CN116637107A - 一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法 - Google Patents

一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116637107A
CN116637107A CN202210137357.9A CN202210137357A CN116637107A CN 116637107 A CN116637107 A CN 116637107A CN 202210137357 A CN202210137357 A CN 202210137357A CN 116637107 A CN116637107 A CN 116637107A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
drug
tumor
natural
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210137357.9A
Other languages
English (en)
Inventor
张仕勇
廖春燕
谭毅峰
雷雨
吴潇
廖玉龙
马然
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN202210137357.9A priority Critical patent/CN116637107A/zh
Publication of CN116637107A publication Critical patent/CN116637107A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/385—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having two or more sulfur atoms in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物，属于生物医药领域。本发明所述天然抗氧化剂纳米药物，包括纳米载体以及按一定比例同时负载于所述纳米载体中的2种及其以上的天然抗氧化剂。该纳米药物能有效延长抗氧化剂的血液循环时间，促进抗氧化剂在肿瘤组织处富集，且能以最优比例同时递送天然抗氧化剂进入肿瘤细胞，进而产生高效协同肿瘤抑制效果，使得天然抗氧化剂纳米药物在与化疗药物使用剂量相当的情况下高效杀死肿瘤及其耐药肿瘤细胞，且对多种肿瘤模型有较高的肿瘤抑制效果，还具有抗多药耐药作用。同时，该纳米药物具有优异的生物相容性，对机体几乎不造成任何毒副作用，可解决化疗药物易产生毒副作用的问题。因此，该天然抗氧化剂纳米药物的开发，可推进天然抗氧化剂在临床肿瘤治疗的应用，为肿瘤治疗提供了一种新的治疗方法。

Description

一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及天然抗氧化剂纳米药物。
技术背景
天然抗氧化剂具有一定的抗肿瘤活性，且对肿瘤细胞和正常细胞具有选择性抑制作用，是一种较为理想的肿瘤治疗药物。然而，由于这些抗氧化剂自身具有低的毒性，且在体内循环时间短，无肿瘤靶向性，因此仅在极高剂量下表出一定的肿瘤抑制作用，没有实际临床应用价值。同时，在高剂量条件下，其也不可避免地带来一定的副作用。
联合策略是一种提高药物疗效的有效方法。将多种天然抗氧化剂物理混合联用具有提高其肿瘤细胞抑制效果，降低单药使用剂量，但其使用剂量仍远远超过化疗药物；同时，其在体内仍存在单独使用时血液循环时间短、无肿瘤靶向性等缺点。众所周知，药物联用时，联合的比例至关重要，其将影响药物的联合效果。抗氧化剂物理混合联用时，在体内无法实现按固定的比例进入肿瘤细胞。因此，目前的抗氧化剂联合在体内无法达到高效协同肿瘤抑制效果。
发明内容
针对以上问题，本发明结合纳米技术和天然抗氧化剂的优点，开发了一种新型的天然抗氧化剂纳米药物，将2种及其以上的天然抗氧化剂按一定比例同时负载于纳米载体中，该纳米药物能有效延长抗氧化剂的血液循环时间，促进抗氧化剂在肿瘤组织处富集，且能以固定比例同时递送天然抗氧化剂进入肿瘤细胞，进而产生高效协同肿瘤抑制效果，使得天然抗氧化剂纳米药物产生与化疗药物相当的治疗效果。同时，该纳米药物具有优异的生物相容性和抗多药耐药作用，对机体几乎不造成任何毒副作用，有效克服了化疗药物易产生毒副作用的问题，为肿瘤治疗提供了一种新的选择。
本发明包含以下技术方案：
一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物，包括纳米载体以及按一定比例同时负载于所述纳米载体中的2种及其以上的天然抗氧化剂。通过同时负载能够实现各种天然抗氧化剂以固定比例进入细胞，达到最佳的协同效果。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂选至硫辛酸(LA)、维生素C(VC)、维生素K3(VK3)、花青素(ATC)、百里香醌(TQ)、姜黄素(Cur)、染料木黄酮及其药学上可接受的衍生物，所述衍生物为药学上可接受的盐或对天然抗氧化剂进行的不影响其核心作用发挥的非实质性改性而获得的药学上可接受的改性物(包括但不限于在天然抗氧化剂分子上接枝官能团)。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述纳米载体选至脂质体、囊泡、胶束等常用的纳米药物载体。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂为小分子抗氧化剂；所述小分子抗氧化剂的分子量小于1000.0Da，其能有效地被负载于纳米载体中。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂之间的摩尔比为1:100～100:1。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂之间的配比是通过体外方法筛选得到抗氧化剂协同效果最优比。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂能够在细胞内相互循环再生。
作为可选方式，在上述纳米药物中，其中一种天然抗氧化剂为硫辛酸和/或硫辛酸衍生物。进一步的，其余的天然抗氧化剂是能够与硫辛酸相互循环再生的抗氧化剂。所述其余的天然抗氧化剂与硫辛酸相互循环再生的过程中，能够促进活性氧(ROS)的产生。这些小分子抗氧化剂单独存在于细胞内时，易快速被代谢掉。所述其余的天然抗氧化剂在细胞内可以通过失去电子产生ROS，而自己被氧化(处于氧化态，无法再继续产生ROS)；而所述LA在细胞内被还原生成的二氢硫辛酸(DHLA)是一种强的还原剂，DHLA可以还原这些被氧化的化合物，进而又可继续产生ROS，此时DHLA被氧化成LA(可再次被还原成DHLA，实现LA循环)。同时DHLA循环过程中也可产生ROS。从而实现LA和其它抗氧化剂的相互循环再生，LA和其它抗氧化剂相互循环，减缓LA与其余的天然抗氧化剂的代谢，降低其被排出胞外的量，同时可以促进ROS的产生，以维持胞内高水平的天然抗氧化剂含量，发挥更强的抗肿瘤作用。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂为LA与VC，进一步的，所述VC与LA的摩尔比为2:1。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂为LA、VC和VK3。进一步的，所述LA、VC和VK3的摩尔比为2:1:1。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述其余的天然抗氧化剂为VC和ATC。进一步的，所述VC和ATC的摩尔比为2:1。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述其余的天然抗氧化剂为LA与TQ，进一步的，所述VC与TQ的摩尔比为1:1。
