CN103044528A

CN103044528A - 一种草莓镶脉病毒抗体及其抗原多肽、免疫原和应用

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Publication number: CN103044528A
Application number: CN2013100204485A
Authority: CN
Inventors: 肖文斐; 马升华; 阮松林; 柳爱春; 余红; 陈文岳; 裘劼人; 郑桂珍; 童建新; 忻雅; 王淑珍; 方献平; 来文国
Original assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: CN103044528B; CN103739675A; CN103739675B

Abstract

本发明公开了一种草莓镶脉病毒抗体及其抗原多肽、免疫原和应用。所述抗原多肽为多肽A或多肽B，其中多肽A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，多肽B的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述免疫原由所述抗原多肽和与其偶联的载体蛋白组成；所述草莓镶脉病毒抗体为抗体A或抗体B，其中抗体A由含有多肽A的所述免疫原制备获得，抗体B由含有多肽B的所述免疫原制备获得；所述应用为一种检测草莓镶脉病毒的试纸条或ELISA检测试剂盒。与现有技术相比，本发明的草莓镶脉病毒抗体能特异识别草莓镶脉病毒；试纸条和ELISA检测试剂盒制作简单，特异性强，灵敏性高。

Description

一种草莓镶脉病毒抗体及其抗原多肽、免疫原和应用

技术领域

本发明属于病毒免疫学检测及技术领域，尤其涉及一种草莓镶脉病毒抗体及其抗原多肽、免疫原和应用。

背景技术

草莓长期靠匍匐茎繁殖，易形成病毒病感染。多表现为斑驳、黄边、皱叶、镶脉等类型。草莓病毒病给草莓生产造成严重的经济损失，一般可使草莓减产高达20％～30％，并且使浆果的质量下降，果实变小，商品性变差。

草莓镶脉病病毒英文名称为Strawberry vein banding virus，简称SVBV，SVBV分类上属花椰菜花叶病毒科、花椰菜花叶病毒属，是一种粒子等轴状的双链DN病毒。它是我国草莓主栽区的主要感染病毒之一，单独侵染时症状不明显，复合侵染后叶脉皱缩，叶片扭曲，同时沿叶脉形成黄白色或紫色病斑，植株极度矮化，匍匐茎发生减少。SVBV以半持久性方式通过蚜虫或嫁接传播，在栽培品种上的带毒率可达21％，已成为危害我国草莓生产的4中主要病毒之一。

SVBV病毒粒子呈球形，大小约45-50nm。基因组长度约为8kb，包括7个基因开放阅读框(ORF)，其中ORF IV编码外壳蛋白，Pappu等和隋春都对SVBV的外壳蛋白设计PCR引物，检测了不同地区草莓中的SVBV，结果表明外壳蛋白在SVBV中的保守性较好，不同地区中SVBV病毒的外壳蛋白基因仅存在个别位点的变异。

目前对草莓镶脉病毒的鉴定方法有病毒指示植物鉴定法、电子显微镜镜检法和多聚酶链式反应(PCR)技术等，但上述方法通常实验耗时长，步骤复杂，同时检测需要配备昂贵的检测仪器，难以得到大范围的应用和推广。

胶体金试纸检测技术是一项近年快速发展的高通量技术，它的原理是植物汁液(由加样孔滴入)，经样品垫过滤处理后，样品病毒蛋白与标记物垫上的显色标记物发生免疫反应，然后层析到测试线(T线)发生特异性免疫反应，根据是否显色来判断样品是否感染病毒；未反应的显色标记蛋白复合物与控制线(C线)反应显色，确认试纸有效，残液被吸水垫吸收。反应实质为特异性免疫结合反应，胶体金(红色)为反应指示物。

胶体金免疫层析试纸条最大的优点在于检测成本低，操作极为简便，便于大规模推广。目前，国内已在玉米细菌性枯萎病、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、马铃薯X病毒和Y病毒的检测中成功应用，并取得了很好的效果，但在草莓上还未见相关应用的报道，且没有相关的快速检测试剂的研发。

发明内容

本发明提供了一种抗原多肽，利用该抗原多肽获得的多克隆抗体能特异灵敏地识别草莓镶脉病毒(SVBV)。

一种抗原多肽，为多肽A或多肽B，其中多肽A的氨基酸序列如SEQID No.1所示，多肽B的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述抗原多肽是以草莓镶脉病毒的外壳蛋白为靶蛋白，根据该外壳蛋白上的两个抗原优势表位设计合成的。其中多肽A对应了SVBV外壳蛋白N端(2-15)区域，多肽B对应了SVBV外壳蛋白C端(455-468)区域。

