应用也越来越广泛。多糖-药物偶联物是指把小分子药物通过共价键链接在多糖高分子载体上，作为侧基的一部分。多糖-药物偶联物的优点如下：(1)对小分子药物而言，能增加药物的作用时间、提高药物的选择性、降低药物的毒性、提高疏水性药物溶解度等。(2)对多糖高分子而言，可以通过合理的化学修饰优化其生物特性，以发挥更好的疗效。如在透明质酸分子上引入疏水基团可改善其易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等不足；在壳聚糖分子上接枝甘草次酸可以增加其肝靶向性等。

两亲性聚合物在聚合物浓度超过临界胶束浓度(CMC)后可自发形成的热力学稳定体系的聚合物胶束，大小在几十到几百纳米范围内。通过对多糖骨架进行化学修饰得到的两亲性多糖类偶联物作为难溶性药物的载体，口服给药时，有助于减少药物对胃肠道的刺激性，增加吸收部位的药物浓度，提高药物在胃肠道中的稳定性，再加上胶束粒径较小，可以通过EPR效应和内吞作用进入细胞，从而提高了疏水性药物的口服生物利用度；注射给药时，有助于避免网状内皮系统(RES)的识别，延长体循环时间，也可偶联靶向配体，实现药物定位传递。

药物的吸收是指药物从给药部位向血液循环系统转运的过程，主要是通过胃肠道以及肺泡、皮肤、鼻粘膜和角膜等部位的上皮细胞进行的，药物的溶解性、解离度、溶出度、粘膜透过性、首过效应以及胃肠道的生理因素等均对药物的口服吸收有一定影响。为提高口服药物的生物利用度而进行的吸收促进剂研究，是药物制剂研究的热点。促进剂的促吸收机理比较复杂，虽然口服吸收促进剂的研究已较为深入，但临床应用还在初级阶段。传统的吸收促进剂如各种表面活性剂(SDS、胆盐、脂肪酸等)、氨基酸衍生物、螯合剂、环糊精等本身可能对人体存在不良反应。秉承着“安全、高效”的选用原则，姜黄素和多糖在吸收促进剂研究领域都显示了一定的应用前景。

综上所述，本专利通过二胺类物质为连接臂，其中一端氨基通过酰胺反应与多糖上的羧基结合，另一端氨基通过简单的希夫碱反应将黄酮类药物姜黄素接枝到多糖骨架上，生成优良的高分子-药物偶联物，由于姜黄素为疏水性药物，大大增强了多糖的两亲性，该偶联物可在水性环境形成稳定的胶束，具有以下特征：(1)姜黄素与亲水性多糖偶联后，可明显增加姜黄素的溶解度。(2)该偶联物在水溶液中可自组装形成纳米胶束，增加了姜黄素在水性介质中的稳定性。(3)该偶联物可添加至药学活性或药理活性分子或其制剂中，以促进其口服吸收，达到更好的治疗效果。且利用姜黄素-多糖类偶联物作为口服吸收促进剂的研究国内外均未见文献与专利报导。(4)该偶联物也可以单独用作高分子新药，发挥抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多方面药理作用。(5)该偶联物还可用作注射、口服给药的药学活性或药理活性分子的载体，提高疗效、降低该药物毒副作用。由于姜黄素与多糖通过具有pH敏感的亚胺键连接，偶联物在中性pH条件下稳定，在酸性条件下易水解还原为姜黄素和多糖。而肿瘤细胞内含体和溶酶体的酸碱度(pH 5～6)要明显低于细胞外酸碱度(pH 6.2～6.8)，因此当使用姜黄素-多糖类偶联物包载抗肿瘤药物可增加肿瘤靶向性，发挥减毒增效的作用。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种姜黄素-多糖类偶联物，通过二胺类连接臂将姜黄素接枝到大分子多糖上，一方面能够改善姜黄素的水溶性及稳定性，同时增强了多糖的生物活性，得到相互增效的希夫碱衍生物，该偶联物可以用作高分子新药，也可用作其他具有药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂，还可用作注射或口服给药的药学活性或药理活性分子的载体。本发明使姜黄素和多糖的应用具有更广阔的产业化前景。