作为可选方式，在上述纳米药物中，所述其余的天然抗氧化剂为LA与Cur。进一步的，所述LA与Cur的摩尔比为2:1。
作为可选方式，所述纳米药物的粒径小于500nm，优选为100～200nm。该粒径范围的纳米药物能够通过实体瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR效应)在肿瘤部位富集，实现被动靶向效果。
本发明还公开了一种上述纳米药物中天然抗氧化剂负载比例的体外筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
(1)将所述2种及其以上的天然抗氧化剂按照不同比例混合并负载于纳米载体中，制备得到一系列负载比例不同的天然抗氧化剂纳米药物；
(2)将步骤(1)中制备的负载比例不同的纳米药物分别以不同的浓度与肿瘤细胞进行体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，通过细胞存活率计算协同指数(CI)，选择具有最低CI值且CI值小于0.9的纳米药物对应的天然抗氧化剂负载比例作为目标配比。
作为可选方式，在上述体外筛选方法中，还包括步骤(3)：将单独负载各天然抗氧化剂的纳米载体按照步骤(2)中得到的目标配比混合后形成的载体混合物以不同的浓度与肿瘤细胞进体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，计算该载体混合物以及具有目标配比的纳米药物中天然抗氧化剂之间的协同指数，如果具有目标配比的纳米药物的协同指数小于载体混合物对应的协同指数，则说明目标配比具有较好的协同抗肿瘤效果。
作为可选方式，在上述体外筛选方法中，协同指数(CI)的计算方法具体为：根据共培养实验中得到的一系列细胞存活率，绘制联合用药时的肿瘤抑制率-浓度曲线，根据曲线得到联合用药达到某一特定肿瘤抑制率时(如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％)所对应的各天然抗氧化剂的浓度D1、D2、…、Dn，然后，按照以下公式计算协同指数(CI)：
CI＝D1/Dx1+D2/Dx2+…+Dn/Dxn；
其中Dx1、Dx2、…、Dxn分别为单独使用对应的天然抗氧化剂达到该特定肿瘤抑制率时对应的浓度。作为可选，分别将各天然抗氧化剂单独以不同的浓度与肿瘤细胞进行体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，绘制对应天然抗氧化剂的肿瘤抑制率-浓度曲线，然后根据曲线得到单独使用各天然抗氧化剂达到该特定肿瘤抑制率时对应的浓度Dx1、Dx2、…、Dxn；CI≤0.1表示很强的协同作用(+++++)，0.1<CI≤0.3表示强协同作用(++++)；0.3<CI≤0.7为增效作用(+++)；0.7<CI≤0.85为中度协同作用(++)；0.85<CI≤0.9为轻度增效(+)；0.9<CI≤1.1表示近似相加，1.1<CI≤1.2表示轻微相加对抗；1.2<CI≤1.45为中度拮抗。
本发明还公开了一种上述纳米药物的应用，其特征在于，将其用于体内或体外抗肿瘤效果测试以及制备临床抗肿瘤药物。
本发明还公开了一种上述纳米药物的应用，其特征在于，将其用于制备具备抗多药耐药作用的抗肿瘤药物。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1.本发明所述纳米药物将不同的天然抗氧剂固定比例同时负载于载体内，能实现天然抗氧剂以固定比例进入细胞增强这些抗氧化剂的抗肿瘤活性，使得其在低剂量下(100mg/kg)实现优异的抗肿瘤效果。开发该类天然抗氧化剂纳米药物，可推进天然抗氧化剂在临床肿瘤治疗的应用。
2.本发明所述纳米药物抗肿瘤效果比单纯物理混合有大幅提高，接近甚至超过一般的化疗药物的肿瘤细胞毒性，使得天然抗氧化剂纳米药物在与化疗药物使用剂量相当的情况下高效杀死肿瘤及其耐药肿瘤细胞，且对多种肿瘤模型有较高的肿瘤抑制效果。所述纳米药物具有良好的体内生物相容性和生物安全性，在肿瘤治疗过程中对机体几乎不造成毒副作用，大大提高动物存活率。
附图说明：
图1为所构筑的纳米药物示意图；
图2为实施例1中硫辛酸(LA)和硫辛酸钠(LA-Na)对不同细胞的毒性评估；
图3为实施例2中天然抗氧化剂(a-d)和分别负载天然抗氧化剂的脂质纳米药物(e-h)对U251细胞的毒性；
图4为实施例3中负载不同比例VC/LA的脂质纳米药物的细胞毒性图(a)和协同指数(b)；
图5为实施例3中不同形式组合的细胞毒性(a)、协同指数(b)和细胞凋亡百分比(c)；
图6为实施例4中负载不同比例LA、VC和VK3的脂质纳米药物的细胞毒性图(a)和协同指数(b)；
图7为实施例5中负载不同比例VC/ATC的脂质纳米药物的细胞毒性图(a)和协同指数(b)；
图8为实施例5不同形式组合的细胞毒性(a)、协同指数(b)和细胞凋亡百分比(c)；
图9为实施例6中树状大分子负载LA/TQ的囊泡纳米粒的细胞毒性图；
图10为实施例6中负载不同比例LA/TQ的树状大分子纳米粒的细胞毒性图(a)和协同指数(b)；
图11为实施例6中不同形式组合的细胞毒性(a)、协同指数(b)和细胞凋亡百分比(c)；
图12为实施例7中胶束和负载LA/Cur的胶束纳米粒的细胞毒性图；
图13为实施例7中负载不同比例LA/Cur的胶束纳米粒的细胞毒性图(a)和协同指数(b)；
图14为实施例7中不同形式组合的细胞毒性(a)、协同指数(b)和细胞凋亡百分比(c)；
图15为实施例8中1@纳米药物1的抗肿瘤机制研究结果：胞内的LA含量(a)、胞内的VC含量(b)、胞内ROS产生速率(c)和ROS含量(d)；
图16为实施例9中1@纳米药物1(a)和TMZ(b)对U251和U251/TR的细胞毒性；
图17为实施例10中1@纳米药物1的急性毒性评估：小鼠体重变化(a)，小鼠离体组织重量(b)，肾功能指标(c)和肝功能指标(d)；
图18为实施例10中1@纳米药物的免疫原性评估：白细胞计数(a)和细胞因子(TNF-α和IL-6)检测(b)；
图19为实施例10中1@纳米药物的微核试验评估：微核率(a)和PCE/NCE的比值(b)。
图20为实施例10中1@纳米药物的染色体畸变评估：染色体畸变率；
图21为实施例11中1@纳米药1对U251皮下肿瘤模型的抗肿瘤评估：小鼠肿瘤体积变化(a)，药物体内协同抗肿瘤的联合指数Q(b)和肿瘤抑制率(c)；
图22为实施例11中1@纳米药1对U251皮下肿瘤模型的抗肿瘤评估：小鼠体重变化(a)和存活率(b)；
图23为实施例11中1@纳米药1对皮下U251荷瘤裸鼠的骨髓抑制评估：白细胞数(a)、血小板数(b)和红细胞数(c)；
图24为实施例11中1@纳米药1对U251/TR皮下肿瘤模型的抗肿瘤评估:小鼠肿瘤体积变化(a)，肿瘤抑制率(b)，小鼠体重变化(c)和存活率(d)。
具体实施方式：
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1.
