CN101623504A - 伊文思蓝作为实体肿瘤着色剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及伊文思蓝(Evans Blue，EB)这种水溶性染料的新用途。具体地，本发明首次通过合理选择伊文思蓝的施用剂量和作用时间，实现了无毒、高灵敏度、强选择性的对实体肿瘤着色，由此提供了伊文思蓝作为实体肿瘤着色剂的新用途。

Description

伊文思蓝作为实体肿瘤着色剂的用途

技术领域

本发明涉及病理学、组织化学领域。具体地，本发明涉及伊文思蓝(Evans Blue，EB)这种水溶性染料的新用途。本发明通过合理选择伊文思蓝的施用剂量和作用时间，能够灵敏度高、选择性强地对肿瘤进行着色，由此提供了伊文思蓝作为实体肿瘤着色剂的新用途。

背景技术

伊文思蓝(Evans Blue，EB)是一种水溶性染料，  它的结构式如下所示：

通过结构式可知，伊文思蓝具有四个对称的磺酸基，能与蛋白表面亲核集团如赖氨酸、精氨酸或羟基发生磺化反应，与蛋白质间形成氨苯磺胺或磺酸酯链复合物。

伊文思蓝磺酸基与蛋白氨基结合反应式如下所示：

已知伊文思蓝是一种临床上广为应用的的实验诊断用药，它对人体没有任何毒性，被广泛用作血浆和血容量测定及血脑屏障、毛细血管通透性的研究研究中。其机理是在血液中，血浆白蛋白约占血浆总蛋白含量的60％，结构和立体构象赋予了血浆白蛋白结合其他物质的能力，如结合正常的代谢产物长链脂肪酸、类固醇等和外来的非生物物质如药物和染料等。伊文思蓝入血后迅速与白蛋白牢固结合，形成稳定的大分子复合物。文献报道伊文思蓝在血液中优先与白蛋白结合，当血浆中伊文思蓝与白蛋白摩尔比小于8时，伊文思蓝只与血浆白蛋白结合。

同时，本领域公知实体瘤组织血管系统与正常组织相比有很多不同。肿瘤直径达到2mm左右时，就诱导血管发生，形成新血管系统以满足不断增长的营养和氧需求，使血管密度增加。肿瘤血管形状构造不规则、血管壁膨胀缺失，血管内皮细胞排列不紧密、间隙大，文献报道人结肠腺癌血管孔径达400nm。正常组织中，血管平滑肌肉层在乙酰胆碱、NO等调节因子的作用下松弛或收缩以维持稳定的血流和血压；而肿瘤血管内皮细胞周围的平滑肌缺失使其丧失了自发调节功能而处于持久扩张状态，使血管渗漏增加。肿瘤血管内皮生长因子(VEGF/VPF)、缓激肽(BK)、NO、前列腺素(PGs)、基质金属蛋白酶(MMPs)等调节因子生成增多、交互作用加强，促使血管通透性增加。上述原因导致大分子物质可以透过血管壁进入肿瘤组织，在肿瘤组织滞留量增加；此外，肿瘤组织淋巴清除系统缺失，使需经淋巴系统清除的大分子药物和脂质等在肿瘤组织贮留时间延长，构成了大分子物质肿瘤被动靶向性的基础。这种大分子药物包括脂质体不能透过血管进入正常组织，但在肿瘤组织蓄积量增加、贮留时间延长的现象被称为EPR效应(Enhanced Permeability and  Retention)^[1]。实体瘤解剖学和病理生理学的改变是大分子化合物存在EPR效应的根本原因，有文献报道大分子在肿瘤组织滞留时间可以延长数周甚至数月。分子量大于40KDa(大于肾阈值)、血浆半衰期较长的大分子及大脂质体存在此效应。

申请人认为伊文思蓝本身用于人体是没有毒性的，而且其能够结合大分子白蛋白的物理特性和肿瘤组织中滞留大分子的时间长的EPR效应可以尝试将其作为肿瘤着色剂进行使用，又鉴于目前目前尚且没有将其用作肿瘤的着色剂的相关报道，设想将伊文思蓝作为肿瘤的着色剂。

