CN111214439A - 一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及细菌抗毒素治疗药物，具体涉及一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统及其用途，所述的纳米药物系统采用挤压过膜法，高压均质法或微射流法将红细胞膜和磷脂膜融合制成红细胞膜杂合脂质体，进一步制成抗细菌感染药物，该纳米药物，通过将细菌成孔毒素吸附于其表面，中和毒素的毒性实现细菌抗毒素治疗，从而提高抗细菌感染治疗尤其是耐药细菌感染的效果。本发明为临床实践提供了一种针对抗细菌感染的新的干预策略。

Description

一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统及其用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及细菌抗毒素治疗药物，具体涉及一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统及其用途，该纳米药物通过将细菌成孔毒素吸附于其表面，中和毒素的毒性实现细菌抗毒素治疗，从而提高抗细菌感染治疗尤其是耐药细菌感染的效果。

背景技术

目前，细菌感染仍然是世界范围内的一种高发病率和致死率的疾病，细菌耐药对于抗细菌感染治疗带来了更多挑战，因此，业内急需设计新型策略以改善细菌感染的治疗效果。研究报道了成孔毒素(Pore-forming toxins，PFTs)是细菌感染主要的毒力因子成分，其主要通过在细胞膜上形成孔道，改变细胞膜通透性而杀伤靶细胞(Bischofberger M，Iacovache I，van der Goot FG.Pathogenic pore-forming proteins：function andhost response.Cell Host Microbe.2012；12：266-75.)。成孔毒素主要是成孔蛋白，在细菌感染过程中，通过破坏机体上皮屏障和免疫系统来促进病原菌的生长、侵袭和定殖(DalPeraro M，van der Goot FG.Pore-forming toxins：ancient，but never really out offashion.Nat Rev Microbiol.2016；14：77-92.)。因此，成孔毒素已成为目前细菌感染主要的预防和治疗靶点；由此，产生了抗毒力因子的策略，即通过抑制成孔毒素来进行预防和治疗细菌感染；拮抗毒素并非直接杀灭细菌，因此所述的治疗方法对耐药性细菌感染具有更重大的意义。

传统的抗毒素药物包括一些小分子拮抗剂和抗体，通过中和毒素或阻断毒素结合位点以实现阻碍毒素孔道形成的作用，所述抗毒素药物由于全身非特异分布，清除快，导致给药剂量高，副作用大，而且由于拮抗剂往往针对单一毒素，通用性差，均使得传统的抗毒力因子药物应用受到极大限制。

近年来，基于纳米技术的抗毒素策略受到越来越多的关注。纳米药物具有吸附表面积大，循环时间长，靶向性强等一系列优势。红细胞是众多成孔毒素主要的靶细胞，成孔毒素会吸附在细胞膜上，在细胞膜表面形成孔道，发挥其毒力效果。根据成孔毒素的作用机制，本技术领域的研究者合成各类仿红细胞纳米粒来吸附成孔毒素，以用于细菌感染的治疗，如Zhang Liangfang等人制备了红细胞膜包被的PLGA纳米粒(纳米海绵)用于清除细菌成孔毒素(Hu CM，Fang RH，Copp J，Luk BT，Zhang L.A biomimetic nanosponge thatabsorbs pore-forming toxins.Nat Nanotechnol.2013；8：336-40.)；有研究者制备含鞘磷脂和胆固醇的脂质体用于吸附成孔毒素(Henry BD，Neill DR，Becker KA，Gore S，Bricio-Moreno L，Ziobro R，et al.Engineered liposomes sequester bacterialexotoxins and protect from severe invasive infections in mice.NatBiotechnol.2015；33：81-8.)；研究表明，成孔毒素在细胞膜上的特异性吸附与细胞膜表面的多种受体(包括糖类，脂质，蛋白质)密切相关，单纯的人工脂质膜难以完全模拟细胞膜的成分、结构和功能，其解毒谱较窄，体内稳定性也较差，应用受到很大的限制。研究显示，红细胞膜包被的纳米粒虽然解毒谱较广，但其解毒能力较弱，而且其包被过程复杂，对纳米粒内核要求高，稳定性较差，难以大规模生产；此外，细胞膜蛋白成份易在包被纳米粒过程中失活，易进一步削弱纳米海绵的解毒效果，使红细膜的资源利用效率进一步降低；因此，构建新型的、具有高解毒效率、高稳定性、易生产的仿红细胞纳米粒对于成孔毒素的解毒和抗细菌感染治疗尤为重要。

