CN101745119B - 羧酸类药物-多糖偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羧酸类药物-多糖偶联物及其制备方法与应用。该偶联物通过碳原子数为2～12的亚烷基二胺为连接臂，将羧酸类药物和多糖的羧基以酰胺键连接。与原羧酸类药物相比，该偶联物药理作用增强，不良反应降低，安全性更高。此外，利用疏水性羧酸类药物，可以使该偶联物具有两亲性，从而能够作为难溶或微溶性药物的载体。本发明制备方法简单，工艺成熟，产率高，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种具备良好生理活性和生物可降解性的羧酸类药物-多糖偶联物作为药物载体或高分子前体药物，本发明还涉及该偶联物的制备方法及其应用。
背景技术
在药物研究中发现，有近40％的药物是水难溶性的，易导致制剂制备困难和生物利用度低等问题，因此提高难溶性药物的溶解度，进而提高药物的生物利用度成为药剂领域的一个热点和难点。
在制剂过程中，常采用微乳、脂质体及固体分散体等技术，或将药物制备成盐、加入潜溶剂、加入助溶剂以及加入表面活性剂等方法増溶。然而，脂质体作为药物载体，仍存在包封率低、靶向分布不理想、贮存中稳定性欠佳等缺点；成盐往往需要强酸或强碱条件，对许多药物不适用；生理安全的潜溶媒很少，且用量又有所限制；通过药物形成络合物而增加药物溶解度的助溶剂安全性又不易保证。高分子-药物偶联物应运而生，即将小分子疏水性药物接入大分子载体，制成高分子前药，特别是纳米级聚合物粒子由于其小尺寸效应和表面、界面效应等，不仅可以提高药效、减轻不良反应，且方便患者使用。其突出优势还在于：①增加疏水药物可溶性；②被动靶向和缓控释作用；③避免被肾脏快速清除，延长药物血浆半衰期等。然而，大多数合成高分子均存在着或多或少的溶血、热源反应及渗透性等方面缺陷；生物大分子中各种水溶性蛋白质则易被蛋白酶水解，在体内降解速度较快。因此，天然存在的多糖，就显现出其独特的优势。
多糖是所有生命有机体的重要组分，在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面有重要作用。同时，多糖具有优良的生物相容性并能够在生物体中酶解成易被活体吸收、无毒副作用的小分子物质，此外，多糖的主链结构还有大量的氨基和羧基，易于化学修饰(如酰化、硫酸酯化、接枝与交联等)而改善其理化性质。故以多糖作为高分子-药物偶联物的水溶性部分，能够克服上述偶联物中高分子选择性的限制。现已有部分多糖-药物偶联物处于研究阶段，但这些偶联物仍存在以下缺陷：高分子化学反应本身固有的困难，使得合成条件较为苛刻，产率较低；当不能通过羟基、氨基等官能团直接进行缩合时，所使用的连接臂较为复杂，如氨基酸或多肽；某些疏水性药物的接枝率较低，载药量不高，导致难以达到给药剂量，影响治疗效果等。
针对以上问题，本专利以天然多糖为骨架，在多糖的羧基或经衍生化形成的羧基上通过简单的亚烷基二胺为连接臂，引入疏水性羧酸类药物，从而合成优良的高分子前体药物；此外，由于该羧酸类药物-多糖偶联物含有亲水性多糖部分，和疏水性羧酸类药物部分，使其具有了两亲性，故该偶联物可同时作为药物载体，兼具聚合物胶束的特征：1)在水溶液中可自组装形成纳米胶束，避免了有机溶剂、表面活性剂、交联剂或加热条件的使用；2)在疏水基团和多糖分子链与药物的双重作用下，显著提高药物的载药量，稳定时间也明显延长；3)由于増溶在偶联物内核的药物是以非共价的方式与载体结合，使得运载的药物能够较为容易释放出来，构成快速释药的速释部分；化学偶联的药物则构成恒速释药的缓释部分，以维持平稳、均匀的有效血药浓度，起到长效作用。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种生物可降解的羧酸类药物-多糖偶联物。该偶联物以天然来源的多糖作为原料，通过化学修饰得到安全性好、载药量高、生理活性好的高分子前体药物及药物増溶载体。
本发明的另一个目的是提供上述偶联物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述偶联物在制药中的应用。
为达到上述目的，本发明提供一种羧酸类药物-多糖偶联物，该偶联物是在多糖分子的羧基或经过衍生化形成的羧基上，通过亚烷基二胺为连接臂，引入疏水基团——疏水性羧酸类药物，使其具有两亲性性质，在水介质中可自组装为纳米胶束。由于疏水基团为羧酸类药物，故该偶联物具有药理学活性，可用作单一高分子前体药物，也可用作难溶性药物的増溶载体。
所述的羧酸类药物-多糖偶联物，其中羧酸类药物，选自疏水性的含羧基抗肿瘤药物、抗炎药物、抗感染药物、调血脂药物、抗血栓药物。
所述的羧酸类药物-多糖偶联物，其中多糖，选自原本含有羧基的多糖未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、透明质酸、软骨素、多硫酸化软骨素、海藻酸和原本不具有羧基但引入羧基的多糖壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、葡聚糖、真菌多糖。
所述的羧酸类药物-多糖偶联物的制备方法，包括下列步骤：
将羧酸类药物溶于适当有机溶剂中，采用亚烷基二胺为连接臂，二环己基碳化二亚胺(DCC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂进行缩合反应，得到游离一端氨基的活性中间体；将含羧基或经衍生化成羧基的多糖溶于反应溶剂中，与得到的活性中间体通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂，进一步羧基和氨基缩合反应。
所述的制备方法，其中适当有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜。
所述的制备方法，其中连接臂为碳原子数2～12的亚烷基二胺结构。
所述的制备方法，其中反应溶剂选自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
所述的羧酸类药物-多糖偶联物，可以用于注射、口服、外用或粘膜给药的药学活性或药理活性分子的载体，也可单独用作高分子前体药物。其中该药学活性或药理活性分子选自：紫杉烷类、喜树碱类、黄酮类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类、维A酸类、环孢素类、二氢吡啶类、小蘖碱类抗肿瘤药物、甾体类或非甾体类抗炎药物、心血管药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。
该羧酸类药物-多糖偶联物制备载药纳米胶束的方法操作步骤如下：羧酸类药物-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到多糖偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解，与所述多糖偶联物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。
具体方案如下：
在含羧基或经衍生化形成含羧基的多糖分子链上引入疏水基团(羧酸类药物)，使其具有两亲性，在水介质中可自组装成纳米胶束，相对疏水的羧酸类药物聚集成内核，多糖分子亲水链形成高度亲水性外壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体网状内皮系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。因此这类羧酸类药物-多糖偶联物既是一类优良的药物载体，尤其对于难溶性药物，又是一种良好的高分子前体药物。该偶联物可用于注射、口服、外用或粘膜给药。该偶联物作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，表面光滑，均匀度好，再分散性好，载药量和包封率高。
