CN111170910B - 姜黄素对称衍生物及其制备和在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗癌化疗药物领域，具体公开了一种全新结构的姜黄素对称衍生物，本发明还提供了所述的化合物的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。实验证明，本发明的全新结构的化合物具有极高的负载效率与优异的毒性选择性。

Description

姜黄素对称衍生物及其制备和在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体提供了一种全新的抗癌活性药物。

背景技术

姜黄素(CUR)是一种从姜黄中分离出来的植物化学物质，具有抗肿瘤作用，其可能与核转录因子NF-kβ和蛋白激酶C相互作用，最终导致细胞凋亡。CUR因其对膀胱癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤癌等具有广泛抗肿瘤效果，并对正常组织细胞毒性低，引起了极大的用于癌症治疗的研究兴趣。体外和临床前实验表明，姜黄素的抗癌活性非常有前景。然而，姜黄素的药代动力学性质差，仍然受到低水溶性、快速代谢、快速消除和低生物利用度的限制，而常规通过脂质体或聚合物等包封CUR制成纳米粒虽能一定程度上延长体循环而提高生物利用度，但负载效率并不令人满意，一般外部聚合物载体占据主要组分，而药物含量相对非常低，大多数姜黄素纳米粒载药量在10％左右，需要大量的赋形剂材料来包封药物达成有效负载，而关于赋形剂相关毒性、代谢、降解仍然存在问题，不仅如此，姜黄素的毒性选择性也不理想。

发明内容

为解决药物姜黄素现存的应用问题，本发明第一目的在于，提供了一种全新的姜黄素对称衍生物，旨在提高毒性选择性，改善载药效率。

本发明的第二目的在于，提供了所述的姜黄素对称衍生物的制备方法。

本发明的第三目的在于，提供了所述的姜黄素对称衍生物在抗肿瘤方面的肿瘤选择毒性作用。

本发明的第四目的在于，提供了一种采用所述的姜黄素对称衍生物制得的肿瘤药物。

一种姜黄素对称衍生物，具有式1所示结构：

本发明提供了一种全新的具有全对称结构的姜黄素活性衍生物，通过分子结构的相互作用，可以出人意料地选择性毒杀肿瘤细胞，且对正常细胞毒性较小，具有优异的毒性选择性；此外，还具有良好的生物利用度以及实现人为调控释放等特点；不仅如此，在制剂方面，还可以大大的提高载药量，减少赋形剂的使用。

本发明还提供了所述的姜黄素对称衍生物的制备方法，由姜黄素和式2化合物在酯化反应得到；

本发明研究还发现，控制酯化过程的姜黄素和式2化合物的比例以及浓度，有助于进一步改善目的产物的选择性和收率。

作为优选，姜黄素和式2化合物的摩尔比大于或等于2.2。

作为优选，酯化反应起始溶液中，姜黄素的浓度为2.2nmol/mL～22nmol/mL。

本发明中，所述的反应溶剂为可以溶解所述原料的溶剂，例如为二氯甲烷。

作为优选，酯化过程添加有羧基活化剂和催化剂。

作为优选，所述的羧基活化剂优选为EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、DCC/NHS、EDC/NHS中的至少一种。

作为优选，所述的催化剂优选为DMAP(4-二甲氨基吡啶)。

作为优选，所述的羧基活化剂优选为姜黄素摩尔量的2～3倍，进一步优选为2.7倍。

作为优选，所述的催化剂优选为姜黄素摩尔量的0.1～0.3倍，进一步优选为0.2倍。

作为优选，式2化合物由3-巯基丙酸与无水丙酮在三氟乙酸的催化下发生反应得到。

将反应液纯化，获得所述的目的产物，所述的纯化步骤例如为预先对反应液进行透析(初步脱出小分子)以及对透析的产物进行色谱纯化处理。

所述的色谱纯化的洗脱液例如为CH₂Cl₂和MeOH(V/V＝93～96:4～7)。

本发明优选的制备方法，包括以下步骤：

(1)式2的合成

将无水3-巯基丙酸(5.31g,50mmol)和无水丙酮(5.81g,100mmol)加入25mL三颈烧瓶中，然后用2滴TFA催化。30℃下搅拌2h后，将烧瓶置于冷却的冰浴中进行产物结晶过夜。抽滤过滤晶体，用正己烷和冷水冲洗。在真空烘箱中干燥得到白色产物。

