ES2553385T3

ES2553385T3 - Proceso para preparar una composición de inmunoglobulina

Info

Publication number: ES2553385T3
Application number: ES11715928.5T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Möller; Dieter Rudnick; Oliver Maneg; Michael Rodemer; Herbert Dichtelmueller; Eckhard Flechsig
Original assignee: Biotest AG
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 2010-04-22
Filing date: 2011-04-21
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2031-04-21
Also published as: EP2560691A2; CA2796263A1; ZA201208540B; CA2796409A1; WO2011131786A2; US20180319871A1; JP2016222674A; SG184843A1; US8900806B2; ZA201208541B; IL222373A; KR101860459B1; RU2012149743A; CA2796263C; PL2560691T3; JP6612182B2; MX2012012262A; EP2560682A2; CN107080842A; HUE025853T2

Abstract

Un proceso para la preparación de una composición de inmunoglobulina que contiene IgM a partir de una fracción de plasma que comprende inmunoglobulinas, comprendiendo el proceso: (a) proporcionar una fracción plasmática en forma de solución que contiene las inmunoglobulinas; (b) mezclar un ácido carboxílico C7 a C9 con la solución y tratar la solución mezclada con un agitador vibrador para precipitar las proteínas contaminantes; y (c) separar las proteínas precipitadas a partir de la solución para dar como resultado la composición de inmunoglobulina que contiene la IgM.

Description

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descripcion

Proceso para preparar una composicion de inmunoglobulina Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un proceso para la preparacion de una composicion de inmunoglobulina segura contra virus, y a preparaciones de anticuerpos y composiciones farmaceuticas que se pueden preparar utilizando el proceso.

Antecedentes de la invencion

Se conocen en la tecnica composiciones de inmunoglobulinas preparadas a partir de plasma humano y adecuadas para la administracion intravenosa y han Jugado durante varias decadas un importante papel en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Las inmunoglobulinas se utilizan, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones en seres humanos y se pueden asignar a varias clases con diversas propiedades bioqmmicas y fisiologicas. La inmunoglobulina G participa en la defensa contra antfgenos vmcos, mientras que IgM es predominantemente activa en las respuestas inmunes antibacterianas y antitoxinas.

Las soluciones de inmunoglobulinas comprenden IgG, IgA e IgM en diversos porcentajes, con diferentes preparaciones que tienen diferentes aplicaciones de tratamiento, por ejemplo, se usan preparaciones con un mayor porcentaje de IgM en la profilaxis o el tratamiento de infecciones bacterianas. A diferencia de las preparaciones de IgG, los anticuerpos IgM se agregan facilmente en solucion. Las preparaciones de IgM son difmiles de estabilizar especialmente si estan enriquecidas en comparacion con las concentraciones plasmaticas y se almacenan en solucion Ifquida.

Las soluciones de inmunoglobulinas se preparan usualmente a partir de fracciones de plasma o suero sangumeo, por ejemplo, fracciones de Cohn. Estas fracciones se someten a continuacion a numerosas etapas de purificacion para eliminar contaminantes entre los que se incluyen virus, protemas desnaturalizadas, proteasas y Kpidos. El plasma humano para fraccionamiento se recoge a partir de miles de donantes y puede contener virus patogenos a pesar de someter a ensayo totalmente la fuente de plasma. Por tanto, son esenciales las etapas de proceso para inactivar o eliminar virus a fin de conseguir productos seguros para el uso en medicina. Se conocen en la materia algunas tecnicas para la inactivacion/eliminacion vmca, por ejemplo, tratamientos clmicos, irradiacion con UVC Iuz o filtracion nanometrica, que se llevan a cabo para garantizar la seguridad total del virus. Sin embargo, dichas etapas pueden tener un impacto negativo sobre la actividad de las inmunoglobulinas; por ejemplo, tiempos de irradiacion prolongados con UVC pueden reducir el rendimiento de la IgM natural activa en la solucion final de inmunoglobulina.

La capacidad de las etapas de proceso para la eliminacion o inactivacion vmca se valida usando modelos a escala laboratorio del proceso de produccion y para cada etapa se determina un factor de eliminacion o inactivacion. Un aumento del factor de eliminacion / inactivacion proporciona seguridad vmca adicional al producto farmaceutico. Actualmente, las directrices de los organismos reguladores requieren al menos dos etapas eficaces contra los virus con envoltura y sin envoltura en la fabricacion de compuestos farmaceuticos derivados de plasma.

En adicion a los virus que estan potencialmente presentes, es tambien necesario eliminar otros contaminantes como proteasas, agregados de protemas, e inmunoglobulinas desnaturalizadas, para conseguir un producto bien tolerado. Las inmunoglobulinas desnaturalizadas son especialmente un riesgo potencial para los pacientes debido a que tienen una elevada capacidad de activar de forma inespedfica el complemento, dando lugar a graves efectos secundarios en pacientes que reciben estas inmunoglobulinas desnaturalizadas. Esta actividad anticomplementaria (ACA) se mide mediante un ensayo normalizado descrito en Farmacopea Europea.

La eliminacion de todos estos contaminantes es esencial (1) para que el producto sea bien tolerado por el paciente tras la administracion intravenosa, (2) para asegurar que el producto cumple con las directrices de bioseguridad relativas a la contaminacion vmca, (3) para permitir que el producto sea estable durante el almacenamiento a largo plazo, y (4) para generar la mezcla de compuesto / composicion farmaceutica deseada.

Se ha llevado a cabo la purificacion inicial de soluciones de IgM humanas mediante metodos clasicos de fraccionamiento de plasma de Cohn con alcohol fno o sus modificaciones bien conocidas (por ejemplo, Cohn/Oncley, Kistler/Nitschmann). Mediante el uso de procesos de precipitacion con etanol fno, se recupera la fraccion de IgM en la fraccion Ill o la fraccion l/lll (denominada tambien B o B+l). Se han descrito metodos que, partiendo de la fraccion Ill o l/ll, purifican soluciones de protemas enriquecidas en IgM. El documento EP0013901 describe un metodo de purificacion que parte de la fraccion Ill incluyendo etapas que utilizan acido octanoico, p- propiolactona y una etapa de adsorcion que utiliza una resina de intercambio anionico. Este metodo se utiliza para producir Pentaglobin® -hasta la fecha, el unico producto de IgM intravenoso comercialmente disponible. El documento EP0352500 describe la preparacion de un concentrado de IgM para su aplicacion intravenosa con una actividad anticomplementaria reducida utilizando la cromatograffa de intercambio anionico, p-propiolactona, irradiacion con Iuz ultravioleta y una etapa de incubacion a temperatura elevada (40 0C a 60 0C). p-propiolactona es

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un compuesto qmmico bien conocido utilizado en las etapas de esterilizacion para inactivar virus que estan potencialmente presentes. Como la p-propiolactona es una sustancia muy reactiva que produce la modificacion qmmica de las protemas, se produce tambien una perdida sustancial de las actividades antivmcas y antibacterianas de las inmunoglobulinas. La preparacion producida mediante este metodo era estable en solucion ffquida durante un tiempo limitado debido a la modificacion qmmica. La concentracion de IgM estaba por encima del 50 % del contenido total de inmunoglobulina.

Se ha descrito la preparacion de soluciones de protema enriquecidas en IgM sin modificacion qmmica mediante la p- propiolactona en los documentos EP0413187 (Biotest) y EP0413188 (Biotest). Estos metodos implican someter una solucion de protema adecuada a tratamiento con acido octanoico y cromatograffa de intercambio anionico, partiendo de la fraccion Ill o II/III de Cohn. En la patente EP0413187 (Biotest) el tratamiento con acido octanoico se lleva a cabo agitando durante 15 min, para eliminar los ffpidos que estan presentes en la fraccion Ill de Cohn.

Puesto que se administran a los pacientes grandes cantidades de inmunoglobulinas por via intravenosa, debe conseguirse una preparacion farmaceutica que sea tolerable. Se ha descrito que las preparaciones de IgM son diffciles de preparar para aplicacion intravenosa. IgM es por naturaleza un intenso activador del complemento tras la union de los anffgenos. Por tanto, la actividad anticomplementaria inespedfica de las moleculas de IgM desnaturalizadas es mucho mas peligrosa para los pacientes que las moleculas de IgG desnaturalizadas. La preparacion de acuerdo con el documento eP0413187 tuvo una baja actividad anticomplementaria, entre 0,6 y 0,8 CH50/mg de protema, pero tuvo que estabilizarse, e inactivarse los virus mediante la p-propiolactona. La baja actividad anticomplementaria se considera que es < 1 CH50/mg de protema de acuerdo con la monograffa de la EP sobre inmunoglobulinas.

El documento EP0413188B1 (Biotest) describe la preparacion de una preparacion enriquecida en IgM para administracion intravenosa utilizando cromatograffa de intercambio anionico para reducir la aactividad anticomplementaria. Adicionalmente se ha descrito un tratamiento termico a pH 4 - 4,5 a 40 a 60 0C, preferentemente entre 50 y 54 oc, para reducir la actividad anticomplementaria. Esta preparacion debe liofilizarse para garantizar la estabilidad de la preparacion durante varios meses. No se pudo demostrar la estabilidad a largo plazo en forma de solucion ffquida.

Otro metodo describe el uso de un tratamiento termico suave de las preparaciones de IgM a 40 a 62 oc, preferentemente de 45 a 55 oc, a pH 4,0 a 5,0 (documento EP 0450412, Miles) para reducir la activacion no espedfica del complemento. En esta solicitud de patente se anade acido octanoico a la suspension de la fraccion Ill de Cohn a fin de eliminar el activador precalicrema y las lipoprotemas mediante centrifugacion. Sin embargo, este tratamiento ocasiona la perdida parcial de los determinantes antigenicos de IgM. Esto puede aumentar el riesgo de generar nuevos anffgenos que conduce a un aumento de la inmunogenicidad en seres humanos o a la perdida de la actividad.