在此设想的基础上，申请人采用合理的伊文思蓝用量，以伊文思蓝-白蛋白作为大分子模型，研究其在肿瘤组织的蓄积和滞留情况，结果观察到其在肿瘤组织内分布显著高于其它组织(P＜0.01)，肉眼可见瘤块和周围组织有明显的颜色差异。由此发现伊文思蓝制备用于肿瘤着色的肿瘤着色剂的新用途，由此完成了本发明。

发明内容

本发明涉及伊文思蓝在制备用于实体肿瘤着色的肿瘤着色剂中的用途。任选地，其中所述肿瘤源自哺乳动物。任选地，前述哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、兔子、狗。任选地，该用途中，其中所述实体肿瘤类型包括肝癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、各种肉瘤、肺癌、头颈部癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、绒毛膜癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌等实体癌瘤。

附图说明：

图1表示伊文思蓝-甲酰胺溶液全波长扫描图。

图2表示伊文思蓝与白蛋白体内结合稳定性。

图3表示不同时间点伊文思蓝-白蛋白含量测定。

图4表示伊文思蓝-白蛋白大分子化合物在小鼠体内组织分布，其中，A为正常小鼠，B为S-180荷瘤小鼠，C为H22荷瘤小鼠。

图5表示EB-白蛋白大分子化合物在血浆与肿瘤组织分布，其中，A为S-180荷瘤小鼠，B为H22荷瘤小鼠。

图6表示EB-白蛋白大分子化合物在S-180肿瘤组织的蓄积，其中A表示未注射荷瘤小鼠，B表示尾静脉注射伊文思蓝-BSA大分子化合物(24h)，C表示尾静脉注射伊文思蓝-BSA大分子化合物(48h)。

图7表示S-180荷瘤小鼠尾静脉注射EB24h后肿瘤组织伊文思蓝荧光。

图8表示不同浓度伊文思蓝对肿瘤细胞生长的影响。

图9表示伊文思蓝-白蛋白在小鼠S-180肿瘤组织滞留情况。

图10表示伊文思蓝对不同体积S-180肿瘤着色。

图11表示伊文思蓝-白蛋白在不同大小S-180肿瘤的分布含量。

图12表示小鼠、裸鼠实体瘤着色，其中，图12.1表示裸鼠腋下接种肿瘤着色，图12.2表示小鼠腹腔接种Lewis肿瘤着色，图12.3表示裸鼠腹腔接种BGC-823着色。

图13表示不同剂量伊文思蓝-白蛋白在S-180荷瘤小鼠组织分布，其中A：低剂量-0.05mg伊文思蓝/10g体重，B：中剂量-0.1mg伊文思蓝/10g体重，C：高剂量-0.2mg伊文思蓝/10g体重。

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。

材料与方法

第一部分实验材料

一、主要试剂

受试药物冻干人促黄体激素释放激素突变体-绿脓杆菌外毒素A突变体重组蛋白(LHRH-PE38)为冻干粉剂，绿脓杆菌外毒素A蛋白(PE38)为溶液剂，纯度均大于98％，-20℃保存。均由由合肥丽湖医药科技开发有限责任公司提供。

其它试剂：青霉素、链霉素、甲醛、三氯醋酸、5-氟尿嘧啶、戊巴比妥钠等为国产或进口试剂或药品，试剂均为分析纯或化学纯。

二、主要仪器

三、实验动物

昆明小鼠，雄性，18～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供。

NuNu及CD1裸鼠，雌性，16-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

四、实验细胞株

人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC823、人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞Lovo、小鼠黑色素瘤细胞B16-BL6、小鼠肉瘤细胞S-180、小鼠肺癌细胞LEWIS、小鼠肝癌细胞H22等肿瘤细胞均为本实验室冻存、传代培养。