本发明还提供了一种免疫原，由所述抗原多肽和与其偶联的载体蛋白组成。其中，所述载体蛋白可选牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。优选牛血清白蛋白。

本发明还提供了一种草莓镶脉病毒抗体，为抗体A或抗体B，其中抗体A由含有多肽A的所述免疫原制备获得，抗体B由含有多肽B的所述免疫原制备获得。

将所述免疫原与佐剂混合并充分乳化后，进行动物免疫；获取免疫动物的抗血清，从抗血清中分离纯化获得所述草莓镶脉病毒抗体。该草莓镶脉病毒抗体能特异识别所述抗原多肽，即抗体A特异性识别多肽A，抗体B特异性识别多肽B。

获得所述草莓镶脉病毒抗体后，采用ELISA法测定其效价、反应特异性和敏感性。经间接ELISA检测，抗体A和抗体B都具有较好的特异性和灵敏度，因此可用于草莓镶脉病毒的检测。

从而，本发明提供了一种检测草莓镶脉病毒的试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的抗体A，所述反应膜包被有抗体B；或所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的抗体B，所述反应膜包被有抗体A。

所述反应膜通常是硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述标记物垫通常是玻璃纤维膜。所述试纸条还可装入塑料卡中制成检测卡。由于抗体A和抗体B分别识别SVBV外壳蛋白的不同抗原决定簇，因此可通过双抗体夹心法，利用所述试纸条对SVBV进行检测。

本发明还提供了一种含有所述草莓镶脉病毒抗体的检测试剂盒。

所述检测试剂盒优选为ELISA检测试剂盒。当采用双抗夹心法进行检测时，该ELISA检测试剂盒同时含有抗体A和抗体B，并以抗体A为包被抗体，以抗体B为检测抗体；或以抗体B为包被抗体，以抗体A为检测抗体。

当采用间接ELISA法进行检测时，该ELISA检测试剂盒含有抗体A或抗体B，并以抗体A或抗体B为一抗，以能特异识别抗体A或抗体B的酶标抗抗体为二抗。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的草莓镶脉病毒抗体能特异性识别草莓镶脉病毒外壳蛋白，可准确检测样品中草莓镶脉病毒的水平，具有高特异性、高敏感性的特点；

(2)本发明的试纸条和检测试剂盒制作成本低，能简便快速地对草莓镶脉病毒进行检测，可加以大规模推广。

附图说明

图1为实施例2中部分间接ELISA检测结果图；

图2为本发明胶体金检测试纸条的结构示意图。

具体实施方式

实施例1草莓镶脉病病毒抗体的制备

(1)抗原免疫

分析研究草莓镶脉病病毒外壳蛋白的序列，选取两个抗原优势表位，采用固相合成法合成了两种多肽，其氨基酸序列分别如下：

多肽A：SSRRERLEQLFEEDC；多肽A的前14个氨基酸与SVBV外壳蛋白N端(2-15)氨基酸相同，为了便于与载体蛋白交联，在多肽A的C端最末端添加了一个半胱氨酸C；

多肽B：CESSSDESDDSTDLE；多肽B的后14个氨基酸与SVBV外壳蛋白C端(455-468)氨基酸相同，为了便于与载体蛋白交联，在多肽B的N端添加了一个半胱氨酸C；

将多肽A和多肽B分别与牛血清白蛋白(BSA)进行交联(戊二醛法)，获得免疫原；将免疫原与弗氏完全佐剂(FCA)等体积混合并充分乳化，静脉注射免疫家兔，第一次免疫后21天进行第二次免疫；此后每隔14天再加强免疫一次，共免疫注射四次，注射量为0.5mL/次；第四次免疫一周后，对免疫家兔进行颈动脉放血法采血；将全血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时，待血液凝固、血块收缩后，用毛细滴管吸取血清；于3000rpm离心15分钟，上清即为抗血清；分装后置4℃冰箱中保存备用。

