CN112504985B - 一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，依次按以下步骤进行：（1）配制血红蛋白（Hb）和待测物溶液；（2）取相同体积的Hb溶液，分别向其中添加体积相同的待测物溶液或生理盐水，混匀，静置；（3）用酶标仪进行吸光度测定，比较待测物溶液组、生理盐水组的吸光度，得到r值，若r＞1.5则说明该浓度待测物溶液有导致呼吸困难的风险；其中，
；式中OD是待测物溶液与Hb作用后，在波长280 nm处的吸光度值；OD Hb 是生理盐水与Hb作用后（作为空白对照），在波长280 nm处的吸光度值。本发明首次公开了莪术油中倍半萜类化合物导致呼吸困难的不良反应原因，并进一步公开了一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，为莪术油中倍半萜类化合物的安全用药提供早期预警。
Description
技术领域
本发明涉及药学检测领域，特别是一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法。
背景技术
莪术油是从中药莪术（姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y. H.Chen et C. Ling的干燥根茎）中提取出的挥发油成分。已有相关研究证明，莪术油具有免疫激活、抗癌、抗炎及抗病毒等作用；根据不同的治疗目的，临床上应用的剂型有栓剂、软膏剂和注射剂等。莪术油中的主要化学成分为倍半萜类成分，如莪术酮、莪术醇、榄香烯等。2004年12月17日国家药品监督管理局药品不良反应通报（第7期）莪术油注射液的不良反应中发布了关于含有莪术油的相关制剂的不良反应情况，呼吸困难是其不良反应之一。2007年发表于《中国药事》的《81例莪术油不良反应分析》中报道了莪术油引起的不良反应的临床表现主要为憋气，呼吸困难等。
这些文献报道只是对莪术油临床的不良反应现象进行了现象分析，并未对其临床应用的安全性早期预警建立相应的评价方法，也未明确引起呼吸困难的物质基础（即未阐释莪术油中的什么成分会引起呼吸困难），导致临床上该问题仍未有效解决、未实现早期预警。
2018年发表于《中国肺癌杂志》的《胸腔注射榄香烯致严重不良反应7例病例系列分析》中对榄香烯注射液引发的不良反应案例进行了分析，发现榄香烯注射液的不良反应主要表现为呼吸困难、憋喘，这与莪术油的不良反应相似，但同样只是表征或描述相关的临床不良反应表型，并未对其临床应用的安全性早期预警建立相应的评价方法，也未对其引起不良反应的作用机制或过程进行阐释。中国专利CN103242275A公开了莪术中愈创木烷型和桉烷型倍半萜类化合物的组合物可作为发病机制与一氧化氮的代谢异常有关的肿瘤、炎症、免疫等疾病的治疗，该专利只介绍了部分莪术油中倍半萜类化合物的药理活性，并未涉及引发呼吸困难不良反应这一现象。
因鉴于此，特提出此发明。
发明内容
本发明提供了一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，用于为主要成分为莪术油中倍半萜类化合物的药物或相关制剂在临床上的安全用药提供早期预警。所述方法，依次按以下步骤进行：
（1）配制血红蛋白（Hb）和待测物溶液；
（2）取相同体积的Hb溶液，分别向其中添加体积相同的待测物溶液或生理盐水，混匀，静置；
（3）用酶标仪进行吸光度测定，比较待测物溶液组、生理盐水组的吸光度，得到r值，若r＞1.5则说明该浓度待测物溶液有导致呼吸困难的不良反应的风险；其中，
；式中OD是待测物溶液与Hb作用后，在波长280 nm处的吸光度值；OD Hb 是生理盐水与Hb作用后，在波长280 nm处的吸光度值。
优选的，步骤（1）中，配制的Hb溶液浓度为2mg/mL。
优选的，步骤（2）中，取用的待测物溶液和生理盐水的体积均为100μL。
优选的，添加的Hb溶液体积为100μL。
优选的，步骤（2）中采用在振荡器上震荡5s混匀。
优选的，步骤（2）中的静置为25℃条件下静置10min。
优选的，步骤（3）中吸光度测定的条件为37℃下，230-400nm光谱扫描，且步长为5nm。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本发明首次公开了莪术油中倍半萜类化合物可以与血红蛋白结合，并引起血红蛋白的α-螺旋发生解螺旋，使血红蛋白载氧量降低，从而导致呼吸困难的不良反应的发生，并进一步公开了一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，为莪术油中倍半萜类化合物的药物或相关制剂在临床上的安全用药提供早期预警。