本发明的另一个目的是提供上述偶联物的制备方法。

本发明还有另一个目的是提供上述偶联物在制药中的应用。

为达到上述目的，本发明提供一种新型姜黄素-多糖类偶联物，该偶联物是在多糖分子的羧基或经过衍生化形成的羧基上，通过二胺类化合物为连接臂，引入姜黄素，所形成的药物-多糖类偶联物结构改善了姜黄素的稳定性和溶解性。由于在亲水性的多糖骨架上引入了疏水基团，增强了其两亲性，故该偶联物能在水性介质中自组装为稳定的纳米胶束，不仅可以单独用作大分子新药，也可用作难溶性药物的增溶载体或吸收促进剂，提高药物的生物利用度。

所述的姜黄素-多糖类偶联物，选自未分级肝素；低分子量肝素；脱硫酸化肝素；透明质酸；软骨素；多硫酸化软骨素；海藻酸；羧基化壳聚糖及其衍生物：包括羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、季铵化羧甲基壳聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖；羧基化葡聚糖及其衍生物：羧甲基葡聚糖；羧基化葡聚糖及其衍生物：羧甲基香菇多糖。

所述的姜黄素-多糖类偶联物的制备方法，包括下列步骤：

将上述多糖溶于适当溶剂中，采用二胺类化合物为连接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂进行缩合反应，得到游离一端氨基的多糖活性中间体；将姜黄素与得到的活性中间体通过希夫碱反应生成姜黄素-多糖类偶联物。

所述的制备方法，其中适当溶剂选自水、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或上述的混合溶剂。

所述的制备方法，其中连接臂为对苯二胺、间苯二胺、邻苯二胺、胱胺、碳原子数2～12的亚烷基二胺。

所述的姜黄素-多糖类偶联物，可单独用作高分子新药，也可用作药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂，还可用作注射或口服给药的药学活性或药理活性分子的载体。所述药学活性或药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、黄酮类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类、维A酸类、环孢素类、二氢吡啶类、小蘖碱类抗肿瘤药物、甾体类或非甾体类抗炎药物、心血管药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。

该姜黄素-多糖类偶联物制备载药纳米胶束的方法操作步骤如下：姜黄素-多糖类偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到多糖类偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述多糖类偶联物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

该姜黄素-多糖类偶联物在制备药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂的质量浓度为0.1～90％，优选为0.1～35％。

具体方案如下：

在多糖分子链上引入疏水基团姜黄素，使其具有两亲性，在水介质中可自组装成纳米胶束，相对疏水的姜黄素聚集成内核，多糖分子亲水链形成高度亲水性外壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体网状内皮系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。因此这类姜黄素-多糖类偶联物既是难溶药物的优良载体，又是一种良好的高分子前体药物，还可用作其他药学活性或药理活性分子的吸收促进剂。该偶联物可用于注射或口服给药。该偶联物作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，表面光滑，均匀度好，再分散性好，载药量和包封率高。该偶联物作为口服吸收促进剂，水溶性好，毒副作用小，生物相容性好，具有明显的促进药物吸收的效果。姜黄素-多糖类偶联物的合成、胶束制备方法及作为口服吸收促进剂制备方法详细说明如下：

一、姜黄素-多糖类偶联物的合成

1、多糖活性中间体的制备

将多糖溶于适当溶剂中，采用二胺类化合物为连接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂进行缩合反应，反应时间为4～12h，室温反应至完全，反应终止后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2～3d，冷冻干燥得到游离一端氨基的多糖活性中间体。合成路线见图1。

在上述多糖活性中间体的制备方法中，所述溶剂优选为水、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或上述的混合溶剂；若多糖本身含有NH₂，则为避免发生内交联反应，需将多糖与过量的二胺类化合物混合均匀后再加入EDC与NHS；所述多糖、二胺类化合物、EDC、NHS的摩尔比优选为1∶2～20∶1～5∶1～5。

2、姜黄素-多糖类偶联物的合成

方法1：将姜黄素溶于适当有机溶剂中，直接加入上述多糖活性中间体粉末，加少量催化剂催化，避光条件下，超声回流2～12h，抽滤，滤饼用有机溶剂反复洗涤至滤液无色，以除去未反应的姜黄素及其降解产物，烘干，得橙黄色固体。

方法2：将姜黄素和多糖活性中间体分别溶于适当混合溶剂中，避光、磁力搅拌、加热条件下缓慢向多糖活性中间体溶液中滴加姜黄素，滴加时间为0.5～6h，滴加终止后继续反应1～12h，反复过滤除去不溶性杂质，于PBS缓冲液中透析6～24h，离心取上清液，冻干得橙黄色产物。方法1和方法2的合成路线见图2，