下面以抗体B为例，详细说明从抗血清中获取抗体的方法，抗体A的获取方法与之相同。

(2)亲和纯化

1)将多肽B交联到SulfoLink柱料上，用半胱氨酸封闭；

2)用20mL PBS(50mM，pH 7.4)以60mL/h流速预处理亲合纯化柱；

3)将10mL抗血清用PBS(50mM，pH 7.4)稀释至20mL，重复上样一次；

4)再用30mL PBS(50mM，pH 7.4)以60mL/h流速清洗纯化柱；

5)最后用0.1M的glycine-HCl(pH 3.0)洗脱抗体B，调节pH至7.4；

(3)透析除盐

将装有抗体B(以2mL抗体B为例)的透析袋置于1×PB Buffer透析液中，4℃静止透析，每8小时换液一次，换液5次(共1000mL)后透析完成，调节抗体B浓度至1mg/mL，备用。

实施例2抗体测定

利用抗原多肽采用ELISA法定抗体的效价、反应特异性和敏感性，同时以PCR检测为阳性的草莓植株作为阳性对照，PCR检测为阴性的草莓植株作为阴性对照，1μg/mL BSA为空白对照。下面以多肽B+抗体B为例，对具体检测方法进行详细说明。

(1)抗原包被

1)取1g试样(阳性对照和阴性对照植株的叶片)，加样品提取包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)10mL匀浆，双层纱布过滤，用包被缓冲液将匀浆稀释至浓度为200μL/mL；将多肽B稀释至浓度为1μg/mL，备用；

2)取步骤1)中获得的各抗原稀释液0.1mL，加入酶标板反应孔中，4℃过夜反应；

3)弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST(1×PBS+Tween-20)洗板3次，每次洗3min；

每升PBST洗涤缓冲液含Na₂HPO₄1.12g、KH₂PO₄0.20g、KCl 0.20g、NaCl 8.0g、Tween-200.5g，调节pH至7.4；

(2)封闭

1)每孔加入0.2mL封闭液，25℃放置2h；

封闭液的配方为：每升封闭液含Na₂HPO₄1.15g、KH₂PO₄0.20g、KCl0.20g、NaCl 8.0g、Na₂SO₃1.3g、聚乙烯吡咯烷酮K3020g、Tween-2020g，2g鸡蛋清粉或牛血清蛋白，调节pH 7.4；

2)每孔加0.25mL洗涤缓冲液PBST洗涤3～5次；

(3)加抗体

1)用抗体稀释缓冲液按1∶100～1∶10000梯度稀释抗体B；每孔加0.1mL，置湿盒中，25℃放置2h；

抗体稀释缓冲液的配方为：每升抗体稀释缓冲液含Na₂HPO₄1.12g、KH₂PO₄0.20g、KCl 0.20g、NaCl 8.0g、聚乙烯吡咯烷酮K3010g、Tween-2010g，调节pH至7.4；

2)用洗涤缓冲液PBST洗板3次，每次洗3min；

(4)加酶标抗体

1)用酶标缓冲液按说明稀释酶标抗体(碱性磷酸酶AP标记亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)二抗，购自美国jackson公司)，于各反应孔中加入经稀释的酶标抗体0.1mL，室温放置2h；

酶标缓冲液的配方为：每升酶标缓冲液含Na₂HPO₄1.12g、KH₂PO₄0.20g、KCl 0.20g、NaCl 8.0g、牛血清蛋白2.0g、聚乙烯吡咯烷酮K3020g、Tween-200.5g，调节pH至7.4；

2)用洗涤缓冲液PBST洗板3次，每次洗3min；

(5)显色

1)配制底物缓冲液，配方为：每升含0.1g MgCl₂·6H₂O、97mL二乙醇胺，蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至9.6～9.8；

临用前每5mL底物缓冲液中加1片pNPP底物片剂(5mg/片，美国agdia公司)溶解；

2)于各反应孔中加入现配的pNPP底物溶液0.1mL，室温下避光放置孵育至阳性对照和阳性样品显黄色；

(6)终止反应

各反应孔中加入0.1mL终止液氢氧化钠(3mol/L)，终止反应；

(7)结果判定

将酶标板放于酶标仪上，于405nm读取吸光度数值。以待检样本OD405值与空白对OD405值比值(P/N)作为判定标准。若P/N比值≥3，则判定为阳性，反之为阴性。目测时，阳性样品显黄色；而阴性样品无色透明(图1)。间接法ELISA检测结果如表1所示。