硫辛酸钠制备及毒性评估
1.硫辛酸钠制备：
准确称取1.03g硫辛酸(LipoicAcid，LA)于100ml圆底烧瓶中，在搅拌过程中，通过恒压滴液漏斗逐滴加入30ml乙醇钠中。溶液滴完后，继续搅拌过夜后有大量的硫辛酸钠在溶液中析出，过滤，得到硫辛酸钠。将得到的硫辛酸钠在干燥箱中干燥24小时，得到纯的硫辛酸钠单体(LA-Na)。
2.硫辛酸与硫辛酸钠抗肿瘤活性评估：
选择处于对数生长活跃期的人脑胶质瘤细胞(U251)，人结肠癌细胞(HT29)和人乳腺癌细胞(MCF-7)，分别接种于96孔板，培养24h后，再分别向其中加入不同浓度的LA和LA-Na，设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，吸除旧的培养基，加入200μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，之后再吸取旧的培养基，再每孔加入150μl的DMSO，并在振荡器上振荡2min，最后用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图2所示。实验结果发现，将LA制备成钠盐(LA-Na)，并未影响其抗肿瘤活性。LA和LA-Na分别对U251、HT29和MCF-7具有相似的细胞毒性。
实施例2：
天然抗氧化剂小分子单体的抗肿瘤活性
(1)天然抗氧化剂小分子单体的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的U251细胞接种于96孔板，培养24h后，再分别向其加入不同浓度的硫辛酸(LA)、维生素C(VitaminC，VC)、维生素K3(Vitamin K3，VK3)和花青素(Anthocyan，ATC)，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，吸除旧的培养基，加入200μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，之后再吸取旧的培养基，再每孔加入150μl的DMSO，并在振荡器上振荡2min，最后用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图3a-d所示。实验结果发现，单独硫辛酸、维生素C、维生素K3和花青素对肿瘤细胞的毒性低。
(2)负载于脂质体的天然抗氧化剂小分子的细胞毒性评估：分别将LA、VC、VK3和ATC负载于脂质体中，制备得到脂质纳米药物。再选择处于对数生长活跃期的U251细胞接种于96孔板，培养24h后，再分别向其加入不同浓度的LA、VC、VK3和ATC脂质纳米药物，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，吸除旧的培养基，加入200μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，之后再吸取旧的培养基，再每孔加入150μl的DMSO，并在振荡器上振荡2min，最后用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图3e-h所示。实验结果发现，单独LA、VC、VK3和ATC负载于脂质体后，抗肿瘤活性仍较低，且比小分子单体的抑瘤效果稍差点。
实施例3
脂质体负载硫辛酸和VC的天然抗氧化剂纳米药物(纳米药物1)的体外抗协同肿瘤评估
(1)不同VC/LA负载量的纳米药物的制备：
将VC和LA按照以下比例(nVC:nLA＝2:1，4:1，1:1，10:1和1:10)分别负载于脂质体中，分别制备得到了1@纳米药物1、2@纳米药物1、3@纳米药物1、4@纳米药物1和5@纳米药物1。
(2)纳米药物协同抗肿瘤：
选择处于对数生长活跃期的U251细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物1、2@纳米药物1、3@纳米药物1、4@纳米药物1和5@纳米药物1。每种纳米药物设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图4所示。图4a表明，不同VC/LA负载量的纳米药物1具有不同的肿瘤抑制效果，1@纳米药物 的抑瘤效果比2@纳米药物/> 3@纳米药物/>4@纳米药物/> 和5@纳米药物/>好。同时在各个抑制率条件下，1@纳米药物1的协同指数(0.05＜CI＜0.4)都小于1(图4b)，表明该纳米药物具有最佳的协同效果。
(3)不同形式材料的协同抗肿瘤效果
1@纳米药物1和[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物](nVC:nLA≈2:1)混合物的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的U251细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物1和[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]混合物。每种材料设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图5所示。从实验结果分析可以看出将VC/LA以固定比例负载于同一脂质体的1@纳米药物1具有优异的抗肿瘤活性(图5a)，其能在低剂量下产生较强的协同肿瘤抑制效果(图5b，0.05＜CI＜0.4)；而以相同比例混合的纳米药物混合物[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]，其肿瘤抑制效果较差(图5a)，且几乎没有协同抑制效果(图5b，0.9＜CI＜1.5)。
1@纳米药物1和[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物](nVC:nLA≈2:1)混合物的诱导细胞凋亡：选择处于对数生长活跃期的U251细胞接种于在6孔板中，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物1和混合物。孵育24h后，收集培养基内以及贴壁细胞。离心收集细胞沉淀，并用PBS清洗2次。最后根据AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书加入AnnexinV-FITC和PI孵育15min后，进行流式细胞仪分析。通过FlowJo进行数据处理。实验结果发现，1@纳米药物1比混合物具有强的诱导细胞凋亡能力，其细胞凋亡率(31.5％)是混合物(5.7％)的5.5倍(图5c)。
小分子化合物VC和LA用于联合肿瘤治疗时，将其同时负载于脂质体内，可以通过调控VC和LA的配比实现两者的最优协同。同时也验证了，VC和LA固定以最优比例同时负载于载体内才能实现最优协同，推测主要是由于同时负载才能实现VC和LA以固定比例进入细胞，而自由混合的VC和LA不能实现，因此无法达到最佳的协同效果。
本实验中，将硫辛酸换成硫辛酸钠，仍然可以通过筛选得到具有最优协同肿瘤治疗的脂质纳米药物。
实施例4
脂质体负载LA、VC和VK3的天然抗氧化剂纳米药物(纳米药物2)的外抗协同肿瘤评估
(1)不同LA、VC和VK3负载量的纳米药物的制备：
将LA、VC和VK3按照以下比例(nLA:nVC:nVK3＝1:1:1、2:1:1、2:2:1、2:1:2和1:1:2)分别负载于脂质体中，分别制备得到了1@纳米药物2、2@纳米药物2、3@纳米药物2、4@纳米药物2和5@纳米药物2。
(2)纳米药物协同抗肿瘤：
选择处于对数生长活跃期的U251细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物2、2@纳米药物2、3@纳米药物2、4@纳米药物2和5@纳米药物2。每种纳米药物设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图6所示。图6a表明，不同LA、VC和VK负载量的纳米药物2具有不同的肿瘤抑制效果，其中2@纳米药物的抑瘤效果比1@纳米药物/>3@纳米药物/> 4@纳米药物/> 和5@纳米药物/> 好。同时，2@纳米药物2在各个抑制率下都具有最小的协同指数(图6b，0.25＜CI＜0.55)，表明该纳米药物具有最佳的协同效果。
小分子天然抗氧化剂LA、VC和VK3用于联合肿瘤治疗，将其同时负载于脂质体内，可以通过调控LA、VC和VK3的配比实现三者的最优协同。同时也验证了，LA、VC和VK3固定以最优比例同时负载于载体内才能实现最优协同，推测主要是由于同时负载才能实现LA、VC和VK3以固定比例进入细胞，而自由混合的LA、VC和VK3不能实现，因此无法达到最佳的协同效果。
本实验中，将硫辛酸换成硫辛酸钠，仍然可以通过筛选得到具有最优协同肿瘤治疗的脂质纳米药物。
实施例5
脂质体负载VC和花青素(anthocyan,ATC)的天然抗氧化剂纳米药物(纳米药物3)的外抗协同肿瘤评估
(1)不同VC/ATC负载量的纳米药物的制备：
将VC和ATC按照以下比例(nVC:nATC＝1:1、1:2、2:1、1:5和5:1)分别负载于脂质体中，分别制备得到了1@纳米药物3、2@纳米药物3、3@纳米药物3、4@纳米药物3和5@纳米药物3。
(2)纳米药物协同抗肿瘤：
