CN104367584A - 多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提出了多西环素具有抗肿瘤活性，主要包括对肿瘤生长的抑制作用及抗肿瘤转移和侵袭的活性。通过在体外细胞水平及动物实验水平的实验，证实多西环素对乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、结肠癌类的恶性肿瘤均有抑制生长和迁移的作用，同时在荷瘤小鼠模型上也显示出了很好的抗肿瘤效果。此外，本发明的多西环素具有其它药物不可比拟的优势，患者易于接受且便于了解患者对药物的反应。多西环素将会改变已有肿瘤化疗药物的市场格局，成为一种可长期服用，且有效抑制肿瘤转移、侵袭和复发的临床药物。

Description

多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体而言，涉及多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

多西环素“Doxycycline”（也称为强力霉素），属于四环素类抗生素，是众所周知且应用广泛的抗生素。四环素类药物主要作用于细菌核蛋白体30S亚基，干扰氨基酸tRNA与30S亚基上的作用位点结合，阻断氨基酰tRNA与核糖体-mRNA复合体结合，抑制蛋白质合成，同时也可以改变细胞膜的通透性，使胞内重要物质核苷酸等外露，抑制DNA合成，从而达到抑菌的效果。多西环素是四环素类药物中药效较强的和应用较广的一个类型(Adimora AA.,2002;Kovacova E,et al.,2002)。关于多西环素目前在临床上主要是用于治疗上呼吸道感染、胆道感染、尿路感染,老年慢性支气管炎、急慢性气管炎、肺炎、支气管炎、蜂窝组织炎等症状。

到目前为止，多西环素在肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中的应用尚无报道。肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤是高发性疾病，由于上述恶性肿瘤普遍具有转移和侵袭的能力，因此一旦发生上述疾病，则难以治愈，会对人类健康造成的很大的危害。而针对肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的现有抗肿瘤药物不仅抗肿瘤活性低，且价格昂贵，病人往往难以承受，甚至有些病人因为不能承受昂贵的价格而放弃了治疗机会。因此，迫切需要开发新的抗肿瘤生长、转移或侵袭的药物。

发明内容

针对现有技术中抗肿瘤药物的抗肿瘤活性低且价格昂贵等缺陷，本发明的目的在于提供多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了达成上述目的，本发明提供了多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述多西环素的分子结构式为：

在制备抗肿瘤药物中的应用中，所涉及的肿瘤包含：乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、结肠癌或它们的组合。

在制备抗肿瘤药物中的应用中，抗肿瘤药物的应用，包括作为细胞毒性药物在抗肿瘤生长的抑制剂中的应用、作为抗肿瘤转移的药物中的应用、或作为抗肿瘤侵袭的药物中的应用。

在制备抗肿瘤药物中的应用中，抗肿瘤药物包含有效治疗量的多西环素，或其在药学上可接受的盐，或酯以及辅料。

在制备抗肿瘤药物中的应用中，抗肿瘤药物的有效治疗量为100mg/kg～300mg/kg。

在制备抗肿瘤药物中的应用中，抗肿瘤药物选自片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂或它们的组合。

在制备抗肿瘤药物中的应用中，抗肿瘤药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

本发明提供的抗肿瘤药物的优势在于，患者易于接受且便于了解患者对药物的反应、价格低廉、容易获取。此外，多西环素将会改变已有肿瘤化疗药物的市场格局，成为一种可长期服用，且有效抑制肿瘤转移、侵袭和复发的临床药物。

本发明所使用的多西环素为多西环素盐酸盐，购自上海生工（生产批号DB0889-25g）。多西环素盐酸盐的化学结构式为：

附图说明

图1示出了多西环素对人乳腺癌细胞系MCF-7的抑制作用；

图2示出了多西环素对人肝癌细胞系HepG-2的抑制作用；

图3示出了多西环素多西环素对小鼠黑色素瘤B-16细胞的抑制作用；

图4示出了多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446的抑制作用；

图5示出了多西环素对胰腺癌细胞PC-3的抑制作用；

图6示出了多西环素对人结肠癌细胞LOVO的抑制作用；

图7示出了多西环素对MCF-7细胞迁移的影响；

图8示出了多西环素对HepG2细胞的迁移的影响；

图9示出了多西环素对B16细胞迁移的影响；

图10示出了多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446迁移的影响；

图11示出了多西环素对胰腺癌细胞PC-3迁移的影响；

图12示出了多西环素对人结肠癌细胞LOVO迁移的影响；

图13示出了多西环素对荷瘤小鼠肿瘤大小的抑制作用；

图14示出了多西环素对荷瘤小鼠肿瘤生长状态的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

发明人经过大量的实验研究证实了，四环素结构的多西环素的抗肿瘤的活性。具体实施方式如下。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

