CN105412011A - 一种载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束。这类胶束是将具有抗转移活性的亲水性多糖材料与具有抗肿瘤活性的疏水性化疗药物偶联，在水介质中自组装形成胶束纳米粒。该纳米粒不仅能通过EPR效应将抗肿瘤药物有效输送至肿瘤，载体中的肝素成分还能抑制肿瘤细胞的转移，显示出更好的肿瘤治疗效果。

Description

一种载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性载体及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是当今世界对人类健康威胁最大的一类疾病之一，尽管手术、化疗、放疗可以控制一些癌症病情，但患者的存活率仍然很低。统计资料显示直肠癌在手术切除后5年内，尚有50%的患者发生肝转移，肝癌在根治性切除后5年内，仍有60%-70%的患者出现转移，60%的宫颈癌患者存在盆腔转移，60%-70%的的卵巢癌患者也存在多处转移。近半个多世纪以来的临床资料表明，约80%的肿瘤患者主要的死亡原因是局部复发和远处转移近。百余年来，人们已充分认识到恶性肿瘤对人体所造成危害的主要原因是其重要的生物学特性——侵袭与转移。因此只有在杀死肿瘤细胞的同时，抑制肿瘤细胞的侵袭，阻止肿瘤细胞转移，才能更有效的治疗癌症。

目前除了常规的抗肿瘤药物外，针对转移的不同分子靶点也开发了许多抑制剂，包括整合素蛋白抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、核因子抑制剂、趋化因子抑制剂等。但由于存在一些毒副作用，临床使用受到很大的限制。因而抗肿瘤转移的治疗需要有效且安全的药物。如今，天然来源的抗肿瘤侵袭和转移的研究正方兴未艾。单味中药材提取物，如刺五加皂苷、猪苓多糖、云芝多糖、金荞麦提取物、紫杉醇等表现出一定的诱导癌细胞凋亡、减少转移癌结节数目、抑制肿瘤细胞的侵袭和运动等作用。补益、活血化瘀、清热解毒、化湿利水、软坚散结类的中药复方制剂也表现出减少肿瘤细胞转移的作用，其作用机制可能与抗迁移机制、抑制细胞外基质的降解、抗粘附、阻断信息传递、抑制血管生成等有关。而越来越多研究表明多糖类化合物及其衍生物（诸如肝素、罗勒多糖、裙带菜多糖等）具有抗血栓形成、抗炎、抗氧化及抗肿瘤转移等多种生物活性。其中不仅许多动物实验表明肝素有抑制转移的作用，一些临床试验也证实了肝素具有抗肿瘤转移的活性。此外，天然多糖作为药用高分子材料具有生物相容性、可降解性和无毒性，其有希望被开发用来治疗肿瘤转移。

两亲性的自组装纳米粒被认为是很有前途的肿瘤靶向载体，其优势在于其制备过程简单且不需要有机溶剂或表面活性剂。如果将疏水性的生物活性分子（比如疏水性抗肿瘤药物）连接到亲水性的大分子聚合物上形成共价连接的大分子前体药物，就能在水中自发形成以药物为核心的纳米粒。这种前药具有以下几个优点：(1)药物的生物利用度提高、半衰期延长。(2)药物受到外部亲水层的保护，在水中的稳定性提高。(3)通过增强的渗透和滞留作用提高了药物在肿瘤部位的蓄积。(4)可以通过敏感的化学键连接，使其在敏感pH值或敏感酶存在的环境下释药。多糖的亲水性强，其侧链有一些可修饰的基团，具有作为亲水片段的潜力，如果将其与疏水性抗肿瘤药物共价连接成为两亲性共聚物，可以在水中自组装成胶束纳米粒。

纳米粒在体内循环过程中如何在肿瘤部位特异性响应并释放药物亦是影响疗效的重要因素，因此许多研究者设计出很多具有特定响应性的递药系统。这些相应信号的刺激包括热、光、超声波、谷胱甘肽、酸碱度和某些酶等。pH敏感的载药系统是研究最多的一类之一。肿瘤组织间隙液pH值比正常组织稍低（约6.8），而细胞内的溶酶体和内涵体pH值更低（约pH5.5）。如果设计抗肿瘤药物通过pH敏感的腙键与亲水多糖连接则可构建pH敏感的递药系统。在血液循环中，腙键保持较好的稳定性，不会释放出药物，而在肿瘤组织的弱酸环境中多糖与抗肿瘤药物之间的腙键可以快速断裂，释放药物发挥抗肿瘤活性。

