CN109161530A - 一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法，本发明利用苯硼酸与唾液酸的反应来捕获循环肿瘤细胞。本发明可高灵敏、特异性检测并富集循环肿瘤细胞的，本发明的方法由于是利用肿瘤细胞表面过表达唾液酸这一特性，因此对于分离的CTCs可不限定细胞类型，理论上可分离所有表面过表达唾液酸的循环肿瘤细胞，该特点极大增加了本分离方法的实用性。

Description

一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法
技术领域
本发明属于肿瘤细胞分离技术领域，具体涉及一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法。
背景技术
近年来，肿瘤已经成为威胁人类生命健康的重要因素之一。据最新一期的全国癌症统计数据，2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例，其中晚期癌症患者的死亡率几乎为100％。如果能在患者肿瘤初期检测到是否发生转移对于患者的及时治疗有着重大意义，可大大降低癌症的死亡率。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞会以内渗的方式进入循环系统，被成为循环肿瘤细胞(CTCs)。CTCs的形成和肿瘤转移有关，这些循环肿瘤细胞通过血液循环系统寻找合适的环境然后着床生长形成新的肿瘤组织，有研究发现CTCs和原发灶肿瘤细胞以及转移灶肿瘤细胞都不相同，可以认为CTCs是原发灶肿瘤胞和转移灶肿瘤细胞之间的中间过渡状态。CTCs保持了实体肿瘤的部分特性，能被用于追踪实体肿瘤的性质和变化，因此循环肿瘤细胞作为肿瘤转移的标志物受到越来越多的研究。但是CTCs在血液中的含量极少，约106～107白细胞中才有一个CTCs，在外周血中数亿个细胞中可能只有几个循环肿瘤细胞，这种数量上的巨大差别为CTCs的检测带来极大挑战。目前常用的检测方法大体可分为两类：物理方法和生物方法。物理方法一般是根据肿瘤细胞和正常细胞在形态和大小上的不同，利用特殊的微流控设备进行分离，但是有些肿瘤细胞和正常细胞的大小并没有太大区别，这种方法检测和分选循环肿瘤细胞的灵敏度和特异性均受到质疑。生物方法一般是根据循环肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原，在特殊的芯片或者磁珠上修饰相应的抗体，利用抗原抗体特异性结合从而达到对CTCs分离的目的。但是由于肿瘤细胞表型以及性质的多样性，该方法存在肿瘤异质性的问题，以及肿瘤相关的抗原在CTCs的表达率约为60％～70％，因此利用抗原抗体特性原理进行CTCs的筛选存在着漏筛的可能性，并且抗原抗体不能在较高的流速下得到较好的反应，这些都限制着基于抗原抗体结合对CTCs分选在临床上的应用。因此发展一种可以高灵敏度高特异性检测CTCs的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法。
本发明的另一目的在于提供上述苯硼酸的应用。
本发明的技术方案如下：
一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法，包括如下步骤：
(4)将苯硼酸连接于固相载体上；
(5)将含有循环肿瘤细胞的液体与上述固相载体接触，循环肿瘤细胞上的唾液酸与苯硼酸发生反应形成硼酸酯，使得循环肿瘤细胞被固相载体上的苯硼酸捕获，与其余细胞分离；
(6)接着将捕获了循环肿瘤细胞的固相载体置于pH＝6～7的弱酸性条件下，上述硼酸酯的硼酯键断裂以释放所捕获的循环肿瘤细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述苯硼酸通过聚合物结构与固相载体相连。
进一步优选的，所述聚合物结构为聚乙二醇结构。
在本发明的一个优选实施方案中，所述固相载体包括微流控芯片和纳米磁珠。
进一步优选的，所述纳米磁珠为氨基改性纳米磁珠。
苯硼酸在分离循环肿瘤细胞中的应用。
苯硼酸在制备用于分离循环肿瘤细胞的材料中的应用。
本发明的有益效果是：本发明可高灵敏、特异性检测并富集循环肿瘤细胞的，本发明的方法由于是利用肿瘤细胞表面过表达唾液酸这一特性，因此对于分离的CTCs可不限定细胞类型，理论上可分离所有表面过表达唾液酸的循环肿瘤细胞，该特点极大增加了本分离方法的实用性。
附图说明
图1为本发明的反应原理图。
图2为本发明实施例1的工作流程示意图。
图3为本发明实施例1的的实验结果图之一。
图4为本发明实施例1的的实验结果图之二。
图5为本发明实施例2的的实验结果图之一。
图6为本发明实施例2的的实验结果图之二。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1苯硼酸结合微流控芯片用于循环肿瘤细胞(CTCs)的分选
