CN101543630A

CN101543630A - 白蛋白两亲性衍生物及其药学组合物的制备和应用

Info

Publication number: CN101543630A
Application number: CN200910030941A
Authority: CN
Inventors: 周建平; 霍美蓉; 李静; 张勇; 龚健
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2009-04-20
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2009-09-30

Abstract

本发明涉及一种生物可降解白蛋白两亲性衍生物及其药学组合物。这类衍生物在白蛋白骨架引入亲水长链聚乙二醇以及烷(酰)基或(脱氧)胆酸，使其具有两亲性，在水中自组装形成纳米胶束，其特征包括：1)可通过疏水基团和白蛋白分子链与药物的双重作用将药物包裹，显著提高白蛋白包裹药物的能力；2)亲水长链既可降低白蛋白免疫原性，又可提高胶束表面亲水性，从而提高胶束在水性介质中稳定性，并在体内具有长循环特征。该辅料可作为有机药物、水不溶性或难溶性药物和两亲性药物的载体，用于血管内或肌肉注射、口服、腔道或外用途径给药。本发明制备方法简单，工艺成熟，适于大规模连续生产。

Description

白蛋白两亲性衍生物及其药学组合物的制备和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种生物可降解性两亲性白蛋白衍生物作为药物载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其应用。

背景技术

难溶性药物的给药(特别是注射给药)的最大障碍是溶解度低，难于制备适宜的制剂。往往需要采取各种增加溶解度的方法，如将药物制备成盐、加入潜溶剂、加入助溶剂以及加入表面活性剂增溶。由于成盐往往需要强酸或强碱条件，对许多药物往往不适用，生理安全的潜溶媒很少，且用量有所限制；通过与药物形成络合物而增加药物溶解度的助溶剂的安全性不易保证，因此，通过表面活性剂胶束增溶往往成为首选。例如：紫杉醇是一种作用很强的抗肿瘤药物，体外实验表明紫杉醇对各种肿瘤均具有明显的抑制作用，临床上适用于治疗乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等。然而紫杉醇在水中溶解度极低(<1μg/ml)，口服几乎不吸收，目前临床用制剂，如

[美国Bristol Myers Squibb(BMS)公司]、

(澳大利亚Faulding公司)以及国产的

等均以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)-无水乙醇(50：50，v/v)作为紫杉醇复合溶媒，该增溶方法存在以下的缺陷：①Cremophor EL的临界胶束浓度(Critical micellar concentration，CMC)较高，临床稀释时胶束容易解离，导致药物析出，因此输液管必须有在线滤过装置；②处方中的Cremophor EL会引起体内组织胺释放，给药后数分钟，部分病人会出现药物性皮疹、呼吸急促、支气管痉挛、低血压等过敏反应，即使同时使用氢化可地松，过敏反应的发生率仍达到10％～30％，另外Cremophor EL还会引起肾毒性、神经毒性、心脏毒性等副反应；③注射液中的Cremophor EL与聚氯乙烯塑料管和输液袋接触可浸提出大量的塑化剂邻苯二甲酸二乙基乙酯(DEHP)，引起毒性。同样的情况也出现在喜树碱、依托泊苷等抗肿瘤药物的注射液中，例如依托泊苷注射剂由乙醇、丙二醇、聚山梨酯80组成，用前稀释，注射时刺激性较大。

鉴于普通表面活性剂胶束的高CMC和可能的毒副作用，聚合物胶束是近年来发展起来的药物载体，由两亲性高分子在水中自组装形成，其疏水部分互相缠绕形成“内核”，而亲水性部分则环绕在外，形成柔韧的亲水性“外壳”，疏水性的内核作为药物的载体或储库为疏水性药物提供了一个稳定的微环境，亲水性的外壳使纳米胶束能够稳定地存在于水溶液中和体液中，能够避免MPS吞噬系统的吞噬，具有长循环特征。另外，聚合物胶束还可利用肿瘤组织的EPR效应滞留于肿瘤组织。如Nakanishi T等(Nakanishi T，Fukushima S，K O.Development ofthe polymer micelle carrier system for doxorubicin[J].J.Control.Release，2001，74(1-3)：295-302)制备的阿霉素PEO-b-P(Asp)-DOX制剂，血浆AUC可提高高达28.9倍，肿瘤AUC可提高3.4倍，抗肿瘤活性显著提高。