羧酸类药物-多糖偶联物的合成及胶束制备方法详细说明如下：
一、羧酸类药物-多糖偶联物的合成
1、活性中间体的的制备
a.将羧酸类药物溶于适当有机溶剂中，以二环己基碳化二亚胺(DCC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，控温反应至完全，抽滤除去沉淀，加入过量乙酸乙酯洗涤；对抽滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，除去溶剂，得到活化中间酯。
b.将亚烷基二胺和活化中间酯按适当比例分别溶于适当有机溶剂中，0～4℃将亚烷基二胺缓慢滴入活化中间酯的溶液中，监控反应至完全；对反应液进行萃取，合并有机溶剂层。
c.分离纯化上述产品，得到氨基化的药物，即活性中间体。
所述合成路线图解如下：
在上述活性中间体的制备方法中：步骤a所述有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜，更优选为N，N-二甲基甲酰胺；控温反应优选为先0～4℃反应10～120min，再升至室温反应到完全，更优选为0℃反应30min，再升至室温反应到完全；反应时间优选为6～36h，更优选为24h。
步骤b中所述亚烷基二胺和活化中间酯的比例优选为2～20∶1，更优选为3∶1；所述有机溶剂优选为二氯甲烷。
2、羧酸类药物-多糖偶联物的合成
将含羧基或经衍生化成含羧基的多糖和活性中间体溶于反应溶剂中，在N2保护下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为活化剂，室温反应至完全；反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得最终产物羧酸类药物-多糖偶联物。
所述合成路线图解如下：
在上述羧酸类药物-多糖偶联物的制备方法中：所述反应溶剂优选为水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，更优选为甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；反应时间优选为6～48h，更优选为24h；透析时间优选为1～5d，更优选为3d。
二、羧酸类药物-多糖偶联物胶束的制备方法
按每1ml水中溶解3～30mg的羧酸类药物-多糖偶联物的比例，将制得的羧酸类药物-多糖偶联物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的多糖偶联物胶束。
三、以羧酸类药物-多糖偶联物作为载体，制备含难溶性药物的胶束
羧酸类药物-多糖偶联物溶于水，将难溶性药物如紫杉醇用适当溶剂溶解，与羧酸类药物-多糖偶联物水溶液混合，经超声或高压均质处理，通过透析或超滤或柱分离等方法除去有机溶剂及小分子，制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。
四、采用羧酸类药物-多糖偶联物作为载体，可对难溶性药物有増溶作用
可使用该羧酸类药物-多糖偶联物作为载体的难溶性药物有：全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、紫杉醇、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊苷、阿霉素、多西紫杉醇、柔红霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、环孢素、替尼泊苷、尼莫地平、硝苯地平、灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、吲哚美辛、布洛芬、酮洛芬、萘普生、二氢吡啶、非诺贝特、伊曲康唑、两性霉素B、联苯双酯、氟哌啶醇、利哌啶醇等，但并不局限于这些所列药物。
本发明的有益效果：
一、本发明以亚烷基二胺为连接臂与疏水性羧酸类药物缩合，得到具有一端游离氨基的活性中间体，用一种简单经济和容易实现工业化生产的方法将该活性中间体与含羧基或能够衍生化形成含羧基的多糖反应，制备了一系列羧酸类药物-多糖偶联物，条件温和、反应步骤少、产率高；
二、本发明提供的羧酸类药物-多糖偶联物具有优良的生物相容性和生物可降解性，还具有临界胶束浓度低、稳定性好、毒副作用低的优势，对有机药物、水不溶性或难溶性药物具有良好的増溶作用；
三、本发明提供的羧酸类药物-多糖偶联物，既可作为单一高分子前药，又可作为难溶性药物的优良载体，与化学偶联的羧酸类药物达到联合治疗的目的；
四、本发明提供的羧酸类药物-多糖偶联物可用于注射、口服、外用或粘膜给药。本偶联物具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。
具体实施方案
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：全反式维甲酸-肝素的合成
取10mmol全反式维甲酸、12mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、15mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应30min，然后升至室温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到全反式维甲酸活化中间酯。将1mmol全反式维甲酸活化中间酯溶于10ml二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入3mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法(TLC法)监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即全反式维甲酸活性中间体。取26mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.1mmol肝素的甲酰胺溶液中，室温反应15min，将含26mmol全反式维甲酸活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物全反式维甲酸-肝素偶联物。
实施例2：黄芩苷-软骨素的合成
取10mmol黄芩苷，16mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25ml四氢呋喃中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h，滤去沉淀，加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到黄芩苷活化中间酯。将2mmol黄芩苷活化中间酯溶于20ml二氯甲烷，冰浴条件下，缓慢滴入6mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，TLC监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，分离纯化所得产物，即得黄芩苷活性中间体。取30mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入含0.2mmol软骨素的甲酰胺溶液中，室温活化30min，将含30mmol黄芩苷活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物黄芩苷-软骨素偶联物。
实施例3：黄芩苷-羧甲基壳聚糖的合成
