ES2357941T3 - Métodos para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada. - Google Patents

Métodos para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada. Download PDF

Info

Publication number
ES2357941T3
ES2357941T3 ES02757260T ES02757260T ES2357941T3 ES 2357941 T3 ES2357941 T3 ES 2357941T3 ES 02757260 T ES02757260 T ES 02757260T ES 02757260 T ES02757260 T ES 02757260T ES 2357941 T3 ES2357941 T3 ES 2357941T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
apeg
solution
hemoglobin
poe
solvent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02757260T
Other languages
English (en)
Inventor
Todd Lewis Talarico
Cyrus John Stacey
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Apex Bioscience Inc
Original Assignee
Apex Bioscience Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Apex Bioscience Inc filed Critical Apex Bioscience Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2357941T3 publication Critical patent/ES2357941T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/30—Post-polymerisation treatment, e.g. recovery, purification, drying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)

Abstract

Un método para preparar una solución de hemoglobina PEGilada que está sustancialmente libre de contaminantes, que comprende: (a) disolver un polietilenglicol activado (aPEG) en un disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina y en el que dicho aPEG es estable, en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol y acetonitrilo; (b) filtrar dicho aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, en donde los medios de filtración son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm; y (c) combinar asépticamente dicha solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en medios de combinación, en donde la hemoglobina es hemoglobina libre de estroma purificada, y preparar dicha solución de hemoglobina PEGilada.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a métodos para la purificación de una solución de polietilenglicol activado y para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada. 5
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La sangre es el líquido circulante que transporta oxígeno y materiales nutritivos a los tejidos del cuerpo y retira dióxido de carbono y otros productos metabólicos y residuos para la excreción. La sangre consiste en un fluido, el plasma, en el que está suspendida una variedad de componentes incluyendo los glóbulos rojos. Stedman’s Medical Dictionary, 26ª edición, página 214 (1995). Un componente particularmente importante de los glóbulos rojos es la 10 proteína hemoglobina, que es específicamente responsable del transporte de oxígeno desde los pulmones a otros tejidos del cuerpo.
Debido a la gran demanda de sangre en los Estados Unidos y en todo el mundo, se han dirigido intensos esfuerzos de investigación al desarrollo de sustitutos de sangre basados en hemoglobina. Tales sustitutos se han producido con una variedad de modificaciones de hemoglobina purificada a fin de prevenir la toxicidad o potenciar de otro 15 modo las propiedades de la molécula, usando una clase particularmente importante de modificación efectuada moléculas de la familia del polietilenglicol (PEG) que se han activado (aPEG) de modo que son capaces de modificar químicamente proteínas. Tal PEGilación es importante debido a que altera favorablemente la actividad, la solubilidad, la semivida en circulación in vivo, la toxicidad y la inmunogenicidad de las hemoglobinas. Véanse, generalmente, Delgado et ál. (1992) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 9:249-304; Greenwald et ál. (2000) Crit. Rev. 20 Ther. Drug Carrier Sys. 17: 101-161.
La bibliografía revela que la hemoglobina se ha PEGilado usando una variedad de compuestos de aPEG. Un compuesto de aPEG usado para modificar la hemoglobina es la molécula de PEG activado polioxietileno (α-carboximetil, ω-carboximetoxipolioxietileno) (POE), que se hace reaccionar con hemoglobina piridoxilada para obtener hemoglobina piridoxilada-polioxietileno (PHP). Talarico et ál. (1999) Biochem. et Biophys. Acta 1476:53-65, 25 incorporado en la presente memoria mediante referencia. Las hemoglobinas modificadas con POE son de particular interés debido a que contienen proteínas celulares que potencian su funcionalidad como eliminadores de óxido nítrico (NO), un compuesto implicado en una variedad de enfermedades. Así, existe un gran uso potencial de tales PHPs como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades ligadas a la presencia de NO en exceso, incluyendo, por ejemplo, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), una dolencia médica crítica que es 30 refractaria a las terapias existentes. Privalle et ál. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:1507-17, incorporado en la presente memoria mediante referencia.
Aunque el PHP y otras hemoglobinas PEGiladas son muy prometedoras en estas y otras aplicaciones terapéuticas, existe un número de problemas que afectan a tales usos, notablemente la presencia de compuestos contaminantes que afectan a su seguridad o eficacia. Virus peligrosos tales como el HIV/virus del sida o virus de hepatitis, por 35 ejemplo, a menudo contaminan la sangre entera usada para preparar la fracción de hemoglobina usada en la PEGilación, y deben retirarse en algún punto durante la preparación del producto final PEGilado mediante filtración u otros medios. Adicionalmente, biocarga tal como bacterias puede ser una fuente de contaminación bien de la hemoglobina o bien de materiales de partida tales como un aPEG, como lo pueden ser las endotoxinas, las macromoléculas complejas de lipopolisacáridos (LPS) de la pared celular de bacterias Gram negativas que pueden 40 provocar fiebre, diarrea, choque hemorrágico y otros daños tisulares. Stedman’s Medical Dictionary, 26ª edición, página 572 (1995).
La biocarga y las endotoxinas son una fuente particularmente problemática de contaminación debido a la falta de métodos adecuados para retirarlas de la materia prima de aPEG usada en la PEGilación. Según se analizaba previamente, las moléculas de aPEG son moléculas activada de la familia del polietilenglicol. Muchas de tales 45 moléculas activadas son lábiles en agua y, como resultado, típicamente se añaden a la fracción de hemoglobina en una forma en polvo, en vez de en solución. Aunque los aPEGs en esta forma son relativamente estables, como polvos no pueden procesarse para la retirada de contaminantes usando los métodos disponibles para aPEGs disueltos, tales como las técnicas de filtración. Aunque estos contaminantes pueden retirarse después de la PEGilación, tal retirada tiene consecuencias no deseables. Por ejemplo, aunque las endotoxinas pueden retirarse 50 del PHP mediante cromatografía, tal cromatografía da como resultado cambios no deseables en la composición proteínica del PHP.
