CN107669632A - 一种药物载体、胶束、抗肿瘤和抗肿瘤细胞转移药物制剂、及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种药物载体、胶束、抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物制剂、及其制备方法和用途。所述药物载体和胶束包括：a)亲水部分，所述亲水部分包含亲水性肝素类化合物；和b)疏水部分，所述疏水部分包含疏水性维生素E类化合物，所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物通过特定的方式相连。所述药物载体和胶束不仅其本身具有抗肿瘤转移的作用，而且还可以分别通过进一步包载抗癌药物，实现同时抑制肿瘤和肿瘤转移的优异效果。此外，所述药物载体、胶束稳定性高、制备方法简便，便于工业化生产。

Description

一种药物载体、胶束、抗肿瘤和抗肿瘤细胞转移药物制剂、及 其制备方法和用途

技术领域

本申请涉及药物制剂领域，更具体地，涉及药物载体、胶束、抗肿瘤和抗肿瘤细胞转移药物制剂、及其制备方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤，目前仍然是在世界范围内威胁人类健康并导致高死亡率的重要疾病之一。尽管人们努力通过手术切除肿瘤，以及化疗、放疗等手段，试图治疗或控制相关疾病，但患者的存活率仍然很低。统计资料显示，在对直肠癌、肝癌、盆腔癌、卵巢癌等患者实施切除手术之后的5年内，仍有50％以上的患者，出现一处或多处的癌转移。癌症相关疾病的高死亡率，更大程度上归因于肿瘤转移。临床资料表明，导致约80％的肿瘤患者死亡的原因，是局部复发和癌转移。

肿瘤转移是复杂的多步骤过程，其主要包括肿瘤细胞从原位脱落进入血管或淋巴管，细胞在血管中迁徙运动到达远端器官，细胞跨血管进入远端组织和细胞着床生长，在此过程中受到多种因子的影响和调节。例如，肿瘤细胞中的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)可以分解肿瘤间质，利于肿瘤细胞侵袭入血管，增加肿瘤细胞进入血液的效率。再如，循环肿瘤细胞在血管中通过与血小板粘附，可以获得保护性的“血小板外套”，从而逃避免疫监视和血流动力学的物理伤害。此外，肿瘤细胞还可以在血小板的分泌物的刺激下，发生内皮间质转化(EMT)，从而更加高效地跨越血管壁进入远端器官着床。

为了成功地阻断或抑制肿瘤细胞的转移，研究人员对肿瘤转移的不同靶点进行了研究。开发出众多的抑制剂，包括整合素蛋白抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、核因子抑制剂、趋化因子抑制剂等。但由于实际应用中出现的毒副作用，临床使用受到很大的限制。

而且，由于临床应用的大多数抗癌药物为疏水性药物，需要载体增溶后才能使用，亟待开发出安全、有效的新制剂和载药递送系统。众多基于纳米颗粒载体的研究都面临着：1.载体本身的毒性的问题，由于可用作高效递送载体的材料，往往显示出代谢、排出性差的问题，由此产生潜在的载体毒性；2.合适的载体构建组分的选择问题，载体的构成和体积等因素将直接影响所载药物的种类和药量，载药量太小，药效太弱，如果所构建的载体要求的载药量太大，则很可能因为抗肿瘤药物本身具有的毒性，带来实际应用中不可接受的副作用；3.稳定性问题，如何保证载体本身和载药后的纳米递送系统的稳定，同样是载体的设计和构建者经常要面对的棘手的问题。如何从众多的备选材料中合理地进行选择，巧妙地构建出稳定、高效、载药量适宜的药物递送系统并非易事。

发明内容

发明人通过多年来广泛深入地研究，成功地构建出一类稳定、高效、载药量适宜、且制备方法简便的药物载体和胶束。更优异地，所构建的载体除了具有搭载其他抗肿瘤药物的空白载体功能之外，该载体本身，还具抗癌细胞转移的作用。

在此，提供一种具有抗癌细胞转移作用的药物载体，具有抗癌细胞转移作用的胶束，抗肿瘤和抗肿瘤细胞转移药物制剂，以及它们的制备方法和用途，所述的药物载体、胶束包含亲水性部分和疏水部分，以及可选择地包含肿瘤靶向组分。所述药物载体以及搭载了药物之后，具有EPR效应，更容易渗透进入肿瘤组织并长期滞留(和正常组织相比)。所谓EPR效应(enhanced permeability and retention effect)是指一些特定大小，特别是粒径在200nm-50nm的大分子物质(如脂质体、纳米颗粒等)更容易渗透进入肿瘤组织并长期滞留(和正常组织相比)的现象。

以低分子肝素(LMWH)类化合物，可以通过抑制血小板上的P-选择素，有效抑制血小板和循环肿瘤细胞的粘附，减少肿瘤细胞着床的数量，抑制转移过程的着床步骤。

并且，发明人在研究中发现，维生素E类化合物，可以有效地抑制在肿瘤细胞侵袭、肿瘤生长和转移的过程中起重要作用的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达和分泌，从而减少肿瘤细胞进入血液，由此可以抑制肿瘤转移的起始步骤。

本发明人通过大量的实验，最终从众多的备选组分中确定了以上两类物质，并将两者直接有效连接，构建了一类新的高效稳定的药物载体，所述药物载体在含水溶液中能够自组装成为胶束。

特别优异地，1)与通过连接分子将胶束中的疏水部分与亲水部分相连接的胶束不同，构成药物载体的疏水部分和亲水部分直接相连，由此排除了载体中的非药效成分对患者机体造成的毒性、以及代谢和排除压力；2)构成药物载体的疏水部分和亲水部分本身均具有抗肿瘤转移作用，且分别抑制了肿瘤细胞转移的起始和着床两个最重要的步骤，因此，这一组合更加有效地起到抑制肿瘤细胞转移的作用；3)药物载体胶束的疏水核心可以通过物理方式搭载药物，超越了通过化学键连接药物对所搭载药物的限制；4)药物载体及其所形成的胶束稳定性佳，载药量范围亦有很大的可操作性。

另一方面，还提供在低分子肝素上连接了靶头的药物载体，赋予载体更强的、对于高转移性肿瘤细胞的靶向性，增强药物载体在肿瘤部位的蓄积。如3-氨基苯硼酸(PBA)类化合物、RGD及其改构肽(J.Wermuth,S.L.Goodman.A.Jonczyk,andH.Kessler.Stereoisomerism and Biological Activity of the Selective andSuperactiveαvβ3 Integrin Inhibitor cyclo(-RGDfV-)and Its Retro-InversoPeptide.J.Am.Chem.Soc.1997,119,1328-1335)(包括环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)，等等)、TR、TH、半乳糖、C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)(/代表“或”，X代表任意氨基酸)(Teesalu T.Sugahara K N.Kotamraju V R,et al.C-end rulepeptides mediate neuropilin-1-dependent cell,vascular,and tissue penetration[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(38):16157-16162)等等。以3-氨基苯硼酸(PBA)为例，具体而言，其能够识别高转移性肿瘤的高表达的唾液酸残基，使得载体相对于正常组织具有更强的肿瘤细胞靶向性。

此外，若需搭载多种药物，载体也可以进一步通过化学方式搭载另一种药物，即构成所谓双药载体。如上所述，由于构成载体的亲水性肝素部分和疏水部分的材料本身具有抗肿瘤转移作用，载体可以与其所搭载的药物共同起到抗肿瘤、同时抑制肿瘤转移的高效抗肿瘤作用。