在上述姜黄素-多糖类偶联物的制备方法中：方法1所述反应溶剂优选为甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲酰胺；所述的催化剂选自醋酸、盐酸，调节反应液pH至酸性；方法1中，本应将反应粗产物以甲醇或乙醇为溶剂，在索氏提取器中加热回流一定时间以充分除去未反应的过量姜黄素。由于姜黄素稳定性差，易降解，且具有荧光显色特征，故将除杂过程优选为反复洗涤产物至取滤液点板，荧光下不显色；所述的用于洗涤的有机溶剂为无水甲醇、无水乙醇、无水乙醚、二氯甲烷中的一种或多种；所述多糖中间体和姜黄素的摩尔比优选为1∶1～10；更优选为1∶3～5。方法2所述反应溶剂优选为水和甲醇、水和乙醇、水和二氯甲烷或水和甲酰胺的混合溶剂；所述的PBS缓冲液pH范围优选为5.5～7.4；多糖中间体和姜黄素的摩尔比优选为1∶1～10，更优选为1∶3～5。

二、姜黄素-多糖类偶联物胶束的制备方法

按每1ml水中溶解3～30mg的姜黄素-多糖类偶联物的比例，将制得的姜黄素-多糖类偶联物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的多糖类偶联物胶束。

三、以姜黄素-多糖类偶联物作为载体制备含难溶性药物的胶束

姜黄素-多糖类偶联物溶于水，将难溶性药物如紫杉醇用适当溶剂溶解，与姜黄素-多糖类偶联物水溶液混合，经超声或高压均质处理，通过透析或超滤等方法出去有机溶剂及小分子，制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。

四、姜黄素-多糖类偶联物作为口服吸收促进剂的制备方法

避光条件下，将姜黄素-多糖类偶联物与上述药学活性或药理活性分子或其制剂均匀混合，所述的姜黄素-多糖类偶联物在制备药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂的应用中的质量浓度为0.1～90％，优选为0.1～35％。

本发明的有益效果：

一、本发明以亚烷基二胺、对苯二胺、间苯二胺、邻苯二胺或胱胺为连接臂，将黄酮类药物姜黄素接枝到大分子羧基多糖上，不仅增加了多糖骨架的药理活性，而且大大提高了疏水性药物姜黄素的水溶性和稳定性，生成的姜黄素-多糖类偶联物有望成为一种高分子新药、难溶性药物的载体或其他药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂，合成条件温和，反应简单，原料成本低，易于工业化生产。

二、本发明提供的姜黄素-多糖类偶联物，不仅具有多糖分子良好的生物学特性，还能更好发挥姜黄素抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑制P-糖蛋白活性、降低其他药物毒副作用等功效。

三、本发明提供的姜黄素-多糖类偶联物作为口服吸收促进剂具有生物可降解性和组织相容性好、价廉易得、无生物毒性等优点。

本发明提供的姜黄素-多糖类偶联物可用于口服或注射给药，具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。

附图说明：

图1：多糖活性中间体的合成路线

图2：姜黄素-多糖类偶联物的合成路线(R₁-COOH为多糖，NH₂-R₂-NH₂为亚烷基二胺、对苯二胺、间苯二胺、邻苯二胺、胱胺)

图3：季铵化羧甲基壳聚糖-姜黄素偶联物的粒径图谱

图4：姜黄素-多糖类偶联物的稳定性考察

图5：姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物与简单混合产物的稳定性考察

图6：包载抗肿瘤药物的姜黄素-多糖类偶联物的抗肿瘤活性考察(MTT法)

图7：包载紫杉醇的姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物与简单混合产物的抗肿瘤活性考察(MTT法)

图8：姜黄素-多糖类偶联物对环孢素A的在体肠吸收的影响

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1姜黄素-羧甲基壳聚糖的合成

取0.1mol羧甲基壳聚糖加入10ml水中，磁力搅拌30min至完全溶解，用醋酸调节PH至6～7左右，再加入0.5mol对苯二胺，混合均匀后再滴加0.2mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.3mol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应8h，透析2d，冷冻干燥得游离一端氨基的羧甲基壳聚糖中间体。取上述中间体分散于30ml甲醇中，加入0.3mol姜黄素的甲醇溶液，超声回流反应2h，所得粗产物用无水乙醇、无水乙醚、二氯甲烷反复洗涤至滤液无色，真空干燥得纯化后的姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物。