Así, existe desde hace mucho tiempo una necesidad de un método para purificar aPEGs para el uso con moléculas peptídicas y polipéptidos tales como hemoglobina. Por otra parte, existe desde hace mucho tiempo una necesidad
de métodos para usar tales aPEGs disueltos purificados en la PEGilación de péptidos y polipéptidos tales como hemoglobina, en los que el disolvente en el que está disuelto el aPEG no dé como resultado la desnaturalización o la degradación sustancial del péptido o polipéptido tal como hemoglobina.
La Patente de EE. UU. Nº 5.224.903 muestra un método para producir una solución de hemoglobina químicamente modificada usando un aPEG, seguido por filtración y esterilización para retirar contaminantes. El aPEG se añade a 5 la fracción de hemoglobina como un polvo. La Publicación Internacional Nº WO 90/15613 muestra la preparación de hemoglobina libre de virus usando un aPEG no purificado.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método para preparar una solución de hemoglobina PEGilada que está sustancialmente libre de contaminantes. El método comprende disolver un aPEG en un disolvente adecuado para la 10 adición a una solución de hemoglobina y en el que el aPEG es estable, filtrar el aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, y combinar la solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en medios de combinación. Más específicamente, el método comprende:
(a) disolver un polietilenglicol activado (aPEG) en un disolvente adecuado para la adición a una solución de 15 hemoglobina y en el que dicho aPEG es estable, en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol y acetonitrilo;
(b) filtrar dicho aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, en donde los medios de filtración son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm; y 20
(c) combinar asépticamente dicha solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en medios de combinación, en donde la hemoglobina es hemoglobina libre de estroma purificada, y preparar dicha solución de hemoglobina PEGilada.
En una realización de la presente invención, el aPEG usado es POE.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 25
La Figura 1 es una visión de conjunto esquemática de la síntesis de PHP.
La Figura 2 muestra el perfil de elución de una formulación final de PHP preparada con POE en polvo, según se determinaba mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
La Figura 3 muestra el perfil de elución de una formulación final de PHP preparada con solución de POE/etanol filtrada, según se determinaba mediante SEC. 30
La Figura 4 muestra una superposición de los perfiles de las Figuras 2 y 3 con una sensibilidad de aproximadamente dos veces la mostrada en las Figuras 2 y 3.
La Figura 5 muestra los datos de la Figura 4, confinados a la vecindad de la fracción de alto peso molecular del perfil de elución de SEC y con una sensibilidad de aproximadamente 100 veces la de la Figura 4.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 35
El método de la presente invención abarca la preparación de una solución de aPEG que está sustancialmente libre de contaminantes y métodos para usar estos aPEGs purificados en la preparación de una solución de hemoglobina PEGilada. Más específicamente, el método de la presente invención proporciona la preparación de una solución de aPEG filtrada que es estable y está sustancialmente libre de contaminantes. Los métodos implican disolver un aPEG en un disolvente en el que el aPEG es estable y a continuación filtrar el aPEG disuelto a través de medios de 40 filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante.
“aPEG” y el plural “aPEGs” se refieren a polietilenglicol (PEG) y moléculas relacionadas con PEG que se han activado a fin de que sean capaces de modificar químicamente proteínas, péptidos u otras moléculas. Generalmente, un aPEG tiene un peso molecular de aproximadamente 3 kD a aproximadamente 50 kD. Se contempla que “aPEG” abarque una variedad de tales compuestos, incluyendo, pero no limitados a, polietilenglicol 45 activado, polipropilenglicol activado y modificaciones y derivados de los mismos, tales como POE, amino-PEGs, maleimido-PEGs, sucinimimidil-PEGs, (succinato de succinimidilo)-PEGs y base-PEGs. Otros ejemplos de aPEGs
se proporcionan en Greenwald et ál. (2000) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 17: 101-161 y Delgado et ál. (1992) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 9:249-304, ambos de los cuales se incorporan en la presente memoria mediante referencia.
Los aPEGs purificados de la invención pueden usarse para PEGilar cualquier proteína o péptido de interés. Según se usan en la presente memoria, “PEGilar” o “PEGilación” se refieren a la modificación química de un péptido, 5 polipéptido u otra molécula por un aPEG. En una realización preferida, la proteína de interés es hemoglobina. Sin embargo, la invención pretende aplicarse generalmente a cualquier proteína, péptido u otra molécula que vaya a PEGilarse. Tales proteínas y péptidos incluyen, por ejemplo, hormona del crecimiento, factores de crecimiento tales como FGF, IGF, IL-2, VEGF, etc. Ejemplos adicionales de tales proteínas y péptidos se proporcionan, por ejemplo, en Greenwald et ál. (2000) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 17: 101-161 y Delgado et ál. (1992) Crit. Rev. Ther. 10 Drug Carrier Sys. 9:249-304. En una realización preferida, la PEGilación es de hemoglobina con POE.
