CN102688490B - 含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物及其在制备治疗结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的药物中的应用，本发明药物组合物具有显著的协同效应，提高了药物的疗效，降低了给药剂量，减少了副作用的发生。

Description

含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用，具体涉及含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物及其在制备治疗结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的药物中的应用。 

背景技术

世界卫生组织调查报告表明，全球癌症状况日益严重，今后20年新患者的人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年的600万增加至1000万。其中肺癌为常见的恶性肿瘤之一，源于各级支气管上皮，分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。原发性肝癌为发生在肝细胞与肝内胆管上皮细胞的癌变，是人类最常见的恶性肿瘤之一。 

目前已上市的抗肿瘤药物较多，如烷化剂药物、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂等，但是大多药物由于毒性较大，病人不耐受。大量的临床实践证明，中药或中西医结合能有效治疗恶性肿瘤，同时能减轻放化疗的毒副作用。运用现代医学手段，发现一些活性天然产物能有效抑制肿瘤细胞的生长，有诱导细胞凋亡的作用。目前使用的众多抗生素和抗肿瘤药物或直接来源于天然产物，或经其结构改造而得。因此，安全性高的活性天然产物运用于临床以治疗癌症将具有广阔的前景。随着对肿瘤的发生发展的分子机制研究越来越清楚，分子靶向治疗多种恶性肿瘤受到了广泛的关注和高度重视。分子靶向药物选择性高、广谱有效，其安全性优于细胞毒性化疗药物，是目前肿瘤治疗领域发展的新方 向。 

吴茱萸碱(Evodiamine)是传统中药吴茱萸中的主要生物碱之一，除具有抗炎、降低血糖等作用外，还具有抗肿瘤活性。研究发现，吴茱萸碱一方面能抑制肿瘤细胞生长，引起细胞周期阻滞，并改变细胞周期相关蛋白的表达；另一方面能通过多条信号通路，如依赖于caspase、凋亡诱导因子或通过核因子KB等通路诱导细胞凋亡、坏死，从而提高肿瘤细胞的死亡率。吴茱萸碱能抑制多种肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，能抑制肿瘤血管生成及浸润转移，其抗癌谱广，抗癌活性高，是一种具有开发前景的天然抗肿瘤活性物质。 

细胞凋亡(程序细胞死亡)是机体清除异常或不需要的细胞的自然途径，若其受到影响则可能导致各种疾病如癌症的发生。Bc1-2家族蛋白是凋亡的重要调节剂，其中Bc1-2和Bc1-xL在多种类型的肿瘤中过量表达，被认为可能与肿瘤的发生、发展及耐药性产生有关，故针对Bc1-2和Bc1-xL抗凋亡蛋白的药物开发成为近年来抗肿瘤治疗的研究热点。ABT-263和ABT-737是由美国雅培(Abbott)制药开发的小分子Bc1-2抑制剂，对多种肿瘤作用显著，且可口服使用，具有良好的应用前景。 

随着肿瘤分子生物学的研究进展，肿瘤分子靶向治疗已成为肿瘤研究的热点，在多种肿瘤的治疗中发挥了重要的作用。然而，大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用的，中医药以其多基因多靶点的作用优势正日益受到关注。因此合理的联合用药，有单用药物不可比拟的优越性，联合用药针对多靶点进行靶向治疗将不仅旨在减少或延缓耐药性的出现、降低毒性，而且通过多种药物对癌细胞杀伤的协同作用取得更好的疗效。 

发明内容

针对以上技术缺陷，本发明提供一种药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用，具体为含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物及其在制备治疗结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的药物中的应用。 

本发明含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物中，所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物为吴茱萸碱；Bc1-2抑制剂可以为ABT-263或ABT-737，或两者相应的结构类似物、衍生物。 

本发明药物组合物中的吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物优选为吴茱萸碱，其相应的结构式如式I所示。 

本发明药物组合物中，所述组分不限于吴茱萸碱本身，还可以是其可药用的盐、水合物或衍生物等。 

本发明中，所述Bc1-2抑制剂可以为任何结构类型的Bc1-2抑制剂的药物，优选为ABT-263或ABT-737。其中ABT-263为US2007027135中所记载的式II所示的化合物： 