Se ha descrito la preparacion de una solucion de protema que contiene IgM para la aplicacion intravenosa utilizando un tratamiento con proteasa (por ejemplo, con pepsina) tras una etapa de precipitacion con acido octanoico en el documento EP0835880 (US 6136312, ZLB). El tratamiento con proteasa conduce a la fragmentacion parcial de la molecula de inmunoglobulina, lo que afecta negativamente a la actividad funcional completa de las partes Fab y Fc. Por tanto, las inmunoglobulinas tratadas con proteasa no se pueden considerar como no modificadas. Analogamente, este metodo de preparacion conduce a aproximadamente un 5 % de fragmentos con un peso molecular de <100 kD.

Los metodos descritos para llevar a cabo el tratamiento con acido octanoico (documentos EP0413187 y EP0835880) tienen el inconveniente de que el tratamiento con acido octanoico no es eficaz con respecto a la eliminacion y a la inactivacion de virus sin envoltura, y no elimina sustancialmente toda la actividad proteofftica.

En el documento EP 0345543 (Bayer, Miles) se describe una preparacion de IgM muy concentrada con al menos un 33 % de IgM para uso terapeutico, estando la preparacion sustancialmente exenta de fftulos de isoaglutinina. En esta solicitud de patente se lleva a cabo una precipitacion con acido octanoico anadiendo el acido octanoico y se eliminan las isoaglutininas mediante cromatograffa de afinidad Synsorb. La preparacion final se debe criodesecada.

En conjunto, es posible preparar una preparacion que contiene IgM con una baja actividad anticomplementaria si las inmunoglobulinas estan qmmica o enzimaticamente modificadas y/o purificadas adicionalmente mediante cromatograffa y/o sometidas a un tratamiento termico suave.

Sin embargo, los metodos de la tecnica anterior que dan lugar a una preparacion de inmunoglobulina sin modificar no pueden conseguir la capacidad de inactivacion vffica para todos los virus que pueden estar potencialmente presentes. Aunque algunos metodos, tales como el tratamiento con disolvente/detergente, tratamiento con acido octanoico, filtracion nanometrica y tratamiento termico, son eficaces para inactivar o eliminar los virus con envolturas, existen solo unos pocos metodos conocidos para inactivar o eliminar los virus sin envoltura, por ejemplo los parvovirus. Estos virus sin envoltura son principalmente muy pequenos, usualmente pasan a traves de los filtros nanometricos con tamanos de poro superior a 20 nm. Este tamano de poro es demasiado pequeno para moleculas

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de IgM que tienen un diametro de hasta 30 nm. Los virus sin envoltura se inactivan eficazmente mediante agentes qmmicos del tipo p-propiolactona que, sin embargo, conducen tambien a una inmunoglobulina modificada con funciones afectadas. Otro tratamiento eficaz es la irradiacion con UVC (documento EP1842561, CAF-DCF). Sin embargo, los tratamientos conocidos con disolventes/detergentes, el tratamiento con acido octanoico y los tratamientos termicos suaves no tienen sustanciales efectos sobre los virus sin envoltura.

Por tanto, todas las preparaciones que contienen IgM sin modificar qmmicamente que se preparan por los metodos de la tecnica anterior, y que tienen una baja actividad anticomplementaria, no son seguros para uso humano con respecto a los virus sin envoltura, por ejemplo, los parvovirus.

En resumen, los metodos de la tecnica anterior que afslan preparaciones que contienen una IgM tolerable para administracion intravenosa tienen determinados inconvenientes, tales como incapacidad de inactivar o eliminar eficazmente los virus sin envoltura y una capacidad limitada para eliminar la actividad proteolftica manteniendo a la vez un elevado rendimiento en solucion de la IgM. (La actividad proteolftica se refiere a la suma de las proteasas que estan presentes en la preparacion). Puesto que una preparacion de protema ftquida debe poderse almacenar durante largos periodos (por ejemplo, 2 anos), deben omitirse las actividades de las proteasas residuales, dado que estas actividades deben conducir a la degradacion de la preparacion farmaceutica.

De esta manera, es el objeto de la presente invencion resolver estos inconvenientes.

Sumario de la invencion

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un proceso para la preparacion de una composicion de inmunoglobulina IgM a partir de una fraccion de plasma que comprende inmunoglobulinas, comprendiendo el proceso:

(a) proporcionar una fraccion plasmatica en forma de solucion que contiene las inmunoglobulinas;

(b) mezclar un acido carbox^lico C7 a Cg con la solucion y tratar la solucion mezclada con un agitador vibrador

para precipitar las protemas contaminantes; y

(c) separar las protemas precipitadas a partir de la solucion para dar como resultado la composicion de

inmunoglobulina que contiene la IgM.

Los presentes solicitantes han encontrado, de forma sorprendente que el uso de un agitador vibrador en la etapa donde la solucion de inmunoglobulina se mezcla con el acido carboxflico es extremadamente ventajosa. Esta etapa del metodo proporciona una eliminacion mas eficaz de protemas no deseadas (incluyendo las proteasas) y produce un producto intermedio que es mas adecuado para las etapas de procesamiento posteriores utilizadas para producir un medicamento de inmunoglobulina; el producto intermedio permite que estas etapas de procesamiento posteriores sean mas eficaces. En particular, la composicion que contiene la inmunoglobulina IgM obtenida a partir de la etapa (c) se puede combinar con etapas de tratamiento adicionales, tal como el tratamiento en condiciones acidas suaves y tratamiento con irradiacion UVC, para producir un producto de inmunoglobulina que contiene IgM 0 una preparacion de anticuerpos que es adecuada para su administracion intravenosa y que tiene las siguientes propiedades ventajosas: (i) esta qmmicamente sin modificar; (ii) es segura contra virus (iii) tiene baja actividad proteolftica (y por tanto es estable durante el almacenamiento a largo plazo); (iv) tiene baja actividad anticomplementaria; y (V) retiene un elevado nivel de IgM natural y activa. El nivel de la seguridad contra el virus conseguido con los metodos descritos en el presente documento no se ha obtenido anteriormente. Ademas, el uso del metodo de la presente invencion consigue un producto de inmunoglobulina 0 una preparacion de anticuerpos que contiene IgM con combinaciones de estas caractensticas que no se han obtenido previamente.

En particular, las etapas del metodo de la presente invencion conducen a una mayor inactivacion y eliminacion de partmulas vfticas, especialmente muy resistentes, virus sin envoltura tales como parvovirus, que no suelen ser muy susceptibles al tratamiento con acido octanoico. Ademas, se consigue una eliminacion mejorada de la actividad proteolftica en comparacion con la agitacion convencional. Estas caractensticas se consiguen manteniendo a la vez un elevado rendimiento de la IgM que esta qmmicamente sin modificar. Este hallazgo contrasta con la vision convencional de que el tratamiento con acido octanoico no es una etapa eficaz frente a virus sin envoltura y se puede conseguir una seguridad vftica mejorada mediante la inactivacion de virus mediante metodos rigurosos tales como el tratamiento con p-propiolactona. Analogamente, es bien sabido que aumentar, por ejemplo, la concentracion de acido octanoico para eliminar completamente la actividad proteolftica da como resultado una perdida masiva de IgM.

Los resultados de la presente invencion se consiguen mediante el uso de dispositivos de mezcla que utilizan un modo vibrador en combinacion con el tratamiento con acido octanoico. Esto es particularmente sorprendente ya que se sabe que la IgM es muy susceptible al esfuerzo de cizalladura, que puede conducir a una actividad anticomplementaria muy indeseada. De acuerdo con ello, se podna considerar no utilizar un mezclador vibrador para preparar una composicion de IgM y no se esperana dicho impacto favorable utilizando un mezclador vibrador durante el procesamiento de una solucion que contiene IgM.

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Ademas, con el metodo de la presente invenclon, la separaclon se conslgue en la etapa (c), dlcha clarlflcaclon medlante flltraclon de la soluclon tratada con acldo octanolco resultante de la etapa (b) queda potenclada cuando se usa un dlsposltlvo mezclador vlbrador. La separaclon se conslgue mas facllmente, reduclendo el tlempo de procesamlento y los costes de fabrlcaclon, y la etapa (c) conduce a una soluclon ftmplda que resulta una ventaja para el procesamlento posterior. Las soluciones convencionales, conseguldas flltrando los resultados de las soluclones que contienen IgM tratadas con acldo octanolco que se han agitado, son opalescentes u opacas.

La composicion que contlene IgM resultante obtenida de la etapa (c) se somete preferentemente a tratamlento en condiciones acldas suaves (por ejemplo, pH 4) y una etapa de irradiacion UVC para mejorar la segurldad contra el virus y estabilizar el producto final. Debldo a la clarlflcaclon mejorada de la composicion de inmunoglobulina que contlene IgM obtenida de la etapa (c) es posible dlsmlnulr el tlempo de Irradiacion necesario con UVC para conseguir la inactlvaclon vftlca de los virus sin envoltura de mas de 3 o 4 logio. Esto da como resultado un mayor rendimiento de la IgM natural y activa durante el tratamlento con UVC.