En el método de purificación, un aPEG de interés se disuelve en un disolvente en el que es estable. Según se usa en la presente memoria, el término “estable” pretende significar que un alto porcentaje de un aPEG permanece en su forma activa a lo largo del transcurso de la PEGilación. Por “alto porcentaje” se pretende un valor de más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. 15
La estabilidad puede medirse en una variedad de modos conocidos por un experto en la técnica, incluyendo métodos para ensayar la pérdida del grupo activador del aPEG a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la estabilidad de POE en solución puede controlarse al determinar la cantidad de pérdida de N-hidroxisuccinimida (NHS) del POE que se produce a lo largo del tiempo. La cantidad de pérdida de NHS puede determinarse mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La especie de POE puede separarse y cuantificarse usando este método y puede 20 determinarse una velocidad de pérdida de NHS. Esta puede indicarse como el porcentaje de actividad que permanece a lo largo del transcurso de la exposición a un disolvente. Alternativamente, el aPEG puede derivarse y las diferentes formas pueden separarse mediante HPLC directamente. Un ejemplo de tal método para determinar la estabilidad de POE en solución se da en el Ejemplo 3 de la sección experimental. Aunque este es un método preferidos para tal determinación, otros métodos son conocidos por los expertos. 25
Disolventes que se usan en la práctica de la invención son etanol, metanol y acetonitrilo. El disolvente se elige para mantener la estabilidad del aPEG. Se considerará un número de factores al elegir un disolvente, incluyendo la solubilidad del aPEG en el disolvente, la estabilidad del aPEG en el disolvente, la compatibilidad del disolvente con la proteína de interés si el aPEG se va a usar con una proteína particular, la toxicidad del disolvente, la miscibilidad del disolvente con agua y la capacidad del procedimiento de producción para retirar el disolvente. 30
Una vez que un aPEG se ha disuelto en el disolvente en el que es estable, se purifica a través de medios de filtración que son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm. Según se define en la presente memoria, “medios de filtración” se refiere a medios para reducir sustancialmente los niveles de contaminantes en el aPEG disuelto mediante filtración. La presente invención contempla una variedad de medios de filtración diferentemente formulados dirigidos a diferentes contaminantes que deben reducirse hasta diferentes grados, variando el carácter particular de 35 la filtración dependiendo del contaminante que vaya a reducirse. Según se define en la presente memoria, “contaminantes” se refiere a compuestos que incluyen, pero no se limitan a, biocarga, endotoxina y materiales en partículas.
En una realización de la presente invención, los medios de filtración se dirigen a la reducción sustancial de contaminantes incluyendo biocarga y endotoxina. “Biocarga,” según se define en la presente memoria, se refiere a 40 organismos tales como bacterias que pueden estar presentes en el aPEG disuelto. Existe una variedad de medios de filtración conocidos por un experto normal que pueden usarse para retirar biocarga, incluyendo membranas de filtración con un tamaño de poro suficientemente pequeño a fin de retener la biocarga mientras que permiten que el aPEG disuelto pase al filtrado. Tales membranas incluyen, por ejemplo, filtros de esterilización de 0,2 μm. La elección de un filtro de esterilización particular depende de una variedad de factores incluyendo el disolvente en el 45 que se ha disuelto el aPEG. Específicamente, los disolventes extremadamente no polares pueden dañar o degradar filtros particulares. Así, un aPEG disuelto en un disolvente polar puede filtrarse usando un filtro compuesto por polietersulfona o acetato de celulosa, tal como un filtro Sartobran® (Sartorius), mientras que un aPEG disuelto en un disolvente extremadamente no polar puede filtrarse apropiadamente usando un filtro compuesto de politetrafluoroetileno (PTFE) o nailon. Por ejemplo, para disolventes moderadamente polares tales como metanol, 50 etanol e isopropanol, se contemplan los filtros N66® Posidyne® (Pall corporation) o Durapore® (Millipore), mientras que los filtros Sartoflour® (Sartorius) o Emflon PFR® (Pall corporation) se contemplan para disolventes muy no polares.
“Endotoxina”, según se define en la presente memoria, se refiere a los lipopolisacáridos complejos de la pared celular de bacterias Gram negativas. Las endotoxinas son capaces de producir un número de afecciones médicas 55 graves incluyendo, por ejemplo, el choque séptico, en el que los síntomas varían de efectos menores, tales como escalofríos, fiebre y nauseas, hasta afecciones graves tales como fallo cardíaco, coma y, en la mayoría de los casos extremos, muerte, y son una de las formas más importantes de pirógenos, esto es, compuestos inductores de fiebre,
exógenos. Stedman’s Medical Dictionary, 26ª edición, página 1475 (1995). Los niveles de endotoxinas pueden reducirse sustancialmente a través de una variedad de medios de filtración, incluyendo medios de filtración en los que endotoxinas cargadas negativamente son retenidas por medios de filtración cargados positivamente. Un ejemplo de medios de filtración cargados positivamente capaces de retirar endotoxina es la membrana de filtración N66® Posidyne® (Pall corporation). También pueden usarse otras membranas tales como la serie Zeta Plus® (Cuno) y los 5 absorbentes de membrana SartobindTM (Sartorius), así como adsorbentes cargados positivamente, incluyendo, por ejemplo, resinas y columnas de relleno cargadas positivamente. La elección de un disolvente, un tampón, una condición salina, etc. particular para cada uno de estos medios de filtración será bien conocida para el experto.
La filtración a través de los medios de filtración dará como resultado una solución de aPEG que está sustancialmente reducida en biocarga o endotoxina. Por “sustancialmente reducida” se entiende que los 10 contaminantes se reducen en al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, dependiendo el valor pretendido del contaminante particular que se está reduciendo sustancialmente. La reducción sustancial de contaminantes de biocarga, por ejemplo, se refiere a reducciones de biocarga bacteriana hasta no más de 1 unidad formadora de colonias por ml (CFU/ml), y se dirige preferentemente a 0 CFU/ml. La determinación de la biocarga bacteriana pueden ensayarse mediante una variedad 15 de métodos conocidos por los expertos normales, incluyendo, pero no limitados a, capturar organismos sobre filtros, colocar los filtros sobre placas de agar R2A a 30-35°C durante 4 días y a continuación contar el número de colonias resultantes. Véase, por ejemplo, Official Methods of Analysis of AOAC International (1995) 17ª ed., 17.2.05 Official Method 986.32 o 17.3.08 Official Method 983.25. Alternativamente, la biocarga puede ensayarse mediante técnicas tales como cultivo en placa directo o mediante cultivo en placa con vertido, ambos de los cuales son conocidos para 20 el experto. La reducción sustancial de contaminantes de endotoxina se refiere a reducciones de los niveles de endotoxina en 500 y más preferentemente >5000 EU/cm2 de área del filtro. La determinación de los niveles de endotoxina puede ensayarse mediante una variedad de métodos bien conocidos por los expertos normales, incluyendo, pero no limitados a, el ensayo del lisado amebocítico de Limulus (LAL). USP 24, NF19 <85> Bacterial Endotoxins Test, 1829-1831. 25
Por otra parte, una solución de aPEG que se ha reducido sustancialmente en contaminantes se caracteriza por no inducir efectos patofisiológicos característicos de la presencia de contaminantes al administrar in vivo a un sujeto (es decir, un mamífero, preferiblemente un conejo, ratón, bóvido, cerdo, mono, ser humano, etc.). Pongamos por caso, síntomas fisiológicos incluyen fiebre, coagulación intravascular diseminada, hipotensión y choque cardiovascular. Roth y Levin (1994) Meth. Enzymol. 231:75-91. De ahí que, según se usa en la presente memoria, una solución de 30 aPEG “sustancialmente reducida” en contaminantes sea una que no es infecciosa, de modo que la solución pueda manipularse sin dañar o infectar a alguien expuesto a la misma.