其中ABT-737为WO2005049594和WO2005049593中所记载的式III所示的化合物： 

本发明药物组合物中，所述组分不限于上述ABT-263和ABT-737本身，还可以是它们的水合物、类似物、衍生物及其它有机或无机的盐。 

本发明含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物中，吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的摩尔比为0.1-2.0∶0.25-4.0；进一步优选吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与Bc1-2抑制剂的摩尔比为0.2-1.0∶0.5-2.0。 

本发明含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物可以用于治疗各种肿瘤，所述肿瘤包括但不限于结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌。 

本发明优选吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂的药物组合物用于制备治疗肝癌及肺癌的药物中的应用。 

本发明药物组合物在制备治疗肺癌的药物中的应用中，吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与Bc1-2抑制剂的摩尔比为0.3-1.0∶0.5-1.0；优选吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与Bc1-2抑制剂的摩尔比为0.5-1.0∶0.75-1.0；更进一步优选吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与Bc1-2抑制剂的摩尔比为1.0∶1.0。 

本发明药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用中，所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与Bc1-2抑制剂的摩尔比为0.2-1.0∶0.5-2.0。 

其中，在制备治疗HepG2类型肝癌的药物的应用中，所述Bc1-2抑制剂为ABT-263时，所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-263的摩 尔比为0.3-1.0∶0.5-1.0；进一步优选所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-263的摩尔比为0.5-1.0∶0.75-1.0；最佳为所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-263的摩尔比为1.0∶1.0。 

在制备治疗HUH-7类型肝癌的药物的应用中，当所述Bc1-2抑制剂为ABT-263时，所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-263的摩尔比为0.2-0.5∶0.5-1.0；进一步优选所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-263的摩尔比为0.3-0.5∶0.75-1.0；最佳为所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-263的摩尔比为0.5∶1.0；当所述Bc1-2抑制剂为ABT-737时，所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-737的摩尔比为0.2-0.5∶1.0-2.0；进一步优选所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-737的摩尔比为0.3-0.5∶1.5-2.0；最佳为所述吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物与ABT-737的摩尔比为0.5∶2.0。 

含有吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂组合物在制备治疗结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的药物的应用中，在将本发明组合物制成同时给药的药剂的方案中，吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂可以含在同一种药物制剂如片剂或胶囊中，也可以将吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂分别做成制剂，如分别做成片剂或胶囊，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书的指示同时服用；在将本发明组合物制成先后给药的药剂的方案中，可以将吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书指示的先后顺序进行服用，或将上述组合物中的两种成分制成一种控释的制剂，先释放组合物中的一种成分、然后再释放组合物中的另一种成分，患者只需要服用该控释组合物制剂；在将本发明组合物制备成交叉给药的药剂的方案中，可以将吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书指示的交叉顺序服用，或者将该药物组合物制备成吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂交叉释放 的控释制剂。 

吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂组合物在制备治疗结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的药物中的应用中，所述组合物中的吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂可以同时使用或以任何先后的顺序使用，如可以将吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂同时给患者服用；也可以先将吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物药物给患者服用、然后服用Bc1-2抑制剂，或先服用Bc1-2抑制剂、然后服用吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物药物，对于两者服用的时间间隔没有特别要求，但优选服用两种药物的时间间隔不超过一天；或者两种药物交替给药。 

本发明中，可将本发明吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂采用本领域常规的方法制备成适于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂制成胃肠道给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊、或控释、缓释制剂。在本发明吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式和制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1-99％，优选为10％-90％；制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提；所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。 

本发明中，组合物的制备方法没有特别限制，吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂两者可以进行直接混合然后做成制剂，或分别和/或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方式包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合做成制剂。 

本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。 

本发明分别进行了吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂组合杀死A549(非小细胞肺癌细胞株)和HUH-7、HepG2(肝癌细胞株)的试验，结果表明，本发明吴茱萸碱及吴茱萸碱类衍生物和Bc1-2抑制剂组合治 疗肺癌及肝癌具有显著的协同效应，提高了药物的疗效，降低了用药剂量，减少了副作用的发生。 