更具体而言，提供如下技术方案：

1.一种药物载体，其包含：

a)亲水部分，所述亲水部分包含亲水性肝素类化合物，和

b)疏水部分，所述疏水部分包含疏水性维生素E类化合物，

优选地，所述的亲水性肝素类化合物包括：未分级肝素、低分子量肝素、罗勒多糖、和裙带菜多糖中的一种或多种；

优选低分子量肝素，

更优选地，所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钠，和帕肝素钠中的一种或多种，

更优选所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠，达肝素钠，和那曲肝素钠中的一种或多种；

更优选地，所述低分子量肝素为依诺肝素钠；

优选地，所述的疏水性维生素E类化合物包括：天然维生素E、α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚、维生素E醋酸酯、维生素E亚油酸酯、维生素E阿魏酸酯、维生素E糖苷、聚乙氧基维生素E、高α-维生素E油、和维生素E烟酸酯中的一种或多种，

更优选为α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚，和维生素E烟酸酯中的一种或多种；

更优选为疏水性α-生育酚琥珀酸酯，β-生育酚琥珀酸酯，和γ-生育酚琥珀酸酯中的一种或多种；

更优选α-生育酚琥珀酸酯，

所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物，通过以下连接方式相连，所述连接方式包括：酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和酶敏感的连接物(如二硫键，单硫醚键)中的一种或多种；

优选酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和二硫键中的一种或多种；

更优选所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物，通过酯键直接相连；

优选地，所述药物载体表面具有肿瘤靶向组分，优选地，所述靶向组分包括：3-氨基苯硼酸类化合物、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD，是靶向整合素α_vβ₃的分子)及其改构肽、TR、TH、半乳糖、和C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)序列肽(/代表“或”，X代表任意氨基酸)中的一种或多种，

优选包括3-氨基苯硼酸类化合物和RGD及其改构肽中的一种或多种，

更优选3-氨基苯硼酸，

优选地所述RGD改构肽包括：环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)，

优选地，所述的药物载体的粒径为微米级或纳米级；

更优选地，所述药物载体的粒径范围为200nm-50nm；

更优选地，所述药物载体的粒径为140nm±20nm。

2.一种胶束，其包括上述1所述的药物载体和水或药学上可接受的含水介质；

优选地，所述含水介质为水溶液，更优选为PBS或生理盐水。

3.上述1所述的药物载体的制备方法，所述方法包括：

(1)用羧基活化剂活化所述疏水性维生素E类化合物，优选活化时间为30min到5h，更优选在避光氮气保护条件下活化3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

其中，投料比例(摩尔比)优选为：疏水性维生素E类化合物：活化剂＝1:(1～10)，更优选1:2；

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

(2)将a)上述(1)中经活化的疏水性维生素E类化合物；与b)亲水性肝素类化合物，在反应溶剂中混合，

优选地，先将b)亲水性肝素类化合物溶于反应溶剂，再与a)混合，

优选于30-33℃，优选避光氮气保护的条件下，使a)和b)进行反应生成以下述连接键相连的两亲性共聚物，优选反应时间约8-120h，更优选72h；

所述连接键包括：酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和酶敏感的连接物(如二硫键，单硫醚键)中的一种或多种；

优选酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键、二硫键中的一种或多种；

更优选所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物通过酯化反应，以酯键直接相连；

投料比优选为：所述a)经活化的疏水性维生素E类化合物的羧基，与b)亲水性肝素类化合物的羟基的比例优选1～10:1～10，更优选1:1；

(3)任选地，纯化上述步骤(2)中所得的两亲性共聚物，优选通过丙酮沉淀进行纯化，优选地，用量(体积比)为：反应液:冰丙酮为1:(1～10)，更优选1:2；优选地，将所得的两亲性共聚物经纯水透析，优选地，干燥所得的两亲性共聚物；

(4)任选地，还包含以下靶向组分键合步骤：

a)用活化剂活化以上步骤制备的两亲性共聚物，优选活化时间为30min到5h，更优选3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

b)加入靶向组分，优选地在避光氮气保护下反应，优选4-48小时，更优选24小时，将反应液优选在纯水中，透析，优选24-72小时，更优选地透析72小时，

优选所述靶向组分包括：3-氨基苯硼酸类化合物、RGD及其改构肽、TR、TH、半乳糖、C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)(/代表“或”，X代表任意氨基酸)中的一种或多种，

更优选为3-氨基苯硼酸类化合物和RGD及其改构肽中的一种或多种，

更优选3-氨基苯硼酸；

优选地所述RGD改构肽包括：环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)。

4.上述2所述的胶束的制备方法，其中，所述方法包括：

(1)用羧基活化剂活化所述疏水性维生素E类化合物，优选活化时间为30min到5h，更优选在避光氮气保护条件下活化3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

其中，投料比例(摩尔比)优选为：疏水性维生素E类化合物:活化剂＝1:(1～10)，更优选1:2；

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

(2)将a)上述(1)中经活化的疏水性维生素E类化合物；与b)亲水性肝素类化合物，在反应溶剂中混合，

优选地，先将b)亲水性肝素类化合物溶于反应溶剂，再与a)混合，

优选于30-33℃，优选避光氮气保护的条件下，使a)和b)进行反应生成以下述连接键相连的两亲性共聚物，优选反应时间约8-120h，更优选72h；

所述连接键包括：酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和酶敏感的连接物(如二硫键，单硫醚键)中的一种或多种；

优选酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键、二硫键中的一种或多种；

更优选所述的亲水性肝素类化合物，与所述的疏水性维生素E类化合物，通过酯化反应，以酯键直接相连；

投料比优选为：所述a)经活化的疏水性维生素E类化合物的羧基，与b)亲水性肝素类化合物的羟基的比例优选1～10:1～10，更优选1:1；

(3)任选地，纯化上述步骤(2)中所得的两亲性共聚物，优选通过丙酮沉淀进行纯化，优选地，用量(体积比)为：反应液:冰丙酮为1:(1～10)，更优选1:2；优选地，将所得的两亲性共聚物经纯水透析，优选地，干燥所得的两亲性共聚物；

(4)任选地，还包含以下靶向组分键合步骤：

a)用活化剂活化以上步骤制备的两亲性共聚物，优选活化时间为30min到5h，更优选3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

b)加入靶向组分，优选地在避光氮气保护下反应，优选4-48小时，更优选24小时，将反应液优选在纯水中，透析，优选24-72小时，更优选地透析72小时，

优选所述靶向组分包括：3-氨基苯硼酸类化合物、RGD及其改构肽、TR、TH、半乳糖、C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)(/代表“或”，X代表任意氨基酸)中的一种或多种，

更优选为3-氨基苯硼酸类化合物和RGD及其改构肽中的一种或多种，

更优选3-氨基苯硼酸；

优选地所述RGD改构肽包括：环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)，

(5)将上述步骤所得的两亲性共聚物溶于水或药学上可接受的含水介质；优选地，所述含水介质为含水溶液，更优选PBS或生理盐水。

5.上述3或4所述的制备方法，其中，

所述的亲水性肝素类化合物，包括：未分级肝素、低分子量肝素、罗勒多糖，和裙带菜多糖中的一种或多种；

优选低分子量肝素，

更优选地，所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钠，和帕肝素钠中的一种或多种，

更优选所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠，达肝素钠，和那曲肝素钠中的一种或多种；

更优选地，所述低分子量肝素为依诺肝素钠；

优选地，所述的疏水性维生素E类化合物包括：天然维生素E、α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚、维生素E醋酸酯、维生素E亚油酸酯、维生素E阿魏酸酯、维生素E糖苷、聚乙氧基维生素E、高α-维生素E油、和维生素E烟酸酯中的一种或多种，