(2)CUR₂-TK的合成

将CUR(姜黄素，80.0mg,0.22mmol)溶解在20mL CH₂Cl₂，然后加入缩硫酮TK(25.2mg，0.1mmol)，EDC·HCl(76.8mg，0.40mmol)和DMAP(2.5mg，0.02mmol)。30℃下搅拌1h。之后，加入EDC·HCl(38.4mg，0.20mmol)和DMAP(2.5mg，0.02mmol)，并在相同条件下搅拌反应24h。反应后，旋转蒸发有机溶剂，再溶于5mL DMSO与15mL纯水中，使用透析膜(500D,MWCO)透析48h出去小分子杂质，反应产物以CH₂Cl₂和MeOH(V/V＝95:5)为洗脱液，用硅胶柱层析法纯化，冻干得到深红色产物。

本发明还提供了一种所述的姜黄素对称衍生物在制备抗癌药物中的应用。

本发明研究发现，得益于所述的对称衍生结构，其对肿瘤细胞具有特异的选择性毒性，且对正常细胞的毒性较小，不仅如此，还有助于提升生物利用度以及利于制剂和包封。

作为优选，本发明所述的应用，采用所述姜黄素对称衍生物作为活性成分或前药，配合药学上可接受的赋形剂，制得用于抗癌的医学上可接受的药物制剂；所述的药物制剂为注射液、粉针剂、口服用片剂、胶囊剂和颗粒剂中的至少一种。

本发明还提供了一种抗癌药物，包含药学有销量的所述的姜黄素对称衍生物。

优选的抗癌药物，包含包封有所述姜黄素对称衍生物的纳米颗粒。

本发明中，可以采用现有物料以及方法，将本发明所述的姜黄素对称衍生物进行包封，制得纳米颗粒药物。

优选地，所述的纳米颗粒为利用聚合物包封有姜黄素对称衍生物的颗粒。

作为优选，所述的纳米颗粒的制备方法例如为：

将本发明所述的姜黄素对称衍生物溶解得溶液A，将PEG-PLGA溶解得溶液B；将溶液A和B混合，然后滴加在聚乙烯醇溶液C中，随后挥发溶剂、分离得到所述的纳米颗粒。

所述的溶液A中的溶剂例如为DMSO。

所述的溶液B中的溶剂例如为DCM。

所述的聚乙烯醇溶液C例如为PVA的水溶液，其浓度例如为0.2～2w/v。

(CUR₂-TK)-Polymer NPs)的制备：分别将30mg CUR₂-TK溶解在0.3ml DMSO中，10mgPEG-PLGA溶解在1ml二氯甲烷中，然后将二者混合后逐滴加入5ml聚乙烯醇(PVA)溶液(1％w/v)中，使用超声液体破碎仪(SONICS-VCX500，35％AMP)超声混合3min，再加入40ml 0.1％PVA溶液中，600rpm磁力搅拌4h，挥发有机溶剂，10000rpm低温离心15min，洗涤3次，收集(CUR₂-TK)-Polymer NP纳米粒子，冻干24h，产物NPs储存在-20℃冰箱。

本发明所述的药物，还包含药学上可接受的辅料，例如为赋形剂。

本发明所述的药物的剂型，可以是医学上可接受的任意药物制剂；例如为注射液、粉针剂口服用片剂、胶囊剂和颗粒剂中的至少一种。

有益效果

1、提供了一种全新的具有对称结构的姜黄素对称衍生物。本发明还发现，该特殊结构的化学物具备优异的选择毒性，其对肿瘤细胞具有优异毒性，而对于正常细胞毒性较低。本发明所述的全新结构的化合物具备对肿瘤细胞的特定选择毒性，降低了药物全身毒性，有效减少姜黄素应用中的副作用。