第二部分实验方法

一、血浆白蛋白沉淀试验

将正常小鼠按体重分组，每组3只，将伊文思蓝与生理盐水以1∶8(w∶v)的比例混匀，按0.1ml/10g体重尾静脉注射。分别在注射1、8、24、48、120h后各取一组小鼠，眼球取血1ml，3000rpm离心10min，取上清，加入等体积10％三氯乙酸溶液沉淀蛋白，3000rpm离心10min，观察，拍照。

二、伊文思蓝-白蛋白小鼠组织分布研究

1、最大吸收波长的确定

1mg伊文思蓝溶于1ml甲酰胺，再稀释到50μg·ml^-1，紫外分光光度计在400-800nm扫描，确定伊文思蓝最大吸收波长。

2、组织中伊文思蓝测定方法^[2-4]

2.1组织样本处理与测定

采用甲酰胺提取-紫外分光光度法测定小鼠各脏器中伊文思蓝的含量。取适量待测组织，吸干表面残留水分，按1ml/100mg组织加入甲酰胺，剪碎(尽量粉碎)，37℃振摇提取72h，4000rpm离心10min后，取上清加入96孔板，每孔100μl，酶标仪最大吸收波长处测定吸光度A。

2.2线性实验

2％戊巴比妥钠腹腔麻醉(0.1ml/10g)，肝素钠-生理盐水(0.1492g·1000ml^-1)心脏灌洗至流出液体澄清，按2.1项方法进行处理，分别取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤、皮肤、骨骼肌、骨髓组织的甲酰胺提取液500μl，精密加入不同含量(0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0mg/L)的伊文思蓝-甲酰胺储备溶液500μl，测定并记录吸光值A，浓度(mg/L)对A进行线性回归，得到各组织样品的回归方程。

2.3回收率实验

按照标准曲线确定的范围，按2.1项方法进行处理，分别取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤、皮肤、骨骼肌、骨髓组织的甲酰胺提取液500μl，精密加入不同浓度(1.0、3.0、5.0mg/L)的伊文思蓝-甲酰胺储备溶液500μl，每个浓度做5份样品，测定吸光度A₁；另配制等浓度的伊文思蓝甲酰胺溶液直接测定吸光度A₂。按下式计算回收率：提取回收率＝A₁/A₂×100％。

2.4精密度实验

按照标准曲线确定的范围，按2.1项方法进行处理，分别精密加入伊文思蓝甲酰胺储备液于不同组织的甲酰胺提取液中，配成0.5、2.5、5.0mg/L溶液，每个浓度做5份样品，测定并记录A，测定精密度。

3、EB-白蛋白复合物在正常小鼠体内组织分布

将正常小鼠按体重分组，每组3只，将伊文思蓝与生理盐水以1∶8(w∶v)的比例混匀，按0.1ml/10g体重尾静脉注射。分别在注射后1、8、24、48、120h进行如下操作(空白对照组也进行如下操作)：每个时间点取一组小鼠，右后背部脱毛，单侧眼球取血，收集血浆0.6ml，3000rpm离心15mi n，取上清，最大吸收波长处测定吸光度A。2％戊巴比妥钠腹腔麻醉(0.1ml/10g)，肝素钠-生理盐水(0.1492g·1000ml^-1)心脏灌洗至流出液体澄清为止，取一定量的心、肝、脾、肺、肾、皮肤、骨骼肌、骨髓组织，用纱布吸净表面残留液体，称重，放入2ml塑料离心管中，按上法测定伊文思蓝含量。

4、EB-白蛋白复合物在荷瘤小鼠体内组织分布

无菌条件下抽取S-180肉瘤、H22肝癌荷瘤小鼠的腹水，计数肿瘤细胞，生理盐水稀释成2×10¹⁰·L^-1，每只小鼠前肢腋部皮下接种0.2ml。挑选瘤块直径约8mm的小鼠分组，每组3只。余下操作同实验方法二(4)，并取肿瘤组织。

三、激光共聚焦显微镜观测肿瘤组织伊文思蓝荧光^[5]