Sorprendentemente, estas etapas conducen a una soluclon que contlene IgM sin modificar nl qmmica nl enzlmatlcamente que tlene mayor rendimiento de la IgM natural y activa, que tlene baja actividad anticomplementaria y baja actividad proteolftlca y que tlenen elevada actividad antivmca y antlbacterlana, con una segurldad notable en lo que respecta a virus con y sin envoltura; un rasgo clave de las sustancias farmaceuticas previstas para administracion intravenosa. Ademas, una soluclon que contlene IgM tratada tlene una estabilidad a largo plazo mejorada, siendo muy estable en soluclon ftqulda durante mas de 12 meses a 2 - 8 0C.

De acuerdo con ello, en un aspecto adlclonal, la presente invenclon proporciona una preparaclon de anticuerpos que se puede obtener utilizando el proceso de la presente invenclon que se muestra anteriormente. La preparaclon de anticuerpos es adecuada para su administracion intravenosa a seres humanos y comprende anticuerpos IgG, IgA e IgM, donde al menos un 5 % de las inmunoglobulinas totales son IgM. En un aspecto, la presente invenclon proporciona una preparaclon de anticuerpos que comprende inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM, donde al menos un 15% de las inmunoglobulinas totales son IgM, donde la preparaclon de anticuerpos es segura contra virus con respecto a los virus con envoltura y sin envoltura, tlene una actividad anticomplementaria de < 1 CH 50/mg de protema, y es estable en forma ftqulda durante al menos 6 meses cuando se almacena de 2 a 8 oc. La preparaclon tlene preferentemente una actividad proteolftica inferior a 8 U/I.

Ademas, la presente invenclon proporciona una preparaclon de anticuerpos de la presente invenclon para uso en medicina. En una realizacion, la preparaclon de anticuerpos es para uso en el tratamlento de trastornos inmunologicos y las infecciones bacterianas.

Un aspecto adlclonal de la presente invenclon es el uso de una preparaclon de anticuerpos de la presente invenclon para la fabrlcaclon de un medicamento para el tratamlento de trastornos inmunologicos e infecciones bacterianas.

La preparaclon de anticuerpos de la presente invenclon es adecuada para su uso en un metodo de tratamlento que comprende administrar la preparaclon de anticuerpos de la presente invenclon a un paciente.

La presente invenclon se describira ahora mas detalladamente por medio de ejemplos solamente, con referenda a las figuras que la acompanan.

La FIGURA 1 proporciona una vision general de una realizacion de la invenclon donde se muestran las etapas que se pueden utilizar para formar una preparaclon de anticuerpos adecuada para la administracion intravenosa. La etapa de tratamlento con acldo octanolco emplea un dlsposltlvo vibromezclador, se resaltan el tratamlento a pH 4 y el tratamlento con UVC. El material de partida se genera a partir de un proceso de precipitacion con etanol fno normalizado de plasma humano.

Descripcion detallada de la invencion

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invenclon proporciona un proceso para la preparaclon de una composicion de inmunoglobulina que contlene IgM a partir de una fraccion de plasma que comprende inmunoglobulinas. Son blen conocidas en la materia las fracciones plasmaticas adecuadas para la preparaclon de composiciones farmaceuticas de inmunoglobulina, y los metodos para su produccion. En particular, donde las composiciones farmaceuticas de inmunoglobulina son para su administracion a seres humanos, la fraccion de plasma se obtiene a partir de plasma humano. La fraccion plasmatica es preferentemente una fraccion plasmatica precipitada y lo mas preferible una fraccion plasmatica precipitada obtenida medlante el proceso de fraccionamiento de Cohn o sus modificaciones blen conocidas (por ejemplo, Kistler-Nitschmann). Lo mas preferible, la fraccion es una fraccion l/lll o una fraccion Ill (conocida tambien como fraccion B+l o fraccion B) en un fraccionamiento en etanol fno. Se prefiere que las inmunoglobulinas de la fraccion plasmatica comprendan al menos un 5 % de IgM.

La etapa (a) comprende proporcionar una fraccion plasmatica en forma de soluclon que contlene las inmunoglobulinas. En muchos casos, la fraccion plasmatica que contlene las inmunoglobulinas estara en forma solida o semisolida. De esta manera, el objetivo de esta etapa es asegurar a o poner la protema de la fraccion

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plasmatica en solucion de tal manera que este en un estado adecuado para su mezcla con el acido carbox^lico en la etapa (b). Esta etapa puede comprender mezclar la fraccion plasmatica con un tampon adecuado. Preferentemente, el tampon es de molaridad baja (es decir, menos de 1 M) y tiene un pH entre 4,5 y 5,5 por ejemplo, tampon de acetato de sodio 0,1 M pH 5,o560±1. Se puede completar la mezcla utilizando un mezclador de palas o un agitador vibrador.

En la etapa (b), la solucion formada en la etapa (a) se mezcla utilizando un agitador vibrador con un acido carboxflico C7 a Cg para precipitar las protemas contaminantes (por ejemplo, proteasas, virus, etc). El acido carboxflico puede estar ramificado y/o puede incluir sustituyentes que no alteran sustancialmente el efecto de la etapa (b). El acido carboxflico es preferentemente acido octanoico. El acido se anade preferentemente a una concentracion de al menos 0,075 kg/kg de fraccion plasmatica, hasta una concentracion de 0,2 kg/kg. Mas preferentemente, el acido se anade a 0,8 a 0,15 kg/kg de fraccion plasmatica, y lo mas preferible entre 0,09 kg/kg y 0,13 kg/kg. Se puede usar acido de cualquier molaridad conveniente para proporcionar la concentracion correcta.

Se puede usar cualquier tipo de agitador vibrador comercialmente disponible, adecuado para el uso en la industria qmmica/farmaceutica. Los ejemplos de agitadores vibradores adecuados estan disponibles de Graber + Pfenninger GmbH. En particular, se puede usar el vibromezclador "Labormodell Typ 1" para los experimentos a escala laboratorio, y se puede usar el "Industriemixer Typ 4" para preparaciones a escala produccion. Los mezcladores vibradores se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y en especial, en escenarios que los fabricantes describen como adecuados para la mezcla de soluciones que contienen protemas. Por ejemplo, los mezcladores vibradores pueden funcionar usualmente a menos de 100 Hz con una amplitud de menos de 10 mm, por ejemplo, los presentes inventores llevaron a cabo la mezcla por vibracion mediante el "Labormodell Typ 1" a escala laboratorio a 50 Hz, donde se uso un suministro electrico a 230 V. Se vario la amplitud de la vibracion del proceso de mezcla entre 0 y 3 mm, y se uso preferentemente para la preparacion de IgM la de 3 mm. En los experimentos a escala laboratorio se usaron agitadores de placas con un diametro entre 23 mm y 65 mm. Para la produccion a escala se uso un agitador de placas con un diametro de 395 mm (diametros de los huecos de 13,5 mm y 16 mm).

En la etapa (b), el pH de la solucion mezclada esta preferentemente entre 4,5 y 5,5, y mas preferentemente entre pH 4,8 y pH 5,3. La etapa se puede llevar a cabo en tampon acetato de sodio, y, por ejemplo, con tampon acetato de sodio aproximadamente 0,1 M. La temperatura a la que se realiza la etapa (b) esta preferentemente entre 10 0C y 35 oc, y mas preferentemente 14 a 30 oc.

El tiempo de mezcla utilizando el agitador vibrador no esta particularmente limitado, pero es preferentemente de al menos de 30 minutos y no superior a 3 horas, y mas preferentemente de 40 - 110 minutos. Tiempos de incubacion de menos de 30 minutos pueden reducir el nivel de inactivacion del virus.

En una realizacion de la etapa (b) se mezcla fosfato tricalcico con la solucion de la etapa (b). Preferentemente, se anade a 0,01 a 0,02 kg/kg de fraccion de plasma (que esta en forma solida 0 semisolida). El fosfato de calcio se puede anadir simultaneamente, por separado 0 secuencialmente al acido carboxflico. En una realizacion preferida, el fosfato tricalcico se anade al menos 20 minutos despues del acido carboxflico.

En la etapa (c), las protemas contaminantes precipitadas en la etapa (b) se separan de la solucion para dar como resultado la composicion de inmunoglobulina que contiene IgM (es decir, una solucion que contiene inmunoglobulina). Esta etapa de separacion no esta particularmente limitada pero se puede llevar a cabo mediante cualquier metodo adecuado conocido en la materia. Sin embargo, la etapa de separacion se lleva a cabo preferentemente utilizando filtracion, y mas preferentemente ultrafiltracion, y el resultado de la etapa (c) es por tanto una solucion filtrada.

Tal como se ha descrito anteriormente, el metodo de la presente invencion es ventajoso en terminos de fabricacion debido a que parece producir una precipitacion mas eficaz de las protemas contaminantes, y, como resultado, la etapa (c) es mas facil de realizar. Cuando la mezcla resultante de la etapa (b) se separa, una solucion clara transparente, es decir, se consigue la composicion de inmunoglobulina que contiene IgM. La filtracion es por tanto mas rapida y mas facil.

Se requieren etapas de proceso adicionales para convertir la composicion de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) en una preparacion de inmunoglobulina adecuada para la administracion intravenosa. De acuerdo con ello, en una realizacion preferida, el proceso de la presente invencion comprende las etapas adicionales de tratar la composicion de inmunoglobulina que contiene la IgM obtenida de la etapa (c) en condiciones acidas suaves y, ademas, someter la composicion tratada con acido a irradiacion UVC.

Para el tratamiento en condiciones levemente acidas, la composicion de inmunoglobulina que contiene la IgM obtenida de la etapa (c) se incuba a entre pH 3,5 a pH 4,5, y preferentemente entre pH 3,8 y pH 4,2, para formar una solucion incubada. Se pueden crear condiciones levemente acidas anadiendo un acido adecuado a la composicion de inmunoglobulina que contiene IgM, por ejemplo, el pH se puede ajustar anadiendo HCl 0,2 M.