取10mmol黄芩苷，16mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25ml四氢呋喃中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h，滤去沉淀，加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到黄芩苷活化中间酯。将2mmol黄芩苷活化中间酯溶于20ml二氯甲烷，冰浴条件下，缓慢滴入6mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，TLC监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，分离纯化所得产物，即得黄芩苷活性中间体。取40mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入含0.1mmol羧甲基壳聚糖的异丙醇溶液中，室温活化10min，将含40mmol黄芩苷活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物黄芩苷-羧甲基壳聚糖偶联物。
实施例4：甘草次酸-硫酸软骨素的合成
取10mmol甘草次酸，12mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25mlN，N-二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h，滤去沉淀，加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到甘草次酸活化中间酯。将3mmol甘草次酸活化中间酯溶于30ml二氯甲烷，冰浴条件下，缓慢滴入9mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，TLC监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，分离纯化所得产物，即得甘草次酸活性中间体。取35mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入含0.2mmol硫酸软骨素的甲酰胺溶液中，室温活化20min，将含35mmol甘草次酸活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物甘草次酸-硫酸软骨素偶联物。
实施例5：羧酸类药物-多糖偶联物纳米胶束的制备和表征
1、羧酸类药物-多糖偶联物纳米胶束的制备
实施例1-4羧酸类药物-多糖偶联物40mg溶解在7ml水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.45μm滤膜过滤，即得。
2、粒径
将1制备得到羧酸类药物-多糖偶联物纳米胶束，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(MalvernInstruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表1。
3、临界胶束浓度CMC
采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度增加，放射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of theemission spectra)发生变化，激光光谱(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I1/I3比(在固定的激发波长下扫描，I1、I3分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中I338/I333比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲性分子的浓度作图即可获得两亲性分子的表观CMC，结果见表1。
表1羧酸类药物-多糖偶联物胶束的表征
实施例6：包含紫杉醇羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
(1)透析法
羧酸类药物-多糖偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2)乳化溶剂挥发法
羧酸类药物-多糖偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在二氯甲烷中。然后二者混合，探头超声30min，室温敞口搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中紫杉醇含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表2。
表2实施例1～4载有紫杉醇的羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束
实施例7：包含伊曲康唑羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
羧酸类药物-多糖偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。伊曲康唑10mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中伊曲康唑含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为263nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表3。
表3实施例1～4载有伊曲康唑的羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束
实施例8：包含尼莫地平羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
羧酸类药物-多糖偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。尼莫地平10mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中尼莫地平含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝65∶35(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为237nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表4。
表4实施例1～4载有尼莫地平的羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束
实施例9、包含吲哚美辛羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
羧酸类药物-多糖偶联物20mg，溶解在3ml水中搅拌2h。吲哚美辛10mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中吲哚美辛含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水∶乙酸＝75∶25∶0.1(v/v)，色谱柱为LichrospherC18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为260nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表5。
表5实施例1～4载有吲哚美辛的羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束