实施例2姜黄素-肝素的合成

取2mmol肝素溶于甲酰胺中，加入8mmol乙二胺，磁力搅拌2min，再加入3mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4.5mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应12h，反应结束后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2d，冷冻冻干得到游离一端氨基的肝素活性中间体。取上述所得肝素活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50℃磁力搅拌下，缓慢滴加6mmol的姜黄素的甲醇溶液，滴加时间为1.5h，滴完后继续反应2h，取产物旋转蒸发挥去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，3000r/min离心10min后取上清液，避光条件下于PBS缓冲液(pH＝6.8)中透析8h，小心移取透析袋内澄清液，冻干得最终产物姜黄素-肝素偶联物。

实施例3姜黄素-透明质酸的合成

取3mmol透明质酸溶于四氢呋喃中，加入10mmol间苯二胺，磁力搅拌5min，再加入4.5mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和6mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应12h，反应结束后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2d，冷冻冻干得到游离一端氨基的透明质酸活性中间体。取上述所得透明质酸活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50℃磁力搅拌下，缓慢滴加9mmol的姜黄素的甲醇溶液，滴加时间为2h，滴完后继续反应1h，取产物旋转蒸发挥去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，3000r/min离心10min后取上清液，避光条件下于PBS缓冲液(pH＝7.4)中透析6h，小心移取透析袋内澄清液，冻干得最终产物姜黄素-透明质酸偶联物。

实施例4姜黄素-羧甲基香菇多糖的合成

取0.2mol羧甲基香菇多糖加入15ml水中，磁力搅拌15min至完全溶解，用盐酸调节PH至5.5左右，再加入1mol邻苯二胺，混合均匀后再加入0.2mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.45mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应6h，透析2d，冷冻干燥得游离一端氨基的羧甲基香菇多糖中间体。取上述中间体分散于适量甲醇中，加入0.8mol的姜黄素的甲醇溶液，超声回流反应3h，粗产物用无水乙醇、无水乙醚、二氯甲烷反复洗涤至滤液无色，真空干燥得纯化后的姜黄素-羧甲基香菇多糖类偶联物。

实施例5姜黄素-羧甲基葡聚糖的合成

取0.2mol羧甲基葡聚糖加入15ml水中，磁力搅拌30min至完全溶解，用醋酸调节PH至6～7左右，再加入0.6mol丙二胺，混合均匀后再加入0.2mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.3mol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应12h，透析2d，冷冻干燥得游离一端氨基的羧甲基葡聚糖中间体。取上述中间体分散于适量甲醇中，加入0.9mol的姜黄素的甲醇溶液，超声回流反应2.5h，粗产物用无水甲醇、无水乙醚、二氯甲烷反复洗涤至滤液无色，真空干燥得纯化后的姜黄素-羧甲基葡聚糖偶联物。

实施例6姜黄素-软骨素的合成

取2mmol软骨素溶于甲酰胺中，加入8mmol胱胺，磁力搅拌2min，再加入3mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4.5mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应12h，反应结束后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2d，冷冻冻干得到游离一端氨基的软骨素分子。取上述所得软骨素活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50℃磁力搅拌下，缓慢滴加6mmol的姜黄素的甲醇溶液，滴加时间为1h，滴完后继续反应5h，取产物旋转蒸发挥去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，3000v离心10min后取上清液，避光条件下于PBS缓冲液(pH＝6.8)中透析6h，小心移取透析袋内澄清液，冻干得最终产物姜黄素-软骨素偶联物。

实施例7姜黄素-海藻酸的合成

取0.1mol海藻酸加入10ml的氢氧化钠溶液中，磁力搅拌10min，调节PH至7～8左右，再加入0.5mol丁二胺，混合均匀后再加入0.1mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.15mol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应8h，透析2d，冷冻干燥得游离一端氨基的海藻酸中间体。取上述中间体分散于适量甲醇中，加入0.3mol的姜黄素的甲醇溶液，超声回流反应2h，粗产物用无水甲醇、无水乙醇、无水乙醚、二氯甲烷反复洗涤至滤液无色，真空干燥得纯化后的姜黄素-海藻酸偶联物。