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Esta etapa de incubacion se lleva a cabo preferentemente a entre 32 y 42 0C, y mas preferentemente a entre 35 y 39 oc. El tiempo de incubacion es preferentemente al menos de 2 horas y no mayor de 24 horas, y mas preferentemente al menos de 9 horas pero no mayor de 16 horas.

En la etapa de irradiacion, la solucion incubada obtenida procedente del tratamiento levemente acido descrito anteriormente se traza con luz UVC para formar una solucion irradiada con UVC. Esta etapa se puede llevar a cabo usando dispositivos que estan comercialmente disponibles, tales como el dispositivo UVivatec® (Bayer Technology Services). Se prefiere que la solucion incubada se trate a 254 ± 10 nm con entre 200 y 500 J/m2, mas particularmente entre 200 y 300 J/m2, para inactivar adicionalmente los virus y proteasas que estan potencialmente presentes. Se indica que el tratamiento con UVC, en las condiciones suaves de tratamiento que se requerinan normalmente, solo son posibles con el filtrado en agua transparente que se obtiene en la presente invencion tras el tratamiento con acido octanoico y vibromezclado. Las soluciones mas opalescentes u opacas normalmente obtenidas con las tecnicas de agitacion convencionales necesitanan tiempos de irradiacion mas largos que conducinan a mayor desnaturalizacion de la actividad de la IgM y menores tasas de inactivacion del virus.

Ademas del tratamiento acido suave y la irradiacion con UVC, las etapas adicionales para conseguir una preparacion de inmunoglobulinas para administracion intravenosa puede opcionalmente comprender una o mas etapas de filtracion. En una realizacion, la solucion de protemas que se procesa puede adsorberse en DEAE-Sephadex y a continuacion separarse de la Sephadex mediante filtracion en profundidad. Por ejemplo, puede someterse adicionalmente a adsorcion discontinua con 75 mg por kg de protema de DEAE Sephadex a pH 5,8, para eliminar la protema ceruloplasmina acompanante no deseada.

En una realizacion particularmente preferida, la solucion incubada obtenida procedente del tratamiento acido suave se somete a adsorcion sobre DEAE-Sephadex y a continuacion se separa de Sephadex mediante filtracion en profundidad, antes de tratarse con irradiacion UVC.

En otra realizacion, la solucion de inmunoglobulina que se procesa puede filtrarse a traves de un filtro nanometrico. Se pueden usar filtros de 75 ± 5 nm a 35 ± 5 nm de tamano de poro, o filtros que tienen un tamano de poro nominal de 75 a 35 nm (por ejemplo, Pall Ultipor DV50), en diversas etapas durante el proceso. (Un tamano de poro nominal de por ejemplo, 50 nm corresponde a una tasa de retencion > 4 loglO para un virus con un tamano de 50 nm o mas). En una realizacion preferida, la solucion obtenida de la etapa DEAE-Sephadex descrita en el anterior parrafo se filtra a traves de un filtro de O.2 pm antes de la irradiacion con UvC. En una realizacion preferida adicional, la solucion de inmunoglobulina obtenida tras la irradiacion UVC se somete a nanofiltracion, preferentemente mediante un filtro que tiene un tamano de poros de 40 a 50 nm. Se prefiere que esta etapa se lleve a cabo en condiciones esteriles.

La preparacion final de anticuerpos (es decir, la solucion de inmunoglobulina que contiene la IgM procesada) obtenida a partir del proceso definido anteriormente puede introducirse en un recipiente en condiciones esteriles. Como alternativa, la preparacion de anticuerpos puede formularse con un agente estabilizante, tal como glicina. En particular, la preparacion puede formularse en un tampon que contiene glicina a un pH entre 4 y 5,5, y preferentemente entre 4,1 a 4,5. La preparacion de anticuerpos puede tambien diluirse a una concentracion de protemas entre 40 y 80 g/l y preferentemente entre 55 y 70 g/l.

Preferentemente, el proceso de la presente invencion no comprende una etapa que implica una o mas modificaciones qmmicas de los anticuerpos de la preparacion, la modificacion enzimatica de los anticuerpos, o el tratamiento termico de los anticuerpos (por ejemplo, el tratamiento de los anticuerpos a una temperatura de 40 oc o mas durante 10 minutos o mas). Mas particularmente, el proceso de la presente invencion no incluye una etapa de poner en contacto los anticuerpos con p-propiolactona y/o pepsina.

La presente invencion proporciona ademas una preparacion de inmunoglobulina o una preparacion de anticuerpos que se puede obtener mediante el proceso descrito anteriormente. La preparacion de inmunoglobulina es policlonal y puede comprender al menos un 5 % de IgM, preferentemente, al menos un 15 % de IgM y mas preferentemente al menos un 20 % de IgM. Las otras inmunoglobulinas son IgG e IgA. Preferentemente, la preparacion de inmunoglobulina comprende entre 5 y 30 % de IgM (mas preferentemente entre aproximadamente 15 y 30 %), entre 5 y 30 % de IgA (lo mas preferible entre 15 y 30 %) y entre 40 y 70 % de IgG (lo mas preferible entre 45 y 70 %). En el producto mas preferido, el contenido de IgG es aproximadamente de 50 % y el contenido de IgM e IgA es cada uno de aproximadamente 25 %. Los valores promedio del porcentaje de, por ejemplo, IgM, proceden de la suma de IgG+lgA+IgM. Sin embargo, es tambien posible enriquecer el contenido en IgM adicional mediante metodos bien conocidos similares, por ejemplo, cromatograffa de intercambio anionico. Los valores se pueden determinar mediante nefelometna o mediante inmunoprecipitacion de acuerdo con la Ph. Eur. (edicion actual (2O1O) 2.9.17).

En particular, las inmunoglobulinas de la preparacion de inmunoglobulina no estan qmmicamente modificadas. La preparacion de inmunoglobulina no se ha tratado durante su proceso de produccion con un agente qmmico tal como p-propiolactona para esterilizar el producto. De forma similar, la preparacion no se ha tratado con proteasa anadida, tal como pepsina, para esterilizar el producto. De este modo, las inmunoglobulinas estan sustancialmente en forma natural.

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La preparacion de anticuerpos tiene una actividad proteolftica menor que las preparaciones de anticuerpos descritas en la tecnica anterior. En particular, la actividad proteolftica no es detectable en la preparacion cuando se almacena a entre 2 a 8 0C. Se puede medir la actividad proteolftica mediante metodos de ensayo normalizados conocidos en la materia, tales como los que usan el sustrato cromogeno que se describe a continuacion en el ejemplo 6. En dichos metodos se evaluo la actividad proteolftica mezclando un sustrato cromogeno (en particular uno sensible a al menos una serina proteasa) y una muestra de la preparacion de anticuerpos (habitualmente diluida en tampon para satisfacer el intervalo lineal del ensayo) a 37 oC y controlar la cinetica de absorcion usando un espectrofotometro. La actividad proteolftica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorcion inicial (AAbs/min) utilizando la ecuacion C (U/l) = S x AAbs/min x F (C = actividad proteolftica; S = factor de conversion relativo a un cambio de adsorcion espedfico del sustrato cromogenico; y F = factor de dilucion). Uso del sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En particular, la actividad proteolftica se puede evaluar mediante las siguientes etapas:

(a) 25 mg del sustrato S-2288 (Chromogenix) se disolvieron en 7,2 ml de agua para inyeccion;

(b) una muestra de la preparacion de anticuerpo se diluyo con tampon (Tris.HCl 100 mM pH 8,4, NaCI 106 mM )

para satisfacer el intervalo lineal del ensayo, y la temperatura se ajusto a 37 oC;

(c) cantidades iguales (por ejemplo, 200 pl) de la preparacion de anticuerpo diluida y el sustrato disuelto se

mezclaron;

(d) se midio la cinetica de absorcion a 405 nm durante de 1 a 3 minutos a 37 oc usando un espectrofotometro;

(e) la actividad proteolftica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorcion inicial (AAbs/min)

utilizando la ecuacion C (U/l) = 313 x AAbs/min x F (C = actividad proteolftica, F = factor de dilucion)

El ftmite de cuantificacion de este metodo es 8 U/l, y cuando se usa una muestra de la preparacion de anticuerpo de la presente invencion, la actividad proteolftica es indetectable. De esta forma, el nivel de actividad proteolftica en el producto final de la presente invencion es inferior a 8 U/l.

Como con las preparaciones conocidas en la materia, la preparacion de anticuerpos de la presente invencion se puede almacenar a 5±3 oc. Sin embargo, debido a la eficaz purificacion del metodo de la presente invencion, la estabilidad de la preparacion de anticuerpos es extremadamente buena. El producto final es estable en forma ftquida durante al menos 3 meses, preferentemente al menos 6 meses y mas preferentemente al menos dos anos a 2 a 8 oc, lo que significa que no existe fragmentacion o polimerizacion de IgM por encima del 5 % medida en HPSEC, ni aumento de la actividad proteolftica, ni disminucion de la actividad del anticuerpo IgM contra Escherichia coli y de la actividad del anticuerpo IgM contra Pneumococcus saccharide de mas del 25 % y no existe aumento en la actividad anticomplementaria de mas del 25 %, quedando por debajo de 1 CH50/mg de protema. Ademas, el producto final producido con el metodo de la presente invencion es estable en forma ftquida durante al menos 3 meses, preferentemente al menos 6 meses, y lo mas preferente al menos un ano a temperatura ambiente (entre 23 y 27 oc) como se ha evaluado mediante los mismos criterios.