多西环素盐酸盐，购自上海生工（生产批号：DB0889-25g）；高糖DMEM培养基，RIPM1640培养基，胎牛血清FBS（Hyclone品牌）购自Thermo公司；四甲基噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；96孔板（Nunc品牌）购自Thermo公司；Hochest33342购自碧云天生物技术有限公司；DMSO购自美国Sigma公司；C57/BL小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。

实施例1多西环素对不同肿瘤细胞生长的抑制作用测试

多西环素用DMSO配置成30mM的母液并储存.，使用时用培养液稀释至使用浓度。

选用细胞系为：人乳腺癌细胞系MCF-7（培养基为：RIPM1640加10%FBS，购自北京金紫晶生物医药技术有限公司）；人肝癌细胞系HepG-2（培养基为：DMEM高糖培养基加10%FBS，购自北京金紫晶生物医药技术有限公司）；小鼠黑色素瘤B-16细胞（培养基为：RIPM1640加10%FBS，购自北京金紫晶生物医药技术有限公司）；人小细胞肺癌细胞NCI-H446（培养基为：RIPM1640加10%FBS，购自南京凯基生物科技发展有限公司）；胰腺癌细胞PC-3（培养基为：RIPM1640加10%FBS，购自南京凯基生物科技发展有限公司）；人结肠癌细胞LOVO（培养基为：RIPM1640加10%FBS，购自南京凯基生物科技发展有限公司）。

实验方法为MTT比色法：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

具体实验步骤为：细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，4000cells/孔。置于37摄氏度二氧化碳（5%）培养箱中过夜培养，使细胞贴壁。第二天，弃去培养液，加入含一系列多西环素浓度的细胞培养液（具体浓度在每种细胞结果中述及），并设置不加药物浓度的对照孔。置于37摄氏度二氧化碳（5%）培养箱培养48小时后，每孔加入20μL MTT母液（母液浓度为5mg/mL），继续孵育4h。然后将培养液吸出，每孔加入150μL DMSO作溶剂溶解甲瓒，溶解后用酶标仪（Multiscan FC，Thermo公司产品）测定490nm处的吸光度，按下式计算细胞存活率：

(实验组OD/对照组OD)×100%

实验结果1多西环素对人乳腺癌细胞系MCF-7的抑制作用

多西环素对人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞毒性的剂量响应曲线如附图1所示。所用的多西环素的浓度为：0μM、0.39063μM、0.78125μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM。从图1中可以看出100μM时，MCF-7细胞的存活率为20%。多西环素对MCF-7细胞增殖的抑制达到了80%。表明多西环素对MCF-7细胞的增殖有很好的抑制效果。

实验结果2多西环素对人肝癌细胞系HepG-2的抑制作用。

多西环素对人肝癌细胞系HepG-2的细胞毒性的剂量响应曲线如附图2所示。所用的药物浓度为：0μM、0.39063μM、0.78125μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM。从图2中可以看出，多西环素浓度为100μM时，HepG-2细胞的存活率为80%。多西环素对HepG-2细胞增殖的抑制率达到20%。表明多西环素对HepG-2细胞增殖有一定的抑制效果。

实验结果3多西环素对小鼠黑色素瘤B-16细胞的抑制作用

多西环素对小鼠黑色素瘤B-16细胞毒性测试结果如附图3所示。所用的药物浓度为：0μM、0.78μM、1.56μM，3.125μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM。从图中可以看出，药物浓度为100μM时，细胞的存活率为0.04%。多西环素对B-16细胞增殖的抑制率达到99.6%。表明多西环素对B-16细胞增殖有非常好的抑制效果。