基于现有技术的现状及背景，本申请的发明人拟构建一种新型的红细胞膜杂合脂质体系统(或称红细胞脂质体)，该红细胞脂质体整合人工脂质囊泡和天然红细胞膜的优势，实现细菌成孔毒素的高效吸附与清除。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种新型的红细胞膜杂合脂质体系统(或称红细胞脂质体)；具体涉及一种高效吸附细菌成孔毒素的仿红细胞纳米系统，及红细胞膜和脂质材料组合物及其用途，该红细胞膜杂合脂质体纳米系统通过吸附成孔毒素并将其转运至肝脏进行清除，实现拮抗毒素的目的。

本发明构建了一种新型的红细胞膜杂合脂质体系统(或称红细胞脂质体)，本发明从全血中分离红细胞，并提取红细胞膜，将其与磷脂材料(含磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG))进行融合，制备成红细胞膜杂合脂质体；本发明进行了体外分析其结构和蛋白组成，探讨其稳定性，通过体外红细胞溶血实验证实了其高解毒效率，以及通过皮下注射对皮肤局部进行抗毒素治疗评价，通过静脉注射进行全身抗毒素治疗评价；该红细胞脂质体整合人工脂质囊泡和天然红细胞膜的优势，能实现细菌成孔毒素的高效吸附与清除。

本发明为临床实践提供了一种针对抗细菌感染的治疗策略，尤其是将人工脂质囊泡和天然红细胞膜进行融合构建了稳定的红细胞膜杂合脂质体，并用于对抗细菌毒素和细菌感染的治疗。

更具体的，本发明提供了具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，所述的纳米药物系统为红细胞膜和磷脂膜融合形成的红细胞膜杂合脂质体。

本发明中，纳米材料包括磷脂材料和红细胞膜，其中，磷脂材料为磷脂酰胆碱，DSPE-PEG，和/或胆固醇。

本发明中，所述的磷脂膜由磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成。

本发明中，所述的红细胞膜和磷脂的表面积比为1∶32～1∶1。

本发明中，所述的红细胞膜和磷脂膜融合方法采用挤压过膜法，高压均质法或微射流法中的一种。

本发明中，红细胞膜杂合脂质体的粒径在80～200nm，优选100-120nm。

本发明中，所述的磷脂膜中磷脂酰胆碱与聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为9∶1。

本发明中，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为2000道尔顿，3000道尔顿，优选2000道尔顿。

进一步，本发明通过以下技术方案实现抗细菌成孔毒素策略研究：

(1)全血中分离红细胞，进一步提取红细胞膜，将适量红细胞膜与磷脂材料制备的人工脂膜融合制备红细胞膜杂合脂质体；

(2)采用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、差式扫描量热法(DSC)、荧光共振能量转移(FRET)技术、激光共聚焦显微镜对红细胞膜和脂质体膜的融合情况进行了表征；

(3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot、非标定量蛋白组学、免疫荧光标记法对红细胞膜杂合脂质体的蛋白成分及朝向进行了分析；

(4)对红细胞膜杂合脂质体的理化性质进行表征，如采用Zeta/激光粒度仪测定其粒径、电位和多分散系数，透射电镜观察其形态，并考察其放置稳定性与冻干稳定性；

(5)体外溶血实验评价红细胞膜杂合脂质体的体外毒素吸附能力，通过人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞毒性实验评价该纳米药物的体外毒素吸附能力和对HUVECs细胞的保护作用；

(6)采用荧光标记红细胞膜杂合脂质体，研究其在体内的循环时间及在体内的生物分布情况。

(7)通过考察红细胞膜杂合脂质体对局部皮肤毒素吸附情况来评价其体内局部解毒效果；

(8)通过考察红细胞膜杂合脂质体对体内血液中毒素吸附情况来评价其全身解毒效果。

(9)通过局部细菌感染实验考察红细胞膜杂合脂质体的体内局部抗细菌感染效果；

(10)考察红细胞膜杂合脂质体的体内安全性。

本发明进一步提供了所述红细胞膜杂合脂质体及其在治疗细菌感染中的用途，该纳米药物可以吸附细菌成孔毒素；本发明为临床实践提供了一种针对抗细菌感染治疗的干预策略，该策略包括将人工脂质和天然红细胞膜进行融合，构建红细胞膜杂合脂质体，实现成孔毒素的中和以及体内清除，从而改善抗细菌感染治疗的效果。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1，红细胞膜杂合脂质体制备及细菌成孔毒素吸附示意图：通过薄膜水化以及挤压法制备红细胞膜融合脂质体，其中显示，磷脂、DSPE-PEG和或胆固醇成膜后，水化后加入红细胞膜，通过挤压制备红细胞膜杂合脂质体(以下简称RM-PLs)，细菌成孔毒素(如：α溶血素)会在RM-PLs上形成孔道，从而吸附在RM-PLs上，达到解毒的效果。

图2，其中，图A为一对FRET探针标记脂质后，与不同量的红细胞膜融合制备红细胞膜杂合脂质体，固定激发波长460nm扫描红细胞膜杂合脂质体得到的荧光光谱图(图中Lm∶RBCm表示磷脂膜和RBC膜蛋白的质量比)；图B为用不同荧光染料分别标记脂质膜(红色)和红细胞膜(绿色)后制备的红细胞膜杂合脂质体(左)和物理混合物(右)的激光共聚焦显微镜照片；图C为采用差式扫描量热法对红细胞膜杂合脂质体进行了表征；图D为采用傅里叶变换红外光谱仪测得的杂合脂质体的红外光谱图；PLs为普通脂质体，RMVs为红细胞膜囊泡，RM-PLs为红细胞膜杂合脂质体。

图3，RM-PLs膜蛋白组成，其中(A)RM-PLs和RMVs的SDS-PAGE分析；(B)CD47和ADAM10在RM-PLS和RMVs中的Western印迹分析；(C)RM-PLS和RMVs中鉴定的蛋白数目；(D)通过生物过程对RM-PLs膜蛋白质分类；(E)通过分子功能对RM-PLs膜蛋白质分类；(F)RM-PLS和RMVs中典型膜蛋白表达的热图；(G)糖基化膜蛋白在RM-PLS和RMVs中的定位和朝向分析。

图4，红细胞膜杂合脂质体的表征结果(PLs为普通脂质体，RMVs为红细胞膜囊泡，RM-PLs为红细胞膜杂合脂质体)，其中，图A为透射电镜结果，图B为粒径分布，图C为多分散系数数值，图D为Zeta电位值，图E为红细胞膜杂合脂质体放置稳定性实验，图F为红细胞膜杂合脂质体冻干前后粒径变化测定。

图5，高浓度红细胞膜杂合脂质体的稳定性分析。

图6，RM-PLs的体外毒素吸附效果，其中，图A为溶血试验结果(saline为溶剂阴性对照组，Triton X-100为全溶血阳性对照组，Hla+saline为毒素组，Hla+PLs为普通脂质体组，Hla+RMVs为红细胞膜囊泡组，Hla+RM-PLs为红细胞膜杂合脂质体组)；图B是图A的半定量分析，*P＜0.0001，与Hla+RM-PLs比较；图C为定量RM-PLs(10μg)与不同量体外毒素孵育吸附后的溶血结果，*P＜0.0001，与6μg Hla比较；图D为不同量的RM-PLs与定量毒素孵育吸附后的溶血结果，*P＜0.0001，与6μg RM-PLs比较；图E为采用ADAM10抗体阻断RM-PLs后的RM-PLs的吸附毒素能力；*P＜0.0001，与Anti-ADAM10或RM-PLs比较；#P＜0.001，与RM-PLs比较；图F为HUVECs细胞毒性实验评价该RM-PLs的体外毒素吸附能力和对HUVECs的保护作用，*P＜0.0001，与RM-PLs比较。

图7，RM-PLs的体内毒素吸附效果(局部皮肤解毒)，其中，图A为局部皮肤解毒效果照片；图B为注射部位皮肤和附近肌肉组织样品切片的H&E染色和TUNEL染色显微镜照片。

图8，RM-PLs的体内毒素吸附效果(全身解毒)，其中，图A为RM-PLs体内循环时间考察；图B为RM-PLs体内分布情况考察；图C为先静脉注射RM-PLs后静脉注射致死剂量毒素的小鼠生存曲线；图D先静脉注射致死剂量毒素后静脉注射RM-PLs的小鼠生存曲线。

图9，RM-PLs的抗细菌感染治疗效果。

图10，RM-PLs的体内安全性评价，包括给药后动物的血常规，血生化结果，以及主要脏器切片H&E染色结果。

具体实施方式：

本实施方式中选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分泌的主要成孔毒素α-溶血素(Hla)为成孔毒素代表，探讨红细胞膜杂合脂质体对成孔毒素的吸附清除作用(如图1所示)；

以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步ANOVA法，两组比较采用双侧t检验法。

实施例1：红细胞膜杂合脂质体的构建

本实施例中首先从小鼠全血中分离出红细胞，再通过低渗和离心法提取红细胞膜，具体操作如下：ICR雄性小鼠摘眼球取血，1ml全血用肝素钠抗凝后，700g，4℃离心收集红细胞，加入10mL含1mM EDTA的PBS溶液重悬红细胞，重复以上步骤洗涤红细胞3次，收集底部红细胞。再用PBS将红细胞配成红细胞悬液，每0.25ml分装至1.5mL EP管中，加入950μL0.2mM EDTA水溶液，混合均匀涡旋破碎红细胞，再加入50μL 20×PBS调节至等渗，4℃下20,000g离心10min，弃去上清。再加入950μL 0.2mM EDTA水溶液，重复上述步骤直到得到类白色红细胞膜。最后加入0.25mM EDTA水溶液重悬，定容体积与红细胞悬液体积相同。-80℃冰箱保存待用；

本实施例中红细胞膜杂合脂质体制备方法为薄膜水化挤出法，具体操作如下(如表1所示)：适量的磷脂酰胆碱(PC)、DSPE-PEG₂₀₀₀和或胆固醇(PC与DSPE-PEG₂₀₀₀质量比9∶1)用8mL二氯甲烷溶解后加入到50mL茄形瓶中，室温下旋转蒸发除去二氯甲烷，形成脂质薄膜。加入1.85mL纯水水化，加入适量红细胞膜混合均匀，冰浴超声1min，用脂质体挤出器多次分别过400nm，200nm和100nm微孔膜，得到红细胞膜杂合脂质体(RM-PLs)悬液，如表1所示，不同PC、RBC膜投量比所制备的红细胞膜杂合脂质体粒径在100～120nm之间，电位在-36～41mV之间，将表1的处方2按100倍比例放大，采用360mg PC，40mg DSPE-PEG₂₀₀₀同上成膜水化，和15mL RBC膜混合后超声，然后微射流或高压均质机法制备RM-PLs，所得RM-PLs在100nm左右，电位约为-38mV，显示RM-PLs可以规模化生产；

为了便于下一步进行体外表征及体内药动学和药效学的实验，未特别指定的情况下，RM-PLs采用处方2进行制备，即采用3.6mg PC，0.4mg DSPE-PEG₂₀₀₀和0.15mL RBC膜制备RM-PLs；同上，不加红细胞膜，加入2mL纯水水化制备普通脂质体悬液(PLs)，作为对照。荧光标记的脂质体制备方法同上，只需要将适量的荧光素加入PC和DSPE-PEG₂₀₀₀的二氯甲烷溶液中一起成膜。

表1各种处方下红细胞膜杂合脂质体粒径和电位(n＝3)

膜表面积比为磷脂膜与RBC膜的表面积之比。

实施例2：红细胞膜与脂质膜融合实验验证

用荧光能量共振转移(FRET)技术考察膜融合情况，具体操作：首先用FRET荧光染料对标记脂质膜(C6-NBD和RhB-DHPE)，然后加入不同量的红细胞膜分别挤压过微孔膜，制备得到红细胞膜杂合脂质体，并用荧光光谱仪记录光谱图(如图2A所示)。结果显示，随着红细胞膜量的增加，RM-PLs在534nm处(C6-NBD)荧光强度逐渐增强，583nm处(RhB-DHPE)荧光强度逐渐降低，表明红细胞膜成功融合入脂质膜中，增大了FRET染料的间隙导致FRET现象减弱；

用荧光染料分别标记红细胞膜(绿色荧光染料DiI)和脂质膜(红色荧光染料DiD)，再进行红细胞膜杂合脂质体的制备。利用激光共聚焦显微镜进行拍摄，结果表明，RM-PLs中绿色和红色荧光染料基本全部共定位，说明红细胞膜与脂质膜的成功融合。而对照组(红细胞膜和脂质膜的物理混合物)红色和绿色荧光散在分布，无共定位(图2B)；

采用差式扫描量热法(DSC)对红细胞膜杂合脂质体进行热分析，记录得到DSC曲线，并且以普通脂质体和红细胞膜囊泡为对照。结果显示，RM-PLs具有与红细胞膜囊泡一致的峰温(T_m)，与普通脂质体比较，明显向右位移(图2C)，表明红细胞膜成分与人工脂质成功融合；

采用傅里叶红外光谱(FTIR)仪测定红细胞膜杂合脂质体的红外光谱，并与普通脂质体和红细胞膜囊泡进行比较。红外光谱图显示，RM-PLs有与RMVs相同的细胞膜蛋白特征峰(1,700-1,600cm^-1和1,600-1,500cm^-1)(图2D)，结果表明红细胞膜杂合脂质体的成功制备。

实施例2：红细胞膜杂合脂质体的膜蛋白组成及朝向分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定RM-PLs的蛋白质组分。用SDS样品缓冲液制备样品，Bradford法测定样品膜蛋白浓度，蛋白样品在90℃下加热5分钟，10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)上样，120V下运行1小时，然后用考马斯亮蓝染色、成像。Western印迹法检测RM-PLs中的某些特异性蛋白，如CD47和ADAM10。样品用

1×样品缓冲液制备，如上进行SDS-PAGE分离，将蛋白转移到硝酸纤维素膜(PALL)，分别用CD47(ABCAM，美国)和ADAM10(R&D，美国)特异性抗体和相应的辣根过氧化物酶(HRP)结合二抗(1∶200稀释，Jackson，美国)进行检测，然后用固定化的化学发光HRP底物检测蛋白质。SDS-PAGE实验显示，与RMVs相比，RM-PLs保留了几乎所有的细胞膜蛋白(图3A)。CD47是RBC膜上具有免疫调节作用的自身标志物，ADAM10是成孔毒素在RBC细胞膜上的关键受体蛋白。以CD47和ADAM10为特征性的关键蛋白进行Western印迹分析，结果显示两种蛋白在RM-PLs和RMVs上均存在，而且在RM-PLs融合过程中没有损失(图3B)；

为了进一步分析蛋白质组成，利用非标定量蛋白组学法(质谱法)对RM-PLs的膜蛋白质组学进行了研究，并与RMVs进行了比较，将RM-PLs溶解在裂解缓冲液中(7.8mM N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，50mM Tris·HCl，750mM氨基己酸，0.5mM EDTA；pH7)，加入6倍丙酮，-20℃孵育过夜，然后离心收集蛋白质沉淀。BCA定量测定蛋白，蛋白样品用100mM三乙胺硼烷稀释成1mg/mL，胰酶37℃消化蛋白，将多肽样品注入液相质谱仪进行分析。液相条件：NanoACQUITY UPLC系统(Waters)，流动相A：水(含有0.1％甲酸(V/V))，流动相B：99.9％乙腈，0.1％(V/V)甲酸。将5μL的肽样品注入Trap柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18，100μm×2cm)中，以10μL/min的流速流动3min，然后在分析柱(Acclaim PepMap C18，75μm×25cm)上分离，流动相以线性梯度在110分钟内从5％B上升到30％B，然后在初始条件下重新平衡10分钟，流速保持在300nL/min，柱温保持在45℃，质谱条件：采用2kV的正电喷雾电压，使用300℃的毛细管温度。对于Oribitrap融合MS检测，通过扫描m/z 350-1550，分辨率为120000(m/z 200)，目标自动增益控制(AGC)值为1×10⁶，最大注入时间为50ms，在Orbitrap中进行前体扫描，归一化碰撞能量设置为35％，用于高能碰撞诱导解离(HCD)。典型的质谱扫描条件如下：AGC值2×10⁵；100毫秒的最大填充时间；碎片强度阈值50□000。MS/MS固定第一质量为110；

通过搜索Uniprot数据库，在RMVs中鉴定出150种小鼠膜蛋白，与前人研究中的目录一致(Pasini EM，Kirkegaard M，Salerno D，Mortensen P，Mann M，Thomas AW.Deepcoverage mouse red blood cell proteome：a first comparison with the human redblood cell.Mol Cell Proteomics.2008；7：1317-30.Bryk AH，WisniewskiJR.Quantitative Analysis of Human Red Blood Cell Proteome.J ProteomeRes.2017；16：2752-61.)；有趣的是，在RM-PLs中鉴定出了几乎所有这些膜蛋白(148)(图3C)，表明RM-PLs与RMV具有相同的膜蛋白种类；根据生物学过程(图3D)对RM-PLs蛋白进行分类：转运(28.4％)、内质网应激反应(12.8％)、蛋白折叠(10.6％)、蛋白转运(9.2％)、宿主对病毒基因组复制的正调控(7.8％)、血小板聚集(7.1％)、细胞氧化还原稳态(6.4％)和其他(17.7％)；根据分子功能RM-PLs蛋白分类为：GTP结合(33.8％)、蛋白结合(19.0％)、钙粘蛋白结合(9.7％)、蛋白二硫异构酶活性蛋白结合(9.2％)、未折叠蛋白结合(8.2％)、GDP结合(7.2％)、核苷酸结合(5.6％)，GTPase活性(4.1％)，肌动蛋白结合(3.2％)(图3E)；进一步对36种典型的红细胞膜蛋白进行定量分析，发现RM-PLs与RMVs的蛋白丰度具有高度的一致性，表明RM-PLs保留了与RMVs几乎相同的蛋白种类和相同的蛋白表达水平，如阴离子交换蛋白(Band 3(gene：Slc4a1))、细胞骨架蛋白(例如Spectrin(gene：Spta1)，Ankyrin 1(gene：Ank1)，Tropomyosin 1(gene：Tpm1)，Alpha-adducin(gene：Add1)，Protein 4.1(gene：Epb4.1)，和小鼠特异性Gamma-adducin(gene：Add3))，与自身耐受相关的白细胞表面抗原CD47、PFT受体ADAM10(图3F)；尤其是，ADAM10在RM-PLs中的表达水平较高，占膜蛋白总量的0.031％；

利用小麦胚芽凝集素(WGA)与N-乙酰神经氨酸残基和N-乙酰氨基葡萄糖选择性结合的特点，以荧光标记的WGA为探针，对RM-PLs中红细胞膜糖蛋白进行定位，探讨膜蛋白在RM-PLs中的分布取向。样品与Texas Red-X标记的WGA(Texas Red-X-WGA，激发/发射＝595/615nm，Thermo Fisher Science，美国)在PBS中孵育30分钟，然后通过透析去除未结合的Texas Red-X-WGA；流式细胞法(CytoFLX，贝克曼，美国)测定对样品中RM-PLs的荧光强度。结果表明，WGA可以标记RM-PLs和RMVs，无法标记PLs，表明融合后RM-PLs表面保留了糖蛋白且方向正确(图3G)；脂质双分子层是构成质膜的基本结构，而膜蛋白负责大多数膜功能，如转运体、受体和酶等；以上结果表明，RM-PLs与RMVs一样保留了相同的膜蛋白组成，正确取向的蛋白质将赋予RM-PLs与RBC相似的生物功能，如与成孔毒素结合。

实施例4：红细胞膜杂合脂质体的理化性质表征

采用醋酸铀负染后透射电镜下观察，杂合脂质体呈规则球形，大小均一(图4A)，电位/激光粒度仪测定结果显示，杂合脂质体平均粒径为117.4±2.3nm(图4B&C)，电位为-36.0±0.2mv(图4D)。

实施例5：红细胞膜杂合脂质体的稳定性考察

考察红细胞膜杂合脂质体在PBS溶液中，4℃条件下的放置稳定性。结果表明在一周的时间内，红细胞膜杂合脂质体粒径稳定，无明显聚集现象(图4E)，说明该纳米药物在4℃条件下具有较好的放置稳定性；此外，以10％蔗糖为冻干保护剂将红细胞膜杂合脂质体进行冷冻干燥得到冻干粉，采用适量纯水重悬，测定粒径，结果显示冻干前后粒径无显著性差异(图4F)，说明该纳米药物具有较好的冻干稳定性，可冻干后长期储存；

考察高浓度红细胞膜杂合脂质体在PBS溶液中，4℃条件下的放置稳定性，并且与红细胞包被的PLGA纳米粒(纳米海绵，RBC-NP，参考文献(Hu CM，Fang RH，Copp J，Luk BT，Zhang L.A biomimetic nanosponge that absorbs pore-forming toxins.NatNanotechnol.2013；8：336-40.)制备)相比较，结果显示(图5)，无论浓度是30mg/ml，40mg/ml，RM-PLs在储存期内，粒径均未发生显著性变化，而RBC-NP则在1天后粒径显著性增大，粒子发生明显聚集。

实施例6：红细胞膜杂合脂质体的体外解毒能力考察

采用体外溶血实验对红细胞膜杂合脂质体吸附毒素能力进行了考察。具体操作如下：小鼠摘眼球取全血1mL，适量肝素钠抗凝并加入10mL PBS，700g室温离心5min，弃去上清，重复上述步骤用PBS洗涤三次，收集底部红细胞，用PBS将红细胞配成2.5％红细胞悬液，4℃保存待溶血实验使用。将2μg毒素与5μL RM-PL、RMVs和PLs(2mg/ml)混合，10％蔗糖水溶液补足共200μL，室温孵育30min后，加入1.8mL 2.5％红细胞悬液，37℃孵育2h，室温2000g离心5min，吸取上清100μL，用PBS 1∶1稀释后，酶标仪测定样品在540nm处的吸光度，计算溶血百分数，计算公式如下：

其中，阴性对照为saline溶液，阳性对照为TritonX-100溶液。结果显示，RM-PLs能吸附毒素，继而抵抗毒素对红细胞的溶血作用，RBC未发生溶血，而PLs和RMVs组的RBC均有严重的溶血情况产生(图6A&B)，结果表明，PLs和RMVs不能中和毒素分子，而RM-PLs有较好的中和Hla毒素分子能力；

将实施例1中处方的RM-PLs同上做解毒能力实验，结果表明，所有RM-PLs均能有效保护RBC不发生溶血(溶血百分数与阴性对照无显著性差异)，有较好的中和Hla毒素分子能力；将实施例2中冻干的RM-PLs同上做解毒能力实验，结果表明，冻干的RM-PLs和新鲜的RM-PLs一样能有效保护RBC不发生溶血，有较好的中和Hla毒素分子能力。

实施例7：红细胞膜杂合脂质体的体外解毒效率

研究RM-PLs吸附毒素的量效关系，首先固定RM-PLs的量(10μg)，加入不同量毒素与RM-PLs孵育，同实施例6进行RBC的溶血试验，如图6C所示，当毒素用量低于4μg，RBC不发生溶血；而当毒素用量增至6μg以上，RBC发生部分溶血，固定毒素的量(4μg)，加入不同量的RM-PLs孵育，同上进行RBC的溶血试验实验，如图6D所示，当RM-PLs用量在5μl以上(10μg)，RBC不发生溶血；结果表明，RM-PLs具有良好的毒素吸附性能，能抵抗体外实验中毒素的溶血作用，10μg RM-PLs即可解4μg的毒素，相当于采用0.3ml RBC膜制备的RM-PLs可以解1.6mg的毒素。按照哺乳动物红细胞计数5.0×10⁹/ml计算，每个RBC制备所得的RM-PLs可以清除3.89×10⁷个Hla毒素分子(Hla分子量为33,000Da)；

参考文献(Hu CM，Fang RH，Copp J，Luk BT，Zhang L.A biomimetic nanospongethat absorbs pore-forming toxins.Nat Nanotechnol.2013；8：336-40.)，制备RBC-NP，将RBC-NP与毒素孵育，同上考察RBC-NP对毒素的吸附作用，结果表明，1mg的RBC-NP可以吸附22μg的Hla毒素，与上述文献报道完全一致，将RBC-NP密度按1.2mg/ml计，每个RBC-NP表面可吸附约85个Hla毒素分子，将每个红细胞的表面积以75μm²计(R.E.Waugh，I.H.Sarelius，Effects of lost surface area on red blood cells and red bloodcell survival in mice，Am.J.Physiol.271(1996)1847-1852.)，则每个红细胞可以制备约3300个RBC-NP，因此每个RBC制备所得的RBC-NP可以清除2.81×10⁵个Hla毒素分子(Hla分子量为33,000Da)；

上述结果表明，RM-PLs具有很高的解毒效率，每个RBC制备所得的RM-PLs的解毒能力相当于相应RBC-NP的139倍。

实施例8：红细胞膜杂合脂质体的解毒机理探索

将10μg RM-PLs与10μL ADAM10抗体预先室温孵育30min，然后再与4μg毒素混合，室温孵育30min，然后同实施例6进行RBC溶血试验，如图6E所示，采用抗体阻断RM-PLs表面的ADAM10(Hla毒素的重要受体之一)可以显著降低RM-PLs的解毒能力，RBC发生部分溶血，结果表明RM-PLs表面的ADAM10对于Hla毒素的吸附具有很重要的影响。

实施例9：红细胞膜杂合脂质体的对正常细胞的保护作用

以HUVEC细胞以3×10⁴个/孔接种至96孔板，培养24h。将定量的RM-PLs(10μg)与不同量的Hla毒素混合，室温孵育30min后加到HUVEC细胞中，培养24h，吸去上清，继续细胞培养48h，MTT法测定细胞的活力(图6F)，结果表明，RM-PLs具有良好的毒素吸附性能，能抵抗毒素对HUVEC细胞产生的细胞毒性作用。

实施例10：红细胞膜杂合脂质体的体内局部解毒能力考察

将2μg毒素与5μL RM-PL(10μg)混合，10％蔗糖水溶液补足共150μL，室温孵育30min后，注射至BALB/c裸鼠后肢皮下，saline组作为阴性对照，并与PLs组进行比较，3天后观察裸鼠皮肤外观并拍照(图7A)，结果显示，RM-PLs组小鼠皮肤无明显损伤，而PLs和RMVs组小鼠皮肤有明显的损伤，皮肤与saline组类似。接着处死动物后，取注射部位附近皮肤及连接肌肉组织，4％多聚甲醛固定，并进行石蜡包埋，组织切片，进行H&E染色和TUNEL染色，显微镜拍照，观察皮肤及连接肌肉组织的损伤和细胞凋亡情况(图7B)，结果表明，与saline组一样，PLs组和RMVs组由于无法有效吸附毒素，注射部位附近皮肤及连接肌肉组织严重坏死，细胞广泛凋亡。而RM-PLs组皮肤组织无明显损伤，组织结构规则完整，未见细胞凋亡，结果表明，RM-PLs具有良好的局部清除毒素能力。

实施例11：红细胞膜杂合脂质体的体内循环和组织分布研究

采用荧光染料DiD分别标记纳米药物(RM-PLs，PLs，RMVs)，将其静脉注射至ICR小鼠体内，不同时间点(0，5，15，30min，1，3，6，18，24h)颌下静脉取血，酶标仪测定全血的荧光强度(图8A)，结果显示，RM-PLs的体内循环时间PLs相似，与RMVs组相比，循环时间显著延长，说明红细胞膜的加入并不影响PEG修饰脂质体的长循环性质；

对于组织分布研究，同样采用荧光染料DiD分别标记纳米药物(RM-PLs，PLs，RMVs)，将其静脉注射至ICR小鼠体内，24h后取小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，称重并匀浆，酶标仪测定组织匀浆液的荧光强度(图8B)，结果显示，与大多数纳米递药系统类似，RM-PLs主要分布在肝脾，这可能是由于网状内皮系统的截留作用，但是RM-PLs和PLs组在肝的分布较RMVs显著减少，这可能是因为PEG修饰降低了网状内皮系统的摄取。

实施例12：红细胞膜杂合脂质体的体内全身解毒能力考察

ICR小鼠(n＝9)分别静脉注射200μL纳米药物(PLs，RMVs，RM-PLs，2mg/mL)，接着立即静脉注射5μg毒素溶液，记录每组小鼠的生存曲线(图8C)。结果显示，saline组(对照)小鼠在4h内全部死亡，PLs，RMVs组结果类似，显示无解毒作用，而RM-PLs组最终有78％小鼠存活下来，表明其有较好的解毒效果，改变注射顺序，进行上述实验，即注射5μg毒素2min后注射纳米药物(PLs，RMVs，RM-PLs)，记录每组小鼠的生存曲线(图8D)，结果显示，saline(对照)，PLs，RMVs组的动物5h全部死亡，而RM-PLs组仍然有44％的小鼠能够最终存活下来。上述结果表明，RM-PLs具有良好的体内全身解毒能力。

实施例13：红细胞膜杂合脂质体的体内局部抗细菌感染效果

参考文献(Ying，M.；Zhuang，J.；Wei，X.；Zhang，X.；Zhang，Y.；Jiang，Y.；Dehaini，D.；Chen，M.；Gu，S.；Gao，W.；Lu，W.；Fang，R.；Zhang，L.*″Remote-loaded plateletvesicles for disease-targeted delivery of therapeutics″，Advanced FunctionalMaterials，2018，28，1801032.)，将万古霉素(Vancomycin)通过主动载药法载入RM-PLs(Van-RM-PLs)中，得到Van-RM-PLs粒径为110nm，载药量为1.0％，将耐药细菌MRSA252(10⁹CFU)与100μl的saline，RBC-NP，PLs，RMVs，RM-PLs(2mg/ml)或Van-RM-PLs(2mg/ml)室温混合15min后注射至BALB/c裸鼠后肢皮下，每天观察裸鼠皮肤外观并拍照，测定皮肤损伤的面积，结果显示(图9)，saline，PLs和RMVs组皮肤损伤面积随时间增加而逐渐增大，而RM-PLs组小鼠皮肤1天内无明显损伤，2天后皮肤损伤面积随时间缓慢增大，但显著小于saline，RBC-NP，PLs和RMVs组(P＜0.01)。Van-RM-PLs组5天内皮肤表面几乎没有损伤，上述结果表明，RM-PLs具有良好的局部清除毒素能力，能较好地抵抗局部细菌感染。如果RM-PLs联合万古霉素使用，能很好地抵抗局部细菌感染。

实施例14：红细胞膜杂合脂质体的安全性研究

ICR小鼠(n＝6)隔天静脉注射200μL RM-PLs共一周，等量注射PBS溶液组作为对照，最后一次注射后一天，取全血，测定血常规，血生化(图10A-C)，血常规和血生化结果显示，RM-PLs组小鼠各项指标与对照组小鼠无显著性差异，表明RM-PLs安全性较好，无明显体内毒性作用。接着处死动物，心脏灌流，取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，4％多聚甲醛固定，并进行石蜡包埋，组织切片，进行H&E染色，显微镜拍照，观察各脏器组织结构情况(图10D)，结果表明，与对照组相比，RM-PLs组小鼠各脏器无明显损伤，进一步表明其安全性好。

Claims (8)

1.一种具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的纳米药物系统为红细胞膜和磷脂膜融合形成的红细胞膜杂合脂质体。

2.按权利要求1所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的红细胞膜杂合脂质体中，磷脂膜由磷脂酰胆碱，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成。

3.按权利要求1所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的红细胞膜杂合脂质体中，红细胞膜和磷脂的表面积比为1∶32～1∶1。

4.按权利要求1所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的红细胞膜杂合脂质体中，红细胞膜和磷脂膜采用融合方法制备，所述融合方法选自挤压过膜法，高压均质法或微射流法中的一种。

5.按权利要求1所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的红细胞膜杂合脂质体的粒径在80～200nm，优选100-120nm。

6.按权利要求2所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的磷脂膜中磷脂酰胆碱与聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为9∶1。

7.按权利要求2所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为2000道尔顿，3000道尔顿，优选2000道尔顿。

8.按权利要求1所述的具有细菌成孔毒素吸附性能的纳米药物系统在制备抗细菌感染药物中的用途。

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