“Medios de filtración” puede usarse para referirse a medios de filtración simples, esto es, a una sola membrana u otro medio de filtración. Sin embargo, la presente invención no se limita a uno solo de tales medios de filtración, y en cambio abarca medios de filtración tanto simples como múltiples. Así, “medios de filtración” se usa para abarcar 35 métodos de filtración múltiples. Los medios de filtración múltiples pueden encontrar particular utilidad en situaciones en las que, por ejemplo, sea ventajoso retirar biocarga sobre una membrana y endotoxina sobre una membrana, columna de relleno, medio impregnado, etc. separado. Un experto normal en la técnica será capaz de determinar situaciones en las que son preferibles tales medios de filtración múltiples. Tales situaciones pueden incluir casos en los que los medios de filtración sucesivos actúan para reducir los niveles de biocarga o endotoxina por debajo de los 40 alcanzados por medios de filtración simples, y casos en los que los medios de filtración simples no exhiben todas las propiedades ventajosas que exhiben dos medios de filtración usados conjuntamente. Un ejemplo de tales medios de filtración múltiples incluye una combinación de un filtro esterilizante para retirar la biocarga y un filtro grueso impregnado cargado positivamente para retirar endotoxinas.
Usando los métodos presentados anteriormente para la preparación de una solución de aPEG filtrada que sea 45 estable y esté sustancialmente libre de contaminantes, la presente invención proporciona un método para usar estos aPEGs purificados en la preparación de una solución de péptido o polipéptido PEGilado. Específicamente, la presente invención proporciona un método para disolver un aPEG en un disolvente adecuado para la adición a una solución de péptido o polipéptido y en el que el aPEG sea estable, filtrar el aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, y 50 combinar asépticamente la solución de aPEG filtrada resultante con una solución de péptido o polipéptido en medios de combinación.
En una realización preferida, la presente invención se dirige a un método para usar un aPEG purificado en la preparación de una solución de hemoglobina PEGilada. Específicamente, la presente invención proporciona un método para disolver un aPEG en un disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina y en el 55 que el aPEG sea estable, filtrar el aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, y combinar la solución de aPEG filtrada resultante con una solución hemoglobina en medios de combinación.
Según se define en la presente memoria, “solución de hemoglobina” se refiere a cualquiera de las diversas formas
de soluciones de hemoglobina obtenidas de sangre entera o medios recombinantes que pueden usarse para PEGilación. Tales soluciones pueden contener otras macromoléculas además de hemoglobina. A menudo es deseable, por ejemplo, que las soluciones de hemoglobina que se PEGilan para producir PHP también contengan importantes moléculas antioxidantes endógenas tales como catalasa y SOD. Privalle et ál. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:1507-17. La sangre preferida usada en la invención es sangre humana caducada. Sin embargo, todos los 5 métodos de la presente invención pueden usarse con sangre bovina, porcina, ovina y de otros mamíferos solo con pequeñas modificaciones que son conocidas por un experto en la técnica. Aunque la presente invención contempla específicamente el uso de soluciones de hemoglobina preparadas para la modificación con POE, se contemplan otros modificadores de aPEG.
El término “disolvente adecuado para la adición a una solución de péptido o polipéptido,” según se define en la 10 presente memoria, se refiere a un disolvente que, cuando se añade a la solución de péptido o polipéptido en la proporción requerida, no desnaturaliza o degrada significativamente el péptido o polipéptido en la solución a lo largo del transcurso de la reacción de PEGilación. Según se usa en la presente memoria, los péptidos o polipéptidos no se desnaturalizan o degradan significativamente si los niveles de estos compuestos permanecen más de aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más sin degradar o desnaturalizar 15 después de la adición del disolvente a lo largo de la duración de la PEGilación.
Según se usa en la presente memoria, “disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina” se usa para referirse a una realización específica de la presente invención en la que el polipéptido es hemoglobina. La definición de este término es idéntica a la definida anteriormente para disolventes adecuados para la adición a una solución de péptido o polipéptido. Esto es, “un disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina” 20 es uno que no degrada significativamente la hemoglobina durante el transcurso de la reacción. La hemoglobina no se desnaturaliza o degrada significativamente si los niveles de hemoglobina permanecen más de aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más sin degradarse o desnaturalizarse después de la adición del disolvente a lo largo del transcurso de la PEGilación.
Existe una variedad de ensayos conocidos por los expertos para medir la degradación de un péptido o polipéptido. 25 La degradación para polipéptidos y péptidos en general puede ensayarse mediante técnicas que incluyen, por ejemplo, proteína soluble total, espectros UV-VIS, actividad enzimática, etc. La degradación para el polipéptido hemoglobina puede evaluarse mediante estos métodos, y también mediante métodos específicos para hemoglobina, tales como la concentración de hemoglobina o un ensayo de methemoglobina.
