CN105770905A - 用于抑制β淀粉样蛋白聚集的自组装纳米粒子及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能够抑制β淀粉样蛋白聚集的自组装纳米粒子的制备、表征和应用。首先从已被证实的能有效抑制Aβ聚集的多酚类小分子姜黄素出发，根据姜黄素的强疏水性特征和其功能团，通过酯化反应，在其上修饰亲水性很强的天然大分子透明质酸，从而得到两亲性物质CHA。由于CHA同时具备强疏水部分和强亲水性部分，在水环境中能自发组装形成纳米结构，同时由于HA的特性，能够形成水凝胶结构。这一自组装纳米结构不仅改善了姜黄素难溶于水的缺陷，还能通过纳米凝胶的隔离作用将与姜黄素结合的Aβ单体稳定，使其不易聚集，从而提高抑制效果。因此，CHA的制备和应用是研发阿尔茨海默氏症抑制剂的有效方法，具有广阔的前景。

Description

用于抑制β淀粉样蛋白聚集的自组装纳米粒子及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的自组装纳米粒子的制备、表征和应用。

背景技术

阿尔茨海默氏症(AD)是老年痴呆症的最主要发病形式，是一种进行性发展的神经退行性疾病，临床表现为认知功能障碍和记忆功能丧失，晚期可导致死亡。截止2011年，全球已有3500万名AD患者，而与AD相关的死亡病例大约有48.6万例。AD的发病人数已经仅次于癌症和心脏病，成为最耗费社会财政支出的疾病之一。AD的研究已有100多年的历史，而近年来越来越多的研究表明，β淀粉样蛋白(Aβ)的聚集和纤维化过程是导致产生AD的重要原因。Aβ是含有39-43个氨基酸残基的多肽，由淀粉样前体蛋白(amyloid-βprecursorprotein，APP)经β和γ分泌酶依次切割形成。Aβ的两种主要类型分别是Aβ40和Aβ42，其中Aβ40含量较为丰富，但Aβ42毒性更强。因此研究Aβ聚集行为，在聚集早期对其进行抑制是一种可行的治疗手段，能够阻止或延迟AD的发病。

目前，研究者已经开发了多种针对Aβ聚集的抑制剂，包括小分子多酚类、多肽及其衍生物、抗体、聚合物和各种纳米粒子等。这些抑制剂在体外试验以及细胞试验中具有一定抑制Aβ聚集的效果，但这些抑制剂都存在一定的问题：如生物相容性不佳、自身具有细胞毒性、在体内的稳定性和生物效用差等。在这些抑制剂中，多酚类小分子(如姜黄素、EGCG和巴西木素等)对Aβ的聚集具有一定的优点：良好的抑制效果好、体外作用效果显著、与Aβ的结合作用强和相对安全等。但同时存在一些问题，如多酚类小分子在体内的生物效用普遍较低，这主要是因为其疏水性较强、易于被降解或代谢、不能穿透血脑屏障等原因所造成。解决这些问题的一种方法就是在其分子上修饰其他基团或分子，来提高其水溶性、保护其在体内不被降解等，以提高其功效。

前人研究表明姜黄素是一种能够有效抑制Aβ聚集的多酚类抑制剂。姜黄素是从姜黄根茎中提取出的一种植物多酚，是姜黄中的有效成分，分子式为:C₂₁H₂₀O₆。姜黄素的结构式如下：