表1草莓镶脉病毒间接法ELISA部分检测结果

OD405	抗体A-1	抗体A-2	抗体A-3	平均值	P/N
						多肽P1	3.281	3.330	3.360	3.324	23.445
多肽P2	0.158	0.125	0.123	0.135	0.954
						阳性植株(8-1)	0.781	0.749	0.900	0.810	5.712
阴性植株(7-5)	0.215	0.186	0.197	0.199	1.406

空白	0.133	0.141	0.152	0.142
							抗体B-1	抗体B-2	抗体B-3
多肽P1	0.295	0.357	0.387	0.346	1.310
						多肽P2	3.220	3.331	3.144	3.232	12.231
阳性植株(8-1)	1.076	1.037	1.080	1.064	4.029
						阴性植株(7-5)	0.265	0.283	0.297	0.282	1.066
空白	0.254	0.267	0.271	0.264

由表1可见，经间接ELISA检测，抗体A和抗体B都具有较好的特异性和灵敏度，与特异性多肽及带病毒阳性植株都有较好的反应。

实施例3双抗夹心ELISA试验

利用双抗夹心ELISA法检测样品中的SVBV感染情况，同时以PCR检测为阳性的草莓植株作为阳性对照，PCR检测为阴性的草莓植株作为阴性对照，1μg/mL BSA为空白对照。下面以抗体A+酶标抗体B为例，对具体检测方法进行详细说明。

(1)碱性磷酸酶(AP)标抗体制备

1)取抗体B(2mg/mL)1mL，加入AP 5mg溶解；

2)装入透析袋，用0.01mol/L、pH 7.2的PBS于4℃透析18h，换液3次；

3)加入2.5％戊二醛20μL，室温(20℃左右)放置2h；4℃下0.01mol/L、pH 7.2的PBS透析过夜，换液3次；

4)移入0.05mol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次；

5)取出标记抗体，用含1％BSA和0.02％叠氮钠的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标抗体原液；

6)每毫升酶标抗体原液加入40％甘油，小量分装，4℃保存。

(2)抗体包被

1)用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)将抗体A按1∶100～1∶10000梯度稀释；

2)取步骤1)中获得的抗体稀释液0.1mL，加入酶标板反应孔中，4℃过夜；

(3)加样

1)取1g试样(待测草莓叶片，同时取阳性对照和阴性对照植株的叶片)，加样品提取液(GEB)10mL匀浆，双层纱布过滤，用包被缓冲液将匀浆稀释至浓度为200μL/mL；

每升GEB含Na₂HPO₄1.12g、KH₂PO₄0.20g、KCl 0.20g、NaCl 8.0g、Na₂SO₃1.3g、聚乙烯吡咯烷酮K3020g、Tween-20 20g/L，调节pH至7.4。

2)取步骤1)中获得的样品稀释液0.1mL，加入酶标板反应孔中，置湿盒中，25℃放置2h；

(4)加酶标抗体

1)用酶标缓冲液按1∶100～1∶10000梯度稀释步骤(1)制备的酶标抗体B，于各反应孔中加入经稀释的酶标抗体0.1mL，室温放置2h；

2)用洗涤缓冲液PBST洗板3次，每次洗3min；

(5)显色

(6)终止反应

各反应孔中加入0.1mL终止液氢氧化钠(3mol/L)，终止反应；

(7)结果判定

将酶标板放于酶标仪上，于405nm读取吸光度数值。以待检样本OD405值与空白对OD405值比值(P/N)作为判定标准。若P/N比值≥3，则判定为阳性，反之为阴性。目测时，阳性样品显黄色；而阴性样品无色透明。

(8)样品检测结果

2012年我们对草莓红颊组培脱毒苗的瓶苗及移栽到基质中的培育过1个月的幼苗均进行了抽检(随机抽检瓶苗100份，幼苗80份)，利用本方法在组培苗中并未检出草莓镶脉病毒(SVBV)；同时检测了种植多代的草莓样品37份，检测出携带草莓镶脉病毒的样品13份。

表2草莓镶脉病毒双抗夹心法ELISA部分检测结果

OD405	重复1	重复2	重复3	平均值	P/N
						阳性样品	1.076	1.037	1.080	1.064	7.496
阴性样品	0.133	0.141	0.152	0.142	1.000
						组培脱毒苗1	0.158	0.125	0.123	0.135	0.952
组培脱毒苗2	0.181	0.230	0.260	0.224	1.576
						组培脱毒苗3	0.206	0.229	0.141	0.192	1.350
组培脱毒苗4	0.155	0.166	0.175	0.165	1.163
						组培脱毒苗5	0.195	0.257	0.287	0.246	1.733
多代苗1	1.237	1.234	1.276	1.249	8.793
						多代苗2	1.154	1.167	1.171	1.164	8.199
多代苗3	0.226	0.278	0.229	0.244	1.718
						多代苗4	1.302	1.281	1.206	1.263	8.894
多代苗5	0.220	0.231	0.144	0.198	1.396
						多代苗6	1.085	1.116	1.093	1.098	7.734