实施例8姜黄素-季铵化羧甲基壳聚糖的合成

取0.1mol季铵化羧甲基壳聚糖加入10ml水中，磁力搅拌30min至完全溶解，用醋酸调节PH至5左右，再加入0.3mol乙二胺，混合均匀后再滴加0.12mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.15mol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应6h，透析2d，冷冻干燥得游离一端氨基的季铵化羧甲基壳聚糖中间体。取上述中间体分散于30ml甲醇中，加入0.3mol姜黄素的甲醇溶液，超声回流反应2h，所得粗产物用无水乙醇、无水乙醚、二氯甲烷反复洗涤至滤液无色，真空干燥得纯化后的姜黄素-季铵化羧甲基壳聚糖偶联物。

实施例9姜黄素-多糖类偶联物纳米胶束的制备与CMC值测定

1、姜黄素-多糖药物偶联物纳米胶束的制备：避光条件下，姜黄素-多糖类偶联物40mg溶解在7ml水中，于室温搅拌0.5h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.45μm滤膜过滤，即得。

2、CMC：采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度增加，放射光谱中振动精细结构发生变化，激发光谱(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I₁/I₃比(在固定的激发波长下扫描，I₁、I₃分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中的I₃₃₈/I₃₃₃比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲性分子的浓度作图即可获得两亲性分子的表观CMC，结果见表1。

表1姜黄素-多糖类偶联物胶束的表征

实施例10以乙二胺为连接臂的姜黄素-多糖类偶联物的接枝率考察

分别取0.1mol多糖分子，加入10ml水中，磁力搅拌30min至完全溶解，用醋酸调节PH至6左右，再加入0.5mol乙二胺，混合均匀后再加入0.12mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.15mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应6h，透析2d，冷冻干燥得游离一端氨基的多糖中间体。随后将制得的多糖中间体分别按照方法1和方法2与5倍量的姜黄素反应，考察不同制备工艺的姜黄素接枝率的情况。

制备工艺1：将姜黄素溶于甲醇中，直接加入上述多糖中间体粉末，加少量醋酸催化，避光条件下，超声回流3h，抽滤，滤饼用无水乙醇、无水乙醚、二氯甲烷反复洗涤至滤液无色，以除去未反应的姜黄素及其降解产物，烘干，得橙黄色固体。

制备工艺2：将姜黄素和多糖中间体分别溶于甲醇-水体系，避光、磁力搅拌、加热条件下缓慢向多糖中间体溶液中滴加姜黄素，滴加时间为2h，滴加完毕后继续反应1h，反应终止后，反复过滤除去不溶性杂质，透析8h，离心取上清液，冻干得橙黄色产物。

表2姜黄素-多糖类偶联物的接枝率(w/w)

实施例11姜黄素-多糖类偶联物的溶解度考察

姜黄素-多糖类偶联物的溶解度考察方法：避光条件下，称取研成细粉的姜黄素-多糖类偶联物适量溶解在1ml水中，室温搅拌观察是否能完全溶解。

表3姜黄素-多糖类偶联物的溶解度

注：-几乎不溶++可以溶解+++溶解度较好++++易溶

实施例12姜黄素-多糖类偶联物的稳定性考察

姜黄素-多糖类偶联物的稳定性考察方法：精确配制以下溶液(姜黄素终含量为1mg/ml，其中姜黄素-多糖类偶联物的姜黄素含量由接枝率换算而得)：姜黄素的甲醇/水(50∶50)溶液，含有0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)的姜黄素的甲醇/水(50∶50)溶液，姜黄素-多糖类偶联物的甲醇/pH＝6.8PBS缓冲液(50∶50)。定容后迅速混匀，避光，置于恒温水浴锅中，25℃恒温，定时取样，用紫外分光光度计在425nm处测定姜黄素的吸光度值，计算姜黄素的残余量。实验结果见附图4，姜黄素在甲醇/水(50∶50)溶液中稳定性最差，在加入了0.1％表面活性剂SDS后(文献报道SDS具有提高姜黄素稳定性的作用)，姜黄素的稳定性有所提高，而几种姜黄素-多糖类偶联物中的姜黄素降解速度均低于前两者，证实了姜黄素-多糖类偶联物能提高姜黄素的稳定性。