姜黄素是一种已被证实的具有多种药物效用的物质，许多研究表明，姜黄素具有抗肿瘤、抗炎症、抗损伤、抗氧化、抑制血栓生成、抗辐射等作用。而近年来，越来越多的研究文献开始关注姜黄素在AD治疗中的作用，在已开展的一系列针对姜黄素与AD之间的关联性研究中，研究人员发现姜黄素不仅具有显著抑制Aβ的聚集和降低Aβ聚集体毒性和解聚Aβ纤维的效用，而关于其作用方式有许多机制来解释：姜黄素(0.1～1μmol/L)能导致已形成的纤维状的Aβ发生降解反应，姜黄素的化学结构的对称性可使其直接与游离态Aβ结合进而达到抑制其聚集的目的，通过与纤维状Aβ是有较高的亲和性的，二者结合之后，Aβ的二级结构即以β-折叠形式存在的Aβ会失去稳定性，进而发生降解反应。此外，研究人员发现姜黄素类药物分子结构中的苯酚环能够与淀粉样蛋白氨基酸序列中的芳香基残基相互作用，进而这些抑制剂会与淀粉样蛋白氨基酸序列的中心结合达到干扰淀粉样蛋白的聚集的目的。除此以外，姜黄素的其它方面的药物作用如抗氧化应激、抗炎机制、免疫调节和螯合金属离子等能力也对阿尔兹海默症的治疗具有良好的作用。

综上所述，姜黄素在AD的多个发病环节都起着至关重要的调节作用，也具有良好的预防和治疗作用，具有非常广阔的应用空间。但是，由于姜黄素类物质疏水作用较强、容易于被降解或被代谢掉、不能够穿透血脑屏障等原因，其生物效用普遍较低。此外，姜黄素自身还对细胞具有一定毒性。因此，找到适合的修饰或改进方法成为研究的重中之重。根据姜黄素的强疏水性，利用亲水性大分子物质修饰姜黄素，可以提高水溶性和稳定性、降低毒性、形成两亲性物质自组装得到纳米粒子，从而保护姜黄素不被分解，提高体内稳定性，还能引入纳米效应，利用纳米粒子的性质，可大大增强其对Aβ的抑制作用。

多糖类聚合物具有分子量范围大、拥有大量的活性基团和组成成分多样等而被广泛应用于小分子药物的载体。在多糖类聚合物中，透明质酸是一种天然酸性粘多糖，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，具有水溶性好、无毒、无免疫源性等优点，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，可以调节血管壁的通透性，调节蛋白质等。同时，透明质酸具有大量羧基，不仅可以与姜黄素的酚羟基反应，还能为形成的纳米粒子提供负电荷的界面电势从而形成稳定的纳米粒子，此外，一些研究表明透明质酸修饰疏水药物可以形成纳米凝胶结构，而这种结构可以隔离与姜黄素结合的Aβ单体，具有提高抑制效果的作用。因此，利用透明质酸作为修饰Aβ聚集抑制剂姜黄素，来达到提高水溶性、提高生物体内稳定性，并利用姜黄素的疏水性和透明质酸的亲水性来形成自组装纳米粒子，利用纳米粒子性质来加强与Aβ的作用，提高抑制效果，成为具有前景的治疗AD的候选药物。

发明内容

本发明的目的是克服姜黄素作为Aβ抑制剂的缺陷，设计利用天然大分子透明质酸修饰姜黄素，得到自组装纳米凝胶结构，改善姜黄素的水溶性，提高其在生物体内的稳定性，并利用纳米凝胶的效用提高抑制效果，制备抑制β淀粉样蛋白聚集药物的用途。

透明质酸具有大量羧基，可以通过酯化反应修饰姜黄素，其反应式如图1所示：

本发明首先从已被证实的能有效抑制Aβ聚集的多酚类小分子姜黄素(curcumin)出发，根据姜黄素的强疏水性特征和其功能团，通过酯化反应，在其上修饰亲水性很强的天然大分子透明质酸(HA)，从而得到两亲性物质Curcumin-HA(简称为CHA)。由于CHA同时具备强疏水部分和强亲水性部分，在水环境中能自发组装形成纳米结构，同时由于HA的特性，能够形成水凝胶结构。这一自组装纳米结构不仅改善了姜黄素不溶于水的特性，还能通过纳米凝胶的隔离作用将与姜黄素结合的Aβ单体稳定，使其不易聚集，从而提高抑制效果。

一种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的自组装纳米粒子；其特征是利用天然大分子透明质酸修饰姜黄素，得到自组装纳米凝胶结构，其结构式如下：