附图说明
图1是莪术油中倍半萜类化合物β-榄香烯（BE）结构式；
图2是β-榄香烯对大鼠动脉氧分压的影响结果图；
图3是β-榄香烯对大鼠动脉二氧化碳分压的影响结果图；
图4是β-榄香烯对大鼠动脉血pH的影响结果图；
图5是β-榄香烯对大鼠动脉血氧饱和度的影响结果图；
图6是β-榄香烯对大鼠总血红蛋白的影响结果图；
图7是β-榄香烯对大鼠氧合血红蛋白的影响结果图；
图8是β-榄香烯与血红蛋白的相互作用结果图；
图9是β-榄香烯与血红蛋白相互作用的拟合结果图；
图10是β-榄香烯对血红蛋白结构的影响结果图。
图11是β-榄香烯对血红蛋白紫外吸光度的影响结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及结果，本发明以莪术油中β-榄香烯为例，以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案及特征，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
发明以下实施例选用的主要材料及来源分别如下：
莪术油中倍半萜类化合物β-榄香烯（β-elemene，(1S, 2S, 4R)-1-乙烯基-甲基-2,4-二(1-甲基乙烯基)环己烷），BE，结构式如图1所示，纯度≥98%，购自成都曼斯特生物科技有限公司，CAS：33880-83-0）；槲皮素（quercetin，3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮，纯度≥98%，购自成都曼斯特生物科技有限公司，CAS：117-39-5）；血红蛋白（hemoglobin，Hb，购自美国Sigma公司，货号：H7379）；生理盐水（北京双鹤制药有限公司）；手术器械、G3+血气片（北京市斑珀斯技贸有限责任公司）；雅培i-STAT300便携式手执血气分析仪（美国i-STAT公司）；BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；水合氯醛（大连美仑生物科技有限公司）；96孔板（美国Corning公司）；微孔滤膜（0.22 μm，德国Sartorius Stedim Biotech公司）；1.5 mL /50 mL/10 mL离心管（美国Corning公司）；DMSO（D8418，美国Sigma公司）；吐温80（Tween 80，美国Sigma公司）；PBS-P 10×（GE healthcare）；涡旋混合器（Vortex Genie2，美国Scientific Industries公司）；酶标仪（美国Bio-Tek）；微孔板恒温振荡器（MB100-4A）；CM5传感器芯片（美国BR100530）；超纯水机（美国Milli-Q Integral 5.5 Kit）；表面等离子体共振检测仪（美国Biacore T2000）；圆二色光谱仪（英国Chirascan）。
实施例一β-榄香烯（BE）致大鼠呼吸困难时对血气的影响
配制BE溶液：精密称取BE对照品，用8.8%Tween80水溶液溶解，配置成浓度为1.5mg/mL的BE溶液。
取12只SPF级SD雄性大鼠（6周龄，体重200 ± 25 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，其生产许可证编号为：SCXK（京）2016-0006。研究过程所涉及的动物实验均经过伦理委员会批准。实验大鼠饲养条件为标准光照-黑暗周期为12 h，温度为22 ± 1℃，相对湿度为60 ± 5%。
将大鼠随机分为2组，每组6只，普通饲料适应性喂养一周后，将大鼠禁食过夜（12h），通过腹腔注射水合氯醛（10 mg/mL, 4 mL/kg）将大鼠麻醉。麻醉后两组分别尾静脉注射BE和生理盐水，给药体积均为6 mL/kg。
给药后取腹主动脉血，并立即用血气分析仪分析，结果如图2-7所示。
给药后，可观察到大鼠唇发绀明显，心率加快，呼吸频率加快并且呼吸幅度加大，停止给药后大鼠呼吸频率逐渐降低，呼吸幅度逐渐减小，而后稳定到一定的状态，说明注射BE后大鼠出现呼吸困难症状，且停止给药后会自行恢复。
由图2-7所示的结果可以看出，当注射BE的大鼠出现呼吸困难时，动脉氧分压和动脉血氧饱和度显著降低说明大鼠体内可能处于低氧状态；动脉二氧化碳分压显著降低，而pH无显著变化，说明大鼠肺换气过度，氧气供给不足，这与大鼠的呼吸状态一致。总血红蛋白显著升高，而氧合血红蛋白显著降低，提示该症状与血红蛋白（Hb）和氧气的结合减少，从而导致大鼠呼吸困难。由此可见，针对动物实验， BE溶液诱导的大鼠呼吸困难与Hb和氧气的结合有关。（图例中*表示：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001）