更优选为α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚，和维生素E烟酸酯中的一种或多种；

更优选为疏水性α-生育酚琥珀酸酯，β-生育酚琥珀酸酯，和γ-生育酚琥珀酸酯中的一种多种；

更优选为α-生育酚琥珀酸酯。

6.一种抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物制剂，其中，所述抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物以物理或化学方式装载于上述1所述的药物载体或上述2所述的胶束的疏水部分和/或亲水部分(在一些情况下，例如对于胶束来说，疏水部分即疏水核心，亲水部分即亲水外壳)。

7.上述1的药物载体或上述2的胶束在制备抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，任选地，所述药物载体或胶束搭载抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物。

8.上述1的药物载体或上述2的胶束在制备抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，其中，抗肿瘤药物装载于所述药物载体或胶束的疏水部分，

优选地，所述载药方式为物理作用，优选地，其载药方法选自乳化超声旋蒸法、透析法、溶剂注入法、直接溶解法，和溶剂挥发法中的一种或多种；

更优选透析法和乳化超声旋蒸法；

更优选乳化超声旋蒸法；

优选地，所采用的溶剂选自二氯甲烷、水、甲醇、乙醇、氯仿、四氢呋喃，或它们的混合溶剂；

优选氯仿、二氯甲烷、或四氢呋喃或它们的混合溶剂；

更优选于二氯甲烷。

9.上述1的药物载体或上述2的胶束在制备抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，其中，所述抗肿瘤药物装载于所述药物载体或胶束的亲水部分，

优选地，所述抗肿瘤药物通过连接片段与所述亲水性肝素类化合物偶联；

更优选所述亲水性肝素类化合物与连接片段通过酰胺键或酯键相连，所述抗肿瘤药物与连接片段通过腙键、二硫键或亚胺键相连。

10.上述1的药物载体或上述2的胶束在制备抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，其中，

抗肿瘤药物(A)和抗肿瘤药物(B)分别装载于所述药物载体或胶束的疏水部分和亲水部分；

优选地，

(1)抗肿瘤药物(A)通过物理作用装载于所述药物载体或胶束的疏水部分，

优选地，所述的包载方法包括：乳化超声旋蒸法、透析法、溶剂注入法、直接溶解法，或溶剂挥发法中的一种或多种，

更优选透析法、乳化超声旋蒸法，

更优选乳化超声旋蒸法；

优选地，所采用的溶剂包括：二氯甲烷、水、甲醇、乙醇、氯仿、四氢呋喃，以及它们的混合溶剂，

优选氯仿、二氯甲烷或四氢呋喃，或它们的混合溶剂，

更优选于二氯甲烷；

(2)抗肿瘤药物(B)通过连接片段与所述亲水性肝素类化合物偶联，所述亲水性肝素类化合物与连接片段通过酰胺键或酯键相连，所述抗肿瘤药物与连接片段通过腙键、二硫键、醇醚键或亚胺键相连，

所述的抗肿瘤药物(A)和抗肿瘤药物(B)可以相同或不同。

上述技术方案中，所述抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物包括烷化剂类、抗代谢类、抗肿瘤抗生素如蒽环类抗生素、植物生物碱类、紫杉醇类、拓扑异构酶抑制剂、抗体类、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物中的一种或多种。优选地，为阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、甲氨蝶呤、米托蒽醌、伊立替康等。

有益效果

1.药物载体和胶束本身具有抗肿瘤转移的药效作用，连同其所包载的药物，能够在治疗实体肿瘤的同时，从不同位点抑制转移级联，产生极强的抗转移效果。

2.药物载体和胶束的亲水部分和疏水部分直接相连，构建步骤更简便，结构更简单，颗粒均一、稳定性极佳。

3.药物载体和胶束的疏水部分可通过物理作用包载抗肿瘤药物，与通过化学偶联搭载药物相比，操作更为简便，在工业化生产中的可控性更强，适用的搭载药物种类更广泛。

4.优选载体中的全部组分，均为具有良好生物相容性、可降解的材料构成，并且可以仅通过物理作用包载抗肿瘤药物，从而，与现有技术相比，最大限度地排除了非药效成分对机体造成的毒性以及代谢排出压力。

5.药物载体和胶束体可进一步通过其亲水组分和疏水部分，分别搭载相同或不同的抗肿瘤药物，从而可简便地增加针对靶位点的药物的种类，应用剂量更为灵活，增强抗肿瘤效果。

简言之，本发明的药物载体和胶束构建简洁、稳定性高，适宜搭载多种药物，特别是，载体本身即具有高效抑制肿瘤细胞的侵袭、阻止肿瘤转移的作用，因此能更有益于疾病的治疗和预后。

以下，结合附图来详细说明具体实施方案。

附图说明

图1为LMWH-TOS共聚物的合成示意图。

图2为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯的氢谱图，图中的LMWH为依诺肝素钠，TOS为α-生育酚琥珀酸酯；

图2A为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯共聚物化学结构；

图2B为依诺肝素钠在D₂O中的¹H-NMR谱；

图2C为α-生育酚琥珀酸酯在CDCl₃中的图谱；

图2D为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯在DMSO-d6中的图谱；

图2E为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯在D₂O中的谱图。

图3为搭载了DOX的胶束的纳米颗粒形态电镜图和粒径分布图，

图3A为搭载了DOX的HT NPs的纳米颗粒形态电镜图和粒径分布图，其中，粒径分布图中纵轴为强度(Intensity)百分比(％)，横轴为粒径大小(Size)(nm)；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

图3B为DT NPs和FT NPs的纳米颗粒形态电镜图，其中：

DT NPs为达肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯载体胶束；

FT NPs为那曲肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯载体胶束。

图4为显示胶束的血清稳定性以及体外释药曲线图，

图4A为胶束在含50％FBS中的稳定性试验结果，其中，纵轴表示透射比(Transmittance)(％)，横轴表示时间；

FBS为胎牛血清；

PBS为磷酸盐缓冲液；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯载体胶束；

HTB NPs为修饰有肿瘤靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)的HT NPs；

HT/DOX NPs为载有阿霉素的HT NPs；

HTB/DOX NPs为载有阿霉素的、带有靶向分子苯硼酸的HT NPs；

图4B为游离阿霉素(DOX)，以及搭载了阿霉素的胶束在不同pH下的释药曲线，其中，纵轴表示DOX释药量百分比，横轴表示时间；

游离DOX为游离的阿霉素；

HT/DOX NPs为载有阿霉素的、依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB/DOX NPs为载有阿霉素的、带有靶向分子苯硼酸的、依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束。

图5显示胶束对B16F10细胞(小鼠黑色素瘤细胞)转移抑制作用的结果，

图5A为分别经PBS，LMWH，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs，HTB/DOX NPs培养24h后的划痕愈合情况显微成像照片，0h图表示初始划痕宽度；

图5B为分别经PBS，LMWH，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs，HTB/DOX NPs培养24h后，划痕愈合率分析柱状图，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

LMWH为依诺肝素钠；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB NPs为修饰有肿瘤靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)的HT NPs；

HT/DOX NPs为载有阿霉素的HT NPs；

HTB/DOX NPs为载有阿霉素的、带有靶向分子苯硼酸的HT NPs；

DOX为单独的阿霉素；

平均数±标准误差(means±SD),n＝3。

图5C为分别经游离的达肝素钠、游离的那曲肝素钠、DT NPs、FT NPs培养24h后的划痕愈合情况显微成像照片；0h为划痕后0小时；24h为划痕后24小时的对照；

Dalteparin为单独的达肝素钠；

Fraxiparine为单独的那曲肝素钠；

DT NPs为达肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

FT NPs为那曲肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束。

图6显示胶束体外抗B16F10细胞(小鼠黑色素瘤细胞)侵袭的实验结果，

图6A为分别经PBS，LMWH，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs，HTB/DOX NPs培养48h后，侵入到Transwell微孔膜下室面的B16F10细胞的显微成像照片，侵入的细胞被结晶紫染色；