实验结果4多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446的抑制作用

多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446测试结果如附图4所示。所用的多西环素的浓度为：0μM、0.78μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM。从图中可以看出，药物浓度为200μM时，细胞的存活率为29%。多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖的抑制率达到71%。表明多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖有很好的抑制效果。

实验结果5多西环素对胰腺癌细胞PC-3的抑制作用

多西环素对人胰腺癌细胞PC-3的毒性测试结果如附图5所示。所用的药物浓度为：0μM、1.563μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、100μM、200μM。从图中可以看出，药物浓度为200μM时，细胞的存活率为74%。多西环素对人胰腺癌细胞PC-3增殖的抑制率达到26%。表明多西环素对人胰腺癌细胞PC-3的增殖有一定的抑制效果。

实验结果6多西环素对人结肠癌细胞LOVO的抑制作用

多西环素对人结肠癌细胞LOVO的毒性测试结果如附图7所示。所用的药物浓度为：0μM、0.781μM、1.563μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、100μM、200μM。从图中可以看出，药物浓度为200μM时，细胞的存活率为79%。多西环素对人结肠癌细胞LOVO增殖的抑制率达到21%。表明多西环素对人结肠癌细胞LOVO的增殖有一定的抑制效果。

实施例2体外细胞水平检测多西环素对细胞迁移的影响

实验方法：

细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，4000cells/孔。置于37℃二氧化碳（5%）培养箱中过夜培养，使细胞贴壁。第二天，弃去培养液，加入含一系列浓度受试物（多西环素）的培养液。第二天，吸弃培养液，PBS洗细胞两次，加入Hochest33342（溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，终浓度为5μg/mL）染色液50μL/孔，37℃二氧化碳（5%）培养箱中孵育20min。吸弃染色液，PBS洗两次，加入含有一定浓度待测药物的培养液。然后放在高内涵分析平台ArrayScanVTI（Thermo公司生产）上进行实时动态监测，测试药物对细胞迁移的影响。

多西环素对细胞的影响，可以通过高内涵分析平台自带的软件进行分析。药物对细胞迁移速率的影响主要通过得到的平均距离-时间图中的曲线的斜率来显示。斜率越大，细胞的迁移速率越快，斜率越小，表明细胞的迁移速率越慢。

实验结果1多西环素对MCF-7细胞迁移的抑制

多西环素对MCF-7细胞迁移的抑制作用如图7所示。图中D7是对照组，D8，D9是加药组，D8组药物浓度为20μM，D9组药物浓度为4μM。从图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率明显小于对照组的。证明多西环素对MCF-7细胞的迁移有明显的抑制作用。

实验结果2.多西环素对HepG-2细胞迁移的抑制

多西环素对HepG-2细胞迁移的抑制作用如图8所示。图中C6是对照组，C7，C8是加多西环素组，C7，C8组药物浓度均为20μM。从图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率明显小于对照组的。证明多西环素对HepG-2细胞的迁移有抑制作用。

实验结果3多西环素对B16细胞迁移的抑制

多西环素对B16细胞迁移的抑制作用如图9所示。图中B6是对照组，B7，B8是加药组，B7组药物浓度为4μM，B8组药物浓度为20μM。图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率明显小于对照组的。证明多西环素对B16细胞的迁移有明显的抑制作用。

实验结果4多西环素对NCI-H446细胞迁移的抑制

多西环素对NCI-H446细胞迁移的抑制作用如图10所示。图中D11是对照组，D9，D10是加药组，D9组药物浓度为4μM，D10组药物浓度为20μM。图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率明显小于对照组的。证明多西环素对NCI-H446细胞的迁移有明显的抑制作用。

实验结果5多西环素对PC-3细胞迁移的抑制

多西环素对PC-3细胞迁移的抑制作用如图11所示。图中C2是对照组，C3，C4，C5为加药组，药物浓度均为20μM。图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率小于对照组的。证明多西环素对PC-3细胞的迁移有一定的抑制作用。