目前对生物降解聚合物胶束的研究主要集中在合成高分子材料，主要是两亲性A-B嵌段、A-B-A嵌段共聚物或接枝共聚物。A为亲水性组分，B为疏水性组分。由于可供共聚A、B组分及可生物降解的组分较少，在选择时存在较大困难，故疏水性组分通常为聚内酯，如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸等；亲水性组分则多为聚乙二醇(PEG)。

然而，现有的载药聚合物胶束存在载药量低、稳定性差的问题，且随着载药量的增加，稳定性呈降低趋势，这限制了聚合物胶束的进一步推广和应用。以紫杉醇为例，Le Garrec D等(Le Garrec D，Gori S，Luo L，et al.Poly(N-vinylpyrrolidone)-block-poly(D，L-lactide)as a newpolymeric solubilizer for hydrophobic anticancer drugs：in vitro and in vivo evaluation[J].J ControlRelease，2004，99(1)：83-101)合成的PDLLA-b-PVP作为紫杉醇增溶载体，载药量最高为5％，24h即出现沉淀。Zhang，Z.(Zhang，Z.，Feng，S.S，Biomaterials，2006，27(2)，262-70)等合成的poly(lactide)/Vitamin E TPGS copolymer，其紫杉醇最高载药量仅为5％(w/w)。D.LeGarrec(Le Garrec，D.，Gori，S.，J Control Res，99(1)，83-101)制备了poly(N-vinylpyrrolidone)-block-poly(D，L-lactide)，其紫杉醇最高载药量也仅为5％(w/w)。Burt HM等(BurtHM，ZhangX，Toleikis P，et al.Development of copolymers of poly(d，l-actide)and methoxypolyethyleneglycol as micellar carriers of paclitaxel[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，1999，16(1-4)：161.)制备的PGACL-MePEG作为紫杉醇载体，虽然载药量可以达到22％(w/w)，但是稳定时间<5h。

目前，解决载药聚合物胶束载药量和稳定性的方法主要是选择更加合适的聚合物材料。

白蛋白是一种天然的水溶性高分子，其在药物制剂领域中的一个重要应用就是作为药物的载体材料，这主要是基于以下优越性：白蛋白化学性能稳定、无免疫原性、生物相容性好，在体内分子链中的肽键可被酶降解为小分子而被吸收，且白蛋白分子链上带有较多的极性基团，对很多药物离子具有高度的亲和力，能和药物可逆的结合，为其高负载药物提供可能；白蛋白二级结构中含有约48％的c-螺旋结构，15％β-折叠片结构，其余为无规线团结构，因此具有很多的网状空隙，为携带药物创造了有利的空间条件；另外，白蛋白是正常向细胞输送营养的蛋白质，快速生长的肿瘤可摄取和储备白蛋白，白蛋白作为抗肿瘤药物载体，可与肿瘤细胞膜上的白蛋白受体Gp60结合，显著提高肿瘤细胞中药物的分布，为其肿瘤靶向性提供了可能。

目前，对于白蛋白在药物递送系统中的应用主要集中于以下两个方面：

①制备白蛋白纳米粒作为药物载体。

CN 1994291A公开的乳化加热固化法制备白蛋白纳米粒，需使用油、表面活性剂及较高的温度(100～120℃)，且需使用大量有机溶剂洗除油性残余物和表面活性剂，不仅易引起有机溶解的残留，为纳米粒的纯化带来困难，另外，加热对于热不稳定的药物也不利。

CN1 306955C公开的乳化化学交联法不仅使用有机溶剂或油，而且使用较多的化学交联剂如甲醛、戊二醛等，其残留也将给制剂的使用带来安全隐患。

Amedo A等(Int J Pharm.2002，244(1-2)：59-72)报道的凝聚-化学交联法，除了使用化学交联剂的缺陷外，粒径同样较难控制，且需进行pH值调节，在高浓度蛋白质存在条件下，以玻璃电极测定pH值的可靠性有限。

EP1348431，CN 1448128A公开的紫杉醇白蛋白纳米颗粒的制备方法，通过向人血清白蛋白(HSA)与氯仿水溶液中加入粉末状紫杉醇，得到的混合物进行高压均质处理，然后真空蒸发除去有机溶剂，此方法可能造成制剂产品有机溶剂残留，而且临床稀释稳定性<24小时。