本发明的自组装纳米粒子的制备方法，步骤如下：

1)将透明质酸溶于去离子水/二甲基亚砜体系，分别取1-4mg/mL浓度的透明质酸溶液，加入酯化反应催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，磁力搅拌活化羧基0.5-1h；

2)向上述透明质酸溶液加入的姜黄素，姜黄素与透明质酸质量比例控制在1：1～5，在65℃水浴反应5-8h；

3)反应后的溶液使用二甲基亚砜透析2天，再使用去离子水透析3-5天，除去其中残余可溶物，得到CHA自组装纳米粒子溶液；

4)将不同修饰度的CHA自组装纳米粒子溶液保存在4℃下。

自组装纳米粒子用于制备抑制β淀粉样蛋白聚集药物的用途。

所述的透明质酸分子量范围为大于100万。

所述去离子水/二甲基亚砜体积比1:1。

二甲基亚砜透析的透析截流分子量10000-14000道尔顿。

本发明的关键技术有三点：

首先反应条件和HA/姜黄素添加比例，通过实验测试不同添加比例下得到的CHA中的姜黄素的量，从而制备得到具有不同姜黄素修饰度的CHA，其中姜黄素的修饰度范围在1.27-3.11之间(以每100个透明质酸单体分子所含的姜黄素分子表示)；

其次是对不同姜黄素修饰度的CHA进行纳米结构的表征，结果表明不同修饰度的CHA具有不同的纳米结构和粒径，粒径分布范围为180-580nm，而且随着修饰度的增大，粒径减小，粒径可控性良好；

最后是得到的自组装CHA纳米凝胶大大提高了姜黄素的水溶性，同时能形成十分稳定的自组装纳米凝胶结构，在磷酸缓冲液(100mM磷酸盐，pH7.4)中至少稳定保持7天粒径不变化。而且不同姜黄素修饰度的CHA由于具有不同的纳米结构，而产生了不同的抑制效果，本发明通过实验优化筛选出了具有最佳抑制效果的CHA，姜黄素修饰度以2.4左右时为最佳。本发明的优点：

多种实验手段证明，CHA自组装纳米粒子不仅提高了姜黄素的水溶性和稳定性，降低了姜黄素自身的毒性，还能够有效抑制Aβ40和Aβ40的聚集，减少了纤维的生成；改变了Aβ40聚集体的形貌，同时还能降低Aβ42聚集产生的细胞毒性。此外，不同姜黄素修饰度的CHA具有不同的抑制效果，本发明通过实验优化筛选出了具有最佳抑制效果的CHA，在相同姜黄素浓度下，远比姜黄素的抑制效果好，因此本发明中的CHA是一种Aβ聚集的理想抑制剂，能成为潜在的AD治疗药物，并且本方法为其他类似的多酚类小分子抑制剂的修饰改善提供了思路和方法。

附图说明

图1：合成CHA的示意图；

图2A：实施例4中CHA1紫外-可见光光谱；

图2B：实施例4中CHA1的核磁共振图谱；

图3：实施例5中利用透射电子显微镜观测CHA1的形貌；

图4：实施例6中利用动态光散射仪测定的CHA在水溶液或磷酸缓冲液中的平均粒径大小；

图5：实施例7中Aβ40单独培养或与不同CHA纳米抑制剂共同培养下随时间变化的ThT荧光强度；

图6：实施例8中，Aβ42单独培养或与不同抑制剂共同培养48h后的ThT荧光强度；

图7A：实施例9中，利用透射电子显微镜观测Aβ40单独培养培养48h后的纤维形态；

图7B：实施例9中，利用透射电子显微镜观测Aβ40与姜黄素共同培养48h后的纤维形态；

图7C：实施例9中，利用透射电子显微镜观测Aβ40与CHA纳米共同培养48h后的纤维形态；

图8：实施例10中，CHA纳米对SH-SY5Y细胞的细胞毒性；

图9：实施例11中，Aβ42单独或与CHA共培养20h后培养物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