图6B为分别经PBS，LMWH，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs，HTB/DOX NPs培养48h后，侵入的B16F10细胞定量分析柱状图，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

LMWH为依诺肝素钠；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB NPs为修饰有肿瘤靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)的HT NPs；

HT/DOX NPs为载有阿霉素的、依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB/DOX NPs为载有阿霉素的、带有靶向分子苯硼酸的依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

平均数±标准误差(means±SD),n＝3。

图7为在分别添加PBS，LMWH，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs，HTB/DOX NPs孵育30min后，通过ELISA试验在B16F10细胞培养基上检测MMP-9的结果柱状图，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

LMWH为依诺肝素钠；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB NPs为修饰有肿瘤靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)的HT NPs；

HT/DOX NPs为载有阿霉素的依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB/DOX NPs为载有阿霉素的、带有靶向分子苯硼酸的依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束

平均数±标准误差(means±SD),n＝3。

图8为胶束肿瘤转移抑制试验结果。

图8A为体外血小板黏附B16F10细胞的荧光强度柱状图，其中

+表示与经钙荧光素钙黄绿素(calcein-AM)共孵育的血小板

-表示未与钙荧光素(calcein-AM)共孵育的血小板

平均数±标准误差(means±SD),n＝3。

图8B血小板黏附肿瘤细胞的显微照片，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

DT NPs为达肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

FT NPs为那曲肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

图8C为肺冷冻切片CLSM图像，通过CFSE染色(黄色)来确定在肺部成功着床了的B16F10肿瘤细胞，用DAPI(蓝色)染色细胞核，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

LMWH为依诺肝素钠；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB NPs为修饰有肿瘤靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)的HT NPs；

图中，比例尺表示200μm；

图8D为C57BL/6小鼠的肺部冰冻切片图像，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

DT NPs为达肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

FT NPs为那曲肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束。

图9显示体内抗肿瘤细胞转移治疗结果，其中

图9A为对分别经静脉注射PBS，游离LMWH，HT NPs和HTB NPs(注射剂量60mg/kg)治疗后的B16F10肿瘤转移小鼠模型的肺部照片；

图9B为对分别经静脉注射PBS，游离LMWH，HT NPs和HTB NPs(注射剂量60mg/kg)治疗后的B16F10肿瘤转移小鼠模型的肺表面转移结节数量统计图。

图9C为对分别经静脉注射PBS，游离LMWH，HT NPs和HTB NPs(注射剂量60mg/kg)治疗后的B16F10肿瘤转移小鼠模型的肺进行HE(苏木精&伊红)染色后组织学分析图，其中：

PBS为磷酸盐缓冲液；

LMWH为依诺肝素钠；

HT NPs为依诺肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯胶束；

HTB NPs为修饰有肿瘤靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)的HT NPs；

图中比例尺表示100μm。

图10为胶束抗实体肿瘤实验结果图，其中，

图10A为分别接受PBS，游离阿霉素(DOX)，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤组织照片；

图10B为分别接受PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤体积增长曲线；

图10C为分别接受PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤组织HE染色照片；图中比例尺表示200μm；

图10D为分别接受PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤组织MMP-9免疫组化染色图片。图中箭头指向的黑色絮状部分为染色的MMP-9酶。；图中比例尺表示100μm，

PBS为磷酸盐缓冲液；

DOX为阿霉素；

HT/DOX NPs为载有阿霉素的HT NPs；

HTB/DOX NPs为载有阿霉素的、带有靶向分子苯硼酸的HT NPs。

注：附图中的符号n.s.表示没有显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

以下，结合附图通过示例性的具体实施方案，进一步阐述。本领域技术人员应当理解，本发明并不限于以下的具体实施例以及使用的制备方法。本领域技术人员根据本文的描述，在未超出本申请权利要求、说明书以及说明书附图所记载范围之内，可以想到的等同替换、组合和修饰均包含在本申请所述的发明之内。

为了表述的简洁，说明书和权利要求书中应用了部分缩写符号，其含义如下表1所示：

注：带有*项中的大写字母为氨基酸单字符

实施例1 LMWH-TOS共聚物的合成和表征

本实施例的目的是示例性地说明LMWH-TOS共聚物的合成方法，以及LMWH-TOS共聚物的表征。在本实施例中低分子量肝素(LMWH)和生育酚琥珀酸酯(TOS)分别以依诺肝素钠和D-α-TOS为例进行说明，所制备的共聚物也应用于以下实施例2-6中。

(一)LMWH-TOS共聚物的合成

如图1所示，通过合成在溶酶体中多酯酶低pH值的条件下可断裂的酯键来连接依诺肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯。

1.依诺肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物(HT)的制备

(1)将所述D-α-生育酚琥珀酸酯(403mg)和活化剂(EDC 253mg,NHS 152mg，DMAP40mg)溶于15ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，在避光氮气保护的条件下活化4h；(2)将依诺肝素钠200mg溶于8ml甲酰胺溶剂中，将上述步骤(1)和(2)的溶液混合。于30-33、℃避光氮气保护的条件下反应72h。反应结束后采用双倍体积丙酮沉淀法，除去未反应的D-α-生育酚琥珀酸酯和活化剂，得到乳白色凝胶样沉淀。将上述沉淀溶于少量去离子水中，装入截留分子量1000的透析袋，在去离子水中透析48h之后冻干。冻干后得依诺肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物白色粉末产物，储存于干燥器中备用。

2.达肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物(DT)的制备

(1)将D-α-生育酚琥珀酸酯(403mg)和活化剂(EDC 253mg,NHS 152mg，DMAP 40mg)溶于15ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，在避光氮气保护的条件下活化4h；

(2)将达肝素钠200mg溶于8ml甲酰胺溶剂中，将上述步骤(1)和(2)的溶液混合。于30-33、℃避光氮气保护的条件下反应72h。反应结束后采用双倍体积丙酮沉淀法，除去未反应的D-α-生育酚琥珀酸酯和活化剂，得到乳白色凝胶样沉淀。将上述沉淀溶于少量去离子水中，装入截留分子量1000的透析袋，在去离子水中透析48h之后冻干。冻干后得达肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物白色粉末产物，储存于干燥器中备用。

3.那曲肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物(FT)的制备

(1)将D-α-生育酚琥珀酸酯(403mg)和活化剂(EDC 253mg,NHS 152mg，DMAP 40mg)溶于15ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，在避光氮气保护的条件下活化4h；

(2)将那曲肝素钠200mg溶于8ml甲酰胺溶剂中，将上述步骤(1)和(2)的溶液混合。于30-33、℃避光氮气保护的条件下反应72h。反应结束后采用双倍体积丙酮沉淀法，除去未反应的D-α-生育酚琥珀酸酯和活化剂，得到乳白色凝胶样沉淀。将上述沉淀溶于少量去离子水中，装入截留分子量1000的透析袋，在去离子水中透析48h之后冻干。冻干后得那曲肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物白色粉末产物，储存于干燥器中备用。

(二)LMWH-TOS共聚物的氢谱确证(以依诺肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物为例)

由于材料具有两亲性，在重水中会形成胶束，掩藏疏水片段生育酚琥珀酸酯，故采用双溶剂法分别确证材料的疏水段和亲水段结构，即分别将等量材料溶于等量的D₂O和DMSO-d₆中打谱。结果如图2所示。