实验结果6多西环素对LOVO细胞迁移的抑制

多西环素对LOVO细胞迁移的抑制作用如图12所示。D2是对照组，C9，C10，C11为加药组，C9药物浓度均为20μM，C10药物浓度为10μM，C11药物浓度为4μM。图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率明显小于对照组的。证明多西环素对LOVO细胞的迁移有一定的抑制作用。

实施例3多西环素对黑色素瘤小鼠模型的影响

小鼠荷瘤模型的建立实验方法:

1.B-16细胞悬液的制备：细胞经胰蛋白酶消化后，800rpm离心，将细胞用PBS重悬，再次离心，洗去残余的培养基。细胞计数后，将细胞制成1×10⁷cells/mL的细胞悬液。

2.荷瘤小鼠模型的建立：取C57/BL小鼠10只，随机分为2组，黑色素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠鼠蹊部皮下，每只小鼠接种100μL。

3.接种细胞后，观察小鼠肿瘤的生长时间和小鼠肿瘤的生长特点。待小鼠肿瘤生长至可触及时，进行给药。

4.将多西环素用生理盐水配制成10mg/ml。取一组小鼠作为实验组，腹腔注射多西环素，每只老鼠给药50mg/kg。另外一组小鼠作为对照组，腹腔注射生理盐水作为对照。每天给药，并每天测量给药组和对照组的肿瘤的体积。给药六天后，处死小鼠，并取肿瘤组织做成切片，进行组织形态学分析。

实验结果：

多西环素对荷瘤小鼠肿瘤大小的抑制作用如图13所示（C：对照组，不给药，只给生理盐水；DOX：多西环素给药组），多西环素给药组小鼠肿瘤的体积明显小于对照组，而且多西环素组小鼠的肿瘤体积比较均一，这显示了多西环素对小鼠黑色素瘤的生长有很好的抑制作用。

多西环素对荷瘤小鼠肿瘤生长状态的影响如图14（C：对照组，不给药，只给生理盐水；DOX：多西环素给药组）所示：对照组肿瘤体积大，血管丰富，侵犯腹膜，中间坏死少；多西环素给药组，肿瘤体积小，血管稀少，不侵腹膜易于剥离，中间大量坏死。与对照组相比，多西环素给药组的肿瘤转移侵袭不明显。显示了，多西环素具有一定的抗肿瘤转移侵袭的能力。

通过实施例1可知，当多西环素的浓度为100μM时，多西环素对MCF-7细胞增殖的抑制率达到了80%、对HepG-2细胞增殖的抑制率为20%、对B-16细胞增殖的抑制率达到99.6%。当多西环素的浓度为200μM时，多西环素对人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖的抑制率达到71%、对人胰腺癌细胞PC-3增殖的抑制率达到26%、对人结肠癌细胞LOVO增殖的抑制率达到21%。通过实施例2可知，加药组细胞的运动曲线的斜率小于对照组，证明多西环素对MCF-7细胞、HepG-2B16细胞、NCI-H446细胞、PC-3细胞、LOVO细胞的迁移均有一定的抑制作用。从而说明多西环素对乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、结肠癌类的恶性肿瘤细胞的增殖和迁移均有不同程度的抑制作用。通过实施例3可知，多西环素给药组的小鼠肿瘤的体积均小于对照组小鼠，多西环素给药组的小鼠的肿瘤大小比较均一，没有出现恶性生长；同时发现，多西环素可以明显的抑制肿瘤对腹膜的侵袭。

通过以上的实验可以看出多西环素在制备抗肿瘤药物中的用途。同时本发明的多西环素具有其它药物不可比拟的优势，患者易于接受且便于了解患者对药物的反应、价格低廉、容易获取。此外，多西环素将会改变已有肿瘤化疗药物的市场格局，逐步成为一种可长期服用，且有效抑制肿瘤转移、侵袭和复发的临床药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.多西环素在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述多西环素的分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所涉及的肿瘤包含：乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、结肠癌或它们的组合。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的应用包括作为细胞毒性药物在抗肿瘤生长的抑制剂中的应用、作为抗肿瘤转移的药物中的应用、或作为抗肿瘤侵袭的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物包含多西环素、多西环素在药学上可接受的盐、酯或它们的组合以及辅料。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的所述有效治疗量为100mg/kg～300mg/kg。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂或它们的组合。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。