本发明首先从已被证实的能有效抑制Aβ聚集的多酚类小分子姜黄素(curcumin)出发，根据姜黄素的强疏水性特征和其功能团，通过酯化反应，在其上修饰亲水性很强的天然大分子透明质酸(HA)，从而得到两亲性物质Curcumin-HA(简称为CHA)，分子式如下：

由于CHA同时具备强疏水部分和强亲水性部分，在水环境中能自发组装形成纳米结构，同时由于HA的特性，能够形成水凝胶结构。这一自组装纳米结构不仅改善了姜黄素不溶于水的特性，还能通过纳米凝胶的隔离作用将与姜黄素结合的Aβ单体稳定，使其不易聚集，从而提高抑制效果。

本发明的多肽功能化的金纳米粒子的制备方法，其步骤如下：

1)将透明质酸(分子量>1×10⁶)溶于去离子水/二甲基亚砜体系(体积比1:1)，分别取1-4mg/mL浓度的透明质酸溶液，加入酯化反应催化剂二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，磁力搅拌活化羧基0.5-1h。

2)向上述透明质酸溶液加入的姜黄素，姜黄素与透明质酸质量比例控制在1：1到1:5之间，从而得到不同透明质酸/姜黄素添加比例的反应体系，在65℃水浴反应5-8h。

3)反应后的溶液使用二甲基亚砜透析2天(透析截流分子量10000-14000道尔顿)，再使用去离子水透析3-5天，除去其中残余可溶物，得到CHA自组装纳米粒子溶液。

4)将不同修饰度的CHA自组装纳米粒子溶液保存在4℃下。

5)CHA自组装纳米粒子能够提高姜黄素的水溶性，使其可以应用于抑制β淀粉样蛋白的聚集过程，并且通过凝胶隔离作用和纳米效应来提高其抑制效果。

实施例1：CHA纳米粒子的合成(CHA1)

通过酯化反应利用透明质酸修饰姜黄素，以得到CHA纳米粒子，反应示意图如图1所示。具体制备方法如下所示：将透明质酸溶于去离子水/二甲基亚砜体系，分别取1mg/mL浓度的透明质酸溶液，加入酯化反应催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，磁力搅拌活化羧基0.5-1h；向上述透明质酸溶液加入姜黄素(姜黄素与透明质酸比例分别为1：5)，在65℃水浴反应5-8h；反应后的溶液使用二甲基亚砜透析2天，再使用去离子水透析3-5天，除去其中残余可溶物，得到CHA自组装纳米粒子溶液；将不同修饰度的CHA自组装纳米粒子溶液保存在4℃下，以备使用。此条件下得到的纳米粒子命名为CHA1。

实施例2：CHA纳米粒子的合成(CHA2)

通过酯化反应利用透明质酸修饰姜黄素，以得到CHA纳米粒子，反应示意图如图1所示。具体制备方法如下所示：将透明质酸溶于去离子水/二甲基亚砜体系，分别取2mg/mL浓度的透明质酸溶液，加入酯化反应催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，磁力搅拌活化羧基0.5-1h；向上述透明质酸溶液加入姜黄素(姜黄素与透明质酸比例分别为1：3)，在65℃水浴反应5-8h；反应后的溶液使用二甲基亚砜透析2天，再使用去离子水透析3-5天，除去其中残余可溶物，得到CHA自组装纳米粒子溶液；将不同修饰度的CHA自组装纳米粒子溶液保存在4℃下，以备使用。此条件下得到的纳米粒子命名为CHA2。

实施例3：CHA纳米粒子的合成(CHA3)

通过酯化反应利用透明质酸修饰姜黄素，以得到CHA纳米粒子，反应示意图如图1所示。具体制备方法如下所示：将透明质酸溶于去离子水/二甲基亚砜体系，分别取4mg/mL浓度的透明质酸溶液，加入酯化反应催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，磁力搅拌活化羧基0.5-1h；向上述透明质酸溶液加入姜黄素(姜黄素与透明质酸比例分别为1：5)，在65℃水浴反应5-8h；反应后的溶液使用二甲基亚砜透析2天，再使用去离子水透析3-5天，除去其中残余可溶物，得到CHA自组装纳米粒子溶液；将不同修饰度的CHA自组装纳米粒子溶液保存在4℃下，以备使用。此条件下得到的纳米粒子命名为CHA3。