无菌条件下抽取S-180荷瘤小鼠的腹水，计数肿瘤细胞，生理盐水稀释成2×10¹⁰·L^-1，每只小鼠前肢腋部皮下接种0.2ml。挑选瘤块直径约8mm小鼠3只，尾静脉注射EB生理盐水溶液，0.1ml/10g体重。24h后戊巴比妥钠麻醉，肝素钠-生理盐水(0.1492g·1000ml^-1)心脏灌流冲洗血管，待流出液体澄清后，立即取肿瘤组织，液氮冻存，制备冰冻切片。染核，避光10min，甘油-PBS(1∶1)封片。激光共聚焦显微镜观察伊文思蓝荧光并拍照。

四、细胞培养

细胞以含10％胎牛血清RPM I 1640或DMEM培养基培养，并补充青霉素和链霉素各100KU·L^-1，37℃饱和湿度，5％CO₂条件下培养，每2d换液一次，0.25％胰蛋白酶消化、传代、收集细胞。

五、MTT法

将对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔5000个细胞，培养24h，分别加入不同浓度的受试药物(如伊文思蓝、LHRH-PE 38、PE38、阳性对照药5-Fu等)，每浓度4个平行孔。培养68-72h后，轻吸出上清，用空白培养基轻洗2次，每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg·ml^-1四氮唑蓝(MTT)，37℃培养4h后轻吸出上清。每孔加入100μl DMSO溶解甲臜，振荡器溶解混匀，在最大吸收波长下检测吸光度。用MicroCal Origin软件作图，观察受试药物对肿瘤细胞生长的影响。

1、药物浓度及配制

以《抗肿瘤药效学指导原则》为指导，根据预备试验的结果，设置受试药物EB浓度为250、25、2.5、0.25μg/ml，受试药物LHRH-PE38和PE38浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/ml八个浓度，阳性对照药物5-Fu浓度为10μg/ml，另设空白对照。药物临用现配制，以培养液溶解使用。

2、数据处理

数据用x±S表示：抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％；药物效应指标用半数浓度(EC₅₀)表示，并列出实测最大抑制率(Imax)。用MicroCal Origin软件作图，及该软件中的四参数Logistic程序拟合肿瘤细胞生长曲线，观察药物对细胞生长的影响或求出半效浓度(EC₅₀，μg/ml)。

六、伊文思蓝-白蛋白瘤内滞留情况

无菌条件下抽取S-180荷瘤小鼠的腹水，计数肿瘤细胞，生理盐水稀释成2×10¹⁰.L^-1，每只小鼠前肢腋部皮下接种0.2ml。待肿瘤直径长到8mm左右，挑选瘤块均匀的小鼠，按体重分组，每组3只。将伊文思蓝与生理盐水以1∶8(w∶v)的比例混匀，按0.1ml/10g体重尾静脉注射。分别于1h、8h、24h、48h、5d、10d、15d进行如下操作：2％戊巴比妥麻醉，肝素-生理盐水溶液(0.1492g·1000ml^-1)心脏灌洗，取一定量瘤组织，测定伊文思蓝含量。

七、伊文思蓝作为肿瘤着色剂

1、对不同大小肿瘤着色试验

无菌条件下抽取S-180荷瘤小鼠的腹水，计数肿瘤细胞，生理盐水稀释成2×10¹⁰·L^-1，每只小鼠前肢腋部皮下接种0.2ml。注意观察肿瘤生长情况，游标卡尺测量并计算肿瘤体积，按体积分组，每组3只。在不同体积组别，尾静脉注射EB，0.1ml/10g体重，24h后眼球放血，剥离肿瘤，观察肿瘤显色情况并拍照。

2、对裸鼠、小鼠实体瘤着色试验

2.1裸鼠

将对数生长期BGC-823、HepG-2、MCF-7细胞消化、计数，生理盐水稀释成2×10¹⁰·L^-1，每只裸鼠前肢腋部皮下接种0.2ml。待肿瘤直径长到6mm时，将伊文思蓝与生理盐水以1∶8(w∶v)的比例混匀，按0.1ml/10g体重尾静脉注射。24h后处死，剥离肿瘤，照相，取脑、心、肝、脾、肺、肾主要器官，拍照对比EB-白蛋白大分子化合物的组织分布情况。