US5439686、US549842、US5560933公开的采用超声技术制备紫杉醇和HSA，得到的纳米粒平均粒径<10μm，该粒径不适合于血管内给药。

US5916596、US6096331公开的制备方法是分别制备紫杉醇的溶液和含有HSA的水溶液，然后二相混合，高压下进行均质处理，蒸去有机溶剂，过滤，冻干即得。该方法制备的纳米粒粒径<0.2μm，放置12h即有沉淀倾向。

②通过化学修饰将药物化学键合到白蛋白分子链上

邱晓航等(高等学校化学学报，1999，20(7)，1073-76)采用活性酯法和混合酸酐法将紫杉醇通过化学键结合到白蛋白分子链上，一个分子链可修饰1～9个紫杉醇分子，可显著提高紫杉醇的水溶性。

可见，目前制备白蛋白纳米粒的方法不可避免的使用较多的表面活性剂、有机溶剂、化学交联剂等，而且所形成的纳米载体包载药物有限，稳定性不佳。若将药物化学键合到白蛋白分子链上，则存在产品收率低，原料药损失严重，纯化困难等缺陷。

本发明者在CN 101220093A公开了一类疏水改性的白蛋白衍生物，即于白蛋白分子链上引入一定的疏水基团，发现其在水介质中可自组装为纳米胶束，对难溶性药物有很好的增溶效果，但疏水基团的引入增加了白蛋白的免疫原性，如果使用的是非人源性白蛋白，免疫性更强，而不利于用药的安全。

针对以上问题，本专利将利用白蛋白分子链上有大量的游离氨基、羧基及巯基，在白蛋白分子链中引入合适的亲水长链和疏水基团，该两亲性衍生物具有以下特性：1)由于白蛋白衍生物的两亲性性质，在水溶液中可自组装形成纳米胶束，避免了有机溶剂、表面活性剂、交联剂或加热条件的使用；2)在疏水基团和白蛋白分子链与药物的双重作用下，与未修饰的白蛋白相比，两亲性白蛋白可显著提高药物的载药量，稳定时间也非常显著的延长；3)亲水长链的引入，可以减少载体的免疫原性，适用于更多的蛋白修饰，另外还可增加纳米胶束表面的亲水性，从而提高载体在体内的循环时间，更加有利于其对非吞噬系统组织(比如肿瘤)的靶向性。该类白蛋白自组装纳米胶束尚未见任何文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物可降解的白蛋白两亲性衍生物。该衍生物在水介质中可自组装形成纳米胶束，可避免化学交联剂、大量有机溶剂、加热条件的使用，制备工艺简单；并可利用白蛋白分子链以及疏水基团和药物的双重作用包载药物。该载体具有载药量高、稳定性好、免疫原性低、体内长循环的特征。

本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。

为达到上述目的，本发明提供一种新型药物增溶载体，该载体是在白蛋白分子的游离氨基同时引入亲水长链和疏水基团，使其具有两亲性性质，在水介质中可自组装为纳米胶束。

所述的药物增溶载体，其中选用的白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清蛋白。

所述的药物增溶载体，其中亲水长链为聚乙二醇，分子量500～100000，主要取代在白蛋白的氨基，一个白蛋白分子链引入1～70个聚乙二醇亲水长链。

所述的药物增溶载体，其中疏水基团为碳原子数>2的烷(酰)基或(脱氧)胆酸，主要取代在白蛋白的氨基，一个白蛋白分子链引入1～70个烷(酰)基或(脱氧)胆酸。

所述的药物增溶载体的制备方法，包括下列步骤：

将白蛋白溶于或分散于水或有机溶剂的混合溶剂中，采用提供亲水长链的物质与白蛋白分子链上的氨基、羧基或巯基进行取代反应，得到亲水长链修饰的白蛋白衍生物；采用提供疏水基团的物质进一步与白蛋白分子链上的氨基或羧基进行取代反应，所得白蛋白衍生物即具有良好两亲性，在水介质中可自发形成纳米胶束。亲水长链和疏水基的取代反应次序可前后颠倒；一个白蛋白分子链上引入1-70个亲水长链及1-70个疏水基团即可。