实施例4：定性CHA的合成和定量CHA中所含的姜黄素浓度

将反应后并透析纯化后的产物利用紫外-可见光分光光度计测定其光谱，来检测是否在透明质酸上修饰上姜黄素，其中实施例1中得到CHA1的红外图谱结果如图2A所示。由图2A可知，透明质酸在400-500nm范围内是没有吸光值的，而纯姜黄素以及反应后得到的产物，在440nm左右是具有明显的吸光值的，因此可以认为在透明质酸上成功修饰上了姜黄素。

同时我们还利用核磁共振技术测定实施例1中得到的CHA1的核磁共振图谱，来验证是否在透明质酸上修饰上姜黄素，结果如图2B所示。可以看到，CHA图谱中存在姜黄素的芳香环的峰(6.67–7.12ppm)、与苯环相邻的氢原子的峰(7.51–7.52ppm)和姜黄素的羟甲基的峰(3.82ppm)，这表明在透明质酸上成功修饰上了姜黄素。

同时利用姜黄素在440nm处的特异吸收绘制标准曲线，再利用标准曲线来定量CHA中所含的姜黄素的量，并计算得到CHA的姜黄素修饰度，我们按照其姜黄素含量多少分别命名为CHA1、CHA2、CHA3，其姜黄素含量分别为1.27、2.42、3.11(用每100个透明质酸单体所含姜黄素分子数表示)。

实施例5：CHA自组装纳米粒子的形貌

将实施例1得到的CHA1自组装纳米粒子的水溶液滴加在400目的碳支持膜上，自然干燥后用透射电子显微镜进行观察，选取放大后标尺为100nm的图像进行观察，结果如图2所示。

由图3可知，CHA自组装纳米粒子的形貌为略不规则的球状，且粒径分布范围略宽。

实施例6：动态光散射方法测定溶液中的CHA粒径

将实施例1-3得到的不同的CHA用去离子水或磷酸缓冲液适当稀释后(稀释度以动态光散射数据较稳定为准，约0.1-0.5mg/mL，磷酸缓冲液的终浓度为100mM并含10mM氯化钠)，采用马尔为Zetasizer仪器测定其粒径分布，并计算其平均粒径。结果如图4所示。

由图4可知CHA在水环境下的粒径分布要远大于干燥状态下(即实施例2中的数据)，表明CHA的吸水性很强，失水坍塌后粒径急剧减小。同样地，在水环境下，不同CHA的粒径依然大小不一致，姜黄素的修饰量越高，其粒径越小。此外，在磷酸缓冲液中CHA的粒径要小于在去离子水中的粒径，表明溶液中的离子强度会影响CHA纳米粒子的粒径和结构。以上两例，表明CHA纳米材料是一种粒径可调控的材料。

实施例7：CHA纳米粒子与Aβ40共培养的ThT荧光强度变化

首先将Aβ40溶于六氟异丙醇溶液，得到1mg/mL的Aβ40溶液，超声10min，使Aβ处于单分散状态，冷冻干燥，获得Aβ40干粉，于-20℃保存。

称取5mg的Aβ40，溶于4.03mL的NaOH溶液(浓度为20mmol/L)中，超声10min使之充分溶解，4℃，16000g离心20min，取总体积75％的上清液，得到Aβ40溶液(浓度为275μmol/L)。用磷酸缓冲液(其中磷酸盐浓度为100mmol/L，NaCl浓度为10mmol/L，pH7.4)稀释，得到终浓度为25μmol/L的Aβ40溶液，其中不含或者含有实施例1-3得到的CHA抑制剂和姜黄素抑制剂(姜黄素浓度为25μmol/L)。将配置好的Aβ40溶液至于恒温空气浴摇床中37℃培养，摇床转速为150rpm。