将对数生长期BGC-823细胞消化、计数，生理盐水稀释成2×10¹⁰.L^-1，裸鼠腹腔接种接种0.2ml。10d后，将伊文思蓝与生理盐水以1∶8(w∶v)的比例混匀，按0.1ml/10g体重尾静脉注射。24h后麻醉，尾静脉注射2％戊巴比妥钠，0.3ml/10g体重，模拟全麻手术状态，然后打开腹腔，用纱布擦拭表面血液，对BGC-823肿瘤着色情况进行观察并照相，设置荷瘤对照组。

2.2小鼠

无菌条件下剥离小鼠LEWIS肿瘤，研磨，计数肿瘤细胞，生理盐水稀释成2×10¹⁰.L^-1，小鼠腹腔接种接种0.2ml。10d后，将伊文思蓝与生理盐水以1∶8(w∶v)的比例混匀，按0.1ml·10g体重^-1尾静脉注射。24h后麻醉，尾静脉注射2％戊巴比妥钠，0.75ml·10g体重^-1，模拟全麻手术状态，然后打开腹腔，用纱布擦拭表面血液，对LEWIS肿瘤着色情况进行观察并照相，设置不注射EB的荷瘤对照组。

3、着色剂合适剂量、给药时间推荐

无菌条件下抽取S-180肉瘤荷瘤小鼠的腹水，计数肿瘤细胞，生理盐水稀释成2×10¹⁰·L^-1，每只小鼠前肢腋部皮下接种0.2ml。挑选瘤块直径约8mm的小鼠分组，每组3只。分别给予高(0.2mgEB/10g体重)、中(0.1mgEB/10g体重)、低(0.05mgEB/10g体重)3个剂量的伊文思蓝，分别在1、8、24、48、120h测定不同剂量伊文思蓝在心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织的分布情况，比较不同剂量组中肿瘤与其他组织的伊文思蓝含量比值，统计分析比较差异，推荐着色剂最佳给药剂量以及最佳给药时间的范围。

八、数据分析

数据以均数±标准差(x±S)表示，用EXCEL或SPSS 12.0统计软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。用MicroCal Origin软件作图。

实验结果

伊文思蓝新用途--肿瘤着色剂

一、伊文思蓝-白蛋白肿瘤靶向性分布

(一)伊文思蓝-白蛋白体内结合稳定性

1、最大吸收波长的确定

全波长扫描确定伊文思蓝最大吸收波长为620nm。见图1。

2、EB与血浆蛋白体内稳定结合

小鼠尾静脉注射EB生理盐水溶液，注射1、8、24、48、120h后，眼球取血、离心、取上清沉淀白蛋白，离心，观察，拍照。对照组未注射伊文思蓝。各个时间点加入蛋白沉淀剂后，迅速形成蓝色絮状沉淀，离心后上清液无色透明，说明EB在给定剂量与小鼠体内白蛋白结合完全；随着EB-白蛋白大分子化合物组织分布及代谢，血浆中EB-白蛋白复合物逐渐减少，表现为蓝色沉淀逐渐变浅，但上清液一直保持澄明，说明EB-白蛋白在体内结合稳定。结果见图2。

3、沉淀及上清液中伊文思蓝-白蛋白复合物定量

分别取一定量蛋白沉淀和上清，测定伊文思蓝(即复合物)含量。随着伊文思蓝-白蛋白在各组织尤其是肿瘤组织分布的增多，血浆中(沉淀)含量逐渐下降。上清均未测到伊文思蓝，说明伊文思蓝在体内与白蛋白稳定结合。见图3。

(二)组织中伊文思蓝测定方法

1、线性实验

浓度C(mg/L)对吸光度A进行线性回归，得到各组织样品的回归方程，见表1。

表1：标准曲线

2、回收率实验

各组织样品回收率在98.51-117.74％范围内，达到生物样品的分析要求。见表2。

表2：提取回收率实验，％，n＝5

3、精密度实验

各组织样品中伊文思蓝含量测定精密度0.82-8.30％范围内，达到生物样品的分析要求。见表3。

表3：精密度实验，％，n＝5

小鼠组织中伊文思蓝的质量浓度在0.125-40mg/L的范围内，提取液的吸光度与浓度呈良好的线性关系。方法学考察结果达到生物样品的分析要求。该实验结果表明，用甲酰胺提取-紫分光光度法测定组织中伊文思蓝的浓度，结果准确，重现性好，能有效减少组织中非测定成分产生的干扰。