La elección de un disolvente adecuado para la adición a una solución de péptido o polipéptido dependerá de una 30 variedad de factores. Por ejemplo, la elección del disolvente requiere un equilibrado de la solubilidad y la estabilidad del aPEG disuelto con los efectos negativos que tenga el disolvente sobre la solución de péptido o polipéptido. Puede ser necesario determinar la fracción del volumen de la reacción de PEGilación que puede ser ocupada por el disolvente sin desnaturalizar o degradar la solución de péptido o polipéptido. Así, por ejemplo, un disolvente particular puede ser apropiado para el uso cuando se añade a concentraciones inferiores, hasta, por ejemplo, 15% 35 del volumen de reacción final, mientras que proporciones superiores del mismo disolvente pueden dar como resultado la desnaturalización o degradación de la solución de péptido o polipéptido. Así, necesita considerarse una gama de factores cuando se determina la elección de un disolvente particular, incluyendo, pero no limitados a, la solubilidad del aPEG en el disolvente, la estabilidad del aPEG en el disolvente, los efectos del disolvente sobre la solución de péptido o polipéptido y la proporción máxima del volumen de la reacción de PEGilación que puede 40 ocupar el disolvente sin efectos perjudiciales.
La adición de disolventes orgánicos a soluciones acuosas de proteínas puede dar como resultado una desnaturalización sustancial de proteínas según se evidencia por una pérdida de una actividad de proteína o por agregación y precipitación de proteína. Así, el uso de disolventes específicos, su concentración y tiempo de contacto variarán para cada péptido o polipéptido que ha de modificarse mediante PEGilación. 45
Para la adición a una solución de hemoglobina, pueden usarse metanol, etanol y acetonitrilo. Para el uso con POE en la modificación de hemoglobina, puede preferirse el etanol. Con etanol, incluso al 20% del volumen final no se exhibía una desnaturalización o degradación sustancial de la solución de hemoglobina.
Según se define en la presente memoria, “medios de combinación” se refiere a un aparato para mezclar aPEG disuelto y una solución de péptido o polipéptido e incluyen cualquier dispositivo para mezclar dos soluciones, 50 incluyendo, pero no limitado a, dispositivos para mezclar pequeñas cantidades de dos soluciones así como dispositivos para llevar a cabo tales mezcladuras a escalas de procedimiento. Debido a que es deseable excluir tanta contaminación introducida externamente como sea posible de las fracciones de aPEG y péptido o polipéptido de la reacción de PEGilación, medios de combinación particularmente deseables son un aparato que permita la introducción aséptica de las fracciones de aPEG y péptido o polipéptido. En una realización particular, este aparato 55 puede tener varias compuertas de entrada a través de las cuales estas fracciones pueden introducirse asépticamente. Se contempla que tal introducción aséptica se produce mediante una variedad de mecanismos, incluyendo al acoplar asépticamente los medios de filtración para filtrar un aPEG a una compuerta de entrada del
aparato a través de una longitud de tubo de un tipo conocido por un experto en la técnica.
Como un ejemplo, el acoplamiento aséptico puede efectuarse al realizar las operaciones en un área de clasificación apropiada. Alternativamente, el recipiente puede acoplarse a un filtro preesterilizado que contiene una válvula y un filtro sanitario. La válvula puede cerrarse y el recipiente y el conector pueden esterilizarse a través de introducción de vapor de agua. En el momento del procesamiento, la válvula se abre y la longitud de recorrido desde la salida del 5 filtro hasta el recipiente es estéril.
El método de la presente invención para la preparación de una solución de hemoglobina PEGilada usando aPEG disuelto ofrece un número de ventajas sobre métodos convencionales que utilizan un aPEG en forma de polvo. Una ventaja particularmente importante es la mayor esterilidad resultante cuando se usan conexiones de aporte de fluidos cerradas. Tal introducción puede efectuarse, por ejemplo, al acoplar asépticamente los medios de filtración 10 de aPEG a los medios de combinación. Esto está en contraste con la situación para la adición de aPEG en polvo, cuando la introducción de biocarga debe controlarse, por ejemplo, al añadir material en polvo a una compuerta abierta de los medios de combinación bajo una campana de flujo laminar, o cuando el personal usa guantes y está entrenado en los métodos apropiados para realizar tales conexiones pero no se usa un ambiente especial.
Adicionalmente, resultan ventajas del uso de aPEGs disueltos en comparación con aPEGs en forma de polvo. Una 15 de tales ventajas es la disminución en la formación de productos de alto peso molecular en reacciones de PEGilación a escala de procedimiento usando aPEGs disueltos en oposición a polvos de aPEGs. Aunque tales productos no se forman en una extensión sustancialmente diferente en reacciones a pequeña escala usando aPEG disuelto que en reacciones similares que usan un aPEG en forma de polvo, se forman cantidades sustancialmente menores de tales productos de reacción en reacciones a escala de procedimiento que usan solamente aPEG 20 disuelto. Según se define en la presente memoria, reacciones a “pequeña escala” se refiere a reacciones de 1-5 litros, mientras que la reacciones de 10 litros o más se denominan “escala de procedimiento”. Se contempla que “cantidades sustancialmente menores”, según se define en el contexto de estos productos de alto peso molecular, significa reducidas en al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. Métodos para la determinación de niveles de tales materiales incluyen el uso de cromatografía de 25 exclusión por tamaño (SEC), según se describe en Talarico et ál., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1476:53-65, u otros métodos tales como dispersión de luz láser de ángulo bajo, medidas de los materiales en partículas y conteo directo.
En particular, el uso de aPEG disuelto en la PEGilación a escala de procedimiento da como resultado la reducción en productos de alto peso molecular en la producción a escala de procedimiento de PHP usando POE. Los análisis 30 por SEC de PHP obtenido usando POE en polvo muestran la presencia de un pico de masa alta de aproximadamente 15.548.068. En completo contraste, el análisis por SEC de reacciones a escala de procedimiento realizadas con POE disuelto muestra cantidades sustancialmente menores de este pico de alto peso molecular. Como un ejemplo específico de este efecto, el PHP producido a partir de POE disuelto en etanol al 95% no muestra esencialmente tal material de alto peso molecular, al menos en el intervalo de sensibilidad del análisis realizado. 35
Además, la introducción de POE como una solución da como resultado una reducción de materiales en partículas macroscópicos. Por ejemplo, POE añadido como un polvo a grandes recipientes de reacción da como resultado una condición en la que una cantidad significativa del polvo descansa sobre la superficie del líquido hasta que puede disolverse. Si están presentes grandes partículas o granos de POE, la proteína en solución (hemoglobina) se hace reaccionar sobre la superficie de los gránulos. Puesto que el POE es bifuncional, resulta la reticulación de la 40 proteína. La reticulación es intensiva en la superficie de los gránulos y resulta un “gel” de proteína. Este gel, o masa de proteína reticulada, tiene 1 o más micras de diámetro. La formación de estas macropartículas da como resultado la obturación de filtros usados en operaciones de purificación aguas abajo y una pérdida de producto. Al eliminar cualesquiera “gránulos” de POE presentes en la adición en polvo, se elimina la formación de estas partículas de proteína reticulada. El resultado es una reacción de modificación química y un procedimiento de purificación más 45 eficaces y reproducibles.