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此。 

实施例 

试剂和方法： 

细胞：A549(非小细胞肺癌细胞株)和HUH-7、HepG2(肝癌细胞株)，均购自American Type Culture Collection(ATCC)，美国马里兰州洛克威尔。 

药品：以下实施例中所用药物组合物均按下列方法1或方法2所述来制备；吴茱萸碱购自南京替斯艾么中药研究所；Bc1-2抑制剂均按文献合成而得，ABT-263和ABT-737合成参考文献为：Synthesis，15，2398-2404，WO2005049594，WO2005049593和US2007027135。 

方法1：准确称量相应的药物组合物的各组分，以二甲基亚砜分别溶解，各自配成10mM的贮存液，在-20℃下保存，使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度，然后各自取1微升的各组分的溶液，混合在一起备用。所有的试验中，二甲基亚砜的最终浓度应≤5g/L，以便不影响细胞的活性。 

将所有的细胞于含10％小牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5％ CO₂的湿度条件下培养，在加药的前一天，在六孔板上进行细胞接种2×10⁵/孔，然后向细胞中加入按上述方法制备的药物组合物溶液，使各组分达到其工作浓度，具体见表1中第1-6。 

药物处理后，通过台盼蓝(Trypan Blue)测定细胞死亡，细胞通过在37℃用胰蛋白酶钠/EDTA进行胰酶化作用10分钟。因为死亡的细胞从培养器上脱落进入培养基中，通过在1200转/分钟下离心收集所有的细胞，然后再用培养基重新悬浮沉淀物，与台盼蓝染料混合。染色之后，用光学显微镜和血细胞计数器进行计数。被染料染成蓝色的计为死亡细 胞。随机选取500个细胞进行计数，死亡的细胞以占总计数细胞的百分比来表达。 

方法2：准确称量相应的药物组合物的各组分，以二甲基亚砜分别溶解，各自配成10mM的贮存液，在-20℃下保存。使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度，然后各自取1微升的各组分的溶液备用。所有的试验中，二甲基亚砜的最终浓度应≤5g/L，以便不影响细胞的活性。 

将所有的细胞于含10％小牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5％ CO₂的湿度条件下培养，在加药的前一天，在六孔板上进行细胞接种2×10⁵/孔，然后以任意次序向细胞中加入按上述方法制备的药物组合物的各组分溶液，使各组分达到其工作浓度，具体见表1中第7-12。 

药物处理后，通过台盼蓝(Trypan Blue)测定细胞死亡，细胞通过在37℃用胰蛋白酶钠/EDTA进行胰酶化作用10分钟。因为死亡的细胞从培养器上脱落进入培养基中，通过在1200转/分钟下离心收集所有的细胞，然后再用培养基重新悬浮沉淀物，与台盼蓝染料混合。染色之后，用光学显微镜和血细胞计数器进行计数。被染料染成蓝色的计为死亡细胞。随机选取500个细胞进行计数，死亡的细胞以占总计数细胞的百分比来表达。 

下列表1所示的药物组合中，第1-6的组合按方法1制备，第7-12的组合按方法2制备。 

表1 

实施例1不同比例的吴茱萸碱与ABT-263的组合协同增效促进A549细胞死亡试验，见表2。 

表2 

在考察相关化合物导致非小细胞肺癌细胞株A549细胞死亡的试验中，发现当单独使用1.0μM吴茱萸碱、1.0μM ABT-263时约有15-20％的细胞死亡；而当两者在较低浓度下合用时(0.5μM吴茱萸碱+0.75μMABT-263)则产生明显的协同作用，导致47％的癌细胞死亡；当两者以 1.0μM吴茱萸碱+1.0μM ABT-263的比例合用时，则产生更加显著的协同作用，导致92％的癌细胞死亡。 