实施例4胶体金检测试纸条的制备

下面以抗体B为胶体金标记抗体，以抗体A为硝酸纤维素膜检测区抗体，详细介绍胶体金检测试纸条的制备方法。

(1)胶体金垫的制备

1)以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径35nm的胶体金溶液，制备完成后取100mL胶体金溶液于烧杯内，用0.1M的K₂CO₃调至pH 9.0；

2)加入1.0mL抗体B(浓度为1mg/mL)，室温搅拌30min，加入重量百分比为10％的牛血清白蛋白封闭30min；

3)12000r/min、4℃离心30min，弃上清，用胶体金溶液复溶至100mL，按1mL溶液铺40cm的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30min，制成胶体金垫。

(2)硝酸纤维素膜的包被

1)用0.01M磷酸缓冲液(pH 8.0)将抗体A稀释成0.1mg/mL的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以1.5μL/cm的参数进行划线；

2)将可与上述胶体金标记的草莓镶脉病毒抗体特异性结合的山羊抗兔IgG二抗抗体(上海捷宁生物科技有限公司)溶解在用0.01M磷酸缓冲液(pH 8.0)配制成0.06mg/mL的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜另一端以1.5μL/cm的参数进行划线；

3)划线后在室温下干燥8h，分别得到检测线(T线)和质控线(C线)。

(3)检测试纸的组装

如图2所示，在干燥室内(温度20-25℃，湿度小于30％)将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。

实施例5样品试验

(1)取待测草莓叶片按1∶10(W/V)加入样品提取缓冲液用消毒的研钵研磨后，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品；

样品提取缓冲液的配方为：每升样品提取缓冲液含Na₂HPO₄1.12g、KH₂PO₄0.20g、KCl 0.20g、NaCl 8.0g、牛血清蛋白2.0g、聚乙烯吡咯烷酮K30 20g、Tween-200.5g，调节pH至7.4；

(2)室温下将检测试纸有胶体金复合物的一端插入200μL的待测植物样品提纯液中，注意样品液面不要超过试纸条上的MAX线；

(3)肉眼观测30min，观察记录C线和T线的显色情况。

若T线和C线均显色，判定为阳性；若T线不显色，C线显色，判定为阴性；若T线和C线均不显色，则测试失败。

收集草莓样品37份，其中ELISA试剂(以抗体A为包被抗体，以抗体B为检测抗体)检测出阳性样品13份，试纸条(胶体金标记抗体为抗体B，T线含有抗体A)检测出阳性样品12份，具体结果如下表2所示。

表2试纸条与ELISA对草莓样品的检测结果

检测方法	阳性样品数	阴性样品数	总样品数
				ELISA	13	24	37
试纸条	12	25	37

由表2可见，试纸条与ELISA比较，灵敏度＝12/13＝92.3％，特异性＝25/24＝104.2％。表明本发明的胶体金检测试纸条与ELISA试剂盒的特异性和灵敏度均较高，能对草莓镶脉病毒进行简便快速的检测。

Claims

1.一种抗原多肽，其特征在于，为多肽A或多肽B，其中多肽A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，多肽B的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种免疫原，其特征在于，由权利要求1所述的抗原多肽和与其偶联的载体蛋白组成。

3.如权利要求2所述的免疫原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。

4.如权利要求3所述的免疫原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

5.一种草莓镶脉病毒抗体，其特征在于，为抗体A或抗体B，其中抗体A由含有多肽A的权利要求2～4任一所述的免疫原制备获得，抗体B由含有多肽B的权利要求2～4任一所述的免疫原制备获得。

6.一种检测草莓镶脉病毒的试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，其特征在于，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的权利要求5所述的抗体A，所述反应膜包被有权利要求5所述的抗体B；

或所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的权利要求5所述的抗体B，所述反应膜包被有权利要求5所述的抗体A。

7.一种含有如权利要求5所述草莓镶脉病毒抗体的检测试剂盒。

8.如权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，其为ELISA检测试剂盒。