En la siguiente sección, se presentarán ejemplos ilustrativos. Estos ejemplos se presentan para ilustrar el mejor modo y realizaciones preferidas de la presente invención, y no pretenden limitar la invención reivindicada a no ser que se especifique otra cosa.
PARTE EXPERIMENTAL 50
Ejemplo 1: Ensayo de Reducción de Biocarga en una Solución de POE Filtrada
100,7 gramos de POE de PM 3000 se disolvieron en 300 ml de etanol al 95% y 240 ml de la solución resultante se filtraron a través de un filtro Posidyne de 0,2 μm de 47 mm de diámetro bajo presión positiva. El filtrado se recogió en una botella de vidrio estéril y las muestras se retiraron, se diluyeron y se filtraron a través de una unidad filtrante Milliflex para la enumeración de la biocarga. Las muestras se pusieron sobre agar R2A estéril y se incubaron durante 55
4 días a 30-35 °C. Véase, por ejemplo, Official Methods of Analysis of AOAC International (1995) 17ª, 17.2.05 Official Method 986.32 o 17.3.08 Official Method 983.25. La solución de POE contenía 151 CFU/ml antes de la filtración y 0 CFU/ml después de la filtración.
Ejemplo 2: Ensayos de Reducción de Endotoxinas en Soluciones de POE Filtradas
A. Ensayo de Reducción de Endotoxinas en una Solución de POE/Etanol Filtrada 5
1 ml de endotoxina de LPS de E. coli purificada (Charles Rivers Endosafe®) se añadió a 435 ml de una solución de POE de PM 3000/etanol (1:3 p/v), la solución se muestreó y a continuación se hizo pasar a través de un filtro Posidyne de 0,2 μm de 47 mm de diámetro bajo presión positiva y se recogió en una botella de vidrio libre de pirógenos. El filtrado se muestreó y las muestras tanto de la fracción reunida de partida como de la fracción reunida de filtrado se diluyeron en agua libre de endotoxinas. El contenido de endotoxinas de cada dilución se determinó 10 mediante un ensayo de LAL turbidimétrico cinético. La fracción reunida de partida descartada contenía 1.009.200 EU y el filtrado contenía 346.375 EU. Así, 662.825 EU eran retiradas por el filtro.
B. Ensayo de Reducción de Endotoxinas en una solución de POE/Metanol Filtrada
Aproximadamente 2 millones de unidades de endotoxina de LPS de E. coli purificada se añadieron a 12 ml de una solución de POE de PM 3000/metanol (1:3 p/v), la solución se muestreó y 10 ml se hicieron pasar a través de un 15 filtro Posidyne de 0,2 μm de 47 mm de diámetro bajo presión positiva y se recogieron en una vasija de vidrio libre de pirógenos. El filtrado se muestreó y las muestras tanto de la fracción reunida de partida como de la fracción reunida de filtrado se diluyeron en agua libre de endotoxinas. La fracción reunida de partida contenía 1.197.490 EU y el filtrado contenía 5290 EU. Así, 1.192.200 EU eran retiradas por el filtro.
C. Ensayo de Reducción de Endotoxinas en una solución de POE/Acetonitrilo Filtrada 20
Aproximadamente 2 millones de unidades de endotoxina de LPS de E. coli purificada se añadieron a 12 ml de una solución de POE de PM 3000/acetonitrilo (1:3 p/v), la solución se muestreó y 10 ml se hicieron pasar a través de un filtro Posidyne de 0,2 μm de 47 mm de diámetro bajo presión positiva y se recogieron en una botella de vidrio libre de pirógenos. El filtrado se muestreó y las muestras tanto de la fracción reunida de partida como de la fracción reunida de filtrado se diluyeron en agua libre de endotoxinas. La fracción reunida de partida contenía 1.095.580 EU y 25 el filtrado contenía 273 EU. Así, una reducción de 1.095.307 EU era alcanzada por el filtro.
Ejemplo 3: Estabilidad de POE en Etanol
Se disolvió POE en etanol (1:3 p/v) y se añadió en partes alícuotas a un vial de vidrio. En diversos puntos temporales se retiró una parte alícuota del vial y el POE se hizo reaccionar con hidróxido amónico. Muestras de cada punto temporal se diluyeron hasta 1 mg/ml y se analizaron mediante HPLC para determinar el porcentaje de 30 actividad del POE en solución. Los resultados se muestran posteriormente en la Tabla 1.
Tabla 1
Estabilidad de POE en Etanol
Tiempo (h)
Actividad (%)
0
97,6
0,5
97,6
1
97,3
2
96,8
3
96,0
4
95,8
24
85,9
Ejemplo 4: Reducción de Endotoxinas y Productos de Alto Peso Molecular en Preparaciones a Escala de Procedimiento de PHP con POE en Polvo frente a una Solución de POE/Etanol Filtrada
A. Preparación de PHP con POE en Polvo
Se preparó PHP a partir de hemoglobina purificada libre de estroma. La hemoglobina se modificó químicamente con 5 5-fosfato de piridoxal bajo condiciones predeterminadas. La unión de POE se realizó como sigue. En primer lugar, el POE se añadió a la solución de hemoglobina en un exceso molar de aproximadamente 10 veces. Por ejemplo, 1953 g de POE se añadieron a 70 litros de hemoglobina piridoxilada contenida en un reactor agitado de acero inoxidable de 100 litros al verter el POE a través de un embudo de 10,2 cm (4 pulgadas) unido a una compuerta sanitaria de 3,8 cm (1,5 pulgadas) en la parte superior del reactor. La solución se agitó para permitir la disolución y la mezcladura 10 a fondo del POE. La reacción se deja avanzar durante 40 minutos y a continuación la hemoglobina modificada se retiró para el procesamiento adicional.