基于上述背景，我们设计了一种全新的载药系统：以天然多糖或其衍生物为亲水骨架，通过腙键与疏水性抗肿瘤药物偶联，使其具有两亲性，在水中能自组装形成纳米粒，一方面这样的胶束纳米粒通过EPR效应蓄积于肿瘤部位，又因肿瘤微环境的较低pH使腙键断裂，释放抗肿瘤药物，杀伤原位的肿瘤细胞；另一方面，活性多糖通过与肿瘤相关因素，如选择素、酶类、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等相互作用抑制肿瘤新生血管的生长和肿瘤细胞的血行转移，进一步增强抗肿瘤效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性材料，该材料能够自发组装形成胶束纳米粒。

本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法及应用。

本发明所述的胶束是由具有抗转移作用的亲水性多糖或多糖衍生物通过连接片段和疏水性抗肿瘤药物偶联，使其具有两亲性，在水中能自组装形成胶束纳米粒。

本发明所述的亲水性多糖是具有抗肿瘤转移活性的，包括但不限于未分级肝素、低分子量肝素、罗勒多糖、裙带菜多糖及其衍生物等。

本发明所述的疏水抗肿瘤药物包括但不限于烷化剂类、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇衍生物、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物等。

本发明所述的连接片段一端的反应基团为氨基或羧基，另一端反应基团为羧基或酯。

本发明所述的多糖与连接片段通过酰胺键或酯键相连，疏水抗肿瘤药物与连接片段通过腙键相连。

本发明提供的本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性载体的制备方法如下：

（1）用两端含有氨基和酯键（或羧基，可酯化）做连接片段，将连接片段溶于反应溶剂中，与水合肼发生肼解反应生成带酰肼的中间体1。中间体1的酰肼键进攻疏水性药物上的羰基生成含有腙键中间体2。含有羧基的多糖或含有羧基的多糖衍生物溶于反应溶剂中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和羟基琥珀酰亚胺（NHS）为活化剂，与中间体2发生缩合反应，即得载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的多糖衍生物两亲性胶束。

（2）用两端含有氨基和酯键（或羧基，可酯化）做连接片段，将连接片段溶于反应溶剂中，与水合肼发生肼解反应生成带酰肼的中间体1。中间体1的酰肼键进攻疏水性药物上的羰基生成含有腙键中间体2。含有羟基的多糖或含有羟基的多糖衍生物溶于反应溶剂中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）为活化剂，与中间体2发生酯化反应，即得载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的多糖衍生物两亲性载体。

所述的制备方法中，活化剂包括EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）、NHS（羟基琥珀酰亚胺）、EDC-DMAP（4-二甲氨基吡啶）、EDC-HOBT（1-羟基苯并三氮唑）、DCC（二环己基碳二亚胺）-HOBT、DCC-NHS、DCC-DMAP，其中，投料比例（摩尔比）为多糖或多糖衍生物:活化剂=1:（1~10）。

所述的制备方法中，反应溶剂为水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺、水与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、水与二甲基亚砜的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂。

该胶束的制备方法如下：将合成的两亲性载体溶于水中，常温下振摇10分钟，冰水浴超声处理（200w、5s、5s、15次），即得粒径为150nm左右的胶束纳米粒。

本发明的目的之一在于提供了一种两亲性胶束在制备抗易转移性肿瘤药物中的用途。

有益效果

本发明所述的新型两亲性胶束，其优势在于载体本身同时兼顾以下优点：（1）肝素使载体本身具有抗肿瘤转移的作用；（2）肝素的抗新生血管作用可以增强其抗肿瘤效果；（3）腙键连接可以使胶束在肿瘤低pH条件下释放抗肿瘤药物；（4）载体具有良好的生物相容性和可降解性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的结构示意图。图中，1为肝素，2为阿霉素，3为连接片段。

图2为胶束中阿霉素在三种不同pH条件下（分别为pH5.0，pH6.8和pH7.4）的释放情况。其中HD-DOX代表由肝素和阿霉素通过连接片段偶联后在水中形成的两亲性胶束。