从氢谱结果可以看出，在D₂O中显示出依诺肝素钠(3.2-5.5ppm)的特征峰群，而由于疏水片段隐藏在胶束内部，故D-α-生育酚琥珀酸酯的特征峰不明显。在DMSO-d₆中显示出明显的D-α-生育酚琥珀酸酯(1.0-3.0ppm)的特征峰群，由于在有机溶剂中，亲水片段蜷缩在一起，故依诺肝素钠的特征峰不明显。结合以上两种溶剂中的氢谱可以确证D-α-生育酚琥珀酸酯成功连接于依诺肝素钠上，并且能够在亲水介质中形成胶束。

实施例2 HT NPs、DT NPs、FT NPs的制备

1.HT NPs的制备

(1)将所述D-α-生育酚琥珀酸酯(403mg)和活化剂(EDC 253mg,NHS 152mg，DMAP40mg)溶于15ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，在避光氮气保护的条件下活化4h；

(2)将依诺肝素钠200mg溶于8ml甲酰胺溶剂中，将上述步骤(1)和(2)的溶液混合。于30-33、℃避光氮气保护的条件下反应72h。反应结束后采用双倍体积丙酮沉淀法，除去未反应的D-α-生育酚琥珀酸酯和活化剂，得到乳白色凝胶样沉淀。将上述沉淀溶于少量去离子水中，装入截留分子量1000的透析袋，在去离子水中透析48h之后冻干。

(3)将步骤(2)中所得的依诺肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物白色粉末溶于水，即得到自组装形成的HT NPs(HT nanoparticles)。在用于动物实验时，将所述共聚物粉末溶于生理上可接受的含水介质，如PBS或生理盐水等。

2.DT NPs的制备

(1)将D-α-生育酚琥珀酸酯(403mg)和活化剂(EDC 253mg,NHS 152mg，DMAP 40mg)溶于15ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，在避光氮气保护的条件下活化4h；

(2)将达肝素钠200mg溶于8ml甲酰胺溶剂中，将上述步骤(1)和(2)的溶液混合。于30-33、℃避光氮气保护的条件下反应72h。反应结束后采用双倍体积丙酮沉淀法，除去未反应的D-α-生育酚琥珀酸酯和活化剂，得到乳白色凝胶样沉淀。将上述沉淀溶于少量去离子水中，装入截留分子量1000的透析袋，在去离子水中透析48h之后冻干。

(3)将步骤(2)中所得的达肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物白色粉末溶于水，即得到自组装形成的DT NPs(DT nanoparticles)。在用于动物实验时，将所述共聚物粉末溶于生理上可接受的含水介质，如PBS或生理盐水等。

3.FT NPs的制备

(1)将D-α-生育酚琥珀酸酯(403mg)和活化剂(EDC 253mg,NHS 152mg，DMAP 40mg)溶于15ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，在避光氮气保护的条件下活化4h；

(2)将那曲肝素钠200mg溶于8ml甲酰胺溶剂中，将上述步骤(1)和(2)的溶液混合。于30-33、℃避光氮气保护的条件下反应72h。反应结束后采用双倍体积丙酮沉淀法，除去未反应的D-α-生育酚琥珀酸酯和活化剂，得到乳白色凝胶样沉淀。将上述沉淀溶于少量去离子水中，装入截留分子量1000的透析袋，在去离子水中透析48h之后冻干。

(3)将步骤(2)中所得的那曲肝素钠和D-α-生育酚琥珀酸酯共聚物白色粉末溶于水，即得到自组装形成的FT NPs(FT nanoparticles)。在用于动物实验时，将所述共聚物粉末溶于生理上可接受的含水介质，如PBS或生理盐水等。

图3B为达肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯(DT NPs)和那曲肝素钠-α-生育酚琥珀酸酯(FT NPs)的纳米颗粒形态电镜图。在TEM图中显示纳米粒为规则圆球形纳米颗粒，粒径较为均一。

实施例3 PBA-LMWH-TOS胶束的制备

以靶向分子3-氨基苯硼酸(PBA)为例，在如实施例1所制备出的低分子量肝素-α-生育酚琥珀酸酯共聚物(LMWH-TOS)的基础上，直接通过酰化反应键合上3-氨基苯硼酸(PBA)，即可制备带有靶向组分的低分子量肝素-α-生育酚琥珀酸酯共聚物。具体连接操作步骤如下：

将如实施例1所制备出的粉末状两亲性共聚物200mg与活化剂(EDC 253mg/NHS152mg)溶于8ml N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，活化3小时后，加入3-氨基苯硼酸(PBA)5mg，避光氮气保护反应24小时，将反应液在纯水中透析72小时，冻干得白色粉末。

将上述制备的白色粉末溶于含水介质中即自组装形成带靶头的PBA-LMWH-TOS胶束(HTB NPs,HTB nanoparticles)。在用于动物实验时，将所述共聚物粉末溶于生理上可接受的含水介质，如PBS或生理盐水等。

实施例4 搭载DOX的HT胶束的制备及表征

1)通过物理方式搭载抗肿瘤药物示例

搭载的药物以阿霉素(DOX)为例，取疏水性的阿霉素(DOX)，通过超声乳化旋蒸法制备HT/DOX胶束。首先，将盐酸阿霉素进行脱盐酸化处理，在二氯甲烷中，加入相当于盐酸阿霉素摩尔量三倍的三乙胺，避光搅拌过夜。加入二氯甲烷半量的甲醇，将混合液加入LMWH-TOS共聚物粉末(LMWH-TOS：DOX＝9：1，w/w)中，在37、℃180rmp条件下，避光搅拌3h。接下来将混合液加入10倍体积的去离子水中，超声成乳剂(100W,5s/5s,7min)。接下来，在37℃条件下减压旋蒸出二氯甲烷和甲醇，将红色澄清制剂装入截留分子量1000的透析袋后放入去离子水中透析3h，再通过0.22μm微孔滤膜过滤后冻干保存，得红色棉花状粉末产物。

2)搭载了药物的胶束的表征

取如上所制备的产物溶于去离子水中(2mg/ml)，测定粒径和电位，TEM确认纳米粒形貌。结果如图3A所示，HT/DOX纳米粒的粒径在140nm左右，PDI为0.142，粒径均一。在TEM图中显示纳米粒为规则圆球形纳米颗粒。

3)搭载了药物的胶束的血清稳定性测定

通过浊度法测定各制剂在50％胎牛血清(FBS)中透光率的变化，从而考查各组纳米制剂的血清稳定性。将制剂与FBS(胎牛血清)混合按体积比1:1混合均匀，制剂终浓度为1mg/ml，加入透明96孔板，置于37℃ 75转/分的孵箱中震荡24h。分别于时间点0,1,2,4,8,12,24h在750nm波长下用酶标仪检测紫外吸收，并换算成透光率。

结果如图4A所示，所有的变化值在80％-120％间时，说明纳米载体具有良好的血清稳定性。

4)搭载了药物的胶束的体外释药情况

取制剂1ml制剂(均含有阿霉素100μg)于7kDa截留分子量的透析袋中。放入装有50ml不同pH值PBS的EP管中，放入孵箱中37℃ 75转/分震荡48h，每个时间点取样200μL，并新补加入等温等量等pH值的PBS，用酶标仪于488nm/555nm处检测阿霉素荧光值，根据标曲计算阿霉素释放量。

结果如图4B的体外释药曲线所示，在pH 7.4条件下，胶束结构稳定，释药缓慢。而在偏酸性条件下(pH 6.5和pH 5.0)，胶束释药明显加快，尤其在类似溶酶体的pH5.0条件下，释药率在48h达到80％左右。表明在生理pH条件下的血液循环和正常组织间隙中，纳米粒可以保持稳定，较少释药，而在肿瘤细胞的溶酶体中可以完全释放出阿霉素，产生较好的释药特性。