B. Preparación de PHP con solución de POE/Etanol Filtrada
PHP preparado a partir de una solución de POE/EtOH filtrada se fabrica como se describe anteriormente con las siguientes modificaciones. 1953 g de POE se disolvieron en 6 litros de etanol al 95%, se calentaron hasta 40°C en 15 un recipiente de acero inoxidable de presión graduada con agitación durante 20 minutos. A continuación, la solución se filtró bajo presión (2,07 bares, 30 PSIG) a través de un filtro de cápsula Posidyne de 0,2 μm unido, hacia un recipiente de modificación química de 100 litros que contenía hemoglobina piridoxilada. La solución en el reactor se agitó durante la adición del POE filtrado.
C. Reducción de Endotoxinas en PHP Preparado con POE en Polvo frente a Solución de POE/Etanol Filtrada 20
Las endotoxinas se ensayaron en PHP preparado bien con POE en polvo o bien con una solución de POE/etanol filtrada mediante el método de coagulación de gel mediante LAL. Véase USP 24, NF19 <85> Bacterial Endotoxins Test, 1829-1831. Según se muestra en las Tablas 2 y 3 posteriormente, los niveles de endotoxinas se reducían sustancialmente cuando la solución de POE/etanol filtrada se usaba como el material de alimentación para la modificación química. 25
Tabla 2
Contenido de Endotoxinas de PHP – Adición de POE en Polvo
Lote
Contenido de Endotoxinas (EU/ml)
A
0,50
B
0,26
C
0,24
D
0,26
Tabla 3
Contenido de Endotoxinas de PHP – Adición de POE Líquido
Lote
Contenido de Endotoxinas (EU/ml)
E
≤0,03
F
≤0,03
G
≤0,03
H
≤0,06
D. Reducción de Productos de Alto Peso Molecular en PHP Preparado con POE en Polvo frente a Solución de POE/Etanol Filtrada
Los productos de alto peso molecular se ensayaron en PHP preparado con POE en polvo o con una solución de 5 POE/etanol filtrada. Se realizaron análisis usando SEC según se describe en Talarico et ál., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1476:53-65, y se muestran en las Figuras 2-5. Las Figuras 2 y 3 muestran los perfiles de elución de PHP preparado con POE en polvo o con solución de POE/etanol filtrada, respectivamente. La Figura 4 muestra una superposición de los dos perfiles de las Figuras 2 y 3 a una escala de sensibilidad vertical ampliada de aproximadamente dos veces la mostrada para los perfiles no superpuestos. La Figura 5 muestra la misma 10 superposición que la Figura 4, pero con una sensibilidad vertical aproximadamente 100 veces la de la Figura 4.
Según se muestra más claramente en la Figura 5, el perfil de PHP obtenido usando POE en polvo muestra material de producto de alto peso molecular que se eluye aproximadamente a los 10,3 minutos, con una masa de 15.548.068. En contraste, el perfil de PHP obtenido de POE/etanol filtrados no muestra ningún pico en esta región, incluso a la escala de alta sensibilidad del perfil, indicando la presencia reducida sustancial de estos materiales de 15 alto peso molecular en PHP obtenido con materiales de partida de aPEG disueltos.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica que trata esta invención.
Aunque la invención precedente se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de comprensión, será obvio que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del 20 alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para preparar una solución de hemoglobina PEGilada que está sustancialmente libre de contaminantes, que comprende:
    (a) disolver un polietilenglicol activado (aPEG) en un disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina y en el que dicho aPEG es estable, en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste 5 en etanol, metanol y acetonitrilo;
    (b) filtrar dicho aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, en donde los medios de filtración son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm; y
    (c) combinar asépticamente dicha solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en 10 medios de combinación, en donde la hemoglobina es hemoglobina libre de estroma purificada, y preparar dicha solución de hemoglobina PEGilada.
  2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el aPEG es polioxietileno (POE) activado.
  3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de filtración reducen sustancialmente los niveles contaminantes de endotoxinas en la solución de aPEG filtrada. 15
  4. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que los medios de filtración reducen los niveles contaminantes de endotoxinas en la solución de aPEG filtrada en al menos 500 EU/cm2 de área del filtro.
  5. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de filtración comprenden un filtro de nailon de 0,2 m.
  6. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la solución de hemoglobina comprende hemoglobina 20 piridoxilada libre de estroma.
  7. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de filtración y los medios de combinación están unidos asépticamente.
ES02757260T 2001-08-21 2002-08-20 Métodos para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada. Expired - Lifetime ES2357941T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US934300 1986-11-24
US09/934,300 US7038016B2 (en) 2001-08-21 2001-08-21 Methods for purification of an activated PEG solution and for the synthesis of a modified hemoglobin solution

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2357941T3 true ES2357941T3 (es) 2011-05-04

Family

ID=25465324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02757260T Expired - Lifetime ES2357941T3 (es) 2001-08-21 2002-08-20 Métodos para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7038016B2 (es)
EP (1) EP1419171B1 (es)
JP (1) JP2005508399A (es)
AT (1) ATE492557T1 (es)
CA (1) CA2455974A1 (es)
DE (1) DE60238688D1 (es)
ES (1) ES2357941T3 (es)
WO (1) WO2003016334A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8071546B2 (en) * 2005-06-10 2011-12-06 La Jolla Bioengineering Institute Uses of pegylated albumin
WO2006135740A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Pegylated hemoglobin and albumin and uses thereof
ITRM20080037A1 (it) 2008-01-23 2009-07-24 Uni Degli Studi Perugia Procedimento per la ultrapurificazione di alginati.