(三)伊文思蓝-白蛋白小鼠组织分布研究

1、正常小鼠组织分布

正常小鼠体内，各时间点伊文思蓝-白蛋白大分子复合物在皮肤分布较多，在肝、肺、骨髓等主要器官也有一定分布。结果见图4(A)。

2、荷瘤小鼠组织分布

组间用SPSS 12.0统计软件进行t检验，组内两两比较采用方差分析LSD检验。P＜0.05表示组间差异有统计学意义。

S-180荷瘤小鼠体内，8h时伊文思蓝-白蛋白大分子在肿瘤组织比其他组织浓度高37.0％67.6％(P＜0.01)，24h时肿瘤组织浓度比其他组织高48.0％67.4％(P＜0.01)，48h肿瘤组织浓度比其他组织高49.8％75.5％(P＜0.01)，120h肿瘤组织浓度比其他组织高54.0％75.0％(P＜0.01)；与正常小鼠相比，EB-白蛋白大分子在S-180荷瘤小鼠骨髓分布浓度减小，1h时减少15.7％(P＜0.01)，8h时减少8.4％(P＜0.01)，24h  时减少16.2％(P＜0.01)，48h  时减少32.7％(P＜0.01)，120h时减少26.3％(P＜0.01)。结果见图4(B)。H22荷瘤小鼠体内，8h时EB-白蛋白大分子在肿瘤组织比其他组织浓度高40.8％69.7％(P＜0.01)，24h时肿瘤组织浓度比其他组织高45.8％72.1％(P＜0.01)，48h肿瘤组织浓度比其他组织高49.8％74.4％(P＜0.01)，120h肿瘤组织浓度比其他组织高50.2％74.5％(P＜0.01)；与正常小鼠相比，EB-白蛋白大分子在H22荷瘤小鼠骨髓分布浓度减小，1h时减少14.4％(P＜0.01)，8h时减少6.6％(P＜0.01)，24h  时减少11.9％(P＜0.01)，48h时减少29.7％(P＜0.01)，120h时减少27.6％(P＜0.01)。结果见图4(C)。

3、EB-白蛋白大分子复合物在血浆与肿瘤组织分布变化

EB-白蛋白大分子在S-180荷瘤小鼠体内，8h时在肿瘤组织达到1.401μg/g组织，浓度是血浆中的3倍，此后至120h基本呈现浓度蓄积及稳定滞留情况，24h时肿瘤组织浓度是血浆中的5倍，48h时肿瘤组织浓度达到最高点1.494μg/g组织，是血浆中的13倍；血浆中浓度随时间变化呈下降趋势，120h降到0.068μg/ml。结果见图5(A)。EB-白蛋白大分子在H22荷瘤小鼠体内，8h时在肿瘤组织达到1.434μg/g组织，浓度是血浆中的3倍，此后至120h也基本呈现浓度蓄积及稳定滞留情况，24h时肿瘤组织浓度是血浆中的4倍，48h时肿瘤组织浓度达到最高点1.454μg/g组织，是血浆中的9倍；血浆中浓度随时间变化呈下降趋势，120h降到0.041μg/ml。结果见图5(B)。

4、激光共聚焦显微镜观察伊文思蓝荧光

尾静脉注射EB-白蛋白大分子24、48h后，与未注射组相比肿瘤组织明显变蓝，直观展现了EB-白蛋白在肿瘤组织(以S-180为例)的蓄积作用，结果见图6。申请人将注射EB后的肿瘤组织冰冻切片在激光共聚焦显微镜下观察，与空白肿瘤组织相比，注射伊文思蓝24后肿瘤组织可观察到很强的红色荧光，进一步显示出EB-白蛋白在肿瘤部位的蓄积情况，结果见图7。