取适量姜黄素-乙二胺-羧甲基壳聚糖，测得姜黄素接枝率为(10.20％，w/w)。精确配制姜黄素终含量为1mg/ml的姜黄素-乙二胺-羧甲基壳聚糖偶联物的甲醇/pH＝6.8PBS缓冲液(50∶50)以及等摩尔量(根据接枝率换算)的姜黄素与羧甲基壳聚糖简单混合的甲醇/pH＝6.8PBS缓冲液(50∶50)，定容后迅速混匀，避光，置于恒温水浴锅中，25℃恒温，定时取样，用紫外分光光度计在425nm处测定姜黄素的吸光度值，计算姜黄素的残余量，由此考察姜黄素-多糖偶联产物与简单混合产物的稳定性差异，结果见附图5。由于希夫碱反应简单，常温下将姜黄素与多糖进行混合也有可能发生反应，因此有必要对比简单混合产物与偶联产物的溶解度和稳定性差异。由实施事例11和12我们可以得出结论：通过本发明所述制备方法制得的姜黄素-多糖偶联产物的姜黄素接枝率远大于两者的简单混合产物，溶解度和稳定性也大大提高。

实施例13包载药学活性或药理活性分子的姜黄素-多糖类偶联物胶束的表征

1、姜黄素-多糖类偶联物纳米胶束的制备：避光条件下，姜黄素-多糖类偶联物40mg溶解在7ml水中，于室温搅拌0.5h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.45μm滤膜过滤，即得。

2、粒径：将1制备得到姜黄素-多糖类偶联物纳米胶束，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(MalvernInstruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表4。

3、包载药学活性或药理活性分子的姜黄素-多糖类偶联物胶束的载药量测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行载药量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表4。

表4包载药学活性或药理活性分子的姜黄素-多糖类偶联物胶束的表征

实施例14MTT法测定姜黄素-多糖类偶联物载药纳米胶束的抗肿瘤活性

将处于对数生长期的HepG2细胞用0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，分别以1×10⁵/ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μl，设五复孔，置37℃5％CO₂孵箱内培养24h左右。

对照品紫杉醇、阿霉素、全反式维甲酸分别配制成0.1、1、10、50μg/ml 4个浓度；取待测实施例1～3合成偶联物的载上述抗肿瘤药物的胶束用完全培养液分别配制相当于对应抗肿瘤药物浓度的4个浓度；取对应实施例1的偶联物组分姜黄素和羧甲基壳聚糖，与紫杉醇简单混合配制成对应浓度。分别加入上述细胞培养液中，孵育72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，继续培养4h，弃去全部上清，加入DMSO100μl/孔，微型振荡器上振动5min，使结晶完全溶解，于酶联仪570nm波长处测定吸光度值(A)，A值越高活细胞数也越多。根据A可计算药物对细胞的活力抑制率。

根据实验结果，见附图6、7，在不同浓度下经统计分析，不同的载抗肿瘤药物的姜黄素-多糖类偶联物纳米胶束的抗肿瘤活性均比原抗肿瘤药物单独存在的活性提高，载紫杉醇的姜黄素-羧甲基壳聚糖胶束的抗肿瘤活性也高于紫杉醇与姜黄素和羧甲基壳聚糖简单混合制剂。

实施例15姜黄素-多糖类偶联物对药学活性分子的促吸收行为(肠吸收实验)考察

以实施例1为例，考察其对药学活性分子在体肠吸收情况的影响。

实验前将大鼠禁食过夜，自由饮水，用20％的乌拉坦腹腔注射麻醉(1.2g/kg)，固定。分离十二指肠、空肠8-10cm，在上端切口处插管(此管连接恒流泵)，结扎，用预热至37℃的生理盐水将肠内容物冲洗干净，然后在出液口插管，结扎。灌注KR液，0.2ml/min，平衡15min。将伤口用浸有生理盐水的纱布覆盖，于红外灯下将大鼠保温。用药液进行灌注，0.2ml/min，平衡30min后，收集出液口药液。每隔15min收集一次，共收集6～7个点时间点。

精确配制药学活性分子终浓度为30ug/ml的混悬剂，分别添加0.1％的姜黄素-多糖类偶联物、姜黄素、多糖、姜黄素与多糖(组分比例同偶联物)、维拉帕米与姜黄素-多糖类偶联物，其中，姜黄素-多糖类偶联物与药学活性分子不是通过胶束包载的方式结合，而是均匀混合。