2、本发明所述全新结构的化合物，在制剂方面，能够显著改善包封载药量，其载药包封率可从常规姜黄素微球10％左右的载药量提高到了60％以上，减少了赋形剂的使用。

3、所述的全新的化合物，可以通过ROS实现控制释放能力，且有效改善了姜黄素的生物利用度。

附图说明

图1是CUR₂-TK的FT-IR、UV-vis、HPLC和荧光图

图2是CUR₂-TK的H NMR谱图

图3是CUR₂-TK的Mass谱图

图4是(CUR₂-TK)PEG-PLGANPs的SEM、TEM图

图5是不同投料比下(CUR_2-TK)PEG-PLGANPs的载药量、包封率、粒径、多分散系数变化

图6是H₂O₂触发的CUR₂-TK降解的HPLC图

图7是SKOV3、A549、IOSE细胞的ROS水平荧光图

图8是CUR₂-TK相较于CUR对不同ROS水平的细胞毒性的变化

具体实施方式

为了更好地阐述本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1：式2(TK)的合成

合成反应式为：

将无水3-巯基丙酸(5.31g,50mmol)和无水丙酮(5.81g,100mmol)加入25mL三颈烧瓶中，然后用2滴TFA催化。30℃下搅拌2h后，将烧瓶置于冷却的冰浴中进行产物结晶。过滤晶体，用正己烷和冷水冲洗。在真空烘箱中干燥得到白色产品。

实施例2：(CUR₂-TK，式1)的合成

CUR₂-TK的合成反应式见反应式2：

将CUR(80.0mg,0.22mmol)溶解在20Ml CH₂Cl₂，然后加入接头TK(式1，25.2mg，0.1mmol)，EDC·HCl(76.8mg，0.40mmol)和DMAP(2.5mg，0.02mmol)。30℃下搅拌1h。之后，加入EDC·HCl(38.4mg，0.20mmol)和DMAP(2.5mg，0.02mmol)，并在相同条件下搅拌反应24h。反应后，旋转蒸发有机溶剂，再溶于5mL DMSO与15mL纯水中，使用透析膜(500D,MWCO)透析48h出去小分子杂质，反应产物以CH₂Cl₂和MeOH(V/V＝95:5)为洗脱液，用硅胶柱层析法纯化，冻干得深红色产物，并将最终产物CUR₂-TK储存在-20℃冰箱。

CUR₂-TK的UV-vis、荧光光谱、FT-IR、HPLC的谱图图1所示。

通过FT-IR，UV-vis吸收，荧光光谱和HPLC分析鉴定CUR₂-TK共轭物的化学结构。首先，FTIR光谱证实了CUR₂-TK共轭物的形成。如FTIR光谱(图1c)所示，在1627cm^-1附近的峰与羰基的C＝O延伸有关。1592、1507和1429cm^-1附近的峰是由于苯环的C＝C拉伸振动引起的。在此，在CUR₂-TK的光谱中，在1730cm^-1处出现了新的吸收峰，这是由于通过酯键的形成引起的C＝O拉伸振动。此外，与游离CUR在435nm处的特征性UV-vis吸收峰相比，在413nm下CUR₂-TK共轭物的UV-vis吸收光谱中观察到约22nm蓝移(图1a)，DMSO中CUR₂-TK的最大荧光发射峰(图1b)与游离CUR相比，在荧光发射光谱中显示出7nm红移。这可能是由于CUR分子之间通过缩硫酮进行偶联而引起的。通过硅胶柱层析法纯化的产物HPLC如图1d所示，显示出较高纯度。