所述的制备方法，其中提供亲水基团的物质是PEG活化物，其中包括PEG活化酯(PEG二氯三嗪衍生物、PEG三氟乙基磺酸酯、PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG苯并三唑碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG三氯苯碳酸酯、PEG碳酰咪唑酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、PEG异氰酸酯化物、PEG醛、PEG羧酸酯、PEG羧基；PEG马来酰亚胺正己酸酯、PEG马来酰亚胺、PEG乙酰砜、PEG碘代乙酰胺、PEG正吡啶基二硫化物、PEG邻吡啶二硫醚；PEG-酰肼；PEG氨基等。

所述的制备方法，其中提供疏水基团的物质是碳原子数均不小于2的卤代烃、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰卤、脂肪酸和脱氧胆酸及胆酸。

所述的药物增溶载体的应用，其特征在于可以用于血管内或肌肉注射或口服、腔道或外用的药学活性或药理活性分子的载体。其中该药学活性或药理活性分子主要包括：紫杉烷类、环孢素类、喜树碱类、黄酮类、二氢吡啶类、小蘖碱类、长春碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药、甾体类或非甾体抗炎药物、心血管药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。

该药物增溶载体的制备方法操作步骤如下：两亲性白蛋白衍生物与水按重量比为1～50:1000的比例溶解，得到白蛋白衍生物的纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述两亲性白蛋白衍生物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析袋透析或蒸馏或超滤等法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

具体方案如下：

在白蛋白的氨基或羧基引入亲水长链(聚乙二醇)，同时引入疏水基团(烷基或脂肪酰基或(脱氧)胆酸)，使其具有两亲性，在水介质中可组装成胶束，相对疏水的烷基或脂肪酰基或(脱氧)胆酸聚集成内核，亲水长链形成高度亲水性的外壳，具有降低免疫原性、稳定胶束、有效躲避生物体网状内皮系统的捕捉的作用。因此这类高分子材料是一类优良的药物载体，尤其对于难溶性抗肿瘤药物及其它难溶于水的非抗肿瘤药物。该衍生物作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，表面光滑，均匀度好，颗粒规则无粘连，再分散性好，载药量和包封率高。该药物载体可用于血管内或肌肉注射、口服、腔道和外用。

生物可降解白蛋白衍生物的合成及药学或生理活性组合物制备方法详细说明如下：

一、两亲性白蛋白衍生物的合成

两亲性白蛋白衍生物即在白蛋白分子链上同时引入亲水长链和疏水基团，亲水长链和疏水基团的修饰反应分别如1、2所示。白蛋白的两亲性修饰选自1中任一反应和2中任一反应，p和q分别为一个蛋白分子引入的疏水基团和亲水长链的个数，且亲水长链和疏水基团反应先后次序不限。

1疏水基团修饰白蛋白的制备

1)与烷基醛反应

白蛋白配成水溶液，加入烷基醛，反应0.5～8h后，加入NaBH₄水溶液，继续搅拌12h，HCl液调pH7，纯净水透析3d，冻干即得烷基修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

2)与卤代烷反应

白蛋白配成水溶液，搅拌下加入卤代烃，40～70℃反应4～12h，调反应液pH7，纯净水透析3d，冻干即得烷基修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

3)与酸酐反应

脂肪酸通过分子间脱水而得到酸酐，将白蛋白分散在一定比例的水和醇混合液中，搅拌下加入脂肪酸酐丙酮溶液，室温反应5～15h，旋转蒸发，反应溶液透析3d，冻干即得烷酰基修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

4)与酰卤反应

脂肪酸与二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三溴化磷、五溴化磷中的一种反应，制得脂肪酰卤。将白蛋白分散在二甲亚砜中，搅拌下低价脂肪酰卤，40～50℃反应5～12h，旋转蒸发，反应溶液透析袋透析3d，冻干即得烷酰基修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

5)与脂肪酸反应

方法1：白蛋白配成水溶液，加入脂肪酸，加入EDC催化剂，反应1～24h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得烷酰基修饰的白蛋白。

方法2：在DCC催化下制备脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，加入白蛋白溶液，反应1～24h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得烷酰基修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

6)与烷基胺反应

方法1：白蛋白配成水溶液，加入烷基胺，加入EDC催化剂，反应1～24h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得烷酰基修饰的白蛋白。

方法2：在DCC催化下制备白蛋白NHS活性酯，加入烷基胺，反应1～24h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得烷酰基修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