实施例10、包含川陈皮素羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
羧酸类药物-多糖偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。川陈皮素10mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中川陈皮素含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为332nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表6。
表6实施例1～4载有川陈皮素的羧酸类药物-多糖偶联物自组装纳米胶束
Claims (3)
1.一种羧酸类药物-多糖偶联物，其特征在于该偶联物是在多糖的羧基上，通过亚烷基二胺为连接臂引入疏水性羧酸类药物，使其具有两亲性质，在水介质中可自组装为纳米胶束；所述的羧酸类药物-多糖偶联物为以下四种：
(A)全反式维甲酸-肝素，其制备方法为：取10mmol全反式维甲酸、12mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、15mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在30mL N，N-二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应30min，然后升至室温反应24h；反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀；对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到全反式维甲酸活化中间酯；将1mmol全反式维甲酸活化中间酯溶于10mL二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入3mmol/mL 乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即全反式维甲酸活性中间体；取26mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.1mmol肝素的甲酰胺溶液中，室温反应15min，将含26mmol全反式维甲酸活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h；反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物全反式维甲酸-肝素偶联物；
(B)黄芩苷-软骨素，其制备方法为：取10mmol黄芩苷、16mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25mL四氢呋喃中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀；对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到黄芩苷活化中间酯；将2mmol黄芩苷活化中间酯溶于20mL二氯甲烷中，冰浴条件下，缓慢滴入6mmol/mL乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，分离纯化所得产物，即黄芩苷活性中间体；取30mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.2mmol软骨素的甲酰胺溶液中，室温反应30min，将含30mmol黄芩苷活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h；反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物黄芩苷-软骨素偶联物；
(C)黄芩苷-羧甲基壳聚糖，其制备方法为：取10mmol黄芩苷、16mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25mL四氢呋喃中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀；对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到黄芩苷活化中间酯；将2mmol黄芩苷活化中间酯溶于20mL二氯甲烷中，冰浴条件下，缓慢滴入6mmol/mL乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，分离纯化所得产物，即黄芩苷活性中间体；取40mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.1mmol羧甲基壳聚糖的异丙醇溶液中，室温活化10min，将含40mmol黄芩苷活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h；反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物黄芩苷-羧甲基壳聚糖偶联物；
(D)甘草次酸-硫酸软骨素，其制备方法为：取10mmol甘草次酸、12mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25mLN，N-二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h，滤去沉淀，加大量乙酸乙酯洗涤沉淀；对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到甘草次酸活化中间酯；将3mmol甘草次酸活化中间酯溶于30mL二氯甲烷中，冰浴条件下，缓慢滴入9mmol/mL乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，分离纯化所得产物，即甘草次酸活性中间体；取35mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.2mmol硫酸软骨素的甲酰胺溶液中，室温活化20min，将含35mmol甘草次酸活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h；反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物甘草次酸-硫酸软骨素偶联物。
2.根据权利要求1所述的羧酸类药物-多糖偶联物在制备单独用作高分子前体药物，或用作注射、口服、外用或粘膜给药的药学活性或药理活性分子的载体中的应用，其特征在于所述药学活性或药理活性分子选自：紫杉烷类、喜树碱类、黄酮类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类、维A酸类、环孢素类、二氢吡啶类、小蘗碱类抗肿瘤药物、甾体类或非甾体类抗炎药物、心血管药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。
3.根据权利要求1所述的羧酸类药物-多糖偶联物在制备载药纳米胶束中的应用，其特征在于该羧酸类药物-多糖偶联物制备载药纳米胶束，其方法包括如下步骤：羧酸类药物-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到多糖偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述多糖偶联物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。
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