选择处于对数生长活跃期的U251细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物3、2@纳米药物3、3@纳米药物3、4@纳米药物3和5@纳米药物3。每种纳米药物设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图7所示。图7a表明，不同VC和ATC负载量的纳米药物3具有不同的肿瘤抑制效果，其中2@纳米药物的抑瘤效果比1@纳米药物/> 3@纳米药物/>4@纳米药物和5@纳米药物/>好。同时，相对于其它纳米药物，2@纳米药物3在各个抑制率下都具有最小的协同指数(图7b，0.2＜CI＜0.4)，表明该纳米药物具有最佳的协同效果。
(3)不同形式材料的协同抗肿瘤效果
2@纳米药物3和[VC脂质纳米药物+ATC脂质纳米药物](nVC:nATC≈2:1)混合物的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的U251细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入2@纳米药物3和[VC脂质纳米药物+ATC脂质纳米药物]混合物。每种材料设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图8a,b所示。从实验结果分析可以看出，VC/ATC以最优比例负载于同一脂质体的2@纳米药物3(0.2＜CI＜0.4)比自由混合的[VC脂质纳米药物+ATC脂质纳米药物](0.89＜CI＜1.4)具有更优异的抗肿瘤效果，且其具有较强的协同肿瘤抑制效果。
2@纳米药物3和[VC脂质纳米药物+ATC脂质纳米药物](nVC:nATC≈2:1)混合物诱导细胞凋亡：选择处于对数生长活跃期的U251细胞接种于在6孔板中，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入2@纳米药物3和[VC脂质纳米药物+ATC脂质纳米药物]混合物。孵育24h后，收集培养基内以及贴壁细胞。离心收集细胞沉淀，并用PBS清洗2次。最后根据AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书加入Annexin V-FITC和PI孵育15min后，进行流式细胞仪分析。通过FlowJo进行数据处理。实验结果发现，混合物诱导细胞凋亡能力较弱，诱导后仍存在大量正常细胞(56.9％)，凋亡细胞仅为(33.7％)。而2@纳米药物3比混合物有更强的诱导细胞凋亡能力，细胞凋亡率为(61.8％)，是混合物的1.8倍(图8c)。
小分子化合物VC和ATC用于联合肿瘤治疗时，将其同时负载于脂质体内，可以通过调控VC和LPC的配比实现两者的最优协同。同时也验证了，VC和ATC固定以最优比例同时负载于载体内才能实现最优协同，推测主要是由于同时负载才能实现VC和ATC以固定比例进入细胞，而自由混合的VC和ATC脂质纳米药物不能实现，因此无法达到最佳的协同效果。
本实验中，将硫辛酸换成硫辛酸钠，仍然可以通过筛选得到具有最优协同肿瘤治疗的脂质纳米药物。
实施例6
树状大分子负载硫辛酸和百里香醌(Thymoquinone，TQ)的天然抗氧化剂纳米药物(纳米药物4)的外抗协同肿瘤评估
(1)制备分别负载LA和TQ的树状大分子纳米药物
将树状大分子(5mg)溶于10ml水中，并在其中分别加入溶于DMSO的LA/TQ母液(2mg)，振荡、透析后，得到LA/TQ树状大分子纳米粒子。
(2)LA/TQ树状大分子纳米药物细胞毒性评估
LA/TQ树状大分子纳米粒子的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的人非小细胞肺癌(A549)细胞接种于96孔板，培养24h后，再分别向其加入不同浓度的单纯的树状大分子囊泡纳米粒子、LA树状大分子纳米粒子和TQ树状大分子纳米粒子，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，吸除旧的培养基，加入200μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，之后再吸取旧的培养基，再每孔加入150μl的DMSO，并在振荡器上振荡2min，最后用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图9所示。实验结果发现，单纯的囊泡纳米粒子无肿瘤抑制作用，而LA/TQ树状大分子纳米粒子对A549细胞呈现较弱的细胞毒性。
(3)不同LA/TQ负载量的纳米药物的制备：
将LA和TQ按照以下比例(nLA:nTQ＝1:1、5:1、1:5、10:1和1:10)分别负载于树状大分子纳米粒子中，分别制备得到了1@纳米药物4、2@纳米药物4、3@纳米药物4、4@纳米药物4和5@纳米药物4。
(4)纳米药物协同抗肿瘤：
选择处于对数生长活跃期的A549细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物4、2@纳米药物4、3@纳米药物4、4@纳米药物4和5@纳米药物4。每种纳米药物设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图10所示。图10a表明，不同LA/PT负载量的纳米药物4具有不同的肿瘤抑制效果，其中1@纳米药物 的抑瘤效果比2@纳米药物/> 3@纳米药物/>4@纳米药物 和5@纳米药物/>好。同时，相对于其它纳米药物，1@纳米药物4在各个抑制率下都具有最小的协同指数(图10b，0.1＜CI＜0.25)，表明该纳米药物具有最佳的协同效果。
(5)不同形式材料的协同抗肿瘤效果
1@纳米药物4和[LA树状大分子纳米粒+TQ树状大分子纳米粒](nLA:nTQ≈1:1)混合物的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的A549细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物4和[LA树状大分子纳米粒+TQ树状大分子纳米粒]混合物。每种材料设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图11所示。从实验结果分析可以看出，LA/TQ以最优比例负载于同一脂质体的1@纳米药物4比自由混合的[LA树状大分子纳米粒+TQ树状大分子纳米粒]具有更优异的抗肿瘤效果(图11a)。且在各个抑制率下，1@纳米药物4的CI值(0.1＜CI＜0.25)都比混合物的CI值低(0.15＜CI＜0.45)，1@纳米药物4呈现更优异的协同肿瘤抑制效果(图11b)。
1@纳米药物4和[LA树状大分子纳米粒+TQ树状大分子纳米粒](nLA:nPT≈1:1)混合物诱导细胞凋亡：选择处于对数生长活跃期的A549细胞接种于在6孔板中，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物4和[LA树状大分子纳米粒+TQ树状大分子纳米粒]混合物。孵育24h后，收集培养基内以及贴壁细胞。离心收集细胞沉淀，并用PBS清洗2次。最后根据AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书加入AnnexinV-FITC和PI孵育15min后，进行流式细胞仪分析。通过FlowJo进行数据处理。实验结果发现，混合物诱导细胞凋亡能力较弱，诱导后仍存在大量正常细胞(63.9％)，凋亡细胞仅为(31.5％)。而1@纳米药物4比混合物有更强的诱导细胞凋亡能力，细胞凋亡率为(62.3％)，是混合物的1.97倍(图11c)。
小分子天然抗氧化剂LA和TQ用于联合肿瘤治疗时，将其同时负载于树状大分子内，可以通过调控LA和TQ的配比实现两者的最优协同。同时也验证了，LA和TQ固定以最优比例同时负载于载体内才能实现最优协同，推测主要是由于同时负载才能实现LA和TQ以固定比例进入细胞，而自由混合的LA和TQ脂质纳米药物不能实现，因此无法达到最佳的协同效果。
本实验中，将硫辛酸换成硫辛酸钠，仍然可以通过筛选得到具有最优协同肿瘤治疗的囊泡纳米药物。
实施例7
胶束负载硫辛酸(LA)和姜黄素(Cur)的天然抗氧化剂纳米药物(纳米药物5)的体外抗协同肿瘤评估
(1)制备分别负载LA和Cur的胶束纳米粒子，并进行细胞毒性评估
将普朗尼克(5mg)溶于10ml水中，同时分别加入溶于DMSO的LA/Cur母液(2mg)，振荡、透析后，得到粒径小于200nm的LA/Cur胶束纳米粒子。
(2)LA和Cur的胶束纳米粒子细胞毒性评估
LA/Cur胶束纳米粒子的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的HT29细胞接种于96孔板，培养24h后，再分别向其加入不同浓度的单纯的胶束纳米粒子、LA胶束纳米粒子和Cur胶束纳米粒子，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，吸除旧的培养基，加入200μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，之后再吸取旧的培养基，再每孔加入150μl的DMSO，并在振荡器上振荡2min，最后用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图12所示。实验结果发现，单纯的胶束纳米粒子无肿瘤抑制作用，而LA胶束纳米粒子和Cur胶束纳米粒子对HT29细胞产生了一定的毒性。
(3)不同LA/Cur负载量的纳米药物的制备：