US7989593B1 (en) 2010-05-27 2011-08-02 Bing Lou Wong Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof
US7932356B1 (en) 2010-06-23 2011-04-26 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition
US8048856B1 (en) 2010-06-23 2011-11-01 Billion King, Ltd. Treatment methods using a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition
US8084581B1 (en) 2011-04-29 2011-12-27 Bing Lou Wong Method for removing unmodified hemoglobin from cross-linked hemoglobin solutions including polymeric hemoglobin with a high temperature short time heat treatment apparatus
US20130052232A1 (en) 2011-08-31 2013-02-28 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilating beta-beta cross-linking
WO2019018403A1 (en) 2017-07-18 2019-01-24 Virtech Bio, Llc BLOOD SUBSTITUTES COMPRISING HEMOGLOBIN AND METHODS OF MAKING
CN107982544B (zh) * 2017-11-28 2021-07-20 深圳先进技术研究院 杂交蛋白纳米氧载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5840930B2 (ja) * 1976-09-20 1983-09-08 株式会社ミドリ十字 Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法
JPS5432611A (en) * 1977-08-16 1979-03-10 Nobuhiko Katsunuma Glucocorticoid saving factor
US4929354A (en) * 1982-05-28 1990-05-29 Cuno, Incorporated Filter element having microporous membrane
US4831012A (en) 1984-03-23 1989-05-16 Baxter International Inc. Purified hemoglobin solutions and method for making same
US5464814A (en) 1986-06-20 1995-11-07 Northfield Laboratories, Inc. Acellular red blood cell substitute
US5084558A (en) 1987-10-13 1992-01-28 Biopure Corporation Extra pure semi-synthetic blood substitute
US5854209A (en) 1995-03-23 1998-12-29 Biopure Corporation Method for oxygenating tissue having reduced red blood cell flow
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
JP3297433B2 (ja) 1989-06-15 2002-07-02 ローヌ−プーラン ローラー インターナショナル （ホウルディングス） インコーポレイテッド ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
US5439882A (en) * 1989-12-29 1995-08-08 Texas Tech University Health Sciences Center Blood substitute
DE4119981C1 (es) 1991-06-18 1993-01-21 Fa. Carl Freudenberg, 6940 Weinheim, De
WO1994009121A1 (en) * 1992-10-22 1994-04-28 The New York Blood Center, Inc. Preparation of enzyme for conversion of sub-type a and ab erythrocytes
US6150507A (en) 1995-03-23 2000-11-21 Biopure Corporation Method for producing a purified hemoglobin product
US5585484A (en) 1995-04-19 1996-12-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Hemoglobin crosslinkers
US5741894A (en) 1995-09-22 1998-04-21 Baxter International, Inc. Preparation of pharmaceutical grade hemoglobins by heat treatment in partially oxygenated form
US5900402A (en) * 1997-05-29 1999-05-04 Enzon, Inc. Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
US6747132B2 (en) 2000-11-29 2004-06-08 Apex Biosciences, Inc. Methods for the synthesis of a modified hemoglobin solution
US20040067898A1 (en) * 2001-11-27 2004-04-08 John Somberg Synthesis and separation of optically active isomers of erythromycin and their biological actions

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003016334A1 (en) 2003-02-27
ATE492557T1 (de) 2011-01-15
US20030045602A1 (en) 2003-03-06
CA2455974A1 (en) 2003-02-27
JP2005508399A (ja) 2005-03-31
DE60238688D1 (de) 2011-02-03
US7038016B2 (en) 2006-05-02
EP1419171A1 (en) 2004-05-19
EP1419171A4 (en) 2004-09-29
EP1419171B1 (en) 2010-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2622834T3 (es) Procedimiento de esterilización por filtración en estado diluido para biopolímeros viscoelásticos
FI107388B (fi) Menetelmä puhdistettujen hepariinifraktioiden valmistamiseksi, jotka eivät sisällä nitrosoyhdisteitä
ES2032802T5 (es) Sucedaneo de sangre semisintetico extrapuro.
ES2553385T3 (es) Proceso para preparar una composición de inmunoglobulina
CN111484568B (zh) 一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用
ES2357941T3 (es) Métodos para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada.
SA96160728B1 (ar) محاليل انترفيرون الفا ثابتة
CN106729623A (zh) 一种包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG‑PLGA纳米颗粒及其制备方法和应用
US20040072729A1 (en) High oxygen affinity PEG-hemoglobin as treatment for brain stroke
WO2023193389A1 (zh) 一种白藜芦醇卵磷脂纳米粒及其制备方法、用途
CN110755638A (zh) 一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用
CN103536910A (zh) 细胞色素c注射液
JPS58141785A (ja) 抗腫瘍物質の製法
RU2749193C1 (ru) Способ получения бетулина для использования в качестве адъюванта в вакцине против коронавируса SARS-CoV-2
ES2383351T3 (es) Procedimiento de fabricación de un medicamento factor de transferencia
CZ302750B6 (cs) Farmaceutická kompozice a ampulka na bázi erythropoietinu a zpusob inhibování mikrobiálního rustu v roztoku obsahujícím tuto látku
JP2002516087A (ja) 幾つかの重篤な疾患の治療のための医薬組成物を調製するための修飾されたリゾチームｃの使用
ES2899389T3 (es) Procedimiento para tratar una solución contaminada con circovirus porcinos
Al-Achi et al. Human insulin binding to erythrocyte-membrane
CN1836651A (zh) 左旋舒必利注射剂的制备方法
US20030073820A1 (en) Dextran-hemoglobin conjugates as blood substitutes
ES2738173B2 (es) Nanosistemas con complejos
JP2017505815A (ja) 輸液セット用フィルター
CN117024565A (zh) 一种多肽改造体及其在制备抗大肠杆菌感染药物中的应用
CN116785401A (zh) 新型两亲性脂肽纳米制剂及其应用