在不同培养时间取样200μL，加入2mLThT溶液(其中ThT浓度为25μmol/L，含磷酸盐浓度为100mmol/L，NaCl浓度为10mmol/L，pH7.4)，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度。测定结果取三个平行样品的平均值，并以只含Aβ40的样品为100％对照组，将含有不同抑制剂的Aβ40或只含Aβ40在不同时间的荧光值绘制成图，并按照文献中常用的纤维生长方程进行拟合，并计算延迟期，结果如图5所示,拟合方程如下：

$y=y_0+\frac{y_{max}-y_0}{1+\exp \[-(t-t_{1/2})k\]}$

其中y是t时刻的荧光值，y₀andy_max分别是荧光生长曲线的最小值和最大值,t_1/2是达到荧光值一半时的培养时间,k是表观一级纤维生长速率。此外，有公式中的参数可以计算得到延迟期，公式如下：

T_lsg＝t₁/2-2/k

由图5可知，加入CHA纳米粒子后，不仅能够降低Aβ40纤维的总量，还能减缓纤维聚集的速度即增加延迟期。此外，可以看到CHA明显比同浓度的游离态姜黄素的抑制效果更强，表明CHA纳米粒子是一种能够有效抑制Aβ聚集的抑制剂。

实施例8：CHA纳米粒子与Aβ42共培养的ThT荧光强度变化

按照与实施例4相同的方法处理Aβ42，并配制与实施例4相同的含有实施例1-3得到的CHA或姜黄素抑制剂的Aβ42溶液(溶液中Aβ42的终浓度为25μmol/L)，并采用与实施例4相同的培养条件进行培养，并培养48h后测定ThT荧光，结果如图6所示。

由图6可知，CHA纳米粒子同样能够抑制Aβ42纤维的形成，而且与实施例4结果相类似，CHA比同浓度的游离态姜黄素抑制效果更强，抑制效果更佳。

实施例9：Aβ40单独培养或与姜黄素或CHA2自组装纳米粒子共培养48h后培养物的形态

按照实施例4所述方法，25μmol/LAβ40单独培养或与姜黄素或实施例2得到的CHA2自组装纳米粒子共培养48h，取100μL的Aβ40培养液，超声10min，将5-10μL溶液滴加在400目的碳支持膜上，5min后滴加1％的磷钨酸溶液(pH＝6.5)染色30s后吸掉多余液体，自然干燥。然后用透射电子显微镜进行观察，结果如图7所示，其中图7A为Aβ40单独培养后的形态，图7B为Aβ40与25μmol/L的姜黄素共培养后的形态，图7C为Aβ40与CHA3(含25μmol/L姜黄素)共培养后的形态。

由图7可知，Aβ40在单独培养48h后形成了10-20nm宽，数微米长的纤维；而Aβ40与25μmol/L的姜黄素共培养48h后纤维的形态发生了变化，首先纤维的数量显著减少了，纤维长度缩短了，并且存在高度较小的纤维以及一些点状的纤维。而Aβ40与CHA3(含25μmol/L姜黄素)共培养48h后形态显示，长纤维消失，而存在大量点状纤维。这说明，CHA3纳米粒子能发挥与姜黄素相同的作用，改变了Aβ的聚集路径，使Aβ40纤维的形态发生变化，减少长纤维的量，而且CHA的效果要强于同浓度的姜黄素。

实施例10：不同CHA自组装纳米粒子对SH-SY5Y细胞的细胞毒性

细胞毒性实验采用MTT实验测试，使用的细胞为人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)。培养基为DMEM/F-12培养基，含15％FBS，1％谷氨酰胺，100U/mL双抗。培养环境为5％CO₂，37℃恒温培养。