将LA和Cur按照以下比例(nLA:nCur＝1:1、2:1、1:2、10:1和1:10)分别负载于胶束纳米粒子中，分别制备得到了1@纳米药物5、2@纳米药物5、3@纳米药物5、4@纳米药物5和5@纳米药物5。
(4)纳米药物协同抗肿瘤：
选择处于对数生长活跃期的HT29细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入1@纳米药物5、2@纳米药物5、3@纳米药物5、4@纳米药物5和5@纳米药物5。每种纳米药物设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图13所示。图13a表明，不同LA/Cur负载量的纳米药物5具有不同的肿瘤抑制效果，其中2@纳米药物的抑瘤效果比1@纳米药物/> 3@纳米药物/>4@纳米药物5和5@纳米药物/>好。同时，相对于其它纳米药物，2@纳米药物5在各个抑制率下都具有最小的协同指数(图13b,0.2＜CI＜0.4)，表明该纳米药物具有最佳的协同效果。
(5)不同形式材料的协同抗肿瘤效果
2@纳米药物5和[LA胶束纳米粒+Cur胶束纳米粒](nLA:nCur≈2:1)混合物的细胞毒性评估：选择处于对数生长活跃期的HT29细胞，分别接种于96孔板，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入2@纳米药物5和[LA胶束纳米粒+Cur胶束纳米粒]混合物。每种材料设置不同浓度梯度，每个浓度设置5个平行样，并设置对照组。继续培养48h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗，加入100μl含有10％(v/v)MTT的培养基继续孵育2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率，其结果如图14所示。从实验结果分析可以看出，LA/Cur以最优比例负载于同一脂质体的2@纳米药物5(0.2＜CI＜0.4)比自由混合的[LA胶束纳米粒+Cur胶束纳米粒](0.6＜CI＜0.9)具有更优异的抗肿瘤效果(14a)，且其具有较强的协同肿瘤抑制效果(14b)。
2@纳米药物5和[LA胶束纳米粒+Cur胶束纳米粒](nLA:nCur≈2:1)混合物诱导细胞凋亡：选择处于对数生长活跃期的HT29细胞接种于在6孔板中，培养24h后，分别向其中不同的孔板内加入2@纳米药物5和(nLA:nCur≈2:1)混合物。孵育24h后，收集培养基内以及贴壁细胞。离心收集细胞沉淀，并用PBS清洗2次。最后根据AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书加入Annexin V-FITC和PI孵育15min后，进行流式细胞仪分析。通过FlowJo进行数据处理。实验结果发现，混合物诱导细胞凋亡能力较弱，诱导后仍存在大量正常细胞(66.9％)，凋亡细胞仅为(29.2％)。而2@纳米药物5比混合物有更强的诱导细胞凋亡能力，细胞凋亡率为(50.3％)，是混合物的1.72倍(图14c)。
小分子化合物LA和Cur用于联合肿瘤治疗时，将其同时负载于胶束，可以通过调控LA和Cur的配比实现两者的最优协同。同时也验证了，LA和Cur固定以最优比例同时负载于载体内才能实现最优协同，推测主要是由于同时负载才能实现LA和Cur以固定比例进入细胞，而自由混合的LA和Cur胶束纳米药物不能实现，因此无法达到最佳的协同效果。
实施例8
以负载VC/LA的1@纳米药物1为例，研究其抗肿瘤机制研究
(1)细胞内LA和VC含量检测：用高效液相色谱法测定细胞内VC和LA浓度。简单地说，选择处于对数生长活跃期的U251细胞(5×104细胞/ml)接种于6孔板中，在37℃/5％CO2下培养。孵育24h后，分别采用LA脂质纳米药物、VC脂质纳米药物、1@纳米药物1和[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]混合物孵育细胞0、10、20、30、40、60、120、180、240、300和360min。孵育后，用PBS离心洗涤细胞3次。用裂解液(含1mM EDTA)对细胞沉淀进行细胞裂解。将裂解液进行4℃离心30min(10000rpm/min)后收集上清夜，并保存于-20℃。最后采用高效液相进行VC/LA的检测。如图15a,b所示，当单独的VC和LA脂质纳米药物作用于细胞，一段时间后，胞内的VC/LA被快速代谢掉。然而同时孵育VC和LA时，胞内的VC和LA含量升高，表明VC和LA能相互循环彼此。此外，相对于[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]，1@纳米药物1可维持胞内较高水平的VC和LA含量(图15a,b)，表明当VC和LA以最优比负载于同一脂质内，可实现VC和LA最优的相互循环，进而维持胞内高水平VC/LA含量，促进其发挥抗肿瘤效果。
(2)活性氧(ROS)的产生速率：用2,7-二氯二氢荧光素双乙酸酯(DCFH-DA)染色细胞，用活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)。简单地说，选择处于对数生长活跃期的U251细胞(5×103细胞/ml)接种于96孔板，37℃/5％CO2培养。孵育24h后，在无血清培养基中，采用DCFH-DA(10μM)孵育细胞30min。孵育后，采用PBS洗涤细胞3次，再采用1@纳米药物1和[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]孵育细胞，并在孵育后的0、10、20、30、40、50和60min通过荧光酶标仪检测细胞内的DCF(λEm＝525nm；λEx＝488nm)的荧光强度。细胞内ROS浓度变化与DCF荧光强度变化成正相关。以各组细胞在0min时DCF荧光强度进行归一化为，设为100％。如图15c所示，当VC和LA同时负载于同一脂质体内，该纳米药物能快速产生ROS，其产生ROS的速率是[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]的3.14倍,结果表明，当VC和LA以最优比例负载于同一脂质体内，可以有效提高纳米药物产生ROS的速率。
(3)细胞内ROS检测：简单地说，选择处于对数生长活跃期的U251细胞(5×103细胞/ml)接种于96孔板，37℃/5％CO2培养。孵育24h后，采用1@纳米药物1和[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]孵育细胞6h。孵育后，在无血清培养基中，采用DCFH-DA(10μM)孵育细胞30min。孵育后，采用PBS洗涤细胞3次，通过荧光酶标仪检测细胞内的DCF(λEm＝525nm；λEx＝488nm)的荧光强度。未处理细胞作为空白对照，未处理细胞的荧光强度归一化为100％。如图15d所示，同时负载VC和LA的脂质纳米药物1@纳米药物1在胞内产生ROS的量明显高于同时负载于[VC脂质纳米药物+LA脂质纳米药物]混合物，ROS水平是其1.7倍。从而表明，1@纳米药物1在胞内能促进大量的ROS产生，这应该是其表现高肿瘤细胞毒性的原因。
通过文献的调研以及实验研究，发现VC和LA可在细胞内产生ROS，进而促进肿瘤细胞发生凋亡。VC和LA联用时，可实现相互循环再生彼此，且两者以最优协同比例负载于同一载体内，可以实现最大化的循环再生，进而高效产生ROS，进而促进其在低剂量下发挥最优抗肿瘤效果。
实施例9
以负载VC/LA的1@纳米药物1为例，评估纳米药物对耐药细胞毒性
采用MTT法进行1@纳米药物1的体外细胞毒性评价。简而言之，U251细胞和耐替莫唑胺(TMZ)的U251(U251/TR)细胞(5×103/孔)接种于96孔板中，并在37℃/5％CO2的细胞培养箱中孵育，待细胞完全贴壁。孵育24h后，吸去旧的培养基，并分别加入200μl含有不同浓度1@纳米药物1和TMZ的完全培养基，而未加任何材料的细胞为空白组。细胞孵育72h后，吸去旧的培养基，并加入200ul含有10％MTT(5mg/ml)的培养基孵育2h。孵育后，移除培养基，并每孔加入150μl二甲亚砜。通过酶标仪检测每个孔板在490nm处吸光度来评估材料的细胞毒性。细胞存活率按以下公式计算：细胞存活率(％)＝A490(样本)/A490(对照)×100％。IC50的计算采用Calcusyn软件，所有实验数据与计算数据吻合良好。实验结果显示，1@纳米药物1对U251和它的耐药细胞(U251/TR)具有无差异性抑制作用，其对U251的为84.5μM，而对U251/TR的/>为111.4μM(图16a)。然而脑胶质瘤一线化疗药物替莫唑胺(TMZ)对U251的为34.2μM，而对U251/TR的/>为438.6μM(图16b)。实验结果表明，1@纳米药物1能在与化疗药物(TMZ)相当的剂量下杀死肿瘤细胞，且其对肿瘤细胞和它的耐药肿瘤细胞都具有无差异性抑制作用，具有抗多药耐药作用。
实施例10
以负载VC/LA的1@纳米药物1为例，评估纳米药物的体内生物相容性和生物安全性