7)脱氧胆酸修饰白蛋白的制备：

方法1：白蛋白配成水溶液，加入脱氧胆酸，加入EDC催化剂，反应1～24h，调节pH7，反应液透析3d，冻干即得脱氧胆酸修饰白蛋白。

方法2：在DCC催化下制备脱氧胆酸NHS活性酯，加入白蛋白溶液，反应1～24h，调pH7，反应液透析3d，溶液冻干即得脱氧胆酸修饰白蛋白。

合成路线图解如下：

8)胆酸修饰白蛋白的制备

方法1：白蛋白配成水溶液，加入胆酸，加入EDC催化剂，反应1～24h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得胆酸修饰白蛋白。

方法2：在DCC催化下制备胆酸NHS活性酯，加入白蛋白溶液，反应1～24h，调pH7，反应液透析3d，溶液冻干即得胆酸修饰白蛋白。

合成路线图解如下：

2亲水长链修饰白蛋白

采用活化PEG和白蛋白的氨基、羧基或巯基发生取代反应。

1)与PEG醛反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG醛，反应0.5～8h后，加入NaCNBH4水溶液，继续搅拌12h，HCl液调pH7，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

2)与PEG二氯三嗪衍生物反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG二氯三嗪衍生物，反应12～24h，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

3)与PEG三氟乙基磺酸酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG三氟乙基磺酸酯，反应0.5～12h后，加入甘氨酸或L-赖氨酸等终止反应，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

4)与PEG琥珀酰亚胺碳酸酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG琥珀酰亚胺碳酸酯，反应0.5～12h后，加入甘氨酸或L-赖氨酸等终止反应，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

5)与PEG苯并三唑碳酸酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG苯并三唑碳酸酯，反应0.5～12h后，加入甘氨酸或L-赖氨酸等终止反应，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

6)与PEG对硝基苯碳酸酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG对硝基苯碳酸酯，反应0.5～12h后，加入甘氨酸或L-赖氨酸等终止反应，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

7)与PEG三氯苯碳酸酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG三氯苯碳酸酯，反应0.5～12h后，加入甘氨酸或L-赖氨酸等终止反应，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

8)与PEG碳酰咪唑酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG碳酰咪唑酯，反应12～72h，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

9)与PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯，反应0.5～12h后，加入甘氨酸或L-赖氨酸等终止反应，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

10)与PEG酰肼反应

方法1：将白蛋白配溶于缓冲液中，加入PEG酰肼，在EDC催化下，反应1～24h，调节pH7，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

方法2：在DCC催化下白蛋白上羧基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生成活性酯，加入PEG酰肼，反应0.5～12h，调节pH7，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

11)与PEG马来酰亚胺反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG马来酰亚胺，反应0.5～12h，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

12)与PEG乙烯基砜反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG乙烯基砜，反应0.5～12h，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

13)与PEG吡啶二硫醚反应

将白蛋白溶于缓冲液中，加入PEG吡啶二硫醚，反应0.5～12h，反应液透析或经离子交换柱纯化，冻干即得PEG修饰的白蛋白。

合成路线图解如下：

二、白蛋白纳米胶束的制备方法

按每1ml水中溶解3～30mg的两亲性白蛋白衍生物的比例，将制得的两亲性白蛋白衍生物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的白蛋白胶束。

三、以白蛋白衍生物作为载体，制备含难溶药物的药物组合物

白蛋白两亲性衍生物溶于水，浓度0.1％～5％(w/w)，将难溶性药物如紫杉醇用适当溶剂溶解，经超声或高压均质处理，通过透析或减压蒸馏或超滤的方法除去有机溶剂及小分子，制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。

四、采用白蛋白衍生物作为载体制备药物组合物，可对药物有效负载。

可使用该两亲性白蛋白衍生物作为载体的药物有：紫杉醇、环孢素、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇，灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、吲哚美辛、布洛芬、酮洛芬、萘普生、硝异梨酯、二氢吡啶、尼莫地平、非诺贝特、伊曲康唑、两性霉素B、联苯双酯、孕酮、二氢睾酮、氟哌啶醇、利哌利酮等，但并不局限于这些所列药物。

本发明较现有技术所具有的优点：

一、自组装技术制备白蛋白纳米胶束：较目前文献专利报道的制备白蛋白纳米粒的方法，如：乳化热固化法和乳化化学交联法，可避免交联剂和大量有机溶剂或油的使用，后处理简单，安全性高。