将细胞按每孔90μL培养液，5000个细胞的密度加入96孔板中。培养24h后，加入实施例1-3得到的CHA或姜黄素，最终使加药孔每孔中姜黄素浓度为25μmol/L，CHA所含姜黄素25μmol/L。继续培养24h在每孔中加入10μLMTT溶液(使每孔MTT终浓度为0.5mg/mL)，继续培养4h。检测时，将96孔板以1500rpm的速度离心10min，离心后移除96孔板中溶液，每孔加入100μL的DMSO摇床震荡10min。待紫色晶体完全溶解后，使用酶标仪在570nm下测定吸光度，计算细胞存活率。以不含细胞的样品作为空白组(0％)；不含Aβ和抑制剂，仅含有细胞的样品作为对照组(100％)，计算加药组的细胞存活率。实验中每个样品设置6个平行。结果如图8所示。

由图8可知，姜黄素具有25％的细胞毒性，而利用透明质酸修饰后能降低姜黄素的细胞毒性，修饰后只有10％的细胞毒性。表明利用大分子透明质酸修饰姜黄素后可以在一定程度上改善姜黄素自身的毒性。

实施例11：Aβ42单独或与CHA或姜黄素共培养20h后培养物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性

细胞实验方法与条件同实施例7，将细胞按每孔90μL培养液，5000个细胞的密度加入96孔板中。培养24h后，加入10μL老化后的Aβ42或Aβ42与实施例1-3得到的CHA或姜黄素共培养的样品(使每孔终浓度含Aβ4225μmol/L)，每组设置六个平行，并且采用t-test方法比较姜黄素组和CHA组是否具有显著区别，结果如图9所示。

由图9可知，Aβ42单独培养加入细胞后时，细胞存活率为50％。而加入与姜黄素共培养的Aβ42后SH-SY5Y细胞存活率提高到58％，而加入与CHA共培养的Aβ42后SH-SY5Y细胞存活率大幅提高，细胞存活率最高，可达82％，说明姜黄素在降低Aβ42聚集体造成的细胞毒性的作用上不明显，而CHA纳米粒子则能够有效降低Aβ42聚集体造成的细胞毒性。

本发明基于姜黄素水溶性差、稳定性差和具有一定细胞毒性的缺陷，设计利用天然高亲水性大分子透明质酸，通过酯化反应修饰姜黄素来改善缺陷。并有效利用姜黄素强疏水性的特点得到两亲性物质CHA，在水环境下能自组装形成纳米凝胶结构，利用纳米凝胶的特点提高姜黄素与Aβ的作用，从而提高抑制效果。此外，通过调节反应中添加的透明质酸和姜黄素的比例，制备得到具有不同姜黄素修饰度和不同纳米结构的CHA，并将其应用于Aβ的构象变化、聚集和细胞毒性抑制实验的研究，并且证明了CHA既能改善姜黄素的水溶性和毒性问题，还能利用纳米凝胶结构加强姜黄素的抑制效果，并且筛选优化了具有最佳修饰度和纳米结构的CHA。通过实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (6)

1.一种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的自组装纳米粒子；其特征是利用天然大分子透明质酸修饰姜黄素，得到自组装纳米凝胶结构，其结构式如下：

2.权利要求1所述的自组装纳米粒子低制备方法，其特征是步骤如下：

1)将透明质酸溶于去离子水和二甲基亚砜体系，分别取1-4mg/mL浓度的透明质酸溶液，加入酯化反应催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，磁力搅拌活化羧基0.5-1h；

2)向上述透明质酸溶液加入的姜黄素，姜黄素与透明质酸质量比例控制在1:1～1:5，在65℃水浴反应5-8h；

3)反应后的溶液使用二甲基亚砜透析2天，再使用去离子水透析3-5天，除去其中残余可溶物，得到自组装纳米粒子CHA溶液；

4)将不同修饰度的CHA自组装纳米粒子溶液保存在4℃下。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的透明质酸分子量范围为大于100万。

4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述去离子水和二甲基亚砜体积比1:1。

5.如权利要求2所述的方法，其特征是二甲基亚砜透析的透析截流分子量10000-14000道尔顿。

6.自组装纳米粒子CHA在制备抑制β淀粉样蛋白聚集药物的用途。