急性毒性实验：通过急性毒性试验，评估1@纳米药物1的体内生物相容性/生物安全性。购买体重约20g的BALB/c小鼠，在标准条件下饲养，使得其可自由获取食物和水。观察一周后进行相应实验。小鼠随机分为3组，每组10只(雄性5只，雌性5只)，再通过尾静脉注射0.2ml由无菌生理盐水配置的1@纳米药物1(1000mg/kg)。同时，我们将生理盐水处理和未处理(空白)的小鼠作为对照，在注射后的2周内每2天记录一次体重。观察结束后，将小鼠的1000μl血液样本进行收集，并分为两部份：150μl血液收集于含EDTA-K2的采血管中；850μl血液收集于1.5ml的EP管中。收集于的EP的血液室温放置30min后离心15min(3000rpm/min)，进行2次离心，每次收集上面的血清。通过全自动血液学分析仪检测小鼠的肝功能指数：丙氨酸转氨酶、谷氨酸移氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、白蛋白，肾功能指标：尿素氮、肌酐和尿酸(UA)以及白细胞计数：白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。在观察结束后，三组小鼠均未出现死亡，且如图17a所示，即使在1000mg/kg的剂量下，1@纳米药物1组小鼠未出现体重降低，与生理盐水组和空白组一样体重稍上升。且进一步将小鼠心、肝、脾、肺和肾进行称重，1@纳米药物组小鼠的各脏器重量与生理盐水组和空白组小鼠的无显著性差异(图17b)，表明纳米药物对小鼠未造成显著性的毒性损伤。通过检测肾功能指标，1@纳米药物1组小鼠的尿素氮、肌酐和尿酸都在正常水平(图17c)，表明纳米药物未引起肾功能变化。通过检测肝功能指标，1@纳米药物1组小鼠的丙氨酸转氨酶、谷氨酸移氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、白蛋白都在正常水平(图17d)，表明纳米药物未引起肝功能变化。同时进行了全血分析，1@纳米药物1组小鼠白细胞计数：白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞处于正常水平(图18a)，表明纳米在体内未引起显著的免疫反应。综上表明，1@纳米药物1具有优异的生物相容性，且不会引起显著的免疫反应。
免疫原反应测试：为了评估1@纳米药物1在体内是否引起免疫反应，进一步通过检测血清中IL-6和TNF-α进行评估。购买体重约20g的雌性BALB/c小鼠，在标准条件下饲养，使得其可自由获取食物和水。观察一周后进行相应实验。小鼠随机分为3组，每组3只，一组小鼠通过尾静脉注射0.2ml由无菌生理盐水配置的1@纳米药物1，另一组小鼠注射0.2ml无菌生理盐水。不做任何处理的小鼠作为空白对照。给药24h后，通过摘取眼球进行采血，并将血液收集于1.5ml的EP管中。血液室温放置30min后离心15min(3000rpm/min)，进行2次离心，每次收集上面的血清。通过小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的ELISA试剂盒说明书进行血清中细胞因子检测。所有动物实验均按照指导方针进行，并经四川大学动物伦理委员会批准。如图18b所示，1@纳米药物1组小鼠血清中的TNF-α和IL-6与生理盐水组和空白组无显著性差异，表明纳米药物未显著引起机体免疫反应。
微核实验：微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法，因此通过微核试验评估1@纳米药物1的遗传毒性。购买体重约20g的BALB/c小鼠，在标准条件下饲养，使得其可自由获取食物和水。观察一周后进行相应实验。小鼠随机分为3组，每组10只(雄性5只，雌性5只)。一组小鼠通过尾静脉注射0.2ml由无菌生理盐水配置的1@纳米药物1(1000mg/kg)，另一组小鼠注射0.2ml无菌生理盐水，每天一次，持续2天。第三组小鼠在治疗结束前24h通过尾静脉注射环磷酰胺(100mg/kg)。在治疗结束时，通过颈椎脱位将小鼠处死，并将小鼠股骨的骨髓细胞收集到少量(1ml)胎牛血清(FBS)中。采用21G针头注射器抽吸股骨骨髓悬液，滴于载玻片上，制备涂片。涂片干燥后，再放置于甲醇溶液进行细胞固定10min，随之再放入吉姆萨染液中(10％，v/v)染色30min。染色后，通过清水进行涂片清洗，再自然风干。将制备好的涂片置于显微镜下观察，进行2000个红细胞(每只动物)记录，并对嗜多染红细胞(PCEs)和正染红细胞(NCEs)进行了微核评分，以评估1@纳米药物1的遗传毒性。与环磷酰胺(阳性对照)组相比，1@纳米药物1和生理盐水(阴性对照)组的小鼠(雄性和雌性)形成微核的数量显著降低(图19a)且PCE/NCE比值显著升高(图19b，PCE/NCE的正常范围为0.6～1.2，若比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制)，表明1@纳米药物1几乎无基因毒性。
染色体畸变：染色体畸变(chromosomal aberration)是指生物细胞中染色体在数目和结构上发生的变化，因此采用染色体畸变(CA)法测定1@纳米药物1的遗传毒性。购买体重约20g的BALB/c小鼠，在标准条件下饲养，使得其可自由获取食物和水。观察一周后进行相应实验。小鼠随机分为3组，每组10只(雄性5只，雌性5只)。一组小鼠通过尾静脉注射0.2ml由无菌生理盐水配置的1@纳米药物1(1000mg/kg)，另一组小鼠注射0.2ml无菌生理盐水，每天一次，持续2天。第三组小鼠在治疗结束前24h通过尾静脉注射环磷酰胺(100mg/kg)。所有动物均于颈椎脱位处死小鼠前2h通过腹腔给予秋水仙碱(4mg/kg)。通过PBS(pH6.8，5ml)收集/冲洗小鼠股骨的骨髓细胞，再以离心10min(1000rpm/min)，获得细胞沉淀。将收集的细胞沉淀置于0.075M KCl低渗溶液中，再37℃条件下孵育30min，再用冰乙酸/甲醇固定液(冰醋酸/甲醇，1:3，v/v)进行固定1min。固定后，再离心10min(1000rpm/min)，获得细胞沉淀。将收集的细胞沉淀再固定20min后再进行离心(该步骤再重复1次)。离心后，去除上清液，最后得到约0.5ml细胞悬液。将细胞悬液滴加在预冷(4℃)的载玻片上，干燥后用Giemsa染液(10％，v/v)染色30min。通过对100个分散良好的中期细胞(每只动物)进行评分来确定染色体畸变的频率，以此作为基因毒性的指标。记录各种染色体和染色单体的断裂、染色体和染色单体的间隙、缺失、着丝粒的丢失和交换。1@纳米药物1组和生理盐水(阴性对照)组小鼠细胞的染色体保持正常结构，而环磷酰胺(阳性对照)组，雌性和雄性小鼠的染色体都发生变异(染色体末端缺失、染色体内裂隙和染色体间对称互换)。进行染色体变异统计，结果表明，阴性对照相比，给药1@纳米药物1并没有显著增加雄性和雌性小鼠的染色体变异百分比，而环磷酰胺的雄性和雌性小鼠中，染色体变异的百分比都显著增加(图20)。综上表明，1@纳米药物1几乎无基因毒性，可在体内应用。
上述实验结果表明，天然抗氧化剂纳米药物优异的生物相容性，即使在高剂量下，也不会产生显著的毒副作用，具有机体应用潜力。
实施例11
以负载VC/LA的1@纳米药物1为例，评估纳米药物体内协同抗肿瘤作用
皮下U251肿瘤模型评估：在4周龄裸鼠(约20g)皮下建立U251肿瘤模型，待肿瘤长至～50mm3时，将裸鼠随机分成7组，每组6只，分别为生理盐水组、替莫唑胺(TMZ，脑胶质瘤一线化疗药物，15mg/kg)、VC脂质体(62.5mg/kg)、LA脂质体(37.5mg/kg)、[VC+LA](62.5+37.5mg/kg)、[VC脂质体+LA脂质体](62.5+37.5mg/kg)、1@纳米药物1(15mg/kg)和1@纳米药物1(100mg/kg)组。上述7组裸鼠，每2天尾静脉给药一次，共给药11次，期间记录小鼠的肿瘤体积以及体重。实验结果如图21a所示，VC脂质体和LA脂质体仅显示微弱的抑制肿瘤增长的效果，肿瘤抑制率分别为11.5％和8.6％(图21c)，说明了单纯的天然抗氧化剂纳米药物的肿瘤治疗效果较差。当VC和LA联用时，天然抗氧化剂VC和LA直接混合组([VC+LA])的肿瘤抑制效果极差，肿瘤抑制率仅为2.6％(图21c)，这主要是由于小分子抗氧化剂在体内血液循环时间短，无肿瘤靶向性，进而导致其疗效极差，即使联用也几乎不能提高其体内肿瘤抑制效果。虽然纳米粒子混合组([VC脂质体+LA脂质体])的疗效较[VC+LA]有所提高，但其抑制率也仅可达20.0％(图21c)。然而我们发现将VC和LA同时负载的1@纳米药物1具有较好的肿瘤抑制效果。1@纳米药物1在15mg/kg剂量下的疗效接近化疗药物TMZ(15mg/kg)，其抑制率可达到40.0％。当1@纳米药物1的给药剂量增加时，肿瘤抑制率也增加，表现出强的体内协同肿瘤抑制效果(图21b，Q＞1)，推测这主要是当1@纳米药物1能有效延长抗氧化剂的血液循环时间，同时又可以固定比例同时递送VC和LA进入细胞，并在细胞内相互循环再生，从而实现高效的肿瘤抑制效果。化疗药物TMZ虽然具有一定的肿瘤抑制效果(抑制率为42.5％)，但在肿瘤治疗过程中造成一定的毒副作用，导致小鼠体重显著降低(图22a)，生存中位数仅为34天(图22b)。同时，也造成白细胞(图23a)和血小板(图23b)数量降低，引起严重的骨髓抑制。然而1@纳米药物1具有优异的生物相容性，在肿瘤治疗过程中几乎不会引起毒副作用(图22和图23)，因此其具有临床应用潜力。