CUR₂-TK的H NMR谱图见图2。CUR₂-TK的Mass谱图见图3。

通过HNMR谱(图2)与质谱(图3)进一步证实产物结构。在CUR₂-TK偶联物的光谱中，在6至8ppm之间的区域中发现了CUR芳族基团的多个特征性质子共振峰。2.5ppm为氘代DMSO溶剂峰，3.3ppm为水峰，而作为插入的中间连接基团的TK接头的特征峰由原来的1.53ppm和2.74ppm偏移到了1.62ppm和2.92ppm处，这些结果证明了所得产物的成功合成。此外，在质谱分析结果中可以找到952.8322与953.8328，这与MS m/z十分吻合：对于C₅₁H₅₂O₁₄S₂(CUR₂-TK)[M+H]＝953。该结果进一步证实了通过单个TK在两个CUR分子之间的成功合成。所有以上结果证实了CUR₂-TK聚合物前药的成功合成，其可以进一步用作构建具有高载药量的ROS响应型CUR递药系统的重要组成单元。

实施例3：(CUR₂-TK)-Polymer纳米粒子的制备。

(CUR₂-TK)-Polymer NPs制备：分别将30mg CUR₂-TK溶解在0.3ml DMSO中，(60、30、15、10)mg PEG-PLGA溶解在1ml二氯甲烷中(CUR₂-TK：PEG-PLGA＝1:2、1:1、2:1、3:1)，然后将二者混合后逐滴加入5ml聚乙烯醇(PVA)溶液(1％w/v)中，使用超声液体破碎仪(SONICS-VCX500，35％AMP)超声混合3min，再加入40ml 0.1％PVA溶液中，600rpm磁力搅拌4h，挥发有机溶剂，10000rpm低温离心15min，洗涤3次，收集(CUR₂-TK)-Polymer NP纳米粒子，冻干24h，产物NPs储存在-20℃冰箱。

实施例4：对实施例3制得的载药系统的形态、粒径及分布等进行表征。

采用马尔文粒度分析zeta电位仪对粒径大小和多分散指数(PDI)进行表征；采用扫描电镜、透射电镜研究纳米粒子形态，形态是否球形，尺寸是否均匀；考察聚合物分子结构和载药纳米粒子制备条件对纳米粒子粒径的影响，通过控制调节载药制备条件对粒径进行调控；考察不同投料比下载药量、包封率，取冷冻干燥载药纳米粒加入二氯甲烷后进行破乳，待破乳完成后进行离心，取离心的破乳上清液采用紫外分光光度计测得纳米粒中药物的吸光值(OD值)。再按照已经绘制好的药物的标准曲线计算出药物的浓度，计算出纳米粒中药物的包封率。载药量的测定即对纳米粒溶液进行离心后，将其上清液按照上述方法进行紫外分光光度计检测，再计算载药量。

(CUR₂-TK)PEG-PLGANPs的SEM、TEM图见图4

通过溶剂挥发法制备了一些列大小均一的(CUR₂-TK)PEG-PLGANPs，其扫描电镜(SEM)与透射电镜(TEM)如图4所示，表现为规则的球形，尺寸分布均匀。

不同投料比下(CUR_2-TK)PEG-PLGANPs的(a)载药量、(b)包封率、(c)粒径、(d)多分散系数变化见图5。

通过不同的CUR₂-TK：PEG-PLGA投料比考察微球的各项参数，当(CUR₂-TK)PEG-PLGANPs需要进一步的临床应用时，药物的封装效率和负载量很重要。在此，CUR₂-TK的载药量在CUR₂-TK：PEG-PLGA＝3：1时为约61±2.9％(图5a)，远大于常规CUR PEG-PLGANPs的10％左右的载药量，药物的包封率随CUR₂-TK的比重增大而降低(图5b)，在CUR₂-TK：PEG-PLGA＝3：1时降低到80±3.84％，可得出随着CUR₂-TK药物的占比增加包封效率逐渐变差；

图5c与5d为DLS测得的微球的水合粒径大小与多分散系数(PDI)，可观察到微球的水合粒径随着CUR₂-TK占比的增加而增大，由1:2时的48±3.2nm逐渐增大到3:1时的171±5.8nm，50～200nm的粒径能通过EPR效应有效在肿瘤部位积聚，多分散系数稳定在0.2～0.3之间，代表微球大小较为均一。