图3为采用划痕实验检测游离肝素、游离阿霉素和胶束对B16F10黑色素瘤细胞迁移的抑制情况。其中Beforetreated代表划痕后0小时，Untreated代表细胞不加药后24小时，Freeheparin和FreeDOX分别代表细胞与游离肝素和游离阿霉素孵育24小时，HD-DOX代表细胞与胶束孵育24小时。

图4为采用管路生成实验检测游离肝素、游离阿霉素和胶束对内皮细胞HUVECs形成管路的抑制作用。其中control代表不加药组，Heparin和DOX分别代表细胞与肝素和阿霉素孵育16小时，HD-DOX代表细胞与胶束孵育26小时。

图5为体内抗肿瘤和抗肿瘤转移实验。其中Saline代表给小鼠注射的生理盐水，Heparin、DOX和HD-DOX分布代表肝素、阿霉素和胶束。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。但是本领域技术人员

应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。并且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1连接片段（6—氨基己酸乙酯）的合成

100ml三口瓶中加入30ml无水乙醇，冰浴冷却至-10℃以下，缓慢滴加5ml二氯亚砜，保持温度在0℃以下。滴毕，搅拌10分钟，加入4.37g6-氨基己酸，升温到70℃左右回流反应8小时。减压蒸出过量的氯化亚砜和乙醇，残余物固化，用甲醇：石油醚（V:V=5:1）重结晶，得白色固体，即6-氨基己酸乙酯。

实施例2连接片段酰肼化

精密称取195.7mg的6—氨基己酸乙酯于50ml圆底烧瓶，溶于少量乙醇中，然后加入80μl水合肼，升温至70℃，避光回流反应8小时，TLC监测（展开剂二氯甲烷:甲醇=1:1），反应完全后旋蒸得粗品。过硅胶柱分离得纯品。

实施例3连接片段—阿霉素的合成

精密称取94.8mg酰肼于50ml圆底烧瓶，溶于少量乙醇中，然后加入271.8mg脱盐酸阿霉素和少量的三氟醋酸。室温条件下避光反应24小时，旋蒸得产物。

实施例4肝素—连接片段—阿霉素的合成

精密称取121.6mg肝素于100ml圆底烧瓶，滴加5ml甲酰胺，缓慢加热溶解。降温后加入59mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和35mg的羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌3小时，然后加入有连接片段的阿霉素，继续反应3天。丙酮沉淀并洗涤两次，将产物溶于超纯水，透析24小时后冻干。

实施例5胶束的制备

精密称取5mg两亲性纳米粒，溶于5ml超纯水中，冰水浴探头超声，得光学透明体。粒径大约为150nm。

实施例6胶束在体外药物释放情况

取胶束溶液0.3ml，与等体积的PBS溶液（pH7.4和pH6.5）混合，装入截留分子量为8000-10000的透析袋中，扎紧，将透析袋装入50ml的EP管中，加入30ml的PBS溶液（pH7.4和pH6.5）。将EP管置于37℃，75rpm的摇床中孵育，分别于0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h取样0.3ml，同时补充等体积空白PBS。24小时取样后剪破透析袋，作为释放完全的药物总量。取200μL用荧光化学发光分析仪测定阿霉素的荧光强度（Ex=470nm，Em=590nm，狭缝宽度为5nm，测定时间为200ms），各样品组以0h的荧光强度作为空白对照，计算各时间点释放的阿霉素占总的阿霉素的百分比，以阿霉素释放百分比为纵坐标，取样时间点作为横坐标绘制阿霉素的释放曲线图。

结果如图2所示，胶束中的阿霉素在pH7.4的条件下释放较缓慢，24小时的时候只释放了30%阿霉素。随着pH值的降低，不同时间点的阿霉素释放量都大大提高。pH6.8和pH5.0的时候，阿霉素24小时释放量分别达到60%和80%。说明通过腙键连接的两亲性胶束具有pH敏感性。

实施例7胶束对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用

将易转移的B16F10黑色素瘤细胞以1×10⁵/孔的密度接种于六孔板上，待细胞长至密度大于90%时用200μl枪头于每孔垂直划下划痕，用PBS清洗两次后更换为无血清培养基。同时分别加入游离肝素、游离阿霉素和胶束，继续培养24小时，观察、拍照。