El proceso de la presente invencion proporciona ademas un nivel mayor de eliminacion de virus que los procesos de la tecnica anterior dando como resultado una preparacion de anticuerpos que es mas segura que las preparaciones de anticuerpos de la tecnica anterior, particularmente con respecto a los virus sin envoltura activos del tipo, por ejemplo, parvovirus. El metodo de la presente invencion es capaz de eliminar/inactivar virus, y en particular virus sin envoltura, en mas de 3 logio, preferentemente en mas de 4 logio, y lo mas preferente en mas de 5 logio. Esto da como resultado una preparacion de anticuerpos que esta sustancialmente exenta de virus, y en particular sustancialmente exenta de virus sin envoltura (es decir, es segura contra virus). Ademas, el metodo de la presente invencion puede conseguir este nivel de eliminacion/inactivacion de partmulas vfticas sin un impacto significativo sobre la cantidad de IgM activa o sobre la actividad anticomplementaria de la preparacion de anticuerpos. De acuerdo con ello, las preparaciones de anticuerpos son seguras contra virus con respecto a los virus con envoltura y sin envoltura, que contienen al menos un 15%, mas preferentemente al menos un nivel del 20 % de IgM y que tienen actividad anticomplementaria de 1 CH 50/mg de protema.

La preparacion de anticuerpos de la presente invencion es adecuada para su uso en medicina y se puede utilizar en el tratamiento de trastornos e infecciones inmunologicas, especialmente en trastornos por deficiencia de IgM y en infecciones bacterianas. La preparacion de inmunoglobulina polivalente humana enriquecida con IgM humana para administracion intravenosa, que se puede preparar mediante el proceso de la presente invencion, contiene tftulos de anticuerpo mas altos contra bacterias Gram positivas y Gram negativas cftnicamente relevantes asf como tftulos de anticuerpo mas altos contra endotoxinas de bacterias Gram negativas y exotoxinas de bacterias Gram positivas en comparacion con las preparaciones polivalentes de inmunoglobulina G.

En particular, las preparaciones de anticuerpo de la presente invencion son adecuadas para su administracion por via intravenosa a pacientes, y en particular son adecuadas para la inyeccion intravenosa en seres humanos.

De esta manera, la preparacion de anticuerpos de la presente invencion es adecuada para su uso en un metodo de tratamiento de un paciente que comprende una etapa de administrar la preparacion de anticuerpos de la presente invencion al paciente. En particular, el paciente puede padecer un trastorno inmune o una infeccion bacteriana.

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La presente invencion se describira ahora adicionalmente por medio de ejemplos solamente.

Descripcion del metodo de ensayo para la determinacion de la actividad anticomplementaria

El ensayo para determinar la actividad anticomplementaria se llevo a cabo de acuerdo con el metodo descrito en la Farmacopea Europea (metodo 2.6.17, Ph. Eur. 6. Edicion, 2008).

Eritrocitos de oveja pretratados con hemolisina se hemolizaron completamente. La hemolisis se suprimio mediante anticuerpos que se uman al complemento de la muestra. Se determino la cantidad de complemento, que esta unido (inactivado) a 1 mg de inmunoglobulina.

Una determinada cantidad de inmunoglobulina (10 mg) se mezclo con el complemento de cobayas, y se titulo el complemento libre. La actividad anticomplementaria se expresa como complemento usado con respecto al complemento usado de una solucion de referenda. La unidad hemolttica de la actividad del complemento (CH50) es la cantidad de complemento que conduce a la hemolisis de 2,5 x 108 eritrocitos preparados de forma optima de una cantidad total de 5 x 108 eritrocitos en condiciones optimas de tampon.

Los eritrocitos preparados de forma optima (8 ml de eritrocitos estabilizados de oveja, lavados tres veces con tampon de gelatina-barbital, finalmente, 1 ml de eritrocitos se suspendieron en 24 ml de tampon de gelatina-barbital) se prepararon mezclando 20 ml de suspension de eritrocitos con 20 ml de hemolisina (ajustado a 2 MHE/ml -mmima unidad hemolttica) e incubacion durante 15 min a 37 0C.

Un equivalente de 10 mg de inmunoglobulina se diluyo en tampon de gelatina-barbital (1 g de gelatina en 1 l de tampon de barbital, pH 7,3, solucion tampon de barbital 5 veces: 83 g de cloruro de sodio, 10,192 g de barbital sodio en 2 litros de agua, pH 7,3). Hasta un volumen final de 1 ml, se anadieron 200 |jl de complemento 100 CH50 / ml. Los tubos de ensayo se incubaron con agitacion durante 1 h a 37 oc. Las muestras se diluyeron y se titularon frente a eritrocitos preparados de forma optima. Tras una incubacion durante 1 h a 37 oc, las muestras se centrifugaron y se determino la densidad optica utilizando un espectrofotometro a una longitud de onda de 541 nm.

Ejemplo 1 -Preparacion de una preparacion enriquecida en IgM a partir de la fraccion I/III

180 kg de Fraccion I/III de Cohn, originada a partir del fraccionamiento en etanol frm de plasma humano se suspendieron en 720 l de tampon de acetato de sodio 0,1 M pH 5,05 y se mezclaron durante 15 - 30 minutos una vez que se alcanzo la temperatura de la suspension (22 ± 4 oc).

La solucion se trato mediante la adicion de 19,8 kg de acido octanoico (0,110 kg por kg de pasta I/III utilizada) a temperatura ambiente, y la solucion de protema se mezclo adicionalmente durante 80 minutos, usando un mezclador por vibracion (Vibromixer®, tamano 4, Graber+Pfenniger GmbH, Vibromixer ajustado al nivel 2 - 3). El acido octanoico se anadio lentamente durante 30 min.

Aproximadamente 3 kg de fosfato tricalcico (Ca3(P04)2) se anadieron a lo anterior, y la solucion de protema se mezclo adicionalmente durante al menos 15 min. El precipitado se elimino mediante filtracion con clarificacion usando un filtro prensa. Se llevo a cabo una filtracion 0,2 jm, y la solucion de protemas se sometio a ultrafiltracion con membranas de 10 kD. La solucion de protemas se diafiltro contra una solucion de NaCI 0,04 M y despues se ajusto a una concentracion de protemas de 40 g/l.

La solucion de protema se trato a un pH 4,0 ± 0,1 tras dilucion 1 + 1 con agua para inyeccion. El ajuste del pH se realizo usando Hci 1 M y la solucion de protema se incubo durante 9 h a 37 oc ± 2 oc. Tras la incubacion a pH 4, la solucion de protema se ajusto a pH 5,8, usando NaOH 1 M. La solucion de protema resultante se purifico adicionalmente mediante adicion de DEAE Sephadex en modo discontinuo (75 g DEAE Sephadex por kg de protema). La solucion de protemas se incubo con agitacion durante > 60 min a temperatura ambiente. La DEAE Sephadex se elimino mediante filtracion con clarificacion. La solucion de protema se sometio a una filtracion 0,2 jm.

La solucion de protema se filtro a traves de un filtro de 0,1 jm y un filtro Pall, Ultipor VF DV50, 20". El filtrado se proceso adicionalmente mediante tratamiento con luz UVC a 254 nm, utilizando un dispositivo de proceso de flujo piston UVivatec® (Bayer Technology Services / Sartorius Stedim) a una dosis de UVC de 240 J/m2 La velocidad de flujo a traves del reactor UVC se calculo segun las instrucciones del fabricante. La solucion de protema irradiada se concentro hasta una concentracion de protema de 50 - 70 g/l mediante ultrafiltracion, y se sometio a diafiltracion (membrana de 10 kD, usando tampon de glicina 0,32 M pH 4,3). El producto final se filtro a traves de un filtro de 0,2 jm y se almaceno de 2 a 8 oc.

Ejemplo 2 - Investigacion de las condiciones en la etapa de tratamiento con acido octanoico

Para el tratamiento con acido octanoico, se sometieron a ensayo los siguientes intervalos experimentales, tambien combinados entre sf usando el metodo descrito en el Ejemplo 1 (no se muestran los resultados).

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- Cantidad de acido octanoico: 0,09 kg/kg a 0,13 kg/kg (Cantidad de acido octanoico por kg usado de fraccion I/III) (acido octanoico 120 a 180 mM)

- pH del tratamiento con acido octanoico entre pH 4,8 y 5,3

- Intervalo de temperatura de la reaccion: 14 0C a 30 0C

- Tiempo de incubacion: 40 a 110 min

Todas las condiciones ensayadas condujeron a compuestos intermedios faciles de clarificar para su procesamiento posterior, y con una amplia reduccion de la actividad proteolftica desde varios miles de U/l en la fraccion de Cohn suspendida I/III). Estos compuestos intermedios dan como resultado un producto final con una actividad proteolftica inferior a 8 U/l (calculada como se describe mas adelante en el Ejemplo 6), que es el ftmite de cuantificacion.

Ejemplo 3 - Reduccion de virus mediante el uso de Vibromixer -Determinacion de Ios factores de eliminacion de virus para el tratamiento con acido octanoico con y sin el uso de un vibromixer.

250 ml de fraccion I/III suspendida se homogeneizaron durante 30 min a pH 5,05 y 22 . La suspension se enriquecio con 2,6 ml de la solucion madre de virus. Se anadio acido octanoico (llo g/kg) y se homogeneizo durante 60 min con un vibromixer. En un experimento paralelo, la misma mezcla se homogeneizo mediante agitacion convencional. Despues de 60 min se anadio fosfato tricalcico (0,15 g/kg de acido octanoico) y la suspension se agito durante 15 min. La suspension se aclaro mediante filtracion profunda usando un disco de filtro. El filtro de disco se preaclaro con 70 - 80 ml de tampon. Tras la filtracion, el filtro de disco se enjuago con 80 ml de tampon. El filtrado y el lavado se combinaron, y se extrajo una muestra para la titulacion del virus.