二、伊文思蓝新用途--肿瘤着色剂

临床手术时大块肿瘤被切除后，微小肿瘤灶的切除是防止术后复发的重要措施，由于肉眼很难区分微小肿瘤灶与正常组织界限，所以经常有肿瘤切除不彻底的情况，使肿瘤存在复发的可能性。基于前面对EB复合物组织分布的研究，申请人观察到肿瘤灶的EB着色显著高于正常组织，肉眼很容易区分，因此，申请人尝试开发伊文思蓝作为肿瘤着色剂，便于临床医生手术时分清肿瘤灶与正常组织的界限，协助手术切除完整顺利地进行，并为肿瘤相关基础实验研究提供技术支持。

(一)不同浓度伊文思蓝对肿瘤细胞生长的影响

MTT试验表明浓度在25μg/ml以下时，伊文思蓝对B16、BGC-823等肿瘤细胞生长基本没有影响。结果见图8。

(二)伊文思蓝-白蛋白在肿瘤组织滞留情况

尾静脉注射EB生理盐水溶液后，EB-白蛋白大分子在瘤内蓄积量逐渐增加，24、48h逐渐达到顶峰，15天在瘤内仍有较大浓度，与文献报道大分子化合物瘤内蓄积时间延长数周吻合^[1]。随着时间延长，瘤内浓度保持较高水平，而进入正常组织的少量EB-白蛋白则逐渐被代谢，EB-白蛋白在肿瘤与正常组织的比值增加，肿瘤着色效果可能更佳。结果见图9。

(三)伊文思蓝作为肿瘤着色剂

1、对不同体积肿瘤着色的研究

对荷有不同体积S-180肿瘤的小鼠尾静脉注射EB后，均可观察到肿瘤组织出现明显蓝染情况。结果见图10。而且给与相同当量的伊文思蓝，不同直径肿瘤的伊文思蓝含量(μg/g组织)没有显著性差异，表明伊文思蓝-白蛋白在EPR效应下，于小肿瘤也具有同等被动靶向作用。结果见图11。因此伊文思蓝作为肿瘤着色剂适用于各种体积的实体瘤，对于分界肿瘤部位、尤其对发现切除直径小、临床上难以观察到的小肿瘤具有较大的现实意义。

2、对小鼠移植瘤、裸鼠人移植瘤着色

给荷有BGC-823、HepG-2、MCF-7肿瘤的裸鼠注射伊文思蓝，可见肿瘤组织与其他组织相比明显着蓝色。见图12.1。模拟临床手术状态，申请人对腹腔接种肿瘤细胞7-10天的小鼠、裸鼠模型无菌静脉注射伊文思蓝，24h后麻醉，开腹腔，观察肿瘤组织着色情况。腹腔接种Lewis肿瘤的小鼠及腹腔接种BGC-823肿瘤裸鼠，肿瘤在腹腔无序生长，注射伊文思蓝24h后，麻醉状态下打开腹腔，可见遍布腹腔的大小瘤块均出现蓝染现象，一些直径约1-2mm的小体积瘤块也被染成蓝色(见图12中红色箭头)，与荷瘤空白对照组相比，肿瘤与正常组织界限更加清晰可见，有利于临床手术切除的准确性、彻底性，同时也可以观察原发灶周围是否存在转移灶；也可应用于肿瘤相关实验研究。见图12.2、12.3。

3、最佳给药剂量、时间推荐

给予S-180荷瘤小鼠不同剂量[高(0.2mg/10g体重)、中(0.1mg/10g体重)、低(0.05mg/10g体重)]的伊文思蓝，分别在1、8、24、48、120h测定不同剂量伊文思蓝在心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织的分布情况，结果见表4、图13。比较不同剂量组不同时间点肿瘤与其他组织的伊文思蓝含量比值(X，其中X₁＝瘤/心，X₂＝瘤/肝，X₃＝瘤/脾，X₄＝瘤/肺，X₅＝瘤/肾)，比值越大，说明EB在肿瘤组织的相对分布越多，越有利于分辨肿瘤与正常组织的区别，作为着色剂使用剂量、时间的推荐依据，结果见表5。用SPSS 12.0统计软件General LinearModel中的多变量检验multi-variate检验分析比较伊文思蓝在肿瘤与其它组织含量比值的差异，显示组别即给药剂量与给药时间有交互作用。组间剂量、时间差异分析具体见表6。