二、较低的临界胶束浓度(Critical micelle concentrations，CMC)：实施例1～8中白蛋白衍生物的CMC皆在1～100mg/L范围内，预示它有极好的稀释稳定性。

三、对有机药物、水不溶性或难溶性药物和两亲性药物具有较好的负载，例如，对紫杉醇的负载高达30.5％(w/w)，对吲哚美辛的负载高达16.9％(w/w)，对伊曲康唑的负载高达21.9％(w/w)，对尼莫地平的负载高达18.9％(w/w)，对环孢素A的负载高达22.2％(w/w)，对氟哌啶醇的负载高达16.4％(w/w)，对阿奇霉素的负载高达16.8％(w/w)。

四、良好的稳定性：实施例10～16中所制备的紫杉醇、吲哚美辛、伊曲康唑、尼莫地平、环孢素A、氟哌啶醇、阿奇霉素白蛋白纳米胶束，稀释至1～3mg/ml，置于25℃，稳定性分别>3d，其中紫杉醇白蛋白纳米粒胶束稳定性>7d。可见，白蛋白胶束不仅具有极高的载药量，还具有非常优越的稳定性。

五、低(或无)免疫原性：豚鼠过敏实验结果表明，亲水长链的引入可以大大降低载体的免疫原性，从而可以拓宽白蛋白的可选择范围。

六、本发明辅料亦可用于血管内或肌肉注射、口服、腔道或外用。本载体材料具有高度安全性，比如人血清白蛋白在临床上作为血浆代用品，单剂量为5g，载体本身粒径可控制在10～1000nm，不仅可肌肉注射、口服、外用等，还符合静脉注射要求。亲水长链的引入可明显降低材料的免疫原性，提高了用药的安全性。

综上所述，本发明用可生物降解的白蛋白作为原料，进行化学结构修饰，在水介质中自发形成纳米胶束，在体内具有良好的生物相容性、生物可降解性和稀释稳定性，对药物有较好的负载。

本发明研究的两亲性白蛋白衍生物，可以在水中自发形成纳米胶束，不但可用于药物的包载，控制药物释放，而且由于其亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束结构，可以延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，增加肿瘤靶向，达到减少毒副作用，增加疗效的目的。

本发明提供的两亲性白蛋白衍生物的临界聚集浓度低，载药量高、药物包封率高，纳米胶束稳定。本辅料毒性小、可作为难溶性有机药物的载体，以纳米级分散体系用于注射、口服和外用。本发明制备方法简单，工艺成熟，适于大规模连续生产。

附图说明

图1：N-辛基N-聚乙二醇-牛血清白蛋白的粒径图谱。

图2：载有紫杉醇的N-辛基-N-聚乙二醇-牛血清白蛋白的粒径图谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1：

N-聚乙二醇N-辛基人血清白蛋白的制备

1)N-聚乙二醇人血清白蛋白的制备

1g人血清白蛋白分散在水中，加入13.8g聚乙二醇丙醛(分子量5000)，反应2h后，加入NaBH₄或NaCNBH₃水溶液，继续搅拌12h，HCl液调pH7，蒸馏水透析3d(MWCO＝12000～14000)，冻干即得。元素分析结果表明一个白蛋白分子链引入了18个PEG。

2)N-聚乙二醇-N-辛基人血清白蛋白的制备

1g N-聚乙二醇人血清白蛋白溶于水中，加入0.5g正辛醛，反应1h后，加入NaBH₄或NaCNBH₃水溶液，继续搅拌12h，HCl液调pH7，蒸馏水透析3d(MWCO＝12000～14000)，冻干即得。元素分析结果表明一个白蛋白分子链引入了30个辛基。

实施例2：

N-聚乙二醇-N-辛基牛血清白蛋白的制备

反应条件同实施例1，以牛血清白蛋白代替人血清白蛋白。一个牛血清白蛋白分子引入15个PEG亲水长链，引入27个疏水辛基。

实施例3：

N-聚乙二醇-N-辛基猪血清白蛋白的制备

反应条件同实施例1，以猪血清白蛋白代替人血清白蛋白。一个猪血清白蛋白分子引入15个PEG亲水长链，引入32个疏水辛基。

实施例4：

N-聚乙二醇-N-辛酰基猪血清白蛋白的制备

1)N-辛酰基猪血清白蛋白

3.6g正辛酸(0.05mol)，滴入4ml醋酸酐，120℃蒸出醋酸，得到正辛酸酐。将猪血清白蛋白1g分散在水/甲醇中，搅拌下滴加正辛酸酐，40℃反应8h，反应液透析，冻干即得。元素分析测得一个猪血清白蛋白分子引入24个疏水辛基。