实施例5 胶束肿瘤转移抑制试验(划痕试验和侵袭试验)

本实施例利用选取侵袭转移性极强的小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)，通过体外划痕试验和侵袭试验证明空白药物载体纳米胶束以及加载了抗癌药物后的载药胶束对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用。

(一)划痕试验

1，第一组试验

首先，将B16F10细胞接种于6孔板中，待其长到密度为90％以上时，采用200μL枪头沿着灭菌后的直尺在6孔板中划5条细线。用PBS洗去游离细胞后，加入空白培养基。再分别加入PBS，游离DOX，依诺肝素钠，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs或者HTB/DOX NPs进行培养，用显微镜拍照记录0h和24h划痕愈合的图片(图5A)。按照下述公式计算愈合指数：

结果如图5B所示，PBS组划痕基本愈合完全，愈合指数达到90％以上。而游离DOX组由于DOX剂量很低，没有表现出明显的细胞毒性作用，愈合指数较高。游离依诺肝素钠表现出了较为明显的抗划痕愈合的作用，愈合指数为60％左右。空白载体胶束组相对于游离依诺肝素钠表现出较强的抗愈合性，愈合指数为35％左右，说明空白药物载体能够有效抑制细胞迁徙的运动性。载药组由于DOX的联合作用表现出最强的抗划痕愈合的作用，其愈合指数为25％左右。

2，第二组试验

类似地，分别应用PBS，达肝素钠，那曲肝素钠，以及DT NPs或FT NPs培养24h后，划痕愈合情况显示出与应用依诺肝素钠类似的效果。

具体而言，首先，将B16F10细胞接种于6孔板中，待其长到密度为90％以上时，采用200μL枪头沿着灭菌后的直尺在6孔板中划5条细线。用PBS洗去游离细胞后，加入空白培养基。再分别加入PBS，达肝素钠，那曲肝素钠，DT NPs或FT NPs进行培养，用显微镜拍照记录0h和24h划痕愈合的图片。

如图5C所示结果可以看出游离的达肝素钠、那曲肝素钠均能抑制细胞的迁徙运动，而DT NPs和FT NPs具有更强的抑制细胞迁徙运动的作用。

(二)侵袭试验

首先，将1×10⁵个B16F10细胞接种于表面覆盖有基质胶的transwell小室(24-孔,微孔直径8μm,Coring,USA)上层，上层采用100μL无血清培养基培养，下层加入600μL含20％血清的培养基，形成营养梯度，诱导上层细胞穿过膜侵袭入下层。随后在上层加入PBS，依诺肝素钠，HT NPs，HTB NPs，HT/DOX NPs或者HTB/DOX NPs进行培养。48h后，侵袭入下层的细胞采用4％多聚甲醛固定10min，然后用结晶紫染色，最后下层细胞在显微镜下观察成像，采用33％醋酸溶解后在波长570nm处测定紫外吸收值。

实验结果如图6A和6B所示，PBS组和依诺肝素钠组细胞大量侵袭入小室，表明此浓度下的游离依诺肝素钠不能显著调节B16F10细胞水解酶(基质金属蛋白酶-9)的表达，不能有效降低细胞分解基质胶，侵袭入下室的能力。而其余四个组均表现出明显的抗细胞侵袭的作用，载药组由于DOX的毒性作用，表现出最强的抗侵袭作用，只有少量的细胞侵袭到下室中。说明生育酚琥珀酸酯在调节细胞水解酶的表达方面具有重要作用，可以显著降低其水解酶类的表达量。

接着检测了MMP-9酶在制剂处理后的表达量，结果如图7所示，所有带有生育酚琥珀酸酯成分的组其MMP-9酶的表达量明显降低。可以由此推测，胶束可以抑制实体瘤本身MMP-9的表达，从而抑制其对肿瘤周围基质的分解，可以减少转移性的肿瘤细胞入血，从源头上抑制转移的产生。

实施例6胶束肿瘤转移抑制试验(抗黏附和抗着床试验)

本实施例通过体外和体内试验证明HT胶束和载有抗肿瘤药物的HT胶束能够抑制血小板对肿瘤细胞的黏附，以及肿瘤细胞在远端组织的“着床”作用，证明胶束具有抑制肿瘤细胞转移的作用。

(一)体外抗粘附实验

1、第一组试验

首先，将肿瘤细胞接种于6孔板(含10％血清的DMEM培养基)中，培养至细胞覆盖率为80％左右。然后从C57BL/6小鼠眼眶取血提取出血小板，用5μM calcein-AM染色20min，离心分离后待用。将培养基换为无血清培养基，分别加入PBS，依诺肝素钠，HT NPs和HTB NPs处理10min，然后加入1×10⁶荧光标记血小板。孵育30min后，用PBS洗三次除去没有黏附上的血小板，显微镜观察后用DMSO溶解在激发波长490nm和发射波长515nm条件下检测荧光强度。

结果如图8A所示，所有含有依诺肝素钠成分的组均表现出显著的抗黏附作用。采用依诺肝素钠构建胶束后没有使其抗黏附的作用消失，推测其可能在体内血循环中可以有效减少血小板对肿瘤细胞的保护和促“着床”作用。

2、第二组试验

首先，将肿瘤细胞接种于6孔板(含10％血清的DMEM培养基)中，培养至细胞覆盖率为80％左右。然后从C57BL/6小鼠眼眶取血提取出血小板，PBS稀释后待用。将培养基换为无血清培养基，分别加入PBS,DT NPs或FT NPs处理10min，然后加入1×10⁶个/孔的血小板。孵育30min后，用PBS洗三次除去没有黏附上的血小板，显微镜观察拍照。

如图8B所示结果可见PBS组中大量血小板(黑色小颗粒)粘附于肿瘤细胞表面，而空白胶束组DT NPs和FT NPs处理后，黏附的血小板显著减少。表明这两种低分子肝素构建的胶束依旧可以发挥抗血小板和肿瘤细胞黏附的作用。

(二)体内抗“着床”实验

由于LMWH能够有效抵抗血小板在肿瘤细胞表面形成保护形外套和促进肿瘤细胞的跨血管作用，因此推测其可能能够在体内表现出抗细胞在转移远端器官的“着床”作用。

1、第1组试验

首先采用CFSE(20μM,37℃,15min)活细胞膜染料将体外培养的B16F10细胞染色。提前30min对小鼠进行尾静脉给药，分别打入PBS，依诺肝素钠，HT NPs和HTB NPs，提前抑制小鼠体内血小板黏附功能。后将染色的肿瘤细胞尾静脉注射入小鼠体内，30min后将小鼠处死，分离出肺部组织，进行冰冻切片，细胞核采用DAPI标记后用共聚焦荧光显微镜观察肿瘤细胞的“着床”数量。

实验结果如图8C所示，相对于PBS组，其余三组“着床”的肿瘤细胞数量显著减少，且没有形成较大的细胞团块。细胞团块的形成可以显著增加“着床细胞”存活的几率，最终发展成为大的转移灶。

2、第二组试验

采用荧光标记的B16F10细胞进行试验。

如图8D所示的C57BL/6小鼠的肺部冰冻切片中，白色亮点为荧光标记的已经“着床”的肿瘤细胞，暗色细胞为正常肺组织细胞。

首先采用CFSE(20μM,37℃,15min)活细胞膜染料将体外培养的B16F10细胞染色。提前30min对小鼠进行尾静脉给药，分别打入PBS，DT NP或FT NPs，提前抑制小鼠体内血小板黏附功能。后将染色的肿瘤细胞尾静脉注射入小鼠体内，30min后将小鼠处死，分离出肺部组织，进行冰冻切片，细胞核采用DAPI标记后用共聚焦荧光显微镜观察肿瘤细胞的“着床”数量。