皮下U251/TR肿瘤模型评估：在4周龄裸鼠(约20g)皮下建立U251/TR(耐替莫唑胺的U251)肿瘤模型，待肿瘤长至～50mm3时，将裸鼠随机分成5组，每组6只，分别为生理盐水组、替莫唑胺(TMZ，15mg/kg)、替莫唑胺(TMZ，50mg/kg)、1@纳米药物1(50mg/kg)和1@纳米药物1(200mg/kg)组。上述5组裸鼠，每2天尾静脉给药一次，共给药11次，期间记录小鼠的肿瘤体积以及体重。实验结果如图24a,b所示，U251/TR肿瘤对TMZ具有很强的耐药性，在相同剂量下，其对U251/TR肿瘤的抑制率仅为10.5％(vs U251肿瘤的抑制率为42.5％)。虽然增加TMZ的给药剂量在一定程度上能增加抑制率，但这也增加了机体毒副作用。如图24c所示，随着化疗药物的给药量增加，小鼠体重降低量增加且小鼠死亡率也增加，在50mg/kg剂量下，其死亡率高于空白对照组(图24d)。然而1@纳米药物1组在50mg/kg剂量下可达到高于TMZ的肿瘤抑制效果(图24a)，其抑制率为65.8％(图24b)，且随给药量增加，其肿瘤抑制率可达到90.0％(100mg/kg，图24b)。1@纳米药物1随着给药量的增加其肿瘤抑制效果增加，但其仍未产生显著的毒副作用(图24c,d)，即使在100mg/kg剂量下，小鼠体重趋于正常，且观察期间小鼠存活率为100％。实验结果表明，1@纳米药物1不仅仅在细胞成眠对肿瘤细胞和其耐药肿瘤细胞具有无选择性抑制作用，其对肿瘤和其耐药肿瘤也产生无选择性抑制作用，表明其具有抑制耐药肿瘤的潜力。
在多种肿瘤模型中，1@纳米药物1相都表现出优异的协同抗肿瘤效果，且相对于化疗药物，其不仅呈现了优异的肿瘤治疗效果，且避免了化疗药物对机体造成的毒副作用。上述实验结果表明，简单的将抗氧化剂直接物理混合，无法达到优异的协同效果，主要是由于天然抗氧化剂在体内循环时间短，无肿瘤靶向性。将抗氧化剂制备纳米药物，虽然能促进其富集于肿瘤组织，但是药物联用时，仍无法达到最佳的协同肿瘤抑制效果。而我们将可相互循环的抗氧化以最优比例同时负载于纳米粒中，可实现以固定的最优比例同时递送抗氧化剂进入肿瘤细胞，且抗氧化剂还能在肿瘤细胞内相互循环再生，进而放大抗氧化剂的治疗疗效，实现最优的协同肿瘤治疗效果。因此，1@纳米药物1具有潜在的临床开发价值。通过该方法，能实现多种天然抗氧化剂纳米药物的开发。
上述体内协同抗肿瘤实验显示，在所述天然抗氧化剂纳米药物的粒径不超过500纳米的情况下，都可以取得较好的体内协同抗肿瘤效果，当所述天然抗氧化剂纳米药物的粒径在100～200纳米时体内协同抗肿瘤效果更佳，推测主要是由于该粒径范围的纳米药物能够通过实体瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR效应)在肿瘤部位富集，实现被动靶向效果。
实施例12
参照实施例2-5及实施例9、11的实验方法，将其中的维生素C替换成其衍生物抗坏血酸棕榈酸酯，得到相似的体外体内肿瘤抑制效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物，其特征在于，包括纳米载体以及按一定比例同时负载于所述纳米载体中的2种及其以上的天然抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述天然抗氧化剂选至硫辛酸、维生素C、维生素K3、花青素、百里香醌、姜黄素、染料木黄酮、表没食子茶素没食子酸酯及其药学上可接受的衍生物。
3.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米载体选至脂质体、囊泡、胶束。
4.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述天然抗氧化剂之间的配比是通过体外方法筛选得到抗氧化剂协同效果最优比。
5.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述天然抗氧化剂能够在细胞内相互循环再生。
6.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，其中一种天然抗氧化剂为硫辛酸和/或硫辛酸衍生物。
7.一种天然抗氧化剂纳米药物中天然抗氧化剂负载比例的体外筛选方法，其特征在于，所述天然抗氧化剂纳米药物为权利要求1所述的纳米药物，所述筛选方法包括以下步骤：
（1）将所述2种及其以上的天然抗氧化剂按照不同比例混合并负载于纳米载体中，制备得到一系列负载比例不同的天然抗氧化剂纳米药物；
（2）将步骤（1）中制备的负载比例不同的纳米药物分别以不同的浓度与肿瘤细胞进行体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，通过细胞存活率计算协同指数（CI），选择具有最低CI值且CI值小于0.9的纳米药物对应的天然抗氧化剂负载比例作为目标配比。
8.根据权利要求7所述的体外筛选方法，其特征在于，所述协同指数（CI）的计算方法具体为：根据共培养实验中得到的一系列细胞存活率，绘制联合用药时的肿瘤抑制率-浓度曲线，根据曲线得到联合用药达到某一特定肿瘤抑制率时所对应的各天然抗氧化剂的浓度D1、D2、…、Dn，然后，按照以下公式计算协同指数（CI）：CI = D1/Dx1 + D2/Dx2 +…+ Dn/Dxn；其中Dx1、Dx2、…、Dxn分别为单独负载天然抗氧化剂纳米药物达到该特定肿瘤抑制率时对应的浓度。
9.根据权利要求7所述的体外筛选方法，其特征在于，还包括步骤（3）：将单独负载各天然抗氧化剂的纳米载体按照步骤（2）中得到的目标配比混合后形成的载体混合物以不同的浓度与肿瘤细胞进体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，计算该载体混合物以及具有目标配比的纳米药物中天然抗氧化剂之间的协同指数，如果具有目标配比的纳米药物的协同指数小于载体混合物对应的协同指数，则说明目标配比具有较好的协同抗肿瘤效果。
10.权利要求1所述纳米药物的应用，其特征在于，将其用于体内或体外抗肿瘤效果测试以及制备临床抗肿瘤药物，或将其用于制备具备抗多药耐药作用的抗肿瘤药物。
CN202210137357.9A 2022-02-15 2022-02-15 一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法 Pending CN116637107A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210137357.9A CN116637107A (zh) 2022-02-15 2022-02-15 一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210137357.9A CN116637107A (zh) 2022-02-15 2022-02-15 一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116637107A true CN116637107A (zh) 2023-08-25

Family

ID=87642251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210137357.9A Pending CN116637107A (zh) 2022-02-15 2022-02-15 一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116637107A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110293525A1 (en) * 2010-05-29 2011-12-01 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Tumor stem cells
CN103841961A (zh) * 2011-07-28 2014-06-04 雪松-西奈医学中心 在两亲性间隔基或两亲性聚合物上包含治疗剂的抗氧化剂、神经保护和抗肿瘤纳米颗粒
CN104523500A (zh) * 2014-12-12 2015-04-22 唯美度科技（北京）有限公司 一种含有双效植物活性成分的组合物及其制备工艺
CN104672441A (zh) * 2015-02-10 2015-06-03 长春艾诺生化医药有限责任公司 聚乙二醇-硫基辛酸-维生素e共聚物及制备方法和应用
WO2018010624A1 (zh) * 2016-07-15 2018-01-18 苏州大学 内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用
CN108553458A (zh) * 2018-04-25 2018-09-21 四川大学 一种抗肿瘤纳米药物
CN110302175A (zh) * 2019-06-20 2019-10-08 四川大学 一种含疏水空腔硫辛酸纳米胶囊及其制备方法和应用
CN111001006A (zh) * 2019-12-26 2020-04-14 沈阳药科大学 葫芦素b和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒
US20210268110A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Joyce H. Ma Formulations and uses thereof

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110293525A1 (en) * 2010-05-29 2011-12-01 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Tumor stem cells