分离原理如图1和图2所示：该方法是在微流控芯片上修饰含有苯硼酸的聚合物材料，结合微流控芯片具有分析速度快、可集成化、便于携带、试剂消耗量低、高流通等优点实现了对外周血中CTCs的高效、特异性、高通量的检测和分选。该方法是把收集到的外周血细胞通过微流控进样空注入，随着肿瘤细胞表面的唾液酸与芯片上的苯硼酸发生化学反应形成硼酸酯，使得肿瘤细胞被留在芯片上，而其余的正常细胞自然流出。完成了从外周血中分离CTCs的目的，同时利用硼酸酯在酸性条件下的不稳定特性，向微流装置中注入pH为6.5的磷酸缓冲液，使得硼酸酯水解并释放CTCs，从出口导管处收集到的细胞即为循环肿瘤细胞。
具体包括如下步骤：
1.无菌操作条件下取外周血细胞，离心弃上清，然后把细胞重悬浮在PBS(磷酸缓冲液)中，用细胞计数法调整其浓度，使溶液达到最终浓度为4×106/mL的细胞悬液。
2.用微量导流管吸入细胞悬液，以1mL/hr的流速注入微通道中。
3.将接种有细胞的芯片放入培养箱内，37度孵育15min后，将非循环肿瘤细胞用微量导流管导出芯片外。
4.微流导流管吸入pH为6.5的磷酸缓冲溶液，苯硼酸和唾液酸解离，CTCs自然脱落。5.收集导流管排出的细胞就是循环肿瘤细胞。
对本实施例获得的循环肿瘤细胞进行检测，实验结果如图3和图4所示，其中，A：未经处理的外周血中收集的细胞流式散点图B：芯片捕获外周血中CTCs的细胞流式散点图。图4为芯片捕获外周血中CTCs免疫荧光图，其中a中的蓝色荧光指示细胞核，b中的红色为细胞角蛋白抗体染色。
实施例2苯硼酸结合磁性纳米粒子用于CTCs的分选
分离原理如图1所示：该方法是在纳米磁珠表面修饰含有苯硼酸的聚合物材料，当含有CTCs的外周血与磁珠混合后，肿瘤细胞表面的唾液酸和苯硼酸发生化学反应，使得CTCs以化学共价键的形式连接在纳米磁珠表面。然后将体系置于磁场中，吸去体系中的混合液体，正常细胞由于没有被磁珠固定下来而被吸走，CTCs则通过硼酸的作用连接在磁珠表面。磁珠通过磁力作用被吸附在装置中不被吸走，得到的均是留在磁珠表面的CTCs。完成了从外周血中分离CTCs的目的，同时利用硼酸酯在酸性条件下的不稳定特性，向体系中注入pH为6.5的磷酸缓冲液，使得硼酸酯水解并释放CTCs，此时吸取混合液并离心弃上清到的细胞即为循环肿瘤细胞。
利用苯硼酸修饰的纳米磁珠分选循环肿瘤细胞步骤如下：
1.将采集的外周血液样品经离心后收集的细胞重悬浮在PBS(磷酸缓冲液)与被苯硼酸聚合物修饰的纳米磁珠混合均匀，然后置8～15℃孵育10～15min。
2.将试管置于磁场中3min，然后轻轻吸去溶液，并用PBS/BSA洗细胞5～6次，动作要缓慢。
3，在分离管中加入pH为6.5的磷酸缓冲液在37℃下处理20min，取上清培养液，并离心收集的细胞即为循环肿瘤细胞。
对本实施例获得的循环肿瘤细胞进行检测，实验结果如图5和图6所示，其中，A：未经处理的外周血中收集的细胞流式散点图B：苯硼酸修饰的纳米磁珠捕获的外周血CTCs的细胞流式散点图。图6为苯硼酸修饰的纳米磁珠捕获外周血中CTCs免疫荧光图，其中a中的蓝色荧光指示细胞核，b中的红色为细胞角蛋白抗体染色。
对上述实施例1和实施例2所获得的循环肿瘤细胞进行检测的方法包括免疫荧光染色和流式观察细胞数目，具体步骤如下：。
免疫荧光染色
1、取实施例1或实施例2收集的循环肿瘤细胞爬片放到35mm细胞培养皿里，PBS洗三遍。
2、4％多聚甲醛固定20min，PBS洗三遍。
3、0.2％Triton X～100通透10min，PBS洗三遍。
4、与二抗相同宿主的血清封闭30min，PBS洗三遍。
5、一抗4度湿盒内过夜，PBS洗三遍。
6、二抗室温2h(避光)，PBS洗三遍。
7、DAPI染核，直接照荧光片。
8、蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。
9、荧光显微镜观察CTCs。
流式观察细胞数目
1、细胞的收集
吸弃培养基，用PBS清洗两次，加入0.2～0.5mL 0.25％胰酶～EDTA放置细胞培养箱中消化1～2min，用DMEM(10％FBS)终止消化，细胞计数收集2x106个细胞。
2、细胞清洗
将收集的循环肿瘤细胞通过离心机离心1000rpm 5～10min，吸弃上层培养基，加入2mL PBS重悬细胞(轻轻吹打细胞清洗)，再次离心5～10min，吸弃上清液体，再重复清洗一次。加入300μL PBS，4℃储存，待上机。
3、细胞表面封闭
采用PBS(2％FBS)，加入0.5mL封闭液，4℃冰箱封闭15～30min。离心，弃上清，加入100μL PBS(2％FBS)，加入20μL抗体。4℃孵育30min。
4、再次清洗
孵育过程结束后，离心1000rpm 5～10min，吸弃上清，加入2mL PBS轻轻重悬吹打细胞，清洗2次。加入300～400μL PBS上机。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将苯硼酸连接于固相载体上；
(2)将含有循环肿瘤细胞的液体与上述固相载体接触，循环肿瘤细胞上的唾液酸与苯硼酸发生反应形成硼酸酯，使得循环肿瘤细胞被固相载体上的苯硼酸捕获，与其余细胞分离；
(3)接着将捕获了循环肿瘤细胞的固相载体置于pH＝6～7的弱酸性条件下，上述硼酸酯的硼酯键断裂以释放所捕获的循环肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述苯硼酸通过聚合物结构与固相载体相连。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于：所述聚合物结构为聚乙二醇结构。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述固相载体包括微流控芯片和纳米磁珠。
5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于：所述纳米磁珠为氨基改性纳米磁珠。
6.苯硼酸在分离循环肿瘤细胞中的应用。
7.苯硼酸在制备用于分离循环肿瘤细胞的材料中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109752530A (zh) * 2019-01-31 2019-05-14 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司 一种液相细胞免疫鉴定方法及其应用
CN112206325A (zh) * 2020-09-21 2021-01-12 温州医科大学附属眼视光医院 一种长眼表滞留人工泪液及其制备方法
CN113293615A (zh) * 2021-05-24 2021-08-24 西南交通大学 用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法、纤维膜及用途
CN113943653A (zh) * 2020-07-16 2022-01-18 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 基于单宁酸的广谱性ctc捕获和分离基底及其制法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586189A (zh) * 2012-02-02 2012-07-18 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种循环肿瘤细胞特异性富集方法
CN105504301A (zh) * 2015-12-07 2016-04-20 复旦大学 一种树枝大分子—共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用
CN107669632A (zh) * 2017-09-30 2018-02-09 四川大学 一种药物载体、胶束、抗肿瘤和抗肿瘤细胞转移药物制剂、及其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586189A (zh) * 2012-02-02 2012-07-18 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种循环肿瘤细胞特异性富集方法
CN105504301A (zh) * 2015-12-07 2016-04-20 复旦大学 一种树枝大分子—共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用
CN107669632A (zh) * 2017-09-30 2018-02-09 四川大学 一种药物载体、胶束、抗肿瘤和抗肿瘤细胞转移药物制剂、及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEPHANIE DESHAYES等: "Phenylboronic acid-installed polymeric micelles for targeting sialylated epitopes in solid tumors", 《J AM CHEM SOC》 *
吴兴军: "pH响应型苯硼酸酯缀合物的制备、表征和智能释放研究", 《化学研究》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109752530A (zh) * 2019-01-31 2019-05-14 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司 一种液相细胞免疫鉴定方法及其应用
CN113943653A (zh) * 2020-07-16 2022-01-18 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 基于单宁酸的广谱性ctc捕获和分离基底及其制法与应用
CN112206325A (zh) * 2020-09-21 2021-01-12 温州医科大学附属眼视光医院 一种长眼表滞留人工泪液及其制备方法
CN112206325B (zh) * 2020-09-21 2022-11-18 温州医科大学附属眼视光医院 一种长眼表滞留人工泪液及其制备方法
CN113293615A (zh) * 2021-05-24 2021-08-24 西南交通大学 用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法、纤维膜及用途

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