KR101860459B1

KR101860459B1 - 항체 조제물

Info

Publication number: KR101860459B1
Application number: KR1020127030528A
Authority: KR
Inventors: 울프강 묄러; 디에터 루드닉; 올리버 마네크; 미헬 로데머; 마티아스 게르메르; 바이트 브라운
Original assignee: 바이오테스트 아게
Priority date: 2010-04-22
Filing date: 2011-04-21
Publication date: 2018-05-23
Also published as: EP2560691A2; CA2796263A1; ZA201208540B; CA2796409A1; WO2011131786A2; US20180319871A1; JP2016222674A; SG184843A1; US8900806B2; ZA201208541B; ES2553385T3; IL222373A; RU2012149743A; CA2796263C; PL2560691T3; JP6612182B2; MX2012012262A; EP2560682A2; CN107080842A; HUE025853T2

Abstract

본 발명은 IgG, IgA 및 항체 총량을 기준으로 5 중량% 이상의 IgM을 포함하는 인간에게 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물로서, 인간 혈장으로부터 제조되며, 특이적인 보체 활성화 활성을 나타내며, 비특이적으로 보체를 활성화하는 항체 조제물의 능력을 측정하는데 적합한 인간 혈청을 이용한 시험관내 분석에서 실질적으로 C5a 및/또는 실질적으로 C3a를 발생시키지 않는 항체 조제물을 제공한다. 또한, 본 발명은 항체 조제물의 의학적 용도를 제공한다.

Description

항체 조제물 {ANTIBODY PREPARATIONS}

본 발명은 특이적인 보체 활성화 활성을 나타내지만 비특이적인 보체 활성화 능력은 낮은, IgM을 포함하는 항체 (면역글로불린)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의약품으로서의 항체 조제물의 용도에 관한 것이다.

인간 혈장으로부터 제조되어 정맥내 투여용으로 적합한 면역글로불린 조성물이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이러한 조성물은 수십년간 매우 다양한 질환을 치료하는데 중요한 역할을 하고 있다. 면역글로불린은, 예컨대 인간에 있어서 감염증을 치료하는데 사용되며, 다양한 생화학적 및 생리학적 특성에 따라 다양한 유형으로 분류할 수 있다. 면역글로불린 G는 바이러스 항원을 방어하는데 관여하고, 반면, IgM은 대체적으로 항세균 반응과 항독소 면역 반응에서 활발하게 작용한다.

면역글로불린 용액은 IgG, IgA 및 IgM을 다양한 비율로 포함하며, 여러가지 치료 용도에 따라 여러가지 조제물로 사용되며, 예컨대 IgM의 비율이 높은 조제물은 세균성 감염을 예방 또는 치료하는데 사용된다.

면역글로불린 용액은 통상적으로 혈장 또는 혈청의 분획으로부터, 예컨대 콘 분획(Cohn fraction)으로부터 제조된다. 그런 후, 이들 분획은 바이러스, 변성 단백질, 프로테아제 및 지질과 같은 오염원을 제거하기 위해, 여러가지의 정제 단계들을 거치게 된다.

분획 제조에 사용되는 인간 혈장은 수천명의 공여체들로부터 수집되므로, 소스 혈장을 철저하게 검사한다고 하더라도 병원성 바이러스가 포함될 수 있다. 따라서, 의약품으로서 사용하기에 안전한 제품을 만들기 위해서는, 바이러스를 불활성화하거나 또는 제거하기 위한 처리 단계가 필수적이다. 바이러스를 불활성화/제거하기 위한 몇가지 기법들이 당해 기술 분야에 공지되었으며, 그 예로는, 전반적인 바이러스 안전성을 확보하기 위해 수행되는, 화학적 처리, UVC 광 조사 또는 나노미터 여과가 있다.

처리 단계의 바이러스 제거 또는 불활성화 능력은 실험실 규모의 생산 공정 모델을 이용하여 검증되며, 각 단계에서 제거 또는 불활성화 인수(factor)가 결정된다. 불활성화/제거 인수의 증가는 약학 제품에 부가적인 바이러스로부터 안전한 바이러스 세이프(virus safe)를 부여한다. 오늘날, 규제 기관에 의한 가이드라인에 따르면, 혈장-유래 약제를 제조함에 있어 외막형 및 비-외막형 바이러스의 경우에는 2단계 이상의 효과적인 단계들이 요구된다. 용매/디터전트 처리, 옥탄산 처리, 나노미터 여과 및 열 처리 등의 여러가지 방법들이 외막형 바이러스를 불활성화하거나 제거하는데 효과적이지만, 비-외막형 바이러스, 예컨대 파르보 바이러스를 불활성화하거나 제거하기 위한 방법은 몇가지에 불과하다. 비-외막형 바이러스는 대부분 매우 작고, 통상적으로 기공 크기가 20 nm 이상인 나노미터 필터를 통과한다. 이러한 기공 크기는 직경이 최대 30 nm인 IgM에게는 너무 작은 편이다. 비-외막형 바이러스는 β-프로피오락톤과 같은 화합물에 의해 효과적으로 불활성화되지만, 기능에 문제가 생긴 면역글로불린 변형체들이 만들어진다. 다른 유효한 처리 방법으로는 UVC-조사 (EP1842561, CAF-DCF)가 있다. 그러나, 공지된 용매/디터전트 처리, 옥탄산 처리 및 미열 처리는 비-외막형 바이러스에 대해서는 실질적인 효과가 없다.

전술한 바와 같이, 존재 가능성이 있는 바이러스 외에도, 지질, 프로테아제, 단백질 응집체 및 변성된 면역글로불린과 같은 다른 오염원들도 제거되어야 한다. 이러한 모든 오염원을 제거하는 것은, (1) 제품이 바이러스 오염과 관련된 바이오-안전성 가이드라인에 부합될 수 있도록 하고, (2) 환자에게 정맥내 투여 후 제품이 허용될 수 있도록 하고, (3) 제품에 장기 안정성을 부여하고 (임의의 남아있는 단백질분해 활성이, 장기간 보관시, 예컨대 2년간 제품을 분해시킬 수 있음), (4) 바람직한 화합물 혼합물/약학 조성물을 제조하기 위해, 필수적이다.

그러나, 동시에, 오염원을 제거하기 위한 정제 단계는 면역글로불린 분자를 방해하지 않아야 하며, 그래서, 가능한 한 면역글로불린 분자들이 정상적인 생물학적인 활성을 유지하면서도 용액내에 높은 수율로 유지되어야 한다. 공지된 다수의 정제 단계들이 면역글로불린, 특히 IgM의 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 균형을 이루기 어려우며; 예를 들어, 긴 UVC 조사 시간이 최종 면역글로불린 용액내에서 확인되는 천연 및 활성형의 IgM의 수율을 낮출 수 있다. 이는 최종 면역글로불린 용액의 효능 감소를 야기할 뿐만 아니라 용액의 생체내 허용성을 떨어뜨릴 수 있다.

응집체와 변성된 면역글로불린은 특정 정제 단계에서 양적으로 증가될 수 있는데, 이들은 보체를 비특이적으로 활성화하는 능력이 높아, 변성된 면역글로불린을 복용한 환자에게 심각한 부작용을 야기하므로, 특히 환자에게 잠재적으로 위험하다. 보체의 비특이적인 활성화는 특이적인 항체-항원 복합체가 존재하지 않는 보체 케스케이드의 개시를 의미한다. 보체의 비특이적인 활성화는, 저혈압, 홍조, 두통, 열, 오한, 구역질, 구토, 근육통, 호흡곤란 및 빈맥 등의 부적절한 부작용을 야기할 수 있어, 엄격하게 금지되어야 한다. 한편, 보체의 특이적인 활성화는 바람직하며, 이는 면역글로불린에 특이적인 항원이 결합된 이후에만 발생한다.

보체의 비특이적인 활성화는 소위 항-보체 활성(AVA)으로서, 유럽 약전에 기술된 표준 검사를 통해 측정된다.

병원체에 대한 면역 방어에서의 보체 시스템의 역할을 잘 알려져 있다. 보체 시스템은 대략 20종의 단백질로 구성되어 있으며, 이들은 순차적으로 활성화된다. 고전적인 보체 경로는 전형적으로 활성화되기 위해서 특이적인 항원 항체 복합체가 필요하지만, 대체 경로는 항체 없이도 항원에 의해서 활성화될 수 있다. 보체 활성화에 대한 고전적인 경로와 대체 경로 둘다 프로테아제 C3-컨버타제를 만들어낸다. C3-컨버타제는 컴포넌트 C3를 자르고 활성화시켜, C3a와 C3b를 만들어내고, 이는 이후 C5 컨버타제에 의한 C5a 및 C5b 절단과 활성호가 이루어지는 케스케이드를 촉발시킨다. C5b는 막 공격 경로를 개시하며, 그 결과 C5b, C6, C7, C8 및 폴리머 C9로 이루어진 막 공격 복합체가 만들어진다. 이는 보체 케스케이드의 세포용해 작용을 위한 최종 산물로서, 이것은 막통과 채널을 만들어 세균과 같은 타겟 세포에 삼투압에 의한 세포용혈을 야기한다.

보체의 활성화에 의해, 부가적으로 생물학적 활성 단백질 C5a 등의 아나필라톡신이 만들어진다. 아나필라톡신은 면역 세포와 염증 세포에 대한 강력한 주화성 물질로서, 세포의 활성화를 야기하고, 비만 세포에서 히스타민이 분비되게 한다. 과도하거나 통제되지 않는 상황 및/또는 비특이적으로 보체가 활성화된 상황에서, C5a가 과다생산되면 환자에게 유해한 영향을 줄 수 있다.

C5a는 효과적인 백혈구 주화성 물질로서, 보체가 활성화된 부위에서의 백혈구 세포, 특히 호중구 과립구의 축적을 유발한다. C5a는 백혈구를 활성화하며, 강력한 염증 매개인자이다. 이러한 기능들은 특이적인 항체-항원 복합체 반응이 이루어지는 동안에는 유익하지만, 모든 비특이적인 C5a의 생성은 잠재적인 부작용으로 인해 금지되어야 한다.

IgM 항체들은, IgG 조제물과는 대조적으로, 용액 중에서 쉽게 응집되기 때문에, 비특이적인 보체 활성화는 IgM 면역글로불린 조제물 (즉, IgM을 5% 이상으로 포함하는 조성물)에서 특히 문제가 된다. IgM 조제물은 혈장 농도에 비해 농화되어 있어, 액체 용액 중에서 보관하는 경우 더욱 안정화시키기 어렵다. 또한, IgM은 강력한 보체 활성자로서, 항원에 결합된 단 하나의 분자로도 보체를 활성화시킬 수 있다는 것 역시 공지되어 있다. 이는, IgG의 경우, 보체를 활성화하기 위해서는, 2개 이상의 분자가 서로 밀접하게 조합된 형태로 항원에 결합되어야 한다는 점에서, IgG와 대비된다.

또한, IgM을 포함하는 면역글로불린 조제물로 치료하는 주된 증상은 세균성 감염과 패혈증이다. 이들 환자들은 이미 저혈압을 앓고 있기 때문에, 추가적인 바람직하지 못한 비특이적인 보체 활성화와 C5a 생성은 환자의 상태를 임상적으로 더욱 악화시킬 것이다. 그래서, IgM 조제물은 정맥내 투여 용도로 제조하기 어려운 것으로 알려져 있다.

IgM을 포함하는 면역글로불린 조제물을 인간 혈장으로부터 제조하기 위한 몇가지 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

인간 IgM 용액의 일차 정제는 고전적인 콘 혈장 분획 제조 방법 또는 이의 널리 공지된 그 변형 방법(예, Cohn/Oncley, Kistler/Nitschmann)으로 이루어진다. 차가운 에탄올 석출 공정을 이용하여, IgM 분획을 분획 III 또는 분획 I/III (또한, B 또는 B+I)로 회수한다. IgM이 농화된 단백질 용액의 정제를 분획 III 또는 I/III에서 시작하는 방법들이 개시되어 있다. EP0013901은 옥탄산, β-프로피오락톤 처리를 이용하는 단계와 음이온 교환 수지를 이용한 흡착 단계를 포함하는, 분획 III를 출발물질로 하는 정제 방법을 설명하고 있다. 이 방법을 이용하여, Pentaglobin^®이 제조되었으며, 이는 지금까지 상업적으로 이용가능한 유일한 IgM의 정맥내 투여용 제품이다. β-프로피오락톤은, 존재할 가능성이 있는 바이러스를 불활성화하기 위해 멸균 단계에서 사용하는 것으로 잘 알려져 있는 화합물이다. β-프로피오락톤은 단백질에 화학적 변형을 일으키는 매우 반응성이 높은 물질이기 때문에, 면역글로불린의 항바이러스 활성과 항세균 활성에 상당한 손실을 야기한다. 또한, 이러한 화학적 변형으로 인해 화학적으로 변형되지 않은 면역글로불린에 비해 항-보체 활성도 감소되게 된다. EP0352500에서는, 음이온 교환 크로마토그래피, β-프로피오락톤, UVC 광 조사 및 승온 (40℃ - 60℃) 조건에서의 인큐베이션 단계를 이용함으로써, 항-보체 활성이 감소된, 정맥내 사용하기 위한 IgM 농축물의 제조 방법을 기술하고 있다. 이러한 방법으로 제조되는 조제물은, 화학적 변형으로 인해 제한된 기간 동안에만 액체 용액 중에서 안정적이었다. IgM 농도는 총 면역글로불린 함량의 50% 이상이었다.

β-프로피오락톤에 의한 화학적 변형 없이 IgM이 농화된 단백질 용액을 제조하는 방법이 EP0413187 (Biotest) 및 EP0413188 (Biotest)에 기술되어 있다. 이러한 방법들은 콘 분획 III 또는 II/III을 출발 물질로 사용하여, 적절한 단백질 용액을 옥탄산 처리하고, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함한다. 특허 EP0413187 (Biotest)에서는, 콘 분획 III에 존재하는 지질을 제거하기 위해, 옥탄산 처리를 15분간 교반함으로써 수행한다.

EP0413187에 따른 조제물은 항-보체 활성이 0.6 - 0.8 CH50/(단백질)mg으로 낮아, β-프로피오락톤에 의한 안정화 및 바이러스 불활성화를 거쳐야 했다. 낮은 항-보체 활성은 면역글로불린에 대한 EP 모노그래프에 따르면 ≤1 CH50/(단백질)mg인 것으로 간주된다.

EP0413188B1 (Biotest)에서는, 항-보체 활성을 낮추기 위해 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 정맥내 투여용으로서 IgM-농화된 조제물의 제조 방법을 개시하고 있다. 추가적으로 pH 4 - 4.5에서 40 - 60℃, 바람직하게는 50 - 54℃의 열 처리가 항-보체 활성을 낮추기 위한 것으로 기술되어 있다. 이 조제물은 수개월간의 안정성을 확보하기 위해 동결건조하여야 하였다. 액체 용액으로서의 장기 안정성은 확인할 수 없었다.

M. Wickerhauser et al. "Large Scale Preparation of Macroglobulin", Vox Sang 23, 119-125 (1972)에서는, PEG 석출법으로 분리된 IgM 조제물이, 표준 보체 고정 검사에서 항-보체 활성(ACA)이 높으며, 이러한 ACA 활성은 8시간 동안 pH 4.0 및 37℃에서 IgM 조제물을 인큐베이션한 후 pH를 중성으로 재조정하면 10배 낮아졌다. 10배 감소는 정맥내 투여를 보장할 만큼 충분한 것인지는 명시되어 있지 않았다. 저자는 이 IgM 농도에서 특이적인 보체 활성화를 일으킬 수 있는지를 확인하지 않았으며, 어떠한 동물 또는 인간 모델을 대상으로 한 안정성 검사도 실시하지 않았다.

다른 방법으로는, IgM 조제물을 40 내지 62℃에서, 바람직하게는 45 내지 55℃에서, pH 4.0 내지 5.0에서 미열 처리하여, 보체의 비특이적인 활성화를 감소시키는 방법이 있다 (EP 0450412, Miles). 이 특허 출원에서는, 프리칼리크레인(prekallikrein) 활성인자와 지단백질을 원심분리를 통해 제거하기 위해, 콘 분획 III 현탁물에 옥탄산을 첨가하였다. 그러나, 이러한 미열 처리로도 IgM의 항원 결정기가 일부 소실되었다. 이는 새로운-항원(neo-antigen)이 생길 수 있는 위험성이 높여, 인간에 있어서의 면역원성 증가 또는 활성 감소로 이어질 수 있다.

EP0835880 (US 6136312, ZLB)에서는 옥탄산 석출 단계 이후에 프로테아제 (예, 펩신을 이용함) 처리를 이용함으로써 정맥내로 투여하기 위한 IgM 함유성 단백질 용액 조제물을 개시하였다. 프로테아제 처리는 면역글로불린 분자의 부분적인 단편화(partial fragmentation)를 야기하여, Fab 및 Fc 파트들의 전체적인 기능적인 작용을 손상시킨다. 따라서, 프로테아제가 처리된 면역글로불린은 변형되지 않은 것으로 볼 수 없다. 또한, 이러한 제조 방법으로는 분자량이 < 100 kD인 단편들이 약 5% 만들어진다.

옥탄산 처리를 수행하기 위한 개시된 방법들 (EP0413187 및 EP0835880)은, 비-외막형 바이러스의 제거와 불활성화 측면에서 효과가 없으며, 실질적으로 모든 단백질분해 활성을 제거하지는 못한다.

EP 0345543 (Bayer, Miles)에 의해, 치료학적 용도로 IgM이 33% 이상인 고농도의 IgM 조제물이 개시되었으며, 이 조제물은 실질적으로 이소어글루티닌(isoagglutinin) 역가가 없다. 이 특허 출원에서, 옥탄산 석출은 옥탄산을 첨가함으로써 수행되며, 이소어글루티닌은 Synsorb 친화성 크로마토그래피에 의해 제거한다. 최종 제조물은 동결건조하여야 한다.

대체적으로, 면역글로불린을 화학적으로 또는 효소학적으로 변형시키거나, 및/또는 크로마토그래피로 추가적으로 정제하거나 및/또는 미열 처리하는 경우, 항-보체 활성이 낮은 IgM 함유성 조제물의 제조가 가능하다. 그러나, 이러한 방법들은 바이러스 제거/바이러스 불활성화가 (즉, 바이러스 안전성이) 불충분하며, 천연 형태의 면역글로불린 분자의 함량이 낮으며, 및/또는 항-보체 활성이 잔류한다는 단점이 있다. 이처럼, 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 IgM을 포함하는 개선된 면역글로불린 조성물이 여전히 필요한 실정이다.

제1 측면에서, 본 발명은 IgG, IgA 및 항체 총량을 기준으로 5 중량% 이상의 IgM을 포함하는 인간에게 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물로서, 인간 혈장으로부터 제조되며, 특이적인 보체 활성화 활성을 나타내며, 보체를 비특이적으로 활성화하는 항체 조제물의 능력을 측정하는데 적합한 인간 혈청을 이용한 시험관내 분석에서 실질적으로 C5a 및/또는 실질적으로 C3a를 발생시키지 않는 항체 조제물을 제공한다.

본 발명의 출원인은, 특이적인 보체 활성화 활성을 나타내며, 실질적으로 비특이적인 보체 활성을 나타내지 않는, IgM 항체 조제물을, 인간 혈청으로부터 제조하는 것이 가능하다는 것을 놀랍게도 알게 되었다. 이 산물은, 정맥내 투여한 후 보체의 비특이적인 활성화와 관련있는, 저혈압 등의 바람직하지 않은 부작용은 낮추면서 산물의 효능은 유지하므로, 유익하다.

본 발명의 다른 측면은, 아래 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 조제물을 인간 혈장으로부터 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 인간 혈장으로부터 면역글로불린을 포함하는 용액으로서 혈장 분획을 제조하는 단계;

(b) C₇ 내지 C₉의 카르복시산을 상기 용액과 혼합하고, 혼합한 용액을 진동 교반기(vibrating agitator)로 처리하여 오염 단백질을 침전시키는 단계;

(c) 상기 용액으로부터 침전된 단백질을 분리하여, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 수득하는 단계;

(d) 상기 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 pH 3.5 내지 pH 4.5에서 인큐베이션하여, 인큐베이션한 용액을 수득하는 단계;

(e) 상기 인큐베이션한 용액에 UVC를 조사하여, UVC 조사한 용액을 수득하는 단계; 및

(f) 상기 UVC 조사한 용액을 무균 조건 하에 여과하여, 인간에 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물을 수득하는 단계.

본 출원인은, 면역글로불린을 카르복시산과 혼합하는 단계에서 진동 교반기를 사용하는 것이 매우 유용함을 놀랍게도 알게 되었다. 이러한 방법의 단계는, 바람직하지 않은 단백질 (프로테아제 포함)을 매우 효과적으로 제거하고, 면역글로불린 약물을 제조하는데 이용되는 하위 처리 단계들에 보다 적합한 중간 산물들을 제조하며; 상기 중간 산물은 이들 하위 처리 단계의 효율성을 높여준다. 따라서, 하위 처리 단계들은 덜 엄격할 수 있어, 실질적으로 보체의 비특이적인 활성화 없이, 보체를 특이적으로 활성화시킬 수 있는 본 발명의 항체 조제물을 수득하는데 도움이 될 수 있다.

구체적으로, 단계 (c)에서 수득되는 IgM 면역글로불린을 포함하는 조성물을, 약산 조건 처리 및 UVC 조사 처리 등의 추가적인 처리 단계들과 조합함으로써, 정맥내 투여하기 적합하며 다음과 같은 이점을 가지는, 인간에게 정맥내 투여하기 적합한, IgM을 포함하는 면역글로불린 산물 또는 항체 제조물을 제조할 수 있다: 낮은 항-보체 활성; 고농도의 네이티브 IgM 및 활성형 IgM; 및 바이러스 안전성. 본원에 기술된 방법으로 달성되는 바이러스 안전성 수준은 기존에는 달성하지 못하던 수준이다. 추가적인 이점은 단백질분해 활성이 낮으며 (따라서, 장기간 보관시 안정적이며) 화학적으로 변형되지 않는다는 것이다.

또한, 본 발명은 약물로 사용하기 위한 본 발명의 항체 조제물을 제공한다. 일 구현예에서, 항체 조제물은 면역 장애와 세균 감염증을 치료하는데 이용하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 환자에게 본 발명의 항체 조제물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 예시적인 방식으로 보다 상세하게 설명될 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 정맥내 투여용으로 적합한 항체 조제물을 제조하는데 이용할 수 있는 단계들의 개괄도이다. 진동혼합기를 이용한 옥탄산 처리 단계, pH 4 처리 및 UVC 처리가 강조 표시되어 있다. 출발 물질은 인간 혈장을 표준적인 차가운 에탄올 석출 처리를 통해 제조된 것이다.
도 2는 IgM 조제물과 인큐베이션한 후 인간 혈청에서 확인되는 시간에 따른 C5a의 평균 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 IgM 조제물과 인큐베이션한 후 인간 혈청에서 확인되는 시간에 따른 C3a의 평균 농도를 나타낸 그래프이다.

항체 조제물

전술한 바와 같이, 본 발명은 IgG, IgA 및 항체 총량에 대해 IgM을 5 중량% 이상으로 포함하는, 인간에게 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물로서, 인간 혈장으로부터 제조되며, 특이적인 보체 활성화 활성을 나타내며, 보체의 비특이적인 활성화에 대한 항체 조제물의 능력을 측정하는데 적합한 인간 혈청을 이용한 시험관내 분석에서 실질적으로 C5a 및/또는 실질적으로 C3a를 발생시키지 않는 항체 조제물을 제공한다.

본 발명의 항체 조제물은, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상이 면역글로불린 (다클론 항체)으로 구성된 인간 혈장 단백질을 포함한다. 특히, 상기 조제물은 면역글로불린 IgG, IgA 및 IgM을 포함하며, 면역글로불린의 5% 이상이 IgM이다. IgG, IgA 및 IgM 면역글로불린의 양은 비탁법(nephelometry) 또는 Ph. Eur. 2.7.1.에 따라 면역침강법으로 측정할 수 있다.

보다 바람직하게는, 항체 조제물은 IgM을 10% 이상으로, 가장 바람직하게는 IgM을 15% 이상으로 포함한다. IgG 및 IgA와 관련하여, 바람직하게는 상기 항체 조제물은 IgA를 5% 이상으로 및/또는 IgG를 40% 이상으로 포함한다. 모든 %는 항체의 총량에 대한 %이다 (예, IgM의 g / (IgG의 g + IgA g + IgM g) x 100).

항체 조제물이 특이적인 보체 활성화 활성 (즉, 항원의 존재시 보체의 케스케이드를 활성화하는 능력)을 가지는 지를, 면역글로불린 분자의 Fc 파트의 기능적 활성을 평가함으로써 확인하는 방법은, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 특히, 적합한 방법은 유럽 가이드라인 ICH S6 (CPMP/ICH/302/95)에 따라 현행 Eur. Ph. 방법에 기술되어 있으며, 이 방법은 루벨라 항원을 이용한다. 특이적인 보체 활성화와 관련된 추가적인 상세 내용들은 생물학적 활성을 참조하여 아래에 제시된다.

항체 조제물은, 정상적인 인간 혈청 (즉, 건강한 인간의 혈청)에서 보체의 비특이적인 활성화를 결정하는데 적합한 시험관내 분석에서 실질적으로 비특이적인 보체 활성화 (즉, 항체의 부재시 면역글로불린에 의한 보체 케스케이드의 활성화)를 야기하지 않는다. 특히, 본 분석은 항원 부재 조건에서의 분석을 통해 생성되는 C5a 및/또는 C3a의 양을 측정할 수 있다. 전술한 바와 같이, 보체 활성화에 의해 C5a와 C3a가 만들어진다. 이들 2종의 단백질들은 (고전적인/렉틴 경로 또는 대체 경로가 아닌) 보체 시스템의 최종 경로에 참여하기 때문에, 특히 보체 활성화를 확인하는데 유용하다.

항체 조제물은, 항원 부재 조건에서의 인간 혈청을 이용한 시험관내 분석에서 적절히 사용하였을 때, 실질적으로 C5a 및/또는 실질적으로 C3a를 생성시키지 않는다. 바람직한 구현예에서, IgM 농도가 1.72 mg/ml로 조정된 항체 조제물은 분석을 실시한지 60분 후에 C5a를 200 ng/ml 이하로 생성시키거나, 및/또는 IgM 농도가 1.72 mg/ml로 조정된 항체 조제물은 분석을 실시한지 60분 후에 C3a를 6000 ng/ml 이하으로 생성시킨다.

다른 예로, 또는 부가적으로, 분석에서 항체 조제물에 의해 생성되는 C5a 및/또는 C3a의 양은, 인간 혈청 단독으로 동일한 분석을 수행하였을 때 생성되는 C5a 및/또는 C3a의 양과 동일 수준 ± 70%이다. 바람직하게는, 이 결과는 분석을 수행한지 60분 경과한 후의 결과이다.

적합한 분석 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 분석은 아래 단계들을 포함한다:

(a) 인간 혈청 100 ㎕에 항체 조제물을 첨가하여, IgM 1.72 mg/ml을 포함하는 반응 혼합물을 제조하고, 이 반응 혼합물을 37℃에서 60분 동안 일정하게 교반하면서 인큐베이션하는 단계;

(b) ELISA에 적합한 상기 반응 혼합물의 희석액 세트를 제조하는 단계;

(c) C5a 또는 C3a에 대한 1차 항체와 2차 항체 및 발색 물질을 이용하여, 상기 반응 혼합물의 희석액 세트에 대해 샌드위치 ELISA를 수행하는 단계로서, 상기 2차 항체는 효소가 접합된 것이고, 상기 발색 물질은 상기 효소의 기질인 것인 단계; 및

(d) 상기 2차 항체를 통해 C5a 또는 C3a와 결합된 효소에 상기 발색 물질을 접촉시켜 수득되는 색 변화를 토대로, 반응 혼합물내 C5a 또는 C3a의 양을 결정하는 단계.

ELISA에서, 상기 희석액 세트를, 1차 항체로 코팅된 분석 플레이트의 웰과 접촉시킨다. 이 웰을 인큐베이션한 다음, 세척하여, 희석 샘플을 제거한다. 그런 후, 2차 항체는 상기 1차 항체와는 다른 C5a/C3a 에피토프에 결합하므로, 2차 항체와 인큐베이션하여 상기 웰에서 1차 항체에 결합된 임의의 C3a/C5a에 2차 항체를 결합시킨다. 이를 세척하여, 비결합된 2차 항체를 제거하고, 발색 물질과 함께 인큐베이션하여, 상기 2차 항체에 접합된 효소를 반응시킨다. 발색되는 색 변화를 광도계를 이용한 광학 밀도 측정을 통해 측정할 수 있으며, 광학 밀도 측정값은 상기 희석액 세트에 존재하는 C5a/C3a 농도에 비례한다.

특히, 단계 (a)에서 상기 항체 조제물은 상기 반응 혼합물내 IgM 농도를 1.72 mg/ml로 만드는데 적합한 양이다. 단계 (c)와 단계 (d)는, (i) 상기 반응 혼합물의 희석액 세트를, C3a/C5a에 대한 1차 항체 (즉, "포획 항체(capture antibody)"로 코팅된 분석 플레이트의 웰에 넣는 단계; (ii) 상기 플레이트를 인큐베이션하여, 임의의 C3a/C5a를 상기 1차 항체에 결합시키는 단계; (iii) 상기 플레이트를 세척하여, 상기 1차 항체에 결합되지 않은 모든 희석물 물질을 제거하는 단계; (iv) C3a/C5a에 또한 결합하는 2차 효소 결합된 항체 (검출 항체)를 플레이트에 적용하는 단계; (v) 상기 플레이트를 인큐베이션하여, 임의의 2차 항체를 C3a/C5a에 결합시키는 단계; (vi) 상기 플레이트를 세척하여, 결합되지 않은 2차 항체를 제거하는 단계; (vii) 상기 효소를 색 신호로 변환시키는 화합물을 적용하는 단계; (viii) 플레이트 웰의 흡광도를 측정하여, C3a/C5a의 존재 및 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

샌드위치 ELISA는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라, 및/또는 제조사의 지침서에 따라 상업적으로 구입가능한 키트를 이용하여 수행한다. 적합한, 특히 바람직한, 상업적으로 구입가능한 효소 연결된 면역흡착 분석 (ELISA) 키트는 Quidel MicroVue C5a Plus EIA Kit; A025, 및 Quidel MicroVue C3a Plus EIA Kit; A032이다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 항체 조제물은 1200 kDa 이상의 응집체를 2% 이하로, 바람직하게는 1.5% 이하로 포함한다. %는 면역글로불린 양에 대한 %이다. 응집체의 양은 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)로 결정할 수 있다. 이는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다.

다른 예로, 또는 부가적으로, 실질적으로 보체의 비특이적인 활성화를 발생시키지 않는 항체 조제물의 역량은, 조제물의 항-보체 활성 1.0 CH50/(단백질)mg 이하, 보다 바람직하게는 0.75 CH50/(단백질)mg 이하로 규정될 수 있다. 항-보체 활성을 상기한 범위로 측정하는 분석은 유럽 약전에 기술된 방법 (방법 2.6.17, Ph. Eur. 6. Edition, 2008)에 따라 수행할 수 있다. 이러한 분석에 대한 보다 상세한 내용은 아래 분석 단락에 제공된다.

바람직한 구현예에서, 항체 조제물은 항체의 화학적 또는 효소적 변형이 이루어지는 단계없이 인간 혈청으로부터 제조되며, 즉, 인간 혈청으로부터 항체 조제물을 제조하는 공정은 이의 효소적 또는 화학적 변형을 야기하는 시약을 항체와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다. 특히, 이 공정은 항체에 화학적 변형을 야기하는 β-프로피오락톤을 항체와 접촉시키는 단계를 포함하지 않거나, 또는 항체를 효소적으로 분해하는 펩신에 항체를 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다.

다른 예로, 또는 부가적으로, 항체 조제물은 항체를 40℃ 이상에서 10분간 이상 열처리하는 단계없이 인간 혈청으로부터 제조된다. 구체적으로, 열처리 단계는 면역글로불린을 변성시키고, 면역글로불린 응집을 야기할 수 있는 것으로 알려져 있다.

보다 바람직하게는, 항체 조제물은, 비-외막형 바이러스를 3 log₁₀ 이상, 바람직하게는 4 log₁₀ 이상, 가장 바람직하게는 5 log₁₀ 이상으로 제거할 수 있는 공정을 통해 제조되며, 따라서 항체 조제물의 바이러스로부터의 안전성이 확보된다. 따라서, 항체 조제물은 특히 파르보바이러스와 같은 활성형의 비-외막형 바이러스로부터의 안전성이 종래의 항체 조제물 보다 우수하다. 이는, 바이러스가 실질적으로 결여된, 특히 실질적으로 비-외막형 바이러스가 결여된 항체 조제물이 된다. 또한, 본 발명의 방법은, 활성형 IgM의 양 또는 항체 조제물의 항-보체 활성에 대해 유의한 효과없이, 이러한 수준의 바이러스 입자의 제거/불활성화를 달성할 수 있다.

특히, 항체 조제물은 아래 단계를 포함하는 방법을 통해 인간 혈장으로부터 제조할 수 있다:

(b) 상기 용액에 C₇ - C₉ 카르복시산을 첨가하고, 이 혼합 용액을 진동 교반기로 처리하여, 오염성 단백질들을 침전시키는 단계;

(c) 상기 용액에서 침전된 단백질을 분리하여, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 회수하는 단계;

(d) 상기 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 pH 3.5 내지 pH 4.5에서 인큐베이션하여, 인큐베이션 용액을 수득하는 단계;

(e) 상기 인큐베이션 용액에 UVC를 조사하여, UVC 조사한 용액을 수득하는 단계; 및

(f) 상기 UVC 조사한 용액을 무균 조건하에 여과하여, 인간에서 정맥내 투여에 적합한 항체 조제물을 수득하는 단계.

상기 방법은 단계 (d)에서 수득한 상기 인큐베이션 용액을 단계 (e)에서 조사 처리하기 전에 나노여과(nanofiltration)하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 제조 방법에 대한 보다 상세한 내용과 바람직한 측면들은 아래 단락들에 기술된다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 항체 조제물은, 동맥 혈압을 처리전 수준에 대해 10% 이상 감소시키지 않으면서 시노몰구스 원숭이에 115 mg IgM/(체중)kg/시간으로 투여할 수 있다. 전술한 바와 같이, 비특이적인 보체 활성화는 저혈압을 야기하므로, 즉 동맥 혈압에 유의한 변화가 없다는 것은, 보체의 비특이적인 활성화가 건강한 원숭이의 생체내에서 실질적으로 이루어지지 않는다는 것을 의미한다. 동맥 혈압은 압력 카테터(pressure catheter)를 우측 대퇴 동맥을 통해 하위 복부 대동맥부에 삽입함으로써 측정할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 또한, 항체 조제물은 뉴모코커스 사카라이드(Pneumococcus saccharide), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 클라미디아(Chlamydia) 중 하나 이상에 대한 항생제를 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, 항체 조제물내 항체들은 90% 이상이 생물학적 활성을 가진다. 용어 생물학적 활성을 가진다는 의미는, 조제물내 항체들이 네이티브 형태(native form)이며, 특히 항원과의 특이적인 결합으로 인한 결과로서 보체 케스케이드를 활성화시킬 수 있다는 의미이다. 항체 조제물의 생물학적 활성은 당해 기술 분야에 공지된 Fc 완전성(integrity)/기능 및 항체 역가/결합 활성을 결정하는 분석으로 평가할 수 있다. 구체적으로, Fc 기능을 결정하는데 적합한 시험관내 루벨라 항원을 이용한 분석에서, 항체 조제물의 항체의 Fc 영역의 활성은 생물학적 기준 조제물과 동일하며, 바람직하게는 ± 10%, 보다 바람직하게는 ± 5%이다.

생물학적 기준 조제물은 국제 의료 건강관리 커뮤니티에서 활용되고 있으며, 의학 제품의 균일성(consistency)을 확신시킨다. 이처럼, 분석에 적합한 생물학적 기준 조제물은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 입수가능하다 (예, 면역글로불린 생물학적 기준 조제물 (배치 번호 3)). 특히, 본 분석은, 항체 조제물의 활성 % 측정에 있어, 대조군으로서 인간 면역글로불린 생물학적 기준 조제물 (배치 번호 3)을 이용하는, 면역글로불린의 Fc 기능에 대한 국제적으로 공인된 Eur. Ph. 2.7.9 테스트 (현재 버전, 2011, 4월)에 따라 수행할 수 있다. 이러한 테스트는, (i) tanned group O 인간 적혈구에 루벨라 바이러스 항원를 부가하여, 항원으로 코팅된 혈액 세포를 만드는 단계; (ii) 다량의 항체 조제물을 상기 혈액 세포와 인큐베이션하고; 기니아 피그 보체를 첨가하여, 보체에 의해 개시되는 혈액 세포의 세포용해(lysis)를 개시하는 단계; (iii) 541 nm에서의 시간-의존적인 흡광도 변화를 통해 용혈(haemolysis) 카이네틱을 측정하는 단계; (iv) 시간 당 최대 흡광도 변화를 이용하여 항체 조제물의 항체의 기능을 평가하는 단계를 포함한다.

또한, 항체 조제물은 바람직하게는 종래 기술에서 기술된 항체 조제물 보다 낮은 단백질 분해 활성을 가진다. 특히, 단백질 분해 활성은, 2 내지 8℃로 두었을 때에는, 조제물에서 검출되지 않는다. 단백질 분해 활성은, 아래 분석 단락과 실시예 6에 기술되는 발색성 기질을 이용하는 등의, 당해 기술 분야에 공지된 표준화된 테스트 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 항체 조제물은, 글리신과 같은 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.

당해 기술 분야에 공지된 조제물들과 같이, 본 발명의 항체 조제물은 5 ± 3℃에서 보관할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법을 이용한 효율적인 정제로 인해, 항체 조제물의 안정성은 매우 양호하다. 최종 산물은, 2 내지 8℃에서, 3달 이상, 바람직하게는 6달 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상, 액체 상태에서 안정적인데, 이는 HPSEC로 측정시 IgM이 1.5% 이상으로 단편화(fragmentation) 또는 중합(polymerization)되지 않으며, 단백질 분해 활성이 증가되지 않으며, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 IgM 항체 활성과 뉴모코커스 사카라이드(Pneumococcus saccharide)에 대한 IgM 항체 활성이 25% 이상으로 감소되지 않으며, 항-보체 활성이 25% 이상으로 증가되지 않으며, 1 CH50/(단백질)mg 미만으로 유지된다는 의미이다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 최종 산물은, 동일한 기준으로 평가한 바에 따르면, 실온에서 (23 내지 27℃), 3달 이상, 바람직하게는 6달 이상, 가장 바람직하게는 1년 이상, 액체 형태에서 안정적이다.

항체 조제물의 제조 방법

전술한 바와 같이, 본 발명은 면역글로불린을 포함하는 혈장 분획으로부터 IgM을 함유하는 항체 조제물의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 아래 단계를 포함하는 인간 혈장으로부터 본원에 기술된 항체 조제물의 제조 방법을 제공한다:

(b) 상기 용액에 C₇ - C₉ 카르복시산을 첨가하고, 이 혼합 용액을 진동 교반기로 처리하여, 오염 단백질들을 침전시키는 단계;

약제학적 면역글로불린 조성물을 제조하는데 적합한 혈장 분획과 이의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 혈장 분획은, 바람직하게는, 침전시킨 혈장 분획이며, 가장 바람직하게는, 콘 분획 분별(Cohn fractionation) 공정 또는 이의 널리 공지된 변형 방법 (예, Kistler-Nitschmann)에 의해 수득되는 침전된 혈장 분획이다. 가장 바람직하게는, 분획은 차가운 에탄올 분획 분별을 통한 분획 I/III 또는 분획 III (이는 B + I 분획 또는 B 분획이라고도 함)이다. 혈장 분획의 면역글로불린은 IgM을 5% 이상으로 포함하는 것이 바람직하다.

단계 (a)는 면역글로불린을 함유하는 용액으로서 혈장 분획을 제공하는 것을 포함한다. 여러 사례들에서, 면역글로불린을 함유하는 혈장 분획은 고체 또는 반고체 형태일 것이다. 따라서, 이 단계의 목적은, 단계 (b)에서 카르복시산과 혼합하는데 적합한 상태가 되도록, 혈장 분획의 단백질을 용액으로 확보하거나 용액으로 만들고자 하는 것이다. 이 단계는, 상기 혈장 분획을 적정 완충액과 혼합하는 것을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 완충액은 몰 농도가 낮고 (즉, 1M 이하), pH는 4.5 - 5.5이며, 예컨대 0.1 M 소듐 아세테이트 완충액 pH 5.05 ± 0.1이다. 혼합은 블레이드 혼합기(blade mixer) 또는 진동 교반기(vibrating agitator)를 이용하여 달성할 수 있다.

단계 (b)에서, 단계 (a)에서 생성되는 용액을, 진동 교반기를 이용하여, C₇ - C₉ 카르복시산과 혼합하여, 오염 단백질 (예, 단백질 분해 효소, 바이러스 등)을 석출시킨다. 카르복시산은 분지형일 수 있거나, 및/또는 단계 (b)의 효과에 실질적인 변화를 미치지 않는 치환기(substituent)를 포함할 수 있다. 카르복시산은 바람직하게는 옥탄산이다. 카르복시산은 바람직하게는 혈장 분획에 0.075 kg/kg 이상의 농도로, 최대 0.2 kg/kg의 농도로 부가된다. 더 바람직하게는, 카르복시산은 혈장 분획에 0.8 - 0.15 kg/kg으로, 가장 바람직하게는 0.09 kg/kg - 0.13 kg/kg으로 첨가된다. 모든 이용가능한 몰 농도의 산을 사용하여, 적합한 농도를 제공할 수 있다.

화학/약학 산업에서 사용하기 적합한 상업적으로 이용가능한 모든 타입의 진동 교반기를 사용할 수 있다. 적합한 진동 교반기의 예는 Graber + Pfenninger GmbH로부터 입수가능하다. 구체적으로, "Labormodell Typ 1" 진동혼합기(vibromixer)는 실험실 규모의 실험에 사용할 수 있으며, "Industriemixer Typ 4"는 생산 규모의 제조에 사용할 수 있다. 진동 혼합기(vibrating mixer)는 제조사의 지침서에 따라 사용할 수 있으며, 구체적으로, 단백질을 포함하는 용액을 혼합하는데 적합한 제조사가 지정한 조건으로 이용할 수 있다. 예컨대, 진동 혼합기는 통상적으로 진폭 10 mm 이하의 100 Hz 이하에서 수행할 수 있으며, 예컨대 실험실 규모에서 "Labormodell Typ 1"을 이용한 진동 혼합은, 230 V 전력원을 이용하였을 때, 50 Hz로 본 발명자들이 수행하였다. 혼합 공정의 진동 진폭은 0 - 3 mm에서 변화되며, IgM 조제물의 경우에는 바람직하게는 3 mm으로 사용하였다. 직경 23 mm - 65 mm의 교반기 플레이트를 실험실 규모의 실험에서 사용하였다. 생산 규모에서는, 직경 395 mm의 교반기 플레이트가 사용되었다 (홀 직경 13.5 mm 및 16 mm).

단계 (b)에서, 상기 혼합 용액의 pH는 바람직하게는 4.5 내지 5.5, 더 바람직하게는 pH 4.8 내지 pH 5.3이다. 본 단계는 소듐 아세테이트 완충액 중에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 약 0.1 M의 소듐 아세테이트 완충액으로 이루어질 수 있다. 단계 (b)를 수행하는 온도는 바람직하게는 10℃ 내지 35℃, 더 바람직하게는 14 내지 30 ℃이다.

진동 교반기를 이용한 혼합 시간은 구체적으로 한정되진 않지만, 바람직하게는 30분 이상 - 3시간 이하, 보다 바람직하게는 40 - 110분이다. 인큐베이션 시간이 30분 보다 짧으면 바이러스 불활성화 정도가 낮아질 수 있다.

단계 (b)의 일 구현예에서, 단계 (b)의 용액에 트리-칼슘 포스페이트를 혼합한다. 바람직하게는, 이는 혈장 분획 (고체 또는 반고체 형태)에 대해 0.01 내지 0.02 kg/kg으로 첨가된다. 트리-칼슘 포스페이트는 카르복시산과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 첨가할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 트리-칼슘 포스페이트는 카르복시산 첨가 후 적어도 20분 경과시에 첨가한다.

단계 (c)에서, 단계 (b)에서 침전시킨 상기 오염 단백질을 용액으로부터 분리 제거하여, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물 (즉, 면역글로불린 함유 용액)을 수득한다. 본 분리 단계는 특별히 한정되지 않으나, 당해 기술 분야에 공지된 모든 적합한 방법에 의해 수행할 수 있다. 그러나, 분리 단계는 바람직하게는 여과, 보다 더 바람직하게는 한외여과를 이용하여 수행하며, 단계 (c)의 결과가 여과된 용액이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은, 오염 단백질을 침전시키는데 보다 효과적인 것으로 보이며, 따라서 단계 (c)를 수행하기 더 용이해지므로, 제조 측면에서 유익하다. 단계 (b)의 용액이 분리되면, 투명한 맑은 용액, 즉, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물이 수득된다. 즉, 여과가 신속하고 용이해진다.

추가적인 공정의 단계 (d) 내지 (f)는, 단계 (c)에서 수득되는 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물로 전환시키기 위한 것이다.

단계 (d)는 단계 (c)에서 수득되는 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 약산 조건으로 처리하는 것을 포함하며, 단계 (e)는 상기 산 처리한 조성물에 UVC를 조사하여 UVC 조사한 용액을 수득하는 것을 포함하며, 단계 (f)는 상기 UVC 조사한 용액을 무균 조건하에 여과하여, 인간에서 정맥내 투여에 적합한 항체 조제물을 수득하는 것을 포함한다.

약산 조건으로 처리하기 위해, 단계 (c)에서 수득되는 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 pH 3.5 - pH 4.5, 바람직하게는 pH 3.8 - pH 4.2에서 인큐베이션하여, 인큐베이션 용액을 수득한다. 약산 조건은, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물에 적정 산을 첨가함으로써 구현할 수 있으며, 예컨대 0.2 M HCl를 첨가함으로써 pH를 조정할 수 있다.

이러한 인큐베이션 단계는, 바람직하게는 32 - 42℃, 더 바람직하게는 35 - 39℃에서 수행한다. 인큐베이션 시간은 바람직하게는 2시간 이상 - 24시간 이하, 보다 바람직하게는 9시간 이상 - 16시간 이하이다.

조사 단계에서, 전술한 약산 처리를 통해 수득되는 인큐베이션 용액에 UVC 광을 조사하여, UVC 조사한 용액을 수득한다. 본 단계는 UVivatec 장치 (Bayer Technology Services)와 같은 상업적으로 입수가능한 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 인큐베이션 용액을, 존재할 가능성이 있는 바이러스와 단백질 분해 효소를 추가적으로 불활성화시키기 위해, 254 ± 10 nm에서 200 내지 500 J/m², 보다 구체적으로 200 내지 300 J/m²로 처리한다. 일반적으로 요구되는 조건 보다 온화한 조건에서의 UVC 처리는, 진동 혼합으로 옥탄산을 처리한 후 본 발명에 의해 수득되는 맑은 여과물에 대해 이루어질 수 있음에 유념해야 한다. 표준적인 교반 기법에 의해 정상적으로 입수되는 좀더 유백광(opalescent)을 띄거나 불투명한 용액은, 조사 시간이 필연적으로 더 길 것이며, 그래서 IgM 활성은 더 심하게 변성되고 바이러스의 불활성화율도 낮아질 것이다.

단계 (f)에서, 조사한 용액은 무균 조건에서 여과하여, 인간에서 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물을 수득한다. 바람직하게는, 여과는 나노여과, 보다 바람직하게는 기공 크기 40 - 50 nm의 필터를 통한 여과이다.