组别间多变量检验分析显示X在3个剂量组间的P值均小于0.001(见表6表1.1)，均有显著性差异，结合表5和表6图1，低剂量组(0.05mg/10g体重)中X₁-X₅的药时曲线下面积均最小，而中剂量组(0.1mg/10g体重)中X₁-X₅的药时曲线下面积普遍高于高剂量组(0.2mg/10g体重)，因此最佳剂量设置在中剂量和高剂量之间且靠近于中剂量较为合理。

组别间多变量检验分析结合表5和表6图1显示：在中剂量组中，X1在24、48、120h均较大且没有统计学差异；X2在120h最大，在24、48h也较大且没有统计学差异；X3在24h最大且与其它时间点有明显统计学差异，120h也有较高分布；X4在120h最大且有明显统计学差异；X5在8h最大，在24-120h也均较大。上述结果说明随着正常组织对进入的少量EB-白蛋白复合物的代谢，肿瘤组织对进入较多量复合物的滞留时间的相对延长，使得120h时间点X较大，即EB对肿瘤组织着色的界限更加清晰；结合EB-白蛋白在肿瘤组织滞留情况(见图9)显示EB-白蛋白在24-120h有较多分布，48h达峰值，随着时间的延长在肿瘤组织分布显著降低的现象，申请人认为48-120h之间且接近120h的给药时间较为合理。

综上所述，对荷瘤小鼠模型，申请人推荐EB作为肿瘤着色剂的最佳使用剂量是术前2-5天，最佳给药剂量为0.1-0.2mgEB/10g体重。

表4：不同剂量伊文思蓝-白蛋白在S-180荷瘤小鼠体内组织分布含量

表5不同剂量伊文思蓝-白蛋白在肿瘤与其它组织中含量比值

表6：SPSS12.0统计分析结果

1.1组

多因素比较

1.2时间

多因素比较

前面的实验还表明静脉注射伊文思蓝能使1-2mm的小肿瘤着色，提示可以进一步利用伊文思蓝及其荧光观察肿瘤是否存在转移以及转移部位。

产业上应用的可行性

使用伊文思蓝作为肿瘤着色剂的优点是：1：区分微小肿瘤灶与正常组织界限，便于手术彻底清除病灶，降低复发率。肿瘤临床切除手术中，在切除大肿瘤后，微小肿瘤灶的切除是防止术后复发的重要措施，由于肉眼很难区分微小肿瘤灶与正常组织界限，所以经常有肿瘤切除不彻底的情况，使肿瘤存在复发的可能性。通过对伊文思蓝-白蛋白复合物组织分布的研究，申请人观察到肿瘤灶和肿瘤周围囊肿的伊文思蓝着色显著高于正常组织，肉眼很容易区分。2：伊文思蓝的着色剂的检测灵敏度高，申请人静脉注射伊文思蓝，伊文思蓝-血浆白蛋白大分子通过EPR效应在肿瘤组织蓄积，伊文思蓝的生物染料性质使肿瘤组织着色，观察到伊文思蓝甚至可以使1-2mm的小肿瘤着色，便于临床医生手术时分清肿瘤灶与正常组织的界限，协助手术切除完整顺利地进行，并为肿瘤相关基础实验研究提供技术支持。

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Claims (4)

1.伊文思蓝在制备用于实体肿瘤着色的实体肿瘤着色剂中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述实体肿瘤源自哺乳动物。

3.权利要求2的用途，其中所述哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、兔子、狗。

4.权利要求1的用途，其中所述实体肿瘤类型包括肝癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、各种肉瘤、肺癌、头颈部癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、绒毛膜癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌等实体癌瘤和转移瘤灶，以及肿瘤周围淋巴结。

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