实施例5：CUR₂-TK的ROS响应

测试在生物剂量ROS即100mM H₂ O₂存在下，HPLC用于监测硫缩酮的裂解和CUR从CUR₂-TK的水解。采用流动相为乙腈与0.5％冰醋酸进行梯度洗脱：0～8分钟乙腈浓度由44％上升到52％；8～15分钟乙腈浓度维持52％；15到18分钟乙腈由52％降回44％；流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长为415nm，用于检测100mM H₂ O₂与100μg/mL CUR₂-TK共孵育0～24h内吸光度的变化。

结果如图6所示。

CUR₂-TK在10.3min的洗脱时间上呈现出单分散峰。在最初的4h内，洗脱时间为10.3min的峰急剧下降，并在12h内完全消失。同时，在8.4min的洗脱时间出现了一个新峰，该峰属于CUR。该现象表明CUR₂-TK在ROS作用下能降解成CUR单体。

H₂O₂触发CUR₂-TK降解发生在以下三个步骤中：(i)将硫代缩酮连接基裂解为两个巯基；(ii)将磺酰基氧化为亲水性磺酸；(iii)释放活性CUR分子。

实施例6：细胞中的ROS生成

我们通过ROS敏感荧光探针2'，7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)检测人卵巢上皮细胞IOSE、人卵巢癌细胞SKOV3、人肺癌细胞A549中ROS的生成水平。DCFH-DA通过被ROS迅速氧化为荧光分子(二氯荧光素，DCF)来实现ROS水平检测。如图7所示：

结果表明：当将IOSE细胞与100μM DCFH-DA孵育30min时，观察到的荧光较暗，然而，当100μM DCFH-DA与A549细胞、SKOV3细胞孵育后，可见较明显的绿色荧光，且SKOV3细胞ROS水平相比A549较高。该结果表明肿瘤细胞活性氧含量水平(约10^-6M)远高于正常组织细胞(约10^-9M)，肿瘤细胞具备更强的解聚CUR₂-TK成单体的能力。

实施例7：CUR₂-TK体外细胞水平抗癌性能研究

CUR₂-TK抗肿瘤活性实验以高ROS水平的非小细胞肺癌细胞A549与人卵巢癌细胞SKOV3作为阳性细胞，以低ROS水平的人卵巢上皮细胞IOSE作为阴性细胞，与CUR单体进行细胞毒性对比，根据细胞计数结果，用完全培养基将细胞稀释至10万个/mL，每组以每孔1万(100μL)个细胞，将96孔板放入细胞培养箱中培养24h，弃去原培养基，按分组加入含不同浓度(3.12、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)的CUR、CUR₂-TK药物(为方便对比，CUR₂-TK的浓度按相当于其组分中CUR单体的浓度计算，即736/952)溶于1％DMSO的不完全培养基。继续培养24或48h后，弃去培养液，以每孔100μL加入MTT(0.5mg/ml)使用液，放入细胞培养箱中培养4h后，出现紫色结晶，弃去MTT溶液，以每孔150μL加入DMSO溶液，继续培养10分钟至结晶溶解，用酶标仪在490nm处检测其OD值，计算细胞存活情况如图8所示。