实验结果见附图8，与环孢素A的混悬剂相比，添加了姜黄素-羧甲基壳聚糖后，药物吸收速率常数Ka值明显增大；姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物对环孢素A的促吸收作用好于姜黄素、多糖及两者简单的混合。对比只添加姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物，在同时添加了P-糖蛋白抑制剂维拉帕米和的姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物的情况下，环孢素A的吸收量没用明显增加，因此姜黄素-羧甲基壳聚糖对环孢素A具有较好的促吸收效果有可能是由于姜黄素是P-糖蛋白抑制剂的原因。

同样，对不同的姜黄素-多糖类偶联物进行肠吸收实验(空肠)，发现姜黄素-多糖类偶联物的Ka均比混悬剂的值高，结果见表5，同样说明了姜黄素-多糖类偶联物能够促进药物的吸收。

表5姜黄素-羧甲基壳聚糖偶联物对药学活性分子的促吸收行为考察(空肠)

Claims (7)

1.一种姜黄素-多糖类偶联物，其特征在于该偶联物是在多糖的羧基上，通过二胺类连接臂引入姜黄素，使其具有两亲性质，在水性介质中可自组装为纳米胶束，所述多糖为未分级肝素，低分子量肝素，脱硫酸化肝素，透明质酸，软骨素，多硫酸化软骨素，海藻酸，羧甲基葡聚糖，羧甲基香菇多糖或羧基化的壳聚糖；所述二胺类连接臂为对苯二胺、间苯二胺、邻苯二胺、胱胺或碳原子数2～12的亚烷基二胺；所述的姜黄素-多糖类偶联物的制备方法包括下列步骤：

a.多糖活性中间体的制备方法

将所述多糖溶于适当溶剂中，采用二胺类化合物为连接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂进行缩合反应，得到游离一端氨基的多糖活性中间体；所述的适当溶剂选自水、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或上述溶剂的混合溶剂；所述多糖、二胺类连接臂、EDC、NHS的摩尔比为1∶2～20∶1～5∶1～5；

b.姜黄素-多糖类偶联物的制备方法

制备方法1：将姜黄素溶于适当有机溶剂中，直接加入上述多糖活性中间体粉末，加催化剂催化，避光，超声回流2～12h，抽滤，滤饼用有机溶剂反复洗涤至滤液无色，以除去未反应的姜黄素及其降解产物，烘干，得橙黄色固体，所述的适当有机溶剂选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲酰胺；所述的催化剂选自醋酸、盐酸；所述的多糖活性中间体和姜黄素的摩尔比为1∶3～5；

制备方法2：将姜黄素和多糖活性中间体分别溶于适当混合溶剂中，避光、磁力搅拌、加热条件下缓慢向多糖活性中间体溶液中滴加姜黄素，滴加时间为0.5～6h，滴加终止后继续反应1～12h，反复过滤除去不溶性杂质，于PBS缓冲液中透析6～24h，离心取上清液，冻干得橙黄色产物，所述的混合溶剂选自水和甲醇、水和乙醇、水和二氯甲烷或水和甲酰胺的混合溶剂；所述的多糖活性中间体和姜黄素的摩尔比为1∶3～5。

2.根据权利要求1所述姜黄素-多糖类偶联物，其特征在于所述的羧基化的壳聚糖为羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、季铵化羧甲基壳聚糖、或N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖。

3.权利要求1所述的姜黄素-多糖类偶联物在制备药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂中的应用、或者在制备为高分子新药中的应用、或者在制备药学活性或药理活性分子的载体中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药学活性或药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、黄酮类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类、维A酸类、环孢素类、二氢吡啶类、小蘖碱类抗肿瘤药物、甾体类或非甾体类抗炎药物、心血管药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：制备的药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂为口服给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂；制备的高分子新药为口服或注射给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂、注射用冻干粉针；制备的药学活性或药理活性分子的载体为口服或注射给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂、注射用冻干粉针。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于制备药学活性或药理活性分子的载体的方法为：姜黄素-多糖类偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到多糖类偶联物纳米胶束；将药学活性或药理活性分子用药学上可接受溶剂溶解后，与所述多糖类偶联物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：姜黄素-多糖类偶联物在制备药学活性或药理活性分子的口服吸收促进剂的质量浓度为0.1～35％。