实施例二β-榄香烯与血红蛋白的相互作用验证
采用表面等离子共振（SPR）技术验证β-榄香烯与血红蛋白的相互作用。SPR可以提供表征小分子与蛋白之间相互作用的亲和力（KD，是指芯片上50%蛋白位点饱和时的分析物浓度，且KD越小，亲和力越强，即表明两者越易相互结合）。一般认为蛋白与小分子结合的KD的可接受范围在10-4-10-6 M。
1.分析物的准备
（1） 配置血红蛋白溶液：精密称取Hb适量，用超纯水配成浓度为1mg/mL的溶液，后用pH 4.5醋酸稀释20倍，备用；
（2） 将PBS-P 10´用超纯水配成PBS-P 2.1´，再取适量DMSO，配成含5%DMSO +0.1%Tween 20的PBS 2´，过滤，备用；
（3） 精密称取BE对照品适量，溶解于DMSO制备成10 mM溶液，后用PBS-P 2.1´稀释为含5%DMSO的对照品溶液；用2´ PBS-P+依次稀释为100 µM、50 µM、25 µM、12.50 µM、6.25µM、3.125 µM、1.5625 µM、0.78 µM，涡旋1 min，用0.22 μm滤膜过滤后，备用。
2.配制校正液
按下表配制校正液
| 4.5% DMSO | 5.8% DMSO | |
| 2.1´ PBS-P+/1.05´ PBS-P+ | 9.5 mL | 9.5 mL |
| 100%DMSO | 0.45 mL | 0.58 mL |
| Final volume | ~10 mL | ~10 mL |
| 4.9% DMSO | 5.3% DMSO | |
| 4.5% DMSO | 0.8 mL | 0.4 mL |
| 5.8% DMSO | 0.4 mL | 0.8 mL |
| Final volume | 1.2 mL | 1.2 mL |
3.配制洗液
配制50%DMSO（超纯水与过滤后的DMSO（1:1））的洗液用于洗针。
4.实验步骤
（1） 活化芯片：用EDC/NHS活化芯片上羧基（1、2通道）；
（2） 选择2通道，偶联一定量的Hb；
（3） 将芯片上未偶联蛋白的已活化的羧基用乙醇胺封闭；
（4） 用2´ PBS-P+运行缓冲液冲洗流路系统；
（5） 将配置好的BE溶液和洗液，依次放入架子，后将其放于架子托盘上，待进样；
（6）设置程序，采集数据。
SPR结果如图8-9所示。图8-9所示的结果说明BE与Hb的K D = 5.84 µM，说明BE与Hb之间存在较强的亲和力，这也说明两者之间存在分子间相互作用，即BE较易与Hb结合。
实施例三β-榄香烯对血红蛋白结构的影响
采用圆二色光谱技术（CD）测定β-榄香烯对血红蛋白结构的影响。
Hb在200-250 nm以α-螺旋为主，故在该波段呈现α-螺旋。若α-螺旋结构改变，则200-250 nm的CD曲线形状也会随之改变。可由等式（1）计算222 nm处的Hb的α-螺旋含量：
可根据等式（2）来计算平均残基椭圆率（MRE）（deg∙cm2/dmol）：
其中，Cp是Hb的摩尔浓度（mM）；n是氨基酸残基数；l是光径（mm）。
PBS溶液的配制：取适量PBS缓冲液，加入少量Tween 80，配成含0.05% Tween 80的PBS溶液。
Hb溶液的配制：精密称取Hb适量，加入适量含0.05% Tween 80的PBS，配成浓度为30 μM的Hb，待用。
BE溶液的配制：精密称取BE适量，加入含0.05% Tween 80的PBS中，制成浓度为15µM的储备液，待用。
Hb+BE溶液的配制：取适量的BE与Hb配成总体积为1.5 mL的溶液，使Hb最终浓度为5 μM；BE最终浓度分别为6.25 µM、5.00 µM、2.00 µM、1.00 µM、0。
检测波长：200-250 nm，步长：0.5 nm；温度：25℃；响应时间：0.5 s。
操作步骤：
（1） 先将含0.05% Tween 80的PBS溶液装入光径为0.1 cm的石英样品池中放入样品室检测，扫描3次得空白曲线；
（2） 将各浓度样品按从小到大的顺序装入石英样品池中（换液时需要用PBS清洗样品池并需用待测溶液润洗），然后将样品池放入样品室中，依次检测，每个光谱扫描三次；
（3） 分析数据：取每个浓度三次扫描的曲线平均值，分别减去空白曲线进行背景校正，结果如图10所示。