CN103841961A (zh) * 2011-07-28 2014-06-04 雪松-西奈医学中心 在两亲性间隔基或两亲性聚合物上包含治疗剂的抗氧化剂、神经保护和抗肿瘤纳米颗粒
CN104523500A (zh) * 2014-12-12 2015-04-22 唯美度科技（北京）有限公司 一种含有双效植物活性成分的组合物及其制备工艺
CN104672441A (zh) * 2015-02-10 2015-06-03 长春艾诺生化医药有限责任公司 聚乙二醇-硫基辛酸-维生素e共聚物及制备方法和应用
WO2018010624A1 (zh) * 2016-07-15 2018-01-18 苏州大学 内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用
CN108553458A (zh) * 2018-04-25 2018-09-21 四川大学 一种抗肿瘤纳米药物
US20210093607A1 (en) * 2018-04-25 2021-04-01 Sichuan Yuanning Biological Technology Co., Ltd. Antitumor nano-drug
CN110302175A (zh) * 2019-06-20 2019-10-08 四川大学 一种含疏水空腔硫辛酸纳米胶囊及其制备方法和应用
CN111001006A (zh) * 2019-12-26 2020-04-14 沈阳药科大学 葫芦素b和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒
US20210268110A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Joyce H. Ma Formulations and uses thereof

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNYAN LIAO，等: "Dietary Antioxidant-Constructed Nanodrugs Can High-Efficiently Kill Cancer Cells while Protecting Noncancer Cells", ACS APPL MATER INTERFACES, 31 October 2022 (2022-10-31), pages 49508 *
HU CAIBIAO，等: "Development and characterization of a self-double-emulsifying drug delivery system containing both epigallocatechin-3-gallate and α-lipoic acid", JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE, vol. 50, no. 20, 17 August 2015 (2015-08-17), pages 6567 - 6577, XP035519616, DOI: 10.1007/s10853-015-9194-7 *
SAMUEL DAVIES，等: "Simultaneous nanoencapsulation of lipoic acid and resveratrol with improved antioxidant properties for the skin", COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES, 12 April 2020 (2020-04-12), pages 1 - 10 *
ZHAO GUODONG，等: "n vitro evaluation of chitosan-coated liposome containing both coenzyme Q10 and alpha-lipoic acid: Cytotoxicity, antioxidant activity, and antimicrobial activity", OURNAL OF COSMETIC DERMATOLOGY, vol. 17, no. 2, 11 April 2018 (2018-04-11), pages 258 - 262 *
付晓瑞;董旭辉;孙振昌;张明智;: "硫辛酸联合恩再适治疗化疗药物致周围神经病变的疗效观察", 中国全科医学, no. 11, 15 April 2010 (2010-04-15), pages 1232 - 1233 *
张仕勇，等: "基于交联小分子胶束纳米载药系统的设计、合成及生物评价", 中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集, 10 October 2017 (2017-10-10), pages 43 *
黄勇超;施冬云;刘珊林;刘志昕;俞培忠;沈新南;: "α-硫辛酸对缺氧应激肝癌细胞线粒体呼吸率和产能代谢的影响", 生物物理学报, no. 06, 15 December 2007 (2007-12-15), pages 436 - 442 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Magnetic functionalised carbon nanotubes as drug vehicles for cancer lymph node metastasis treatment
Zhou et al. Shape regulated anticancer activities and systematic toxicities of drug nanocrystals in vivo
Wang et al. Tumor-derived exosomes reversing TMZ resistance by synergistic drug delivery for glioma-targeting treatment
EP3795151A1 (en) Antitumor nano medicament
CN104042567A (zh) 一种蛇葡萄素纳米胶束及其应用
CN113521075A (zh) 5-氟尿嘧啶与紫杉醇联合使用在制备治疗乳腺癌的药物中的用途
WO2022052413A1 (zh) 具有不对称膜结构的载药聚合物囊泡及其制备方法与在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用
CN113304119A (zh) 一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法
CN108542880B (zh) 一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法
WO2023280128A1 (zh) 一种多西他赛胶束纳米药物及其制备方法与应用
CN113648401B (zh) 一种蛋白酶体抑制增敏光动力治疗的杂化纳米组装体及其制备与应用
CN110585132A (zh) 一种槲皮素纳米胶束及其制备方法和用途
CN108186772B (zh) 一种柠檬外泌体的修饰方法
CN107007550B (zh) 一种氧化还原响应性两亲性共聚物及其制备方法和应用
CN109224063A (zh) 双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用
CN106606783B (zh) 一种靶向共递释光敏剂与化疗药物的药物递释系统
CN108853056B (zh) 一种叶酸靶向修饰共载盐酸阿霉素和藤黄酸纳米结构脂质载体制剂及其制备方法
Li et al. Targeted delivery of curcumin to polyethylene-induced osteolysis by magnetically guided zoledronate-anchored poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles via repressing NF-κB signaling
CN116650673A (zh) 细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用
CN116637107A (zh) 一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法
CN112569206A (zh) 一种具有抗肿瘤转移和靶向功能的白蛋白纳米递药系统及其制备方法
CN116036289A (zh) 一种增强铁死亡治疗效果的纳米制剂及其制备方法和应用
CN114681430A (zh) 一种白藜芦醇卵磷脂纳米粒及其制备方法、用途
Fan et al. Polysialic acid self-assembled nanocomplexes for neutrophil-based immunotherapy to suppress lung metastasis of breast cancer
CN111249254B (zh) 一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination