CN111103430A - 评估脂质体药物疗效和安全性的诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于评估/预测脂质体药物治疗效果的试剂盒及其在疗效和安全性预测上的应用，所述试剂盒包含能够检测脂质体与IgM结合程度的试剂。本发明的试剂盒能够解决脂质体药物在个体间临床疗效差异和治疗效果预测的空白，从而能够更好地指导脂质体药物的临床应用，实现精准治疗。本发明还公开了抗IgM抗体在用于制备评估脂质体载药系统的治疗效果的诊断试剂中的用途。

Description

评估脂质体药物疗效和安全性的诊断试剂盒

技术领域

本发明属于诊断试剂领域，具体而言，涉及一种能够预测不同个体给予脂质体药物治疗的疗效与安全性的诊断试剂盒。

背景技术

在过去的几十年中，脂质体作为一类多功能载体已被广泛用于抗癌药物与抗感染药物的递送，研究者努力了解这种生物相容性高且表面易修饰的脂质囊泡的物理学和生物学特性，并在脂质体治疗和诊断的基础研究和临床转化研究中均取得了实质性进展。截至今日，已有超过多种用于癌症和感染性疾病等治疗的脂质体制剂被批准。与常规制剂相比，脂质体作为递送载体在提高疗效、减轻副作用方面有许多优势：如实现被载药物的持续、控制释放，通过表面PEG化延长药物在体内的循环时间，以及减少药物在正常器官中的分布(例如减轻阿霉素的心脏毒性)。更有趣的是，通过表面修饰靶向分子(如小分子、多肽、抗体、蛋白等)，脂质体可以实现药物的时空靶向递送。然而，脂质体体内递送机制的不明确阻碍了其临床转化与应用。

表面特性对脂质体体内性能(药代动力学特征、生物分布、免疫原性、靶向性、纳米毒性等)至关重要，然而，脂质体与生物介质之间的相互作用无处不在，导致其体内性能异于设计预期。脂质体在体内循环中吸附血浆蛋白形成蛋白冠，表面性质随之改变，严重影响其体内性能。据报道，数百种血浆蛋白沉积在阿霉素脂质体(Doxil)表面，且部分血浆蛋白对脂质体的体内命运有着巨大影响。靶向分子的存在很大程度上改变了蛋白冠的组成，使脂质体的体内性能更加不可预测。因此，鉴别出关键血浆蛋白并理解其对脂质体体内命运的影响至关重要。

更重要的是，已批准的脂质体药物的临床应用也存在困难。患者的血浆蛋白的含量和成分在疾病期间会发生动态变化，使临床使用的脂质体药物体内命运更加难以预测。

发明内容

本发明要解决的技术难题

如上所述，脂质体在体内的递送机制不明，脂质体药物的临床应用存在困难，接受脂质体药物后，不同患者的反应(治疗效果和副作用)存在显著的个体差异，使得临床使用脂质体药物的疗效不可预测，无法满足临床实际需求。

本发明为了解决上述技术难题，旨在鉴定出主导脂质体体内命运的关键血浆蛋白并破译它们对脂质体体内命运的影响，进一步地，提供一种能够评估不同患者是否适合给与脂质体药物以及能够预测治疗效果的检测试剂盒及其在疗效和安全性预测上的应用，从而更好地指导脂质体的临床用药，并实现精准治疗。

解决技术课题的技术方案

本发明提供一种检测试剂盒，用于预测脂质体药物的治疗效果和/或安全性，所述试剂盒包含：能够检测脂质体与血液中IgM结合程度的试剂。

所述能够检测脂质体与血液中IgM结合程度的试剂包含：脂质体、抗IgM抗体和显色溶液。

上述检测试剂盒中，显色溶液选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色溶液，邻苯二胺(OPD)显色溶液，3，3’-二氨基联苯胺四盐酸(DAB)显色溶液，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)显色溶液中的一种或一种以上。

上述检测试剂盒中，所述脂质体选自未经修饰的脂质体、PEG化脂质体、以及经靶向配体修饰的脂质体。

上述检测试剂盒中，所述脂质体载有小分子药物或大分子药物。

本发明还提供组合物在制备用于脂质体制剂疗效和安全性预测的试剂盒中的用途，所述组合物包括显色溶液、抗IgM抗体和空白脂质体包被的ELISA板，所述显色溶液选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色溶液，邻苯二胺(OPD)显色溶液，3，3’-二氨基联苯胺四盐酸(DAB)显色溶液，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)显色溶液中的一种或多种。

本发明还提供抗IgM抗体在制备用于评估脂质体制剂治疗效果和安全性的诊断试剂盒中的用途。

本发明还提供一种预测脂质体制剂在患者体内代谢状况的方法，包括：将患者的血清与抗IgM抗体进行ELISA测试、Western Blot测试、免疫共沉淀测试或表面等离子共振测试。

本发明的预测方法中，所述ELISA测试包括如下步骤：

将ELISA板的微量滴定孔用PBST或TBST冲洗；

用BSA或脱脂奶粉于37℃±5℃下封闭；

用磷酸缓冲盐溶液梯度稀释血清，并在微量滴定孔中于37℃±5℃温育；

用PBST或TBST冲洗并用BSA或脱脂奶粉于37℃±5℃下封闭；

加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，与IgM于37℃±5℃下反应；

加入显色溶液，用硫酸水溶液终止反应；

测量450nm处的UV吸光度。

上述预测方法中，显色溶液选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺、3，3’-二氨基联苯胺四盐酸、邻苯二胺和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐中的一种或多种。

本发明还提供低修饰度的聚乙二醇修饰的长循环脂质体或普通脂质体在制备降低脂质体的免疫原性的脂质体制剂中的用途，所述低修饰度是不超过1％的多肽靶向配体修饰。

技术效果

本发明通过一系列基础研究发现了以下事实：

(1)天然免疫球蛋白M(IgM)普遍存在于所有脂质体的表面蛋白冠中。天然IgM与脂质体的高结合导致天然IgM在脂质体表面的高沉积。

(2)天然IgM和脂质体之间的结合亲和力评估可以预测脂质体体内性能；尽管脂质体和天然IgM之间的结合模式各异，但天然IgM仍然是脂质体制剂的源头设计和优化的预测因素。特别地，评估脂质体与天然IgM的结合亲和力(例如本研究中的ELISA测试)在脂质体临床前筛选和优化中预期有实用价值。

(3)癌症患者中不同的天然IgM水平预期是影响脂质体药物临床个体差异的原因之一。在应用脂质体之前，患者体内天然IgM水平的临床监测对于优化治疗方案至关重要。

(4)癌症患者中的天然IgM可以以浓度依赖性方式促进临床使用的脂质体药物(例如阿霉素脂质体(DOXIL))激活补体。由于免疫紊乱，不同癌症患者的天然IgM水平不同，可以解释脂质体药物治疗时的个体差异。天然IgM有可能成为指导临床合理使用脂质体的指标。换句话说，天然IgM水平的临床监测对于优化基于脂质体的治疗方案至关重要。

(5)天然IgM易通过静电相互作用沉积在^DCDX肽修饰的脂质体的表面上，且对脂质体的免疫相容性具有负调控作用；

(6)制备具有不同功能化表面的脂质体，在靶向配体修饰后，2％摩尔比的RGD肽和A7R肽修饰不改变天然IgM的沉积。叶酸，Angiopep-2肽和^DCDX肽显著增强天然IgM的沉积，且可通过降低修饰度而减少IgM沉积量。天然IgM的高吸附容易诱导脂质体血液清除加快，免疫原性升高和靶向效率的降低。

本发明基于以上发现，提供了一种评估不同患者是否适合给与脂质体药物以及预测治疗效果的检测试剂盒及其在疗效预测上的应用，通过检测患者体内天然IgM与脂质体的结合亲和力，预测脂质体在患者体内性能，从而在临床前筛选给药方案/治疗方案，更好地指导脂质体的临床合理用药，实现精准治疗和个性化治疗。

本发明测试了9个癌症患者血清中天然IgM浓度及其与脂质体的相互作用，结果表明癌症患者血清中的天然IgM水平可以成为临床合理使用脂质体药物的指标。

附图说明

图1：^DCDX修饰对天然IgM吸附与脂质体性能的影响。

(a)体外天然IgM在脂质体表面上的吸附；

(b)体内天然IgM在脂质体表面上的吸附；

(c)体外和体内天然IgM吸附的相关性；

(d)在给与相应脂质体的四个连续剂量(每周)后血清中特异性IgM滴定结果；

(e)在给与相应脂质体的四个连续剂量(每周)后血清中特异性IgG滴定结果；

(f)体外天然IgM吸附与免疫原性的相关性；

(g)血清对^DCDX结合活性(n＝3)的影响；

(h)体外天然IgM吸附与血清预孵育后^DCDX结合活性降低的相关性。

图2：^DCDX脂质体BALB/c小鼠体内外蛋白冠中天然IgM条带

(a)修饰不同比例^DCDX脂质体与等体积BALB/c小鼠血清孵育1h后收集蛋白冠中天然IgM条带。

(b)修饰不同比例^DCDX脂质体静脉注射BALB/c小鼠体内(50mg HSPC/kg)4h后收集蛋白冠中天然IgM条带。

图3：脂质体SD大鼠体内药代动力学曲线与天然IgM吸附的关系。

(a)未进行预处理时大鼠体内药代动力学；

(b)提前给予低剂量空白脂质体预刺激后的大鼠体内药代动力学；

(c)体外天然IgM吸附与药时曲线下面积(AUC)之间的相关性；

(d)低剂量的相应空白脂质体(n＝3)预刺激后的特异性IgM滴定结果。

图4：^DCDX脂质体SD大鼠体外蛋白冠中天然IgM条带

(a)修饰不同比例^DCDX脂质体与等体积SD大鼠血清孵育1h后收集蛋白冠中天然IgM的蛋白印迹法结果。

(b)通过灰度分析定量分析天然IgM吸附量。

图5：天然IgM对补体的激活效果。

(a)用PBS、sLip和2％^DCDX-sLip孵育后，BALB/c小鼠血清中的C5a浓度。

(b)用2％^DCDX-sLip与不同预处理的SCID小鼠血清或BALB/c小鼠血清孵育后血清中C5a浓度。

图6：脂质体的天然IgM吸附与药代动力学特征之间的相关性。

(a)SD大鼠静脉注射脂质体后，血浆内药物浓度与时间的关系。

(b)标准化天然IgM与脂质体在大鼠体内药时曲线下面积(AUC)之间的线性回归。

图7：DiI标记的不同脂质体与SD大鼠血清孵育1h后体外蛋白冠表征与大鼠体内药时曲线下面积(AUC)。

(a)与等体积大鼠血清孵育1小时后，脂质体表面天然IgM的蛋白印迹法结果。

(b)通过灰度分析定量分析天然IgM吸附量。

(c)DiI标记的脂质体在SD大鼠体内药时曲线下面积(AUC_0-24h)。

图8：天然IgM吸附对载有阿霉素的脂质体的曲线下面积(AUC)的影响。

(a)阿霉素血药浓度随时间的变化；

(b)用GraphPad Prism 6.0分析的标准化天然IgM和脂质体药时曲线下面积(AUC)(RGD-sLip/DOX除外)之间的线性回归。

图9：包载阿霉素脂质体与SD大鼠血清孵育1h后体外蛋白冠表征与大鼠体内药时曲线下面积(AUC)。

(a)与等体积大鼠血清孵育1小时后，脂质体表面天然IgM的蛋白印迹法结果。

(b)通过灰度分析定量分析天然IgM吸附量。

(c)阿霉素脂质体在SD大鼠体内药时曲线下面积(AUC_0-24h)。

图10：脂质体的天然IgM沉积和体内药代动力学特征之间的种间相关性。

(a)天然IgM吸附对脂质体在BALB/c小鼠体内的药时曲线下面积(AUC)的影响；

(b)表示天然IgM吸附对脂质体在兔子体内的曲线下面积(AUC)的影响。

图11：脂质体与小鼠或兔血清孵育1h后蛋白冠表征及体内药代动力学特征。

在与等体积的BALB/c小鼠(a，c)或兔(b，d)血清孵育1h后，采用蛋白质印迹法检测脂质体表面的天然IgM。

分析了时间对BALB/c小鼠(e，g)或兔(f，h)血药浓度的影响以及小鼠或兔血清中DiI标记脂质体的药时曲线下面积(AUC_0-24h/48h)。

图12：天然IgM与脂质体的结合情况。

将BALB/c小鼠血清(a)或兔血清(b)的梯度稀释液与固定在96孔ELISA板上的脂质体一起孵育，并使用抗IgM抗体检测结合的天然IgM。

图13：天然IgM与脂质体的临床相关性。

(a)对9名癌症患者的天然IgM定量的结果。

(b)聚乙二醇化脂质体(sLip)与健康人血清(正常)或癌症患者血清的天然IgM之间的相互作用。

(c)用sLip孵育后癌症患者血清中的C5a浓度。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

说明书实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

对说明书中简称以及术语的说明：

IgM：免疫球蛋白M

HSPC：氢化大豆磷脂酰胆碱

DSPE：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺

sLip：聚乙二醇化脂质体

Lip：常规脂质体，没有PEG化

DOX：阿霉素(多柔比星)

TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺

OPD：邻苯二胺

DAB：3，3’-二氨基联苯胺四盐酸

ABTS：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐

方法

试剂和抗体

^DCDX(G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF)，RGD(GRGDSP)，A7R(ATWLPPR)，ANG(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)通过基于Fmoc的固相肽合成(CS336肽合成仪，CSBio(上海)Ltd.)化学合成。如先前报道的，化学合成FA-PEG3400-DSPE。Mal-PEG3400-DSPE，HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)和mPEG2000-DSPE购自艾伟特制药有限公司(中国上海)。Sephadex G50和DiI来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。胆固醇购自日本精化株式会社(日本高砂)。山羊抗小鼠IgMμ链(HRP)(ab97230,1:5000)，山羊抗大鼠IgMμ链(HRP)(ab97180,1:5000)，山羊抗兔IgMμ链(HRP)(ab97195,1:5000)，山羊抗人IgMμ链(HRP)(ab97205,1:5000)，兔多克隆CD31抗体(ab28364,1：20)和小鼠单克隆IgM(ab18400)，小鼠IgG(ab188776)，小鼠补体C5aELISA试剂盒(ab193718)，人补体C5a ELISA试剂盒(ab193695)来自Abcam(Cambridge，MA)。用于ELISA测定的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)色原溶液，DAPI，快速银染试剂盒和SDS-PAGE样品上样缓冲液(5X)购自Beyotime Biotechnology(中国江苏)。梯度预制聚丙烯酰胺凝胶(4-20％)(Cat#456-1093)和蛋白质双色标准品(Cat#1610374)来自BIO-RAD。盐酸阿霉素和盐酸柔红霉素购自大连美伦生物技术有限公司(中国大连)。

细胞系，动物和人血清

Neuro-2a细胞系来自中国科学院(中国上海)的典型培养物保藏中心。从上海SLAC实验动物有限公司(中国上海)购买成年雄性BALB/c小鼠，Sprague-Dawley大鼠，新西兰兔，并保持在SPF条件下。所有动物实验均按照复旦大学伦理委员会评估和批准的指导原则进行。本研究中人血清的使用得到了复旦大学上海癌症中心伦理委员会的批准，并获得了每位健康捐赠者和癌症患者的知情同意书。

肽-PEG3400-DSPE的制备

含半胱氨酸的多肽(^DCDX，RGD，A7R，ANG)通过巯基-马来酰亚胺偶联方法与Mal-PEG3400-DSPE缀合(具体制备方法可参考Hansen,C.B.,et al.,Attachment ofantibodies to sterically stabilized liposomes:evaluation,comparison andoptimization of coupling procedures.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes,1995.1239(2):p.133-144.)。将Mal-PEG3400-DSPE(50mg)溶解在氯仿中并蒸发形成薄膜，然后在真空下干燥2小时并在37℃下用超纯水(UPW，5ml)水化。将硫基化肽溶于2ml UPW中并与Mal-PEG3400-DSPE胶束(肽：Mal-PEG3400-DSPE＝1.5:1，摩尔比)混合，然后加入0.1M磷酸盐缓冲溶液PB(pH＝7.4,3ml)。加入混合物中，在室温下在磁力搅拌下反应6小时。将混合物置于透析袋中，其截留分子量(MWCO)为8000-14000Da，UPW，48小时，以除去任何残留的游离肽和盐。将所有肽修饰的磷脂冷冻干燥以供进一步使用。

脂质体的制备和表征

通过薄膜水化和挤出法制备普通聚乙二醇化脂质体(sLip)。将HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE(摩尔比为52:43:5)的混合物溶解在氯仿中，减压旋转蒸发形成薄膜，然后在真空下干燥过夜。干燥的脂质膜用生理盐水在60℃下水化后，将脂质分散体通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯膜获得100nm左右的粒径均一脂质体。对于常规脂质体(Lip，没有PEG化)，将HSPC和胆固醇(55:45)溶解在氯仿中以形成薄膜。按照相同的方法制备含有不同摩尔比的靶向配体修饰的PEG3400-DSPE的其他脂质体，除了在形成薄膜之前添加0.5％、1％和2％(摩尔比)靶向配体-PEG3400-DSPE且mPEG2000-DSPE分别降至4.5％、4％和3％。通过在形成脂质薄膜之前添加0.5％摩尔比的DiI来制备DiI标记的脂质体。使用硫酸铵梯度法制备负载阿霉素的脂质体。简言之，将干燥的脂质膜用0.32M硫酸铵溶液在60℃下水化。将脂质分散体通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯膜挤出，并用Sephadex G50柱置换外水相为生理盐水。将盐酸阿霉素(DOX)加入脂质体(DOX/脂质，质量比1:10)中，将混合物在60℃孵育20分钟，然后通过G50柱除去游离的阿霉素。使用钼酸铵比色法测量磷脂浓度，并通过反相高效液相色谱(HPLC)测量DOX浓度。将脂质体稀释在去离子水(脂质浓度为0.5mM)后使用ZetasizerNano ZS90(Malven Instrument，southborough，MA)测量脂质体的粒径和电位。

蛋白质冠的表征

BALB/c小鼠，SD大鼠和兔子收集全血，在室温下静置30分钟后1000×g离心以收集血清。将100微升脂质体(含有8mM HSPC)与相同体积的血清在低蛋白结合管中37℃孵育1小时，然后加入800μL冷冻磷酸盐缓冲盐水(PBS)并以14,000×g离心30分钟。在相同条件下用冷PBS(300μL)冲洗沉淀三次，并重悬于含有30μLPBS，7.5μL SDS-PAGE上样缓冲液(5X)和2μLβ-巯基乙醇的溶液中。在4％-20％聚丙烯酰胺凝胶上根据分子量大小分离蛋白冠样品并转移至PVDF膜。加入含有5％脱脂奶粉的PBST(PBS加0.1％Tween 20)室温孵育1小时封闭PVDF膜上的非特异性结合位点，在4℃下与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠/大鼠/兔/人IgM抗体孵育过夜。对蛋白条带进行化学发光成像(ChemiScope 6000，Clinx Co.Ltd)，并通过Image J软件分析数据。

通过尾静脉向BALB/c小鼠静脉注射含有DiI的脂质体(50mg HSPC/kg小鼠)并于1小时麻醉后对血液取样并在1000×g离心后收集血清。通过荧光检测器测量血清的荧光强度，以定量DiI标记的脂质体的浓度(Ex为550nm，Em为570nm)。按照与上述相同的方法收集和测量脂质体-蛋白质复合物，不同之处在于蛋白质样品的上样量通过DiI标记的脂质体的浓度定量。

Neuro-2a细胞培养和DCDX在脂质体表面的生物活性

将Neuro-2a细胞在含有10％FBS，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素以及5％CO₂的DMEM培养基中于37℃培养。胰蛋白酶消化后收获细胞并悬浮于冷冻的PBS(在270μLPBS中的1×10⁶个细胞)中。将DiI标记的脂质体与等体积(15μL)新鲜BALB/c小鼠血清或PBS在37℃预孵育1小时后加入细胞悬液(脂质浓度10mg/mL)。4℃孵育过夜后，将细胞以130×g离心并用冷的PBS(1mL)冲洗三次。使用流式细胞计数仪计数DiI阳性细胞。

药代动力学研究

将SD大鼠(23mg HSPC/kg大鼠)，BALB/c小鼠(50mg HSPC/kg小鼠)和新西兰兔(12mg HSPC/kg兔)静脉内注射DiI标记的脂质体。于主要时间点对血液取样并在1000×g离心10分钟分离血浆。通过荧光分光光度计(Ex为550nm，Em为570nm)检测脂质体的血药浓度。

为了研究加速的血液清除(ABC)现象，SD大鼠静脉注射低剂量的空白脂质体(2.3mg HSPC/kg大鼠)预刺激。5天后静脉注射DiI标记的脂质体(23mg HSPC/kg大鼠)，于主要时间点取血并1000×g离心10分钟收集血浆检测第二次注射后DiI标记的脂质体血药浓度。通过ELISA检测SD大鼠血清(第二次注射前收集)中抗PEG IgM含量。

通过静脉注射阿霉素脂质体(2mg DOX/kg大鼠)，在SD大鼠体内研究了阿霉素在不同脂质体中的药代动力学特征。在注射后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时对血液取样，1000×g离心10分钟分离血浆，并将50μL血浆与50μLUPW，100μL甲醇(含有10μg/mL柔红霉素作为内标)和400μL氯仿混合以萃取DOX。涡旋1分钟并以8000×g离心15分钟后，将氯仿相转移到新管中并干燥过夜。将样品重新溶解于30％乙腈，离心12000×g离心8分钟去除不溶性杂质后通过反相HPLC与荧光检测器(Ex在480nm和Em在550nm)测量DOX含量。

C5a量化

从BALB/c和SCID小鼠收集小鼠血清并储存于-80℃。在知情同意的情况下从癌症患者和健康人群中收集人血清。通过与0.2Mβ-巯基乙醇在37℃温育1小时获得IgM的血清。为了重建，将小鼠IgG和小鼠IgM加入到耗尽的血清或SCID血清中。将脂质体(含有8mMHSPC)与正常、耗尽或重建的血清在37℃温育40分钟。根据制造商的说明书，使用小鼠或人补体C5a ELISA试剂盒测定血清中的补体活化终产物C5a。

脂质体的免疫原性

BALB/c小鼠腹膜内注射4个剂量(每周一次，50mg HSPC/kg小鼠)脂质体。在第四次注射后7天取血并在室温下静置30分钟，1000×g离心10分钟后收集血清并在-80℃储存。使用mPEG-DSPE(sLip)或^DCDX-PEG-DSPE(0.5％^DCDX-sLip，1％^DCDX-sLip和2％^DCDX-sLip)作为抗原通过ELISA检测BALB/c血清中的抗PEG IgM与IgG含量。

ELISA测定

每孔2μg mPEG-DSPE或^DCDX-PEG-DSPE包被的高结合96孔ELISA板用于免疫原性研究，或每孔含有20μg HSPC的脂质体用于天然IgM吸附研究。所有孔用PBST冲洗三次加入3％BSA于37℃封闭1小时。加入PBS梯度稀释的血清并于37℃孵育1小时。PBST冲洗三次并用3％BSA于37℃下封闭30分钟后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗IgM或IgG抗体，与IgM或IgG于37℃下反应1小时。PBST冲洗三次后加入TMB(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)5-15分钟，用0.18M硫酸终止反应。测量450nm处的UV吸光度。

生物分布研究

为了量化健康BALB/c小鼠中不同脂质体的脑分布，通过尾静脉注射DiI标记的脂质体(50mg HSPC/kg小鼠)。在注射后4小时和8小时，解剖主要器官后将大脑于4％多聚甲醛溶液中4℃固定过夜，并在30％蔗糖溶液中脱水48小时。于低温冷冻切片机内切成16μm薄片后，将脑切片用抗CD31抗体和DAPI染色，使用激光共聚焦显微镜观察并通过Image Pro软件计算DiI阳性区域。

将注射后4小时和8小时的肝脏和脾脏称重并转移至2ml管中，加入5％triton-X100(10mL 5％triton-X 100/g器官)。用组织研磨机粉碎组织后检测组织匀浆的荧光强度(Ex 550nm/Em 570nm)。

统计分析

数据是平均值±标准偏差(SD)，并使用GraphPad Prism软件6.0.4通过Student'st-检验进行分析。p<0.05被认为是统计学上显着的(N.S.：p>0.05,0.01<*p<0.05,0.001<**p<0.01，***p<0.001)。

结果

天然IgM与^DCDX修饰的脂质体之间存在量效关系

^DCDX是一种稳定的D型脑靶向多肽配体，通过识别脑毛细血管内皮细胞上高表达的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)介导脂质体跨越血脑屏障。在我们先前的报道中，天然IgM易于通过静电相互作用沉积在^DCDX修饰的脂质体表面，且对脂质体的免疫相容性具有负调节作用。为了研究是否存在“剂量-效应”关系，我们通过调节^DCDX的修饰度来调节脂质体表面天然IgM沉积(表1)。高修饰度导致脂质体zeta电位升高，这可能归因于^DCDX中的正电荷，同时，^DCDX的修饰度没有改变脂质体粒径大小(参见方法)

表1：

为了研究^DCDX修饰度对蛋白冠组成的影响，将所有脂质体与等体积的新鲜BALB/c小鼠血清在37℃温育1小时，通过离心收集形成的蛋白冠并用冷冻磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，使用蛋白质印迹法测定天然IgM含量(图1a和图2a)。与sLip(没有^DCDX修饰的PEG化脂质体)相比，低修饰度的^DCDX(0.5％和1％)略微增加了天然IgM的沉积。然而，2％^DCDX修饰导致天然IgM沉积量的急剧增加(与sLip相比为12.6倍)。静脉注射DiI标记的脂质体后4小时收集脂质体-蛋白冠复合物(参见方法)，并用蛋白质印迹法测定IgM的含量(图1b和图2b)以研究体内天然IgM在脂质体表面的沉积。与sLip相比，仅2％^DCDX-sLip显示出天然IgM沉积量的显著增加。

体外天然IgM吸附与体内有较好的相关性(图1c)，表明体外蛋白冠测定可以在一定程度上反映体内吸附的趋势。

在我们之前的报告中2％^DCDX-sLip显示出显著的免疫原性。由于^DCDX修饰程度严重影响天然IgM的吸附，因此^DCDX的较低修饰度可能改善免疫相容性。在此，我们在BALB/c小鼠体内评估不同脂质体的免疫原性。在连续四次腹腔注射脂质体(每周，50mg HSPC/kg小鼠)后用ELISA测定(参见方法)抗PEG IgG和IgM抗体。如图1d和1e所示，仅2％^DCDX-sLip产生显著的抗^DCDX-PEG3400-DSPE IgG和IgM，表明较低的^DCDX修饰度可成功地减轻脂质体的免疫原性。对天然IgM吸附量与免疫原性进行拟合(图1f)，其中使用GraphPad Prism 6.0中的特异性结合的嵌入方程将抗体滴度转化为Log(Kd)值，并将不可检测的免疫原性设定为0，2％^DCDX-sLip免疫原性较高归因于表面天然IgM高沉积。使用过表达nAChR(^DCDX的受体)的Neuro-2a细胞评估血清对脂质体表面修饰的^DCDX配体结合活性影响，如图1g所示，^DCDX脂质体与Neuro-2a细胞的结合能力随修饰度的提高而增强。而与BALB/c小鼠血清预孵育后，sLip，0.5％^DCDX-sLip和1％^DCDX-sLip与Neuro-2a细胞结合能力略微下降，平均荧光强度降低1.1-1.2倍；相比之下，2％^DCDX-sLip在与血清预孵育后与Neuro-2a细胞结合能力急剧下降(1.6倍)。血清对^DCDX结合活性的影响与天然IgM吸附量的趋势一致(图1h)。

我们之前的报告证明了2％^DCDX-sLip的快速血液清除现象，是由于天然IgM的吸附增强所致。为了研究脂质体药代动力学性能是否与天然IgM吸附相关，静脉注射用DiI荧光标记的不同脂质体，并在预定时间点检测大鼠体内脂质体血药浓度(参见方法)。如图3a所示，2％^DCDX-sLip血液清除速度极快，有趣的是，1％^DCDX-sLip和0.5％^DCDX-sLip显示出与sLip相当的药代动力学特征，表明脂质体药代动力学特征与天然IgM沉积之间具有良好的相关性。

脂质体的加速血液清除(ABC)现象早有报道：动物在给药前接受(相对低剂量)PEG化脂质体预刺激可产生抗PEG IgM，其在注射后5-7天达到峰值并诱导第二次注射脂质体的快速血液清除。为了研究ABC现象，SD大鼠静脉注射低剂量空白脂质体(无DiI标记，sLip，0.5％^DCDX-sLip，1％^DCDX-sLip或2％^DCDX-sLip，2.3mg HSPC/kg)在第一次注射5天后，第二次注射DiI标记的脂质体(23mg HSPC/kg大鼠，参见方法)。如图3b所示，0.5％^DCDX-sLip和1％^DCDX-sLip在大鼠中表现出与sLip相当的ABC效应，预刺激后sLip，0.5％^DCDX-sLip和1％^DCDX-sLip AUC降低5.5-7.9倍。形成鲜明对比的是，与没有预先给予低剂量空白脂质体组相比，预刺激后2％^DCDX-sLip AUC降低14.4倍。体外天然IgM吸附与ABC现象中脂质体AUC降低倍数的拟合，如图3c和图4所示，提示它们之间可能存在某种相关性。接受sLip预先给药的SD大鼠产生相对低含量的抗PEG IgM，^DCDX修饰度的增加导致IgM含量的增加(图3d)，这些结果与图1f中显示的免疫原性一致，表明^DCDX的高修饰度在SD大鼠中引起重度免疫应答。

天然IgM在补体激活方面处于主导地位

天然免疫球蛋白(如IgG和IgM)已被公认作为有效的调理素，可激活补体，从而加速纳米载体的血液清除并刺激机体产生免疫反应。虽然体内含量最丰富的免疫球蛋白IgG被认为是调理脂质体的主要因素，但IgM是一种多反应位点的免疫球蛋白，调理效率比IgG高100倍以上。补体可以通过三种途径激活：经典途径，凝集素途径和旁路途径，所有三个途径都在C3汇集，激活产生的C3b起到关键作用，将C5因子切割成C5a和C5b，而C5b结合其他补体后形成攻膜复合物C5b-9，它们是补体激活途径的终产物。因此选择终产物C5a作为评估本研究中补体激活的指标。

如图5a所示，与PBS(12.0ng mL^-1)相比，sLip可略微增加血清中的C5a浓度(15.3ngmL^-1)。2％^DCDX-sLip激活补体更有效，将C5a浓度提高到25.4ng·mL^-1。为了理解天然IgM吸附对补体激活的影响，应用缺乏免疫球蛋白的SCID小鼠血清(使用ELISA试剂盒检测不到天然IgG和IgM)(图5b)，与BALB/c小鼠血清(含有全免疫球蛋白)相比，2％^DCDX-sLip在SCID小鼠血清中孵育后产生相对较低的C5a浓度(16.4ng mL^-1)。SCID小鼠血清中加入单克隆小鼠IgM(1mg mL^-1)，2％^DCDX-sLip孵育后C5a浓度升高至34.6ng mL^-1，而加入单克隆小鼠IgG(2mg mL^-1)后C5a浓度仅略微增加至22.5ng·mL^-1。β-巯基乙醇可以破坏分子内二硫键而使天然IgM失活，因此作为在BALB/c小鼠血清中进一步研究天然IgM对补体激活的关键作用的手段。加入β-巯基乙醇后，2％^DCDX-sLip引起的补体激活水平强烈减弱(图5b)，且加入单克隆小鼠IgM(1mg mL^-1)后可以恢复。这些结果表明，天然IgM是主导脂质体的补体激活的免疫球蛋白之一，部分解释了天然IgM吸附与脂质体体内性能之间的相关性。

脂质体吸附天然IgM是普遍现象

为了研究天然IgM沉积与脂质体体内性能是否普遍相关，我们选用了过去几十年中一些流行的靶向分子(例如叶酸，RGD肽，Angiopep和A7R肽)以不同比例修饰于PEG化脂质体表面(参见表2中脂质体的表征)，同时制备并表征了没有PEG化的常规脂质体(Lip)。

表2

如图6a所示，靶向分子的修饰导致这些脂质体在SD大鼠体内的药代动力学特征不同。脂质体普遍吸附天然IgM，且吸附量大有不同(图7)，用GraphPad Prism 6.0分析标准化的天然IgM(图7b)和图6a中的AUC之间的线性回归(图6b)，所有脂质体符合线性回归(R²＝0.69)，表明天然IgM是预测脂质体体内性能的潜在指标。在这些靶向剂中，叶酸(FA)和血管肽-2(ANG)分别是用于癌症和脑靶向的小分子和肽配体，两者在脂质体表面以2％摩尔比修饰后吸附最多的天然IgM，通过降低两种靶向分子的修饰程度，可以有效地减少天然IgM沉积。A7R(针对VEGFR和NPR-1靶向)和RGD(针对整合素靶向)即使高修饰程度(2％摩尔比)也未诱导天然IgM沉积的显著性增加，且在大鼠中具有适度的药代动力学特征。

除了脂质体的药代动力学特征与天然IgM吸附之间的相关性(脂质含量是基于掺入的荧光探针DiI测量的)，我们还研究了阿霉素脂质体的药代动力学特征与天然IgM吸附之间的相关性(图8和图9)。大多数载有阿霉素的脂质体符合线性关系(R²＝0.90)。正如预期的那样，FA-sLip/DOX和ANG-sLip/DOX都表现出对SD大鼠天然IgM的大量吸附和非常快的体内清除速率。

种间相关性

血浆蛋白的来源是理解生物对纳米界面影响的最重要变量之一，关键血浆蛋白对脂质体体内性能调理作用的种间转移性是临床转化的关键。因此，在小鼠和兔子体内进一步研究了天然IgM的普遍吸附及其对脂质体体内性能的调理作用。图10与图11是表示种间相关性的图，显示了天然IgM沉积对脂质体药代动力学特征的影响。如图10所示，脂质体天然IgM沉积与药代动力学特征之间存在显著的线性相关性(小鼠R²＝0.78，兔子R²＝0.91)，证实了不同来源的天然IgM对脂质体体内命运的调理作用具有普适性。

在本研究中，通过蛋白质印迹法测得的天然IgM是通过离心从脂质体的蛋白冠紧密结合层收集的，该层为影响脂质体表面性质与体内性能的驱动力。使用ELISA进一步研究天然IgM和脂质体之间的相互作用(参见方法)。将脂质体固定在96孔ELISA板表面，并与来自小鼠和兔子的梯度稀释血清孵育(参见方法)。

如图12所示，天然IgM的结合与蛋白质印迹法测定的结果具有相似性(图10与图11)。FA-sLip，^DCDX-sLip和ANG-sLip与小鼠和兔血清中天然IgM的相互作用强烈；而Lip，sLip和RGD-sLip与天然IgM结合较弱。

A7R-sLip与小鼠血清的天然IgM的结合比来自兔血清的结合相对更强，这也与蛋白质印迹分析中的结果一致(图10与图11)。Western印迹分析和ELISA检测之间的一致性表明，天然IgM和脂质体之间的结合亲和力评估可能是预测脂质体体内性能的替代方法。

天然IgM指导临床上合理使用脂质体类药物

在本研究中，我们发现天然IgM与脂质体的体内性能密切相关，其在蛋白冠中的含量可以在一定程度上预测脂质体的体内性能，天然IgM的大量吸附通常表明免疫相容性较差。脂质体是最受欢迎的纳米药物之一，然而在接受脂质体药物后，患者的反应(治疗效果和副作用)存在显著差异，脂质体精准化用药仍然是未被满足的临床需求。为了解决这一困境，我们分析了来自不同非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中天然IgM浓度及其与脂质体的相互作用。如图13a所示，天然IgM浓度在这些癌症患者中表现出较大的差异，范围从1.9mgmL^-1(患者#1，P1)至0.1mg mL^-1(患者#9，P9)。在ELISA测试中，来自P1的天然IgM与sLip结合最强(图13b，sLip作为固定在96孔ELISA板上的抗原，参见方法)。低含量的天然IgM(例如P2，P7和P9)与sLip的结合较低。正如预期的那样，由于P1血清所含的天然IgM与脂质体的亲和力最强，sLip可以轻易的激活补体产生C5a(图13c)。

癌症患者中不同水平的天然IgM可能是脂质体应用的个体差异的产生原因：高含量天然IgM导致与脂质体的较强结合和显著的补体激活水平。不难想象脂质体在这些癌症患者的体内表现将会显著不同。例如，与补体激活相关的输液反应更可能发生在具有高浓度天然IgM的患者#1身上。我们的结果表明，癌症患者血清中的天然IgM与脂质体结合水平可以成为临床合理使用脂质体药物的指标。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和替换都被包括在本发明中，并以所附的权利要求书界定保护范围。

Claims (10)

1.一种检测试剂盒，用于预测脂质体药物的治疗效果和/或安全性，所述试剂盒包含：能够检测脂质体与血液中IgM结合程度的试剂。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，所述能够检测脂质体与血液中IgM结合程度的试剂包含：脂质体、抗IgM抗体和显色溶液。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，所述显色溶液选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色溶液，邻苯二胺显色溶液，3，3’-二氨基联苯胺四盐酸显色溶液，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐显色溶液中的一种或一种以上。

4.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，所述脂质体选自未经修饰的脂质体、PEG化脂质体、以及经靶向配体修饰的脂质体。

5.如权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒，所述脂质体载有小分子药物或大分子药物。

6.组合物在制备用于脂质体制剂疗效和安全性预测的试剂盒中的用途，所述组合物包括显色溶液、抗IgM抗体和空白脂质体包被的ELISA板，所述显色溶液选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色溶液，邻苯二胺显色溶液，3，3’-二氨基联苯胺四盐酸显色溶液，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐显色溶液中的一种或多种。

7.抗IgM抗体在制备用于评估脂质体制剂治疗效果和安全性的诊断试剂盒中的用途。

8.一种预测脂质体制剂在患者体内代谢状况的方法，包括：

将患者的血清与抗IgM抗体进行ELISA测试、Western Blot测试、免疫共沉淀测试或表面等离子共振测试。

9.如权利要求8所述的预测方法，所述ELISA测试包括如下步骤：

将ELISA板的微量滴定孔用PBST或TBST冲洗；

用BSA或脱脂奶粉于37℃±5℃下封闭；

用磷酸缓冲盐溶液梯度稀释血清，并在微量滴定孔中于37℃±5℃温育；

用PBST或TBST冲洗并用BSA或脱脂奶粉于37℃±5℃下封闭；

加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，与IgM于37℃±5℃下反应；

加入显色溶液，用硫酸水溶液终止反应；

测量450nm处的UV吸光度。

10.如权利要求9所述的预测方法，所述显色溶液选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺、3，3’-二氨基联苯胺四盐酸、邻苯二胺和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐中的一种或多种。

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