如图8b所示，正常细胞IOSE体现出较低的CUR₂-TK敏感性，在同CUR浓度下CUR₂-TK的杀伤作用明显低于CUR单体，这可能是因为CUR特殊的对称结构在合成CUR₂-TK后减少了官能团结合位点从而降低药效，而正常细胞低的ROS水平无法有效降解CUR₂-TK式1化合物，蓝色组为CUR₂-TK式1化合物与H₂O₂孵育解聚后再给药，发现细胞毒性接近CUR单体，进一步验证了CUR₂-TK对IOSE的低毒性是基于ROS水平过低无法有效解聚(图8b)；A549与SKOV3的MTT实验显示出CUR₂-TK与CUR接近的细胞毒性(图8a、图8c)，且随着孵育时间的延长CUR₂-TK与CUR单体的毒性差距缩小，说明了癌细胞自身的ROS水平随时间的增加能有效解聚CUR₂-TK恢复毒性(图8c、图8d)；图8e为3种细胞在不同CUR₂-TK浓度下的细胞存活率，表明癌细胞A549、SKOV3对CUR的耐受强于正常细胞IOSE；图8f为相同CUR浓度下CUR₂-TK给药后相较于CUR单体给药后细胞的存活率比值，可以发现对于癌细胞A549与SKOV3,在低浓度下CUR₂-TK与CUR单体给药下的细胞存活率比非常接近趋近于1，说明CUR₂-TK解聚充分，在高浓度下CUR₂-TK的杀伤作用渐渐低于CUR单体，说明ROS的水平不够完全解聚。而正常细胞IOSE体现出对CUR₂-TK的不敏感性，在25μg/mL浓度时CUR₂-TK给药下的细胞生存率达到了CUR给药下的3倍左右，表明CUR₂-TK对正常细胞的毒性小于CUR单体。这些都充分说明了CUR₂-TK的细胞毒性具有基于ROS水平的选择性，这与构成其单元的CUR的对称结构有关，因此CUR₂-TK可能是优秀的具备肿瘤选择性杀伤的抗癌前药。

以上实施例为本发明的优选实施方式，仅用于说明本发明的技术方案而非限制，应当理解在不脱离本发明原理的范围内还存在多种替换方案，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (12)

1.一种姜黄素对称衍生物，其特征在于，具有式1所示结构：

2.如权利要求1所述的姜黄素对称衍生物的制备方法，其特征在于，由姜黄素和式2化合物在酯化反应得到；

3.如权利要求2所述的姜黄素对称衍生物的制备方法，其特征在于，姜黄素和式2化合物的摩尔比大于或等于2.2。

4.如权利要求2所述的姜黄素对称衍生物的制备方法，其特征在于，酯化反应起始溶液中，姜黄素的浓度为2.2nmol/mL～22nmol/mL。

5.如权利要求2所述的姜黄素对称衍生物的制备方法，其特征在于，酯化过程添加有羧基活化剂和催化剂；

所述的羧基活化剂为EDC·HCl、DCC/NHS、EDC/NHS中的至少一种；

所述的羧基活化剂为姜黄素摩尔量的2～3倍；

所述的催化剂为DMAP；

所述的催化剂为姜黄素摩尔量的0.1～0.3倍。

6.如权利要求2所述的姜黄素对称衍生物的制备方法，其特征在于，式2化合物由3-巯基丙酸与无水丙酮在三氟乙酸的催化下发生反应得到。

7.一种权利要求1所述的姜黄素对称衍生物在制备抗癌药物中的应用，所述的抗癌药物为抗卵巢癌药物或抗肺癌药物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，采用所述姜黄素对称衍生物作为活性成分或前药，配合药学上可接受的赋形剂，制得用于抗癌的医学上可接受的药物制剂；所述的药物制剂为注射液、粉针剂、口服用片剂、胶囊剂和颗粒剂中的至少一种。

9.一种抗癌药物，其特征在于，包含药学有效量 的权利要求1所述的姜黄素对称衍生物。

10.如权利要求9所述的抗癌药物，其特征在于，包含包封有所述姜黄素对称衍生物的纳米颗粒。

11.如权利要求10所述的抗癌药物，其特征在于，所述的纳米颗粒为利用聚合物包封有姜黄素对称衍生物的颗粒；

所述的聚合物为PEG-PLGA；

姜黄素对称衍生物：PEG-PLGA的质量比为3：1。

12.一种权利要求11所述的抗癌药物的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的姜黄素对称衍生物溶解得溶液A，将PEG-PLGA溶解得溶液B；将溶液A和B混合，然后滴加在聚乙烯醇溶液C中，随后挥发溶剂、分离，得到。

Images