实验结果如图8D所示，相对于PBS组，其余两组“着床”的肿瘤细胞数量显著减少，且没有形成较大的细胞团块。说明这两种低分子肝素构建的胶束同样可以抑制肿瘤细胞在肺部的“着床”，可以在动物体内产生抗转移作用。

(三)体内抗转移治疗实验

利用高转移性的B16F10(小鼠黑色素瘤细胞)进行试验。首先提前30min通过小鼠尾静脉注射PBS，依诺肝素钠，HT NPs和HTB NPs(60mg kg^-1),以提前封闭小鼠体内血小板的P-选择素。然后分别尾静脉注射入肿瘤细胞。在第二天和第三天连续给药，共给药三次。20天后将小鼠处死，分离出肺部组织，进行拍照和转移灶计数。最后进行HE染色。

实验结果如图9所示，其中图9A中显示PBS处理小鼠的肺部产生大量黑色转移结节，依诺肝素钠治疗组结节数明显减少，表现出较为明显的抗转移作用，而胶束组(HT NPs治疗组、HTB NPs治疗组)表现出极强的抗转移作用，如图9B所示，胶束治疗组的肺转移结节数量远小于PBS和依诺肝素钠治疗组。另外由图9C的肺部HE染色结果也可以看出，胶束治疗组的转移结节大小和数量远小于PBS和依诺肝素钠治疗组。此结果得益于依诺肝素钠的抗黏附抗“着床”作用，且由于纳米胶束其体内循环时间相对于依诺肝素钠明显增长，可以更加持久高效的抑制细胞“着床”。

实施例7胶束抗实体肿瘤的治疗试验

实验操作：利用高转移性的B16F10(小鼠黑色素瘤细胞)进行试验。首先在C57BL/6雄性小鼠(4-5周，18-22g)的背部注射1×10⁶个B16F10细胞建立实体瘤模型。然后将荷瘤小鼠随机分为4个组，每组6只，9天后进行第一次给药治疗，每两天给一次药，共5次。四组小鼠分别经尾静脉注射PBS、游离DOX、HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs(DOX当量为3mg/kg)。记录小鼠背部肿瘤体积变化。21天后将小鼠处死，分离出肿瘤组织，进行拍照，最后进行HE染色和MMP-9免疫组化染色。

实验结果如图10所示，其中，

图10A是经PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤组织照片；

图10B是分别接受PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤体积增长曲线；

图10A和10B中的实验结果及分析如下表中所示：

图10C是分别接受PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤组织HE染色照片，比例尺为200微米。

由肿瘤组织HE染色图可以看出，HTB/DOX NPs治疗组的肿瘤组织大面积坏死，图中疏松浅色部分是坏死的肿瘤细胞，致密深色的肿瘤组织活细胞。说明其具有极强的抗肿瘤作用；HT/DOX NPs治疗组也显示出明显的肿瘤组织坏死，说明其具有较强的抗肿瘤作用；相比之下，游离DOX治疗组的组织坏死较少，只有较弱的抗肿瘤作用；PBS组没有明显的肿瘤组织坏死。

图10D是分别接受PBS，游离DOX，HT/DOX NPs和HTB/DOX NPs治疗后的B16F10实体瘤小鼠模型的肿瘤组织MMP-9免疫组化染色图片。图中箭头指向的黑色絮状部分为染色的MMP-9酶。

如图10D所示，MMP-9是一种典型的分泌酶，主要存在于细胞间质中，通过免疫组化染色后成弥散状絮状物。HT/DOX NPs治疗组和HTB/DOX NPs治疗组照片中的黑色絮状部分明显少于PBS组或游离DOX治疗组，说明胶束治疗组的肿瘤组织MMP-9的表达量下降，证明D-α-TOS可以抑制肿瘤细胞表达MMP-9，从而减弱肿瘤细胞的侵袭力，抑制肿瘤细胞入血，从而抑制转移的起始步骤。

Claims (10)

1.一种药物载体，其包含：

a)亲水部分，所述亲水部分包含亲水性肝素类化合物，和

b)疏水部分，所述疏水部分包含疏水性维生素E类化合物，

优选地，所述的亲水性肝素类化合物包括：未分级肝素、低分子量肝素、罗勒多糖、和裙带菜多糖中的一种或多种；

优选低分子量肝素，

更优选地，所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钠，和帕肝素钠中的一种或多种，

更优选所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠，达肝素钠，和那曲肝素钠中的一种或多种；

更优选地，所述低分子量肝素为依诺肝素钠；

优选地，所述的疏水性维生素E类化合物包括：天然维生素E、α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚、维生素E醋酸酯、维生素E亚油酸酯、维生素E阿魏酸酯、维生素E糖苷、聚乙氧基维生素E、高α-维生素E油、和维生素E烟酸酯中的一种或多种，

更优选为α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚，和维生素E烟酸酯中的一种或多种；

更优选为疏水性α-生育酚琥珀酸酯，β-生育酚琥珀酸酯，和γ-生育酚琥珀酸酯中的一种或多种；

更优选α-生育酚琥珀酸酯，

所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物，通过以下连接方式相连，所述连接方式包括：酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和酶敏感的连接物(如二硫键，单硫醚键)中的一种或多种；

优选酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和二硫键中的一种或多种；

更优选所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物，通过酯键直接相连；

优选地，所述药物载体表面具有肿瘤靶向组分，优选地，所述靶向组分包括：3-氨基苯硼酸类化合物、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)及其改构肽、TR、TH、半乳糖、和C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)序列肽(/代表“或”，X代表任意氨基酸)中的一种或多种，

优选包括3-氨基苯硼酸类化合物和RGD及其改构肽中的一种或多种，

更优选3-氨基苯硼酸，

优选地所述RGD改构肽包括：环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)，

优选地，所述的药物载体的粒径为微米级或纳米级；

更优选地，所述药物载体的粒径范围为200nm-50nm；

更优选地，所述药物载体的粒径为140nm±20nm。

2.一种胶束，其包括权利要求1所述的药物载体和水或药学上可接受的含水介质；

优选地，所述含水介质为水溶液，更优选为PBS或生理盐水。

3.权利要求1所述的药物载体的制备方法，所述方法包括：

(1)用羧基活化剂活化所述疏水性维生素E类化合物，优选活化时间为30min到5h，更优选在避光氮气保护条件下活化3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

其中，投料比例(摩尔比)优选为：疏水性维生素E类化合物:活化剂＝1:(1～10)，更优选1:2；

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

(2)将a)上述(1)中经活化的疏水性维生素E类化合物；与b)亲水性肝素类化合物，在反应溶剂中混合，

优选地，先将b)亲水性肝素类化合物溶于反应溶剂，再与a)混合，

优选于30-33℃，优选避光氮气保护的条件下，使a)和b)进行反应生成以下述连接键相连的两亲性共聚物，优选反应时间约8-120h，更优选72h；

所述连接键包括：酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和酶敏感的连接物(如二硫键，单硫醚键)中的一种或多种；

优选酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键、二硫键中的一种或多种；

更优选所述的亲水性肝素类化合物与所述的疏水性维生素E类化合物通过酯化反应，以酯键直接相连；

投料比优选为：所述a)经活化的疏水性维生素E类化合物的羧基，与b)亲水性肝素类化合物的羟基的比例优选1～10:1～10，更优选1:1；

(3)任选地，纯化上述步骤(2)中所得的两亲性共聚物，优选通过丙酮沉淀进行纯化，优选地，用量(体积比)为：反应液:冰丙酮为1:(1～10)，更优选1:2；优选地，将所得的两亲性共聚物经纯水透析，优选地，干燥所得的两亲性共聚物；