检测结果如图10所示。由图10所示的结果可以看出，随着BE的浓度的增大，曲线变化也随之明显，即BE使Hb的α-螺旋发生解螺旋，且BE的浓度越高，解螺旋作用越明显，也即BE通过改变Hb的二级结构，使其不能与氧气结合，导致Hb载氧量降低，使机体不能正常利用氧气，从而导致呼吸困难。
实施例四莪术油中倍半萜类化合物造成不良反应的评价
上述实施例中已经论述了莪术油中倍半萜类化合物造成呼吸困难不良反应的机理，据此提出一种莪术油中倍半萜类化合物造成不良反应的评价方法。
Hb溶液的配制：精密称取Hb粉末适量，用生理盐水溶解（超声30 s），配制成浓度为2 mg/mL的溶液。
BE溶液的配制：精密称取BE对照品适量，用8.8%Tween 80水溶液溶解，配制成浓度为1.5 mg/mL的溶液。
具体操作：
在96孔板孔中加入100 μL Hb溶液，再依次向加入了Hb溶液的孔中加入100 μL BE样品溶液、100 μL8.8%Tween 80水溶液或100 μL生理盐水（作为空白对照），每个样品对应三个复孔，盖上微孔板盖，在振荡器上震荡5 s混匀，在25℃条件下静置10 min。
利用酶标仪进行检测，检测条件为37℃，230-400nm光谱扫描，步长为5nm。
结果曲线如图11所示。
由图11可知，BE存在的情况下，约280 nm处Hb的紫外吸收峰受到影响，这表明芳香残基（Trp和Tyr）和BE之间存在有效的相互作用。且观察到在260-300 nm范围BE使Hb的吸光度显著升高且8.8%Tween 80水溶液（阴性对照）对其基本没有干扰，这也证实了SPR实验的正确性。
据此，提供一种莪术油中倍半萜类化合物造成呼吸困难不良反应的评价方法，用以下公式（3）表示：
其中OD是某一浓度的待测的包括莪术油中倍半萜类化合物的样品与Hb作用后，在280 nm处的吸光度值；OD Hb 是280 nm波长下作为空白对照的生理盐水与Hb作用后的吸光度值；r是OD与OD Hb 的比值。在此公式下，当r>1.5时，说明该浓度下的包括莪术油中倍半萜类化合物的样品可与血红蛋白结合，在临床上使用时发生呼吸困难的风险较大。
对于本实施例，如图11所述，对于1.5 mg/mL的BE溶液而言，r≈1.8>1.5说明该浓度的BE可与Hb结合，在临床使用中发生呼吸困难的风险较大；而8.8%Tween 80水溶液的r=0.9<1.5，说明此浓度下的Tween 80溶液对Hb无明显作用，且在该浓度下对BE无影响。
据此，本发明通过含有莪术油中倍半萜类化合物的药物或相关制剂与Hb作用所得的r值来判断其在临床上使用的风险，从而实现对莪术油中倍半萜类化合物或含有此类成分的药物或相关制剂致呼吸困难的不良反应早期预警。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：
(1)配制血红蛋白和待测物溶液；
(2)取相同体积的血红蛋白溶液，分别向其中添加体积相同的待测物溶液或生理盐水，混匀，静置；
(3)用酶标仪进行吸光度测定，比较待测物溶液组、生理盐水组的吸光度，得到r值，若r＞1.5则说明该浓度待测物溶液有导致呼吸困难的风险；其中，
式中OD是待测物溶液与血红蛋白作用后，在波长280nm处的吸光度值；ODHb是生理盐水与血红蛋白作用后，在波长280nm处的吸光度值。
2.根据权利要求1所述评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，步骤(1)中，配制的血红蛋白溶液浓度为2mg/mL。
3.根据权利要求1所述评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，步骤(2)中，添加的待测物溶液和生理盐水的体积均为100μL。
4.根据权利要求3所述评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，步骤(2)中，取用的血红蛋白溶液体积为100μL。
5.根据权利要求1所述评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，步骤(2)中采用在振荡器上震荡5s混匀。
6.根据权利要求1所述评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，步骤(2)中的静置为25℃条件下静置10min。
7.根据权利要求1所述评价莪术油中倍半萜类化合物不良反应的方法，其特征在于，步骤(3)中吸光度测定的条件为37℃下，230-400nm光谱扫描，且步长为5nm。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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