2)N-聚乙二醇-N-辛酰基猪血清白蛋白

反应条件同实施例1中1)，以N-辛酰基猪血清白蛋白代替猪血清白蛋白，元素分析测得一个猪血清白蛋白分子引入16个PEG长链。

实施例5：

N-聚乙二醇-N-辛基酰胺猪血清白蛋白的制备

1)N-辛基酰胺猪血清白蛋白

白蛋白配成水溶液，加入正辛胺，加入EDC催化剂，反应8h，调节pH7，反应液透析3d，冻干即得烷基氨酰白蛋白。元素分析测得一个白蛋白分子链引入17个辛基。

2)N-聚乙二醇-N-辛基酰胺猪血清白蛋白

反应条件同实施例1中1)，以N-辛基酰胺猪血清白蛋白代替人血清白蛋白，元素分析测得一个猪血清白蛋白分子引入16个PEG长链。

实施例6：

N-聚乙二醇-N-十二烷基猪血清白蛋白的制备

1)N-十二烷基猪血清白蛋白

1g猪血清白蛋白溶于水中，加入1.47g十二烷基醛，反应1h后，加入NaBH4水溶液，继续搅拌12h，HCl液调pH7，蒸馏水透析3d(MWCO＝12000～14000)，冻干即得。元素分析测得一个白蛋白分子链引入28个十二烷基链。

2)N-聚乙二醇-N-十二烷基猪血清白蛋白

反应条件同实施例1中1)，以N-十二烷基猪血清白蛋白代替人血清白蛋白，元素分析测得一个猪血清白蛋白分子引入15个PEG长链。

实施例7：

N-聚乙二醇N-脱氧胆酸猪血清白蛋白的制备

1)N-脱氧胆酸猪血清白蛋白

1g猪血清白蛋白配成水溶液，加入脱氧胆酸，加入EDC催化剂，反应12h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得脱氧胆酸修饰白蛋白。元素分析测得一个猪血清白蛋白分子链引入了6个脱氧胆酸。

2)N-聚乙二醇N-脱氧胆酸猪血清白蛋白

反应条件同实施例1中1)，以N-脱氧胆酸猪血清白蛋白代替人血清白蛋白，元素分析测得一个猪血清白蛋白分子引入16个PEG长链。

实施例8：

N-聚乙二醇-N-胆酸猪血清白蛋白的制备

1)N-聚乙二醇猪血清白蛋白

反应条件同实施例1中1)，以猪血清白蛋白代替人血清白蛋白，元素分析测得一个猪血清白蛋白分子引入15个PEG长链。

2)N-聚乙二醇N-胆酸猪血清白蛋白

1g人血清白蛋白配成水溶液，加入胆酸，加入EDC催化剂，反应12h，NaOH调节pH7，反应液透析3d，冻干即得胆酸修饰白蛋白。元素分析测得一个白蛋白分子链引入了6个胆酸。

实施例9：

白蛋白衍生物纳米胶束的制备和表征

1、白蛋白纳米粒的制备：实施例中1-8白蛋白两亲性衍生物40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌2h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.45μm滤膜过滤，即得。

2、粒径：Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvem，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径，结果见表1。

3、CMC：采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液中不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光广谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度将增加，放射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of the emission spectra)发生变化，激光光谱中(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I₁/I₃比(在固定的激发波长下扫描，I₁、I₃分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲分子的浓度作图即可获得两亲性分子的表观CMC，结果见表1。

表1 白蛋白衍生物纳米胶束的表征

实施例10：

包含紫杉醇两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

(1)探头超声法：

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中搅拌2h。紫杉醇30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2)高压均质法：

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中搅拌2h。紫杉醇30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，高压均质，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm5min，用0.45μn滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).溶剂挥发法：

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中搅拌2h。紫杉醇30mg溶解在氯仿中。然后二者溶液混合，探头超声，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm)5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇:水＝75:25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～8载有紫杉醇的白蛋白自组装纳米粒见表2。

表2 载有紫杉醇的白蛋白自组装纳米粒

实施例11：

包含吲哚美辛两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。吲哚美辛30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中吲哚美辛含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇：水：乙酸＝75:25:0.1v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为260nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～8载有吲哚美辛的白蛋白自组装纳米粒见表3。