(4)任选地，还包含以下靶向组分键合步骤：

a)用活化剂活化以上步骤制备的两亲性共聚物，优选活化时间为30min到5h，更优选3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

b)加入靶向组分，优选地在避光氮气保护下反应，优选4-48小时，更优选24小时，将反应液优选在纯水中，透析，优选24-72小时，更优选地透析72小时，

优选所述靶向组分包括：3-氨基苯硼酸类化合物、RGD及其改构肽、TR、TH、半乳糖、C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)(/代表“或”，X代表任意氨基酸)中的一种或多种，

更优选为3-氨基苯硼酸类化合物和RGD及其改构肽中的一种或多种，

更优选3-氨基苯硼酸；

优选地所述RGD改构肽包括：环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)。

4.权利要求2所述的胶束的制备方法，其中，所述方法包括：

(1)用羧基活化剂活化所述疏水性维生素E类化合物，优选活化时间为30min到5h，更优选在避光氮气保护条件下活化3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

其中，投料比例(摩尔比)优选为：疏水性维生素E类化合物:活化剂＝1:(1～10)，更优选1:2；

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

(2)将a)上述(1)中经活化的疏水性维生素E类化合物；与b)亲水性肝素类化合物，在反应溶剂中混合，

优选地，先将b)亲水性肝素类化合物溶于反应溶剂，再与a)混合，

优选于30-33℃，优选避光氮气保护的条件下，使a)和b)进行反应生成以下述连接键相连的两亲性共聚物，优选反应时间约8-120h，更优选72h；

所述连接键包括：酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键，和酶敏感的连接物(如二硫键，单硫醚键)中的一种或多种；

优选酯键、pH敏感的腙键、亚胺键、醇醚键、二硫键中的一种或多种；

更优选所述的亲水性肝素类化合物，与所述的疏水性维生素E类化合物，通过酯化反应，以酯键直接相连；

投料比优选为：所述a)经活化的疏水性维生素E类化合物的羧基，与b)亲水性肝素类化合物的羟基的比例优选1～10:1～10，更优选1:1；

(3)任选地，纯化上述步骤(2)中所得的两亲性共聚物，优选通过丙酮沉淀进行纯化，优选地，用量(体积比)为：反应液:冰丙酮为1:(1～10)，更优选1:2；优选地，将所得的两亲性共聚物经纯水透析，优选地，干燥所得的两亲性共聚物；

(4)任选地，还包含以下靶向组分键合步骤：

a)用活化剂活化以上步骤制备的两亲性共聚物，优选活化时间为30min到5h，更优选3-4h，

优选地，所述的活化剂选自：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲氨基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)-HOBT，和DCC-NHS与DCC-DMAP的组合，

优选地，所述活化反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自：水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和甲酰胺混合溶剂、二甲基亚砜、二甲基亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、二甲基亚砜和甲酰胺的混合溶剂，以及水和甲酰胺的混合溶剂；

b)加入靶向组分，优选地在避光氮气保护下反应，优选4-48小时，更优选24小时，将反应液优选在纯水中，透析，优选24-72小时，更优选地透析72小时，

优选所述靶向组分包括：3-氨基苯硼酸类化合物、RGD及其改构肽、TR、TH、半乳糖、C-end Rule序列：R/KXXR/K(CendR)(/代表“或”，X代表任意氨基酸)中的一种或多种，

更优选为3-氨基苯硼酸类化合物和RGD及其改构肽中的一种或多种，

更优选3-氨基苯硼酸；

优选地所述RGD改构肽包括：环状RGD(即c(RGDfK))，天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸(DGR)，

(5)将上述步骤所得的两亲性共聚物溶于水或药学上可接受的含水介质；优选地，所述含水介质为含水溶液，更优选PBS或生理盐水。

5.权利要求3或4所述的制备方法，其中，

所述的亲水性肝素类化合物，包括：未分级肝素、低分子量肝素、罗勒多糖，和裙带菜多糖中的一种或多种；

优选低分子量肝素，

更优选地，所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钠，和帕肝素钠中的一种或多种，

更优选所述低分子量肝素为选自依诺肝素钠，达肝素钠，和那曲肝素钠中的一种或多种；

更优选地，所述低分子量肝素为依诺肝素钠；

优选地，所述的疏水性维生素E类化合物包括：天然维生素E、α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚、维生素E醋酸酯、维生素E亚油酸酯、维生素E阿魏酸酯、维生素E糖苷、聚乙氧基维生素E、高α-维生素E油、和维生素E烟酸酯中的一种或多种，

更优选为α-生育酚琥珀酸酯、β-生育酚琥珀酸酯、γ-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚醋酸酯、维生素E脂肪醇醚，和维生素E烟酸酯中的一种或多种；

更优选为疏水性α-生育酚琥珀酸酯，β-生育酚琥珀酸酯，和γ-生育酚琥珀酸酯中的一种多种；

更优选为α-生育酚琥珀酸酯。

6.一种抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物制剂，其中，所述抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物以物理或化学方式装载于权利要求1所述的药物载体或权利要求2所述的胶束的疏水部分和/或亲水部分。

7.权利要求1的药物载体或权利要求2的胶束在制备抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，任选地，所述药物载体或胶束搭载抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移药物。

8.权利要求1的药物载体或权利要求2的胶束在制备抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，其中，抗肿瘤药物装载于所述药物载体或胶束的疏水部分，

优选地，所述载药方式为物理作用，优选地，其载药方法选自乳化超声旋蒸法、透析法、溶剂注入法、直接溶解法，和溶剂挥发法中的一种或多种；

更优选透析法和乳化超声旋蒸法；

更优选乳化超声旋蒸法；

优选地，所采用的溶剂选自二氯甲烷、水、甲醇、乙醇、氯仿、四氢呋喃，或它们的混合溶剂；

优选氯仿、二氯甲烷、或四氢呋喃或它们的混合溶剂；

更优选于二氯甲烷。

9.权利要求1的药物载体或权利要求2的胶束在制备抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，其中，所述抗肿瘤药物装载于所述药物载体或胶束的亲水部分，

优选地，所述抗肿瘤药物通过连接片段与所述亲水性肝素类化合物偶联；

更优选所述亲水性肝素类化合物与连接片段通过酰胺键或酯键相连，所述抗肿瘤药物与连接片段通过腙键、二硫键或亚胺键相连。

10.权利要求1的药物载体或权利要求2的胶束在制备抗肿瘤和/或抗肿瘤细胞转移的药物中的用途，其中，

抗肿瘤药物(A)和抗肿瘤药物(B)分别装载于所述药物载体或胶束的疏水部分和亲水部分；

优选地，

(1)抗肿瘤药物(A)通过物理作用装载于所述药物载体或胶束的疏水部分，

优选地，所述的包载方法包括：乳化超声旋蒸法、透析法、溶剂注入法、直接溶解法，或溶剂挥发法中的一种或多种，

更优选透析法、乳化超声旋蒸法，

更优选乳化超声旋蒸法；

优选地，所采用的溶剂包括：二氯甲烷、水、甲醇、乙醇、氯仿、四氢呋喃，以及它们的混合溶剂，

优选氯仿、二氯甲烷或四氢呋喃，或它们的混合溶剂，

更优选于二氯甲烷；

(2)抗肿瘤药物(B)通过连接片段与所述亲水性肝素类化合物偶联，所述亲水性肝素类化合物与连接片段通过酰胺键或酯键相连，所述抗肿瘤药物与连接片段通过腙键、二硫键、醇醚键或亚胺键相连，

所述的抗肿瘤药物(A)和抗肿瘤药物(B)可以相同或不同。