Los tftulos de virus de las muestras tomadas antes de la adicion de acido octanoico y despues de la filtracion se determinaron con celulas indicadoras adecuadas para SV40, Reo y PPV (CV-1, CCL.7.1 y PK13). Finalmente, se calculo el factor de eliminacion segun las directrices actuales de Ios estudios de validacion de virus.

En Ios estudios de validacion de virus, Ios virus sin envoltura como SV40 y Reo se eliminaron eficazmente en el orden de mas de 4 logio y mas de 5 logio, respectivamente. Ademas, el PPV se elimino en mas de 3 logio. Estos valores son mas de 10 veces y hasta 1000 veces superiores que con el mismo tratamiento con acido octanoico en condiciones de agitacion convencionales sin el vibromezclado.

Tabla 1: Comparacion entre los factores de reduccion del virus (loglO) para el tratamiento con acido ______________________octanoico con y sin el uso de un vibromezclador.______________________

: Reaccion con acido octanoico y agitacion convencional [reduccion de logio] Reaccion con acido octanoico y vibromezclado [reduccion de logio]

vpp: 2,15 ± 0,32 3,39 ± 0,36

reo: 2,34 ± 0,38 5,46 ± 0,28

SV4O: 2,05 ± 0,4 4,71 ± 0,34

Ejemplo 4 - Evaluacion del tratamiento con UVC tratamiento

Se evaluo el intervalo optimo de la dosificacion de radiacion UVC. Existe un equilibrio entre la dosificacion mmima necesaria para conseguir una inactivacion de al menos 4 logio para virus sin envoltura y la dosificacion maxima tolerable para evitar la desnaturalizacion de las moleculas de IgM que conduce a una funcion Fab incorrecta para unir Ios anftgenos y una funcion Fc incorrecta que afecta la activacion del complemento. En el intervalo de 200 a 400 J/m2 se puede observar solamente un leve aumento de Ios agregados de inmunoglobulina y no se observa afectacion significativa sobre el contenido del fragmento.

Para Ios experimentos, la densidad optica (DO) de la solucion de protema original se utilizo para calcular el caudal en el sistema de laboratorio UVivatec con la hoja de calculo Excel proporcionada por el proveedor de BTS (Hoja de calculo maestra del cliente UVivatec Lab II Version 3.0). El caudal se calculo teniendo en cuenta el rendimiento de la lampara, el punto de ajuste del sensor de la lampara de la senal UV y la dosis de irradiacion UVC deseada.

Una solucion que contema IgM con un contenido de protema de aproximadamente 55 g/l (Lote 86GB005BE07) se bombeo a un caudal del 5,8 l/h a traves del sistema UVivatec para conseguir una dosis de 200 J/m2 para un unico flujo piston. Se consiguio una dosis de 300 J/m2 bombeando la solucion de protema a un caudal de 3,9 l/m2 a traves del sistema. Se consiguieron 400 J/m2 bombeando la solucion de protema a un caudal de 2,9 l/m2 a traves del sistema.

Tabla 2: Resultados analiticos de la actividad y determinaciones de titulos antes y despues del tratamiento ___________________________con UVC en el producto final concentrado___________________________


: Producto IgM sin irradiacion UVC Producto despues de 200 J/m2 IgM UVC Producto IgM despues 2de UVC 300 J/m2 Producto IgM despues 2de UVC 400 J/m2

Contenido de protema: g/i 56,3 56,2 57,6 54,4

Contenido de IgG (nefelometna): % 56,1 55,5 55,7 54,9

Contenido de IgA (nefelometna): % 20,1 20,6 20,5 20,7

Contenido de IgM (nefelometna): % 23,7 23,9 23,7 24,4

HPSEC agregados > 1200 kD fragmentos (> 100: % area 1,9 2,6 3,3 4,0

kD): % area 0,66 0,73 0,76 0,79

aca: CH50/mg protema 0,68 0,48 0,46 0,46

pa: U/l < 8 < 8 < 8 < 8

No se pudieron observar diferencias significativas para el contenido de inmunoglobulina, actividad proteolftica o ACA 5 en el intervalo de 200 a 400 J/m2. El intervalo preferido para la dosificacion se ajusto entre 200 y 300 J/m2 porque 200 J/m2 era suficiente para inactivar los virus sin envolturas y a 300 J/m2 no se pudo observar impacto significativo sobre la formacion de agregados y los tftulos de anticuerpo. La dosificacion preferida es 225 J/m2

Una solucion diluida que contema IgM con un contenido de protema de 8 a 12 g/l (Lote 86BB059BE07) se bombeo a 10 un caudal de 5,8 l/h a traves del sistema UVivatec para conseguir dosis entre 200 y 300 J/m2 para un unico flujo piston.

Tabla 3: Resultados analiticos de las soluciones de IgM antes y despues de la irradiacion con UVC a

diferentes dosis de UVC

Lote fraccion l/lll 86BB059BE07: antes UVC UVC: 200 J/m2 UVC: 225 J/m2 UVC: 250 J/m2 UVC: 300 J/m2

Protema: g/i 11,34 10,56 10,65 10,69 10,56

Contenido en IgG: % 59,2 59,1 58,5 58,6 57,1

Contenido en IgA: % 19,6 19,6 20,2 20,1 20,3

Contenido en IgM: % 21,1 21,3 21,2 21,4 22,6

HSEC agregados > 1200 kD: % 0,20 0,39 0,54 0,3 0,47

% fragmentos < 100 kD: % 0,47 0,46 0,25 0,26 0,47

pa: U/l < 8 < 8 n.t. n.t. n.t.

pka: U/ml CH50/mg 3 3 3 3 3

aca: protema 0,1 0,08 0,1 0,1 0,18

Anti-E.coli 01:K1 - IgG: U/mg 24,7 20,5 18,9 19,5 20,2

Anti-E.coli 01:K1 - IgA: U/mg 9,4 9,5 9,5 9,1 8,9

Anti-E.coli 01:K1 - IgM: U/mg 14,1 13,0 15,1 13,9 13,4

Anti-Candida albicans - IgG: U/mg 15,6 16,8 17,9 17,3 17,0

Anti-Candida albicans - IgA: U/mg 11,3 11,6 10,5 10,3 10,4

Anti-Candida albicans - IgM: U/mg 13,8 13,3 13,7 13,9 13,1

Anti-Enterococcus faecalis - IgG: U/mg 13,0 15,5 13,5 14,8 15,0

Anti-Enterococcus faecalis - IgA: U/mg 11,3 10,5 10,1 9,7 9,6

Anti-Enterococcus faecalis - IgM: U/mg 17,2 14,1 16,7 14,0 13,9

Anti-Pneumococcus Saccharid - IgG: U/mg 23,2 24,1 24,7 24,0 25,7

Anti-Pneumococcus Saccharid - IgA: U/mg 13,3 12,1 18,0 16,5 14,8

Anti-Pneumococcus Saccharid - IgM: U/mg 17,5 15,1 18,0 16,4 16,6

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La distribucion entre las clases de inmunoglobulina sigue quedando inalterada mediante el procedlmlento de irradiacion con UV comprendido en este intervalo de dosificacion. El modelo de distribucion de pesos moleculares analizado mediante HPSeC tampoco cambia. El nivel de pureza analizado mediante CZE permanece inalterado. La actividad proteolftica (PA), el activador precalicrema (PKA) y la actividad anti-complementaria (ACA) permanece inalterada. Igualmente, la actividad antibacteriana medida por un metodo Elisa no se ve significativamente alterada para todas las clases de inmunoglobulinas.

Las aKcuotas -irradiadas con intensidades crecientes de UV- se procesaron adicionalmente hasta conseguir el producto final, y se sometio al mismo panel de ensayos analtticos. Tampoco hubo diferencia significativa observable en los productos finales. Todos los tftulos de anticuerpo sometidos a ensayo estuvieron siempre en el intervalo de 100 ± 10 % de la preparacion de control no tratada mediante UVC.

Ejemplo 5 - Reduccion global de virus mediante el uso de Vibromixer/tratamiento pH 4 y tratamiento con UVC -Determinacion de los factores de eliminacion de virus

La validacion de la eliminacion/inactivacion de virus en tras tres etapas de tratamiento con acido octanoico y vibromezclado, tratamiento a pH 4 y tratamiento con UVC (215 J/m2) se llevo a cabo usando los siguientes virus modelo: virus de la diarrea vmca de bovino (DVBV) como virus modelo del virus de la hepatitis C, el virus de la pseudorrabia (VSR) como virus modelo del virus del herpes humano, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), virus de la arteritis equina (VAE) como virus modelo de los corornavirus, virus sindbis (VSin) como virus modelo de los Flavivirus, virus de la encefalomielitis de murino (VEM) como virus modelo del virus de la hepatitis A, reovirus (Reo) como virus modelo de los virus sin envoltura, parvovirus porcino (PVP) como virus modelo del parvovirus humano B 19.

Los resultados de estos estudios con las tres etapas de tratamiento con acido octanoico, tratamiento a pH 4 y tratamiento con UVC se relacionan en la siguiente Tabla 2.

Tabla 4: Reduccion total de virus mediante el proceso de produccion de IgM

Virus modelo: dvbv vsr vih-1 vae SinV vem Reo vpp

Reduccion total (loglO): > 12,5 > io,i > 12,7 > 8,4a >13,7a 9,2 > ii,o > 8,4

a Factor de reduccion sin datos de validacion para la etapa de validacion con UVC

La nanofiltracion opcional con filtros de un tamano nominal de poro de aproximadamente 50 nm anade seguridad adicional aumentando la reduccion total en mas de 17 loglO dependiendo del tamano del virus. Por ejemplo >17.5 logio se alcanzan a continuacion para VIH-1 mientras que PPV no se elimino adicionalmente mediante nanofiltracion.

Por tanto, el procedimiento de purificacion de acuerdo con la invencion conduce a una preparacion de IgM notablemente segura contra virus con unas tasas de inactivacion/reduccion de virus no conseguidas hasta ahora para dicha preparacion que contiene IgM superiores a 8 logio. Esto es especialmente importante para los virus sin envoltura tales como VEM, Reo y PVP, que por lo general son mas resistentes contra los procedimientos de inactivacion y eliminacion de virus debido a un pequeno tamano y la carencia de una envoltura Ifpida.

Ejemplo 6: Determinacion de la actividad proteolftica residual para el tratamiento con acido octanoico con y sin uso de un vibromixer.

El tratamiento con acido octanoico se llevo a cabo como en el ejemplo 1 y, en un experimento paralelo sin un vibromixer pero con agitacion intensa convencional con un agitador de palas. Se determino la actividad proteolftica en las muestras despues del tratamiento con acido octanoico/fosfato tricalcico y ultra/diafiltracion usando el sustrato cromogenico S-2288 (Chromogenix), siguiendo las instrucciones del fabricante. 25 mg del sustrato S-2288 (Chromogenix) se disolvieron en 7,2 ml de agua para inyeccion. Las muestras se diluyeron con tampon (Tris/HCI lOOmM pH 8,4, NaCI 1O6mM) para satisfacer el intervalo lineal del ensayo, por ejemplo, 2OO |jl de tampon se mezclaron con 2OO jl de muestra (mezclado y ajuste de temperatura a 37 0C) y 2OO jl de solucion de sustrato cromogenico. Se midio la cinetica de absorcion a 4O5 nm (1-3 minutos) a 37oc, mediante un espectrofotometro. La actividad proteolftica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorcion inicial (AAbs/min) mediante la ecuacion C (U/I) = 313 x AAbs/min x F (C = actividad proteolftica, F = factor de dilucion)

Tabla 5: Reduccion de la actividad proteolitica mediante el tratamiento con acido octanoico

: Tratamiento con acido octanoico sin vibromezclado Tratamiento con acido octanoico con vibromezclado

Materiales de partida (U/l): 5630 5630

Actividad proteolftica residual: 42 < 8 (LOD)

promedio despues del tratamiento

con acido octanoico/fosfato (U/l)

Cuando se utilizo vibromezclado, el filtrado despues del tratamiento con acido octanoico fue Kmpido. En el experlmento de comparacion, el filtrado despues del tratamiento con acido octanoico y el agitador de palas era muy 5 opaco y diffcil de filtrar.

Ejemplo 7: Tftulos antibacterianos en una preparacion de IgM de acuerdo con la invencion

Para su comparacion con la unica preparacion que contiene IgM tolerable intravenosa comercialmente disponible, 10 Pentaglobin, las actividades antibacterianas se analizaron en tres lotes de este farmaco bien caracterizado, y se compararon con una preparacion de acuerdo con la invencion. La determinacion de los anticuerpos de la clase IgA o IgM en la preparacion de IgM comparada con los antfgenos antibacterianos o antifungicos se llevo a cabo mediante ELISA. Placas de microvaloracion se revistieron con el correspondiente antigeno y se incubaron con un patron o la preparacion de IgM. Los anticuerpos unidos al antfgeno se detectaron con un conjugado de IgA dirigido contra IgG 15 humana o un conjugado de IgM dirigido contra IgG humana. La deteccion se llevo a cabo usando un sustrato de enzima. El cambio de color resultante corresponde a la cantidad de anticuerpos presentes en la preparacion de IgM.

Tabla 6 Comparacion de la actividad de union antibacteriana de IgM en la presente preparacion y en __________________________Pentaglobin comercialmente disponible_________________________

parametro: unidad IgM presente en el medio de preparacion Promedio en el producto comercial Pentaglobin

Anticuerpos IgM contra Pneumococcus saccharide: U/mg IgM 72 21

Anticuerpos IgM contra Escherichia coli: IgM 62 39

Anticuerpos IgM contra Enterococcus faecalis: U/mg IgM 69 27

Anticuerpos IgM contra Candida albicans: U/mg IgM 61 41

Anticuerpos IgM contra Chlamydia: U/mg IgM 71 6

20

Tabla 7 Comparacion de la actividad de union antibacteriana de IgA en la presente preparacion y en _____________________________Pentaglobin comercialmente disponible _______________________

Anticuerpos IgA contra Pneumococcus saccharide: U/mg IgA 86 25

Anticuerpos IgA contra Escherichia coli: U/mg IgA 83 26

Anticuerpos IgA contra Enterococcus faecalis: U/mg IgA 93 21

Anticuerpos IgA contra Chlamydia: U/mg IgA 65 38

Anticuerpos IgA Helicobacter pylori: U/mg IgA 59 24

Las actividades mediadas por IgM e IgA en la nueva preparacion fueron tfpicamente al menos 1,5 veces tan altas 25 como en Pentaglobin, lo que se puede explicar por el hecho de IgM e IgA de Pentaglobin estan modificadas qmmicamente con p-propiolactona. Esta etapa se sustituye por los procedimientos mas suaves de acuerdo con la presente invencion.

En su conjunto, estos datos demostraron que la region de union de las moleculas IgM en la preparacion final esta 30 funcionalmente completamente activa.

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Ejemplo 8 - Estudios de estabilidad durante el almacenamiento con el producto de IgM liquido

El producto de acuerdo con el Ejemplo 1 sin tratamlento con UVC se almaceno en vlales de vidrio de 10 o 100 ml (volumen de llenado 5 ml o 50 ml) a 2 - 8 0C y se analizaron todos los parametros de la especificacion. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los parametros relevantes para mostrar la estabilidad son el contenido en fragmentos y agregados que se mide mediante cromatograffa de exclusion molecular de alto rendimiento (HPSEC), la actividad proteolttica (AP) y la actividad anti-complementaria (ACA). Estos parametros son fundamentales para la tolerabilidad intravenosa, y es probable que cambien durante el almacenamiento a largo plazo. A 2 - 8 oc no se produjeron cambios significativos en estos parametros. Incluso durante el almacenamiento a temperatura ambiente (23 - 27 oc), estos valores permanecieron dentro de la especificacion, aunque se produjo un pequeno aumento de fragmentos despues de 24 meses a temperatura ambiente. Tambien se determinaron otros parametros, como la coloracion, opalescencia, valor del pH y permanecieron inalterados durante la totalidad del periodo de estudio. Los tttulos de IgM e IgA frente a diferentes bacterias permanecieron estables durante 2 anos a 2 - 8 oc.

El producto de acuerdo con el ejemplo 1 con tratamiento con UVC se almaceno en viales de vidrio de 10 o 100 ml (volumen de llenado 5 ml o 50 ml) a 2 - 8 oc y temperatura ambiente y se analizaron todos los parametros de la especificacion. Los resultados se muestran en la Tabla 9. Es este estudio de estabilidad continuado, los datos a 12 meses actualmente disponibles muestran el mismo perfil de estabilidad que el producto sin tratamiento UVC, lo que permite extrapolar la estabilidad a 24 meses.

Tabla 8 Estabilidad del lote A586067 ensayado a 2-8 °C en posicion de reposo Tamano de llenado: 5 ml

Parametros ensayados: Requisito Almacenamiento en meses a 2 - 8 °C 23 -

: (Tolerancia) 27 °C


: 0 3 6 9 12 18 24 24

protema (g/l): 45-55 50,3 51,4 50,3 50,4 50,5 49,6 50,8 49,8

hpsec % agregados > 1200 kD: < 5 0,9 0,6 0,5 0,8 0,6 1,0 1,3 1,7

fragmentos < 100 kD: < 5 0,2 0,6 1,1 0,7 1,6 0,9 1,2 4,1

actividad proteolttica (U/I): < 8 < 8 < 8 < 8 n.t. < 8 n.t. < 8 < 8

contenido en inmunoglobulina (%): > 95 % 96,7 99,0 100 n.t. 99,5 n.t. 98,4 97,5

Contenido en IgM: > 20 % 21,6 22,1 22,1 n.t. 22,3 n.t. 20,9 20,5

actividad anticomplementaria (CH50/mg protema): < 1,0 0,48 0,56 0,48 0,66 0,70 0,64 0,54 0,38

n.t. = no ensayado

Tabla 9 Estabilidad del lote A586057 ensayado a 2-8 °C en posicion de reposo Tamano de llenado: 50 ml

Parametros ensayados: Requisito Almacenamiento en meses a 2 - 8 °C 23 -

: (Tolerancia) 27 °C


: 0 3 6 9 12 18 24 24

protema (g/l): 45-55 50,2 50,8 49,7 50,4 50,3 49,4 50,3 49,7

hpsec % agregados > 1200 kD: < 5 0,9 0,5 0,4 0,8 0,6 1,0 1,3 1,5

fragmentos < 100 kD: < 5 0,3 0,6 1,0 0,9 1,4 1,2 1,2 4,2

actividad proteolttica (U/I): < 8 < 8 < 8 < 8 n.t. < 8 n.t. < 8 < 8

contenido en inmunoglobulina (%): > 95 % 98,6 98,9 100 n.t. 99,5 n.t. 98,5 98,0

Contenido en IgM: > 20 % 21,3 22,3 24,5 n.t. 22,0 n.t. 20,9 20,1

actividad anticomplementaria (CH50/mg protema): < 1,0 0,48 0,82 0,52 0,64 0,68 0,48 0,60 0,40

Ejemplo 9 Experimentos in vivo en el producto IgM

Para confirmar la seguridad y la tolerabilidad, se estudiaron los efectos de la preparacion de IgM sobre la tension arterial tras infusiones intravenosas repetidas durante 5 dfas a 8 macacos conscientes. Se administro una dosis de 190 mg/IgM/kg^a de la preparacion de IgM preparada de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento. Pentaglobin, la preparacion que contiene IgM tolerable para administracion intravenosa comercialmente disponible se administro a algunos monos como sustancia de comparacion. Pentaglobin se administro de manera que se administrara la misma dosis de IgM. Se administro una dosis de control de NaCI al 0,9 % a los animales un poco antes de la administracion de las preparaciones de inmunoglobulina. La tension arterial se determino despues

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de la inyeccion para determinar si la administracion estaba asoclada con un nlvel Intolerable de activadon del complemento no espedfica.

La administradon de la preparacion de IgM (15 ml/kg^a) solo tuvo efectos menores sobre la tension arterial (promedio, sistolica y diastolica). Las diferencias hasta 4 horas despues de cada infusion, en comparacion con los valores anteriores al ensayo, no superior los 4 mm Hg. Estas diferencias se pueden considerar como no biologicamente relevantes.

Los niveles de C3a se determinaron en muestras de plasma tomadas tras la inyeccion como marcador de la activadon no espedfica de la ruta del complemento. Los niveles de C3a [ng/ml]solamente aumentaron ligeramente mediante la administradon de la preparacion de IgM (15 ml/kgPC) y fueron incluso inferiores a los obtenidos con la preparacion de referenda Pentaglobin comercialmente disponible para cantidades iguales de IgM. La extraccion de sangre se realizo aproximadamente 6 horas despues del tratamiento.

Tabla 10a Niveles de C3a [ng/ml] tras la administradon de la preparacion de IgM

: C3a en el control (NaCI al 0,9 %, pH 4,5) [ng/ml] Administracion de C3a en la preparacion de IgM [ng/ml]

Promedio: 229 240

sd: 83 37

n: 8 8

No se pudieron atribuir hallazgos toxicologicos sustanciales a la preparacion de IgM, y no se produjeron alteraciones relevantes que no se hubieran observado con Pentaglobin. Puesto que la seguridad de Pentaglobin esta bien establecida en la practica clmica durante muchos anos, es razonable concluir que estas alteraciones no tienen ninguna relevancia clmica.

Tabla 10b Niveles de C3a [ng/ml] tras la administracion de la preparacion de referenda Pentaglobin

: C3a en el control (NaCI al 0,9 %, pH 6,8) [ng/ml] Administracion de C3a en la preparacion de IgM [ng/ml]

Promedio: 204 263

sd: 20 61

n: 4 4

La buena tolerabilidad y seguridad de la preparacion de IgM tambien se verifico en un estudio en Fase I con seres humanos en 24 voluntarios sanos, hombres y mujeres. La presion arterial sistolica en las primeras 4 horas tras la administracion produjo una disminucion promedio de solo aproximadamente un 9 % (11,9 mmHg) tras la infusion de 91 a 274 mg de la preparacion de IgM por kg PC/d a 0,5 ml/min.

Este intervalo es analogo a la solucion de placebo de NaCI al 0,9 % (9,4 %, 11,7 mmHg). No se registraron eventos adversos graves, y todos los eventos adversos no graves quedaron autolimitados. Ademas, no se produjo evidencia de la transmision de un agente infeccioso, tal como se muestra mediante las determinaciones de pCt.

Se anota que la utilidad de los estudios de eficacia en modelos animales de las enfermedades relevantes son limitados debido a la inmunogenia y a los anticuerpos Gal preformados en las preparaciones de IgM obtenidas de plasma humano. Sin embargo, dado el conocimiento de la tecnica anterior con respecto al uso de Pentaglobin en el tratamiento de patologfas y los tttulos de anticuerpos antibacterianos de la preparacion de IgM preparada mediante el metodo de la presente invencion (como se ha demostrado en el Ejemplo 7) se puede concluir que la preparacion de IgM tiene eficacia clmica.

Claims

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reivindicaciones

1. Un proceso para la preparacion de una composicion de inmunoglobulina que contiene IgM a partir de una fraccion de plasma que comprende inmunoglobulinas, comprendiendo el proceso:

(a) proporcionar una fraccion plasmatica en forma de solucion que contiene las inmunoglobulinas;

(b) mezclar un acido carboxflico C7 a C9 con la solucion y tratar la solucion mezclada con un agitador vibrador para precipitar las protemas contaminantes; y

(c) separar las protemas precipitadas a partir de la solucion para dar como resultado la composicion de inmunoglobulina que contiene la IgM.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde en la etapa (b):

(i) la concentracion del acido carbox^Iico C7 a C9 es al menos de 0,075 kg/kg de fraccion plasmatica; y/o

(ii) el pH de la solucion mezclada esta entre 4,5 y 5,5; y/o

(iii) la temperatura de la solucion mezclada es de 10 0C a 35 0C; y/o

(iv) el acido carbox^Iico C7 a C9 se incubo con la solucion que contema las inmunoglobulinas durante al menos 30 minutos.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 0 la reivindicacion 2 donde:

(i) el acido carboxflico C7 a C9 es acido octanoico; y/o

(ii) las inmunoglobulinas de la fraccion plasmatica comprendan al menos un 5 % de IgM; y/o

(iii) la fraccion plasmatica es una precipitacion de la fraccion I/III de Cohn 0 la fraccion B 0 B+l de Kistler/Nitschmann; y/o

(iv) la etapa (c) comprende ultrafiltracion y la composicion de inmunoglobulina comprende una solucion filtrada.
4. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior que comprende una etapa de incubar la composicion de inmunoglobulina que contiene la IgM procedente de la etapa (c) a entre pH 3,5 y pH 4,5 para formar una solucion incubada, y preferentemente donde la etapa de incubar la composicion de inmunoglobulina que contiene la IgM procedente de la etapa (c) se lleva a cabo a entre 32 y 42 oc.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende ademas las etapas de someter la solucion incubada a adsorcion en DEAE-Sephadex y separar la DEAE Sephadex procedente de la solucion mediante filtracion en lecho.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 5 que comprende ademas la etapa de someter el filtrado procedente de la filtracion en lecho a nanofiltracion, y preferentemente donde la nanofiltracion se lleva a cabo con un filtro de 35 a 75 nm de tamano de poro nominal y mas preferentemente de 40 a 50 nm de tamano de poro nominal.
7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 que comprende ademas una etapa de tratar la solucion incubada de la reivindicacion 4 0 el filtrado de la reivindicacion 5 0 la reivindicacion 6 con irradiacion UVC para formar una solucion irradiada con UVC, y preferentemente donde la solucion incubada 0 el filtrado se trata con irradiacion UVC de 200 a 500 J/m2, y mas preferentemente de 200 a 300 J/m2
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 7 que comprende ademas la etapa de filtrar la solucion irradiada con UVC en condiciones esteriles para producir una preparacion de anticuerpos adecuada para la administracion intravenosa y que comprende preferentemente ademas formular la preparacion de anticuerpos en un tampon que contiene glicina a un pH entre pH 4 y 5,5.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 7 0 la reivindicacion 8, donde:

(i) el proceso comprende ademas una etapa de rellenar un recipiente con la solucion irradiada con UVC de la reivindicacion 7 0 la preparacion de anticuerpos de la reivindicacion 8 en condiciones esteriles; y/o

(ii) la solucion irradiada con UVC de la reivindicacion 7 0 la preparacion de anticuerpos de la reivindicacion 8 tiene una actividad proteolftica de menos de 8U/l; y/o

(iii) el proceso proporciona una eliminacion mayor de 3 logio de virus sin envoltura.
10. Una preparacion de anticuerpos que comprende inmunoglobulinas que se pueden obtener preferentemente mediante el proceso de la reivindicacion 8 0 la reivindicacion 9, donde preferentemente al menos un 15% de las inmunoglobulinas totales son IgM.
11. Una preparacion de anticuerpos que comprende inmunoglobulinas lgG, IgA e IgM, donde al menos un 15 % de las inmunoglobulinas totales son IgM, donde la preparacion de anticuerpos es segura contra virus con respecto a los virus con envoltura y sin envoltura, tiene una actividad anticomplementaria de < 1 CH 50/mg de protema, y es estable en forma Ifquida durante al menos 6 meses cuando se almacena de 2 a 8 oc.

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12. Una preparacion de anticuerpos de acuerdo con la reivindicacion 11, que tiene una actividad proteolftica inferior a 8 U/l.
13. Una preparacion de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde:

(i) la preparacion comprende al menos 20 % de IgM y preferentemente de 20 % a 30 % de IgM; y/o

(ii) la preparacion comprende ademas un agente estabilizante, preferentemente donde el agente estabilizante es glicina; y/o

(iii) donde la preparacion es estable durante al menos 2 anos cuando se almacena de 2 a 8 0C; y/o

(iv) donde las inmunoglobulinas no estan qmmicamente modificadas, o donde la preparacion no se ha tratado durante su proceso con 13-propiolactona o con una proteasa anadida, tal como pepsina.
14. Una composicion de inmunoglobulina que contiene IgM que se puede obtener mediante el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
15. Una preparacion de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en medicina.
16. Una preparacion de anticuerpos de acuerdo con la reivindicacion 15 para su uso en el tratamiento de trastornos inmunes o de infecciones bacterianas, preferentemente donde el trastorno inmune es un trastorno por deficiencia en IgM.
17. Uso de una preparacion de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de trastornos inmunologicos e infecciones bacterianas.