表3 载有吲哚美辛的白蛋白自组装纳米粒

实施例12：

包含伊曲康唑两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。伊曲康唑30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中伊曲康唑含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇:水＝75:25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为263nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～7载有伊曲康唑的白蛋白自组装纳米粒见表4。

表4 载有伊曲康唑的白蛋白自组装纳米粒的表征

实施例13：

包含尼莫地平两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。尼莫地平30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中尼莫地平含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇:水＝65:35(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为237nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～8载有尼莫地平的白蛋白自组装纳米粒见表5。

表5 载有尼莫地平的白蛋白自组装纳米粒

实施例14：

包含环孢素A两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。环孢素A30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈、氯仿)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中环孢素A含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为乙腈:甲醇:水:异丙醇＝900:450:50:0.5(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为225nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为70℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～8载有环孢素A的白蛋白自组装纳米粒见表6。

表6 载有环孢素A的白蛋白自组装纳米粒

实施例15：

包含氟哌啶醇两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。氟哌啶醇30mg溶解在氯仿中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中氟哌啶醇含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为乙腈:甲醇:0.025mol/L磷酸二氢钾＝45:5:50(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μμm。流速为1.0mL/min，检测波长为248nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～8载氟哌啶醇的白蛋白自组装纳米粒见表7。

表7 载有氟哌啶醇的白蛋白自组装纳米粒

实施例16：

包含阿奇霉素两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒组合物的制备和表征

1、制备工艺

白蛋白两亲性衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。阿奇霉素30mg溶解在氯仿中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、两亲性白蛋白衍生物自组装纳米粒中阿奇霉素含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为乙腈:0.1％三乙胺水溶液＝30:70(v/v)，用磷酸调节pH至4.0，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm，流速为1.2mL/min，检测波长为205nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为40℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。

实施例1～8载阿奇霉素的白蛋白自组装纳米胶束的理化性质见表8。

表8 载有阿奇霉素的白蛋白自组装纳米粒

Claims

1.一种药物增溶载体，其特征在于该载体是在白蛋白分子的氨基、羧基或巯基引入亲水长链和疏水基团，使其具有两亲性性质，在水介质中可自组装为纳米胶束。

2.根据权利1所述的药物增溶载体，其特征在于，所述白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清蛋白。

3.根据权利1或2所述的药物增溶载体，其特征在于，亲水长链为聚乙二醇(PEG)，分子量500～100000，取代在白蛋白的氨基、羧基或巯基，一个白蛋白分子链引入1～70个聚乙二醇亲水长链。

4.根据权利1或2所述的药物增溶载体，其特征在于，疏水基团为碳原子数>2的烷(酰)基或(脱氧)胆酸，主要取代在白蛋白的氨基，一个白蛋白分子链引入1～70个烷(酰)基或(脱氧)胆酸。

5.权利要求1或2所述的药物增溶载体的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于提供亲水基团的物质是PEG话化物，包括PEG活化酯(PEG二氯三嗪衍生物、PEG三氟乙基磺酸酯、PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG苯丙三唑碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG三氯苯碳酸酯、PEG碳酰咪唑酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、PEG异氰酸酯化物、PEG醛、PEG羧酸酯、PEG羧基；PEG马来酰亚胺正己酸酯、PEG马来酰亚胺、PEG乙酰砜、PEG碘代乙酰胺、PEG正吡啶基二硫化物、PEG二硫吡啶；PEG-酰肼；PEG氨基等。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于提供疏水基团的物质是碳原子数均不小于2的卤代烃、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰卤、脂肪酸和脱氧胆酸及胆酸。

8.权利要求1所述的药物增溶载体的应用，其特征在于可以用于血管内或肌肉注射或口服、外用的药学活性或药理活性分子的载体。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的药学活性或药理活性分子选自：紫杉烷类、环孢素类、喜树碱类、黄酮类、二氢吡啶类、小蘗碱类、长春碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药、甾体类或非甾体抗炎药物、心血管药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于该药物增溶载体的制备方法包括以下步骤：两亲性白蛋白衍生物与水按重量比为1～50:1000的比例溶解，得到白蛋白衍生物的纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述两亲性白蛋白衍生物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析袋透析或蒸馏或超滤等法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。