实施例2不同比例的吴茱萸碱与ABT-263的组合协同增效促进HepG2细胞死亡试验，见表3。 

表3 

在考察相关化合物导致肝癌细胞株HepG2细胞死亡的试验中，发现当单独使用1.0μM吴茱萸碱时约有18％的细胞死亡、单独使用1.0μMABT-263时几乎没有细胞死亡；而当两者在较低浓度下合用时(0.5μM吴茱萸碱+0.75μM ABT-263)则产生较明显的协同作用，导致38％的癌细胞死亡；当两者以1.0μM吴茱萸碱+1.0μM ABT-263的比例合用时，则产生更加显著的协同作用，导致78％的癌细胞死亡。 

实施例3不同比例的吴茱萸碱与ABT-263的组合协同增效促进HUH-7细胞死亡试验，见表4。 

表4 

在考察相关化合物导致肝癌细胞株HUH-7细胞死亡的试验中，发现当单独使用1.0μM ABT-263或更低浓度时几乎没有细胞死亡，即使单独使用0.5μM吴茱萸碱时只有约20％的细胞死亡；而当两者在较低浓度下合用时(0.3μM吴茱萸碱+0.75μM ABT-263)则产生较明显的协同作用，导致34％的癌细胞死亡；当两者以0.5μM吴茱萸碱+1.0μM ABT-263的比例合用时，则产生更加显著的协同作用，导致72％的癌细胞死亡。 

实施例4不同比例的吴茱萸碱与ABT-737的组合协同增效促进HUH-7细胞死亡试验，见表5。 

表5 

在考察相关化合物导致肝癌细胞株HUH-7细胞死亡的试验中，发现当单独使用2.0μM ABT-737或更低浓度时只有很少量的细胞死亡，即使单独使用0.5μM吴茱萸碱时也只有约20％的细胞死亡；而当两者在较低浓度下合用时(0.3μM吴茱萸碱+1.5μM ABT-737)则产生较明显的协同作用，导致30％的癌细胞死亡；当两者以0.5μM吴茱萸碱+2.0μM ABT-737的比例合用时，则产生更加显著的协同作用，导致64％的癌细胞死亡。 

尽管上述实施例已经对本发明的技术方案进行了详细地描述，但是本发明的技术方案并不限于以上实施例，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何改动都将落入本发明的权利要求书所限定的范围。 

Claims (9)

1.一种用于治疗癌症的药物组合物，其特征在于,所述药物组合物含有吴茱萸碱与Bcl-2抑制剂，其中，所述吴茱萸碱与Bcl-2抑制剂的摩尔比为0.2-1.0：0.5-2.0；所述Bcl-2抑制剂为ABT-263或ABT-737；所述癌症为肝癌或肺癌。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，在用于治疗肺癌的药物组合物中，所述吴茱萸碱与Bcl-2抑制剂的摩尔比为0.3-1.0：0.5-1.0。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，在用于治疗肺癌的药物组合物中，所述吴茱萸碱与Bcl-2抑制剂的摩尔比为0.5-1.0：0.75-1.0。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，在用于治疗肝癌的药物组合物中，所述吴茱萸碱与Bcl-2抑制剂的摩尔比为0.2-1.0：0.5-2.0。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述肝癌为HepG2类型肝癌，所述Bcl-2抑制剂为ABT-263，并且所述吴茱萸碱与ABT-263的摩尔比为0.3-1.0：0.5-1.0。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述吴茱萸碱与ABT-263的摩尔比为0.5-1.0：0.75-1.0。

7.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述肝癌为HUH-7类型肝癌，当所述Bcl-2抑制剂为ABT-263时，所述吴茱萸碱与ABT-263的摩尔比为0.2-0.5：0.5-1.0；当所述Bcl-2抑制剂为ABT-737时，所述吴茱萸碱与ABT-737的摩尔比为0.2-0.5：1.0-2.0。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，当所述Bcl-2抑制剂为ABT-263时，所述吴茱萸碱与ABT-263的摩尔比为0.3-0.5：0.75-1.0。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，当所述Bcl-2抑制剂为ABT-737时，所述吴茱萸碱与ABT-737的摩尔比为0.3-0.5：1.5-2.0。