结果如图3所示，没有加药处理的B16F10细胞在24小时后逐渐迁移到板子中间，之前的划痕变得非常狭窄，说明细胞的迁移能力很强。游离的肝素和阿霉素均对细胞迁移显示一定的抑制作用，我们的胶束组不仅可以抑制细胞活性，使密度降低，而且抑制细胞迁移情况最好。

实施例8胶束对内皮血管细胞管路生成的抑制作用

在48孔培养皿的每个孔内缓慢加入100μL的Matrigel，然后将培养皿放入细胞孵育箱中孵育30min待Matrigel凝固。采集HUVECs细胞，像铺好Matrigel的孔内加入细胞悬液，同时加入游离肝素、游离阿霉素和胶束。继续于孵箱中培养16小时。观察、拍照。

结果如图4所示，内皮细胞在Matrigel基质上形成类管道结构可模拟肿瘤的血管新生。形成含空腔的管道结构的能力是内皮细胞特有的。对照组中HUVECs细胞在Matrigel上形成明显的网格状的初试管道结构。受到肝素或胶束的抑制后这种管道结构或变得稀疏或完全消失。表明肝素及胶束可能具有抑制肿瘤新生血管形成的能力。

实施例9体内抗肿瘤及抗转移的作用

抗肿瘤实验模型是在C57/BL6小鼠背部皮下接种B16F10细胞（1×10⁶/只），肺部转移模型是尾静脉注射B16F10细胞（1×10⁵/只）。小鼠分为4组：生理盐水组、游离肝素组、游离阿霉素组及胶束组。每3天给一次要，给药5次。期间检测肿瘤体积大小，于第18天处死小鼠，取出肺部组织，观察，拍照。

结果如图5所示，肝素和生理盐水组的效果差不多，不能抑制肿瘤生长，而游离阿霉素可以抑制肿瘤的生长，我们的胶束组显示出最好的抗肿瘤效果。此外，由于肝素和阿霉素均对小鼠体内肿瘤肺部转移有一定的抑制作用，胶束组亦显示出最好的抗肿瘤转移效果。

Claims (9)

1.一种载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束，其特征在于该载体是将具有抗转移活性的亲水性多糖材料与具有抗肿瘤活性的疏水化疗药物偶联，使其具有两亲性，在水中能自组装形成胶束纳米粒。

2.根据权利要求1所述的载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束，其特征在于连接片段一端的反应基团氨基或者羧基，另一端反应基团为酯。

3.根据权利要求1所述的载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束，其特征在于多糖与连接片段通过酰胺键或酯键相连，疏水性抗肿瘤药物与连接片段通过腙键相连。

4.根据权利要求1所述的载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束，其特征在于包括下列合成步骤：

（1）用两端含有氨基和酯键（或羧基）的连接片段，将连接片段溶于反应溶剂中，与水合肼发生肼解反应生成带酰肼的中间体1；

（2）中间体1的酰肼键进攻疏水性药物上的羰基生成含有腙键中间体2。

5.含有羧基（羟基）的多糖或含有羧基（羟基）的多糖衍生物溶于反应溶剂中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和羟基琥珀酰亚胺（NHS）或EDC和4-二甲氨基吡啶（DMAP）为活化剂，与中间体2发生缩合反应，即得载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的多糖衍生物两亲性胶束。

6.根据权利要求4所述的多糖与疏水性抗肿瘤药物偶联的制备方法，其特征在于所述活化剂包括EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）、NHS（羟基琥珀酰亚胺）、EDC-DMAP（4-二甲氨基吡啶）、EDC-HOBT（1-羟基苯并三氮唑）、DCC（二环己基碳二亚胺）-HOBT、DCC-NHS、DCC-DMAP，其中，投料比例（摩尔比）为多糖或多糖衍生物:活化剂=1:（1~10）。

7.根据权利要求4所述的多糖与疏水性抗肿瘤药物偶联的制备方法，其特征在于反应溶剂为水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺、水与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、水与二甲基亚砜的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂。

8.根据权利要求1所述的载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的多糖衍生物两亲性胶束，其特征在于所述多糖类必须具有抗转移活性，包括但不限于未分级肝素、低分子量肝素、罗勒多糖、裙带菜多糖及其衍生物等。

9.根据权利要求1所述的载体本身具有抗肿瘤和抗转移活性的两亲性胶束，其特征在于所述疏水性抗肿瘤药物包括但不限于烷化剂类、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇衍生物、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。