약산 처리, UVC 조사 및 여과 단계 외에도, 정맥내 투여하기 위한 면역글로불린 조제물을 제조하기 위한 추가적인 단계들은, 선택적으로, 한가지 이상의 추가적인 여과 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 가공 처리 중인 단백질 용액을 DEAE-세파덱스에 흡착시킨 다음, 심층 여과(depth filtration)에 의해 세파덱스로부터 분리시킬 수 있다. 예컨대, 원치않는 수반되는 단백질 세롤로플사스민(Ceruloplasmin)을 제거하기 위해, pH 5.8에서 단백질 kg 당 DEAE 세파덱스 75 mg으로 배치 흡착(batch adsorption)을 추가로 수행할 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 약산 처리로부터 수득되는 인큐베이션 용액을, UVC 조사 처리하기 전에, DEAE-세파덱스에 흡착시킨 다음, 심층 여과에 의해 세파덱스로부터 분리시킨다.

다른 구현예에서, 가공 처리되는 면역글로불린 용액은 나노미터 필터를 통해 여과할 수 있다. 기공 크기 75 ± 5 nm 내지 35 ± 5 nm의 필터, 또는 공칭 기공 크기 75 내지 35 nm인 필터 (예, Pall Ultipor DV50)를 처리 공정의 다양한 단계들에서 사용할 수 있다. (공칭 기공 크기가 예로 50 nm인 것은 50 nm 이상의 크기인 바이러스에 대한 체류율이 > 4 log₁₀ 임). 바람직한 구현예에서, 앞의 단락에 기술된 DEAE-세파덱스 단계로부터 수득되는 용액을 IVC 조사하기 전에 0.2 ㎛ 필터로 여과한다.

상기에 기술된 공정으로부터 수득되는 최종 항체 조제물 (즉, 가공 처리된 IgM을 포함하는 면역글로불린 용액)은 무균 조건에서 직접 용기에 충전할 수 있다. 다른 예로, 항체 조제물은 글리신-함유 완충액 중에서 pH 4 내지 5.5, 바람직하게는 4.1 내지 4.5로 제형화할 수 있다. 또한, 항체 조제물은 단백질 농도 40 - 80 g/L, 바람직하게는 55 - 70 g/L로 희석시킬 수 있다. 또한, 항체 조제물의 IgM 함량을 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피와 같이 잘 알려진 방법에 의해 농화시킬 수 있음에 유념한다.

앞서 전술한 바와 같이, 전술한 방법은 바이러스 입자의 불활성화 및 제거 효율이 높고, 특히 통상적으로 옥탄산 처리에 의해 처리되지 않는 파르보 바이러스와 같이 비-외막형 바이러스에 대한 방제성(resistant)이 우수하다. 아울러, 일반적인 교반에 비해, 단백질 분해 활성의 제거율이 향상된다. 이러한 특징들은, 화학적으로 변형되지 않은 IgM을 고수율로 유지시키면서 달성된다. 이러한 사실은, 옥탄산 처리가 외-막형 바이러스에 대해 유효한 공정이 아니며, 바이러스 안전성 개선이 β-프로피오락톤 처리와 같은 보다 가혹한 방법을 통한 바이러스의 불활성화에 의해 달성되어야 하는, 종래의 측면과 대비된다. 또한, 단백질 분해 활성을 완전히 제거하기 위해 예컨대 옥탄산의 농도를 증가시키면 IgM이 상당히 소실된다는 것 역시 잘 알려져 있다.

본 발명의 결과들은, 진동 방식을 이용한 혼합 장치를 옥탄산 처리와 조합하여 사용함으로써 달성된다. 이는, 특히, IgM이 전단 응력(shear stress)에 매우 취약하여, 바람직하지 않은 높은 항-보체 활성을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있어, 특히 놀라운 결과이다. 즉, IgM 조성물을 제조하는데 진동 혼합기를 이용하는 것은 누구도 생각하지 못하였고, IgM 함유 용액을 가공 처리하는 동안에 진동 혼합을 사용하는 경우의 이러한 우호적인 효과는 예상되지 못하였다.

아울러, 본 발명에서, 단계 (b)에서 수득한 옥탄산 처리 용액을 여과함으로써 이루어지는 정화(clarification)와 같이, 단계 (c)에 의해 달성되는 분리는, 진동 혼합 장치를 이용하는 경우에 강화된다. 분리는 보다 쉽게 달성되며, 처리 시간과 제조 비용이 감소되며, 단계 (c)를 통해 하위 처리 과정에 유리한 맑은 용액이 수득된다. 옥탄산 처리한 교반되어진 IgM 함유 용액의 결과물을 여과함으로써 수득되는 종래의 용액들은 유백색을 띄거나 불투명하다.

단계 (c)에서 수득되는 제조된 IgM을 함유하는 조성물은 바람직하게는 약산 조건 (예, pH 4)의 처리와 UVC-조사 단계를 거쳐, 바이러스 안전성이 더욱 개선되고, 최종 산물은 안정화된다. 단계 (c)에서 수득되는 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물은 정화 수준이 향상되었기 때문에, 외-막형 바이러스의 바이러스 불활성화를 3 또는 4 log₁₀이상으로 달성하기 위해 필요한 UVC 조사 시간을 낮출 수 있다. 이로 인해 UVC 처리 과정의 천연 및 활성형 IgM의 수율이 증가된다.

놀랍게도, 이러한 단계들로 화학적으로 그리고 효소학적으로 변형되지 않은 IgM을 함유하는 용액이 만들어지는데, 이 용액은 네이티브 및 활성형 IgM의 수율이 높고, 항-보체 활성과 단백질 분해 활성이 낮으며, 항세균 활성과 항바이러스 활성이 높으며, 외막형 바이러스와 비-외막형 바이러스에 대한 바이러스 안전성이 우수하며; 정맥내 투여하기 위한 약제의 주요 특징을 가진다. 또한, 처리된 IgM을 함유하는 용액은 2 - 8℃에서 12개월 이상 액체 용액 중에서 매우 안정적인 개선된 장기 안정성을 가진다.

의학적 용도

본 발명의 항체 조제물은 의약품에 사용하기 적합하며, 면역 장애 및 감염증, 특히 IgM 결핍 장애(IgM deficiency disorder) 및 세균 감염증을 치료하는데 사용할 수 있다. 정맥내 투여하기 위한 인간 IgM-농화된 다가 면역글로불린 조제물은, 다가 면역글로불린 G 조제물과 비교하여, 임상적으로 관련있는 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 대해 높은 항체 역가를 가질 뿐만 아니라 그람 음성 박테리아의 내독소와 그람 음성 및 그람 양성 박테리아의 외독소에 대해 높은 항체 역가를 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 항체 조제물은 환자에게 정맥내 투여하기 적합하다.

또한, 본 발명은, 환자에게 본 발명의 항체 조제물을 투여하는 단계를 포함하는 환자 치료 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 환자는 면역 장애나 세균 감염증을 앓을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체 조제물은 정맥내로 투여된다.

이제 본 발명을 예시적인 방식으로 추가적으로 설명한다.

실시예

분석 방법

IgM 농축물의 HPLC에 의한 분자 크기 분류

아래 방법은 항체 (실시예 8에서 사용되는) 항체 조제물내 응집 %를 측정하는데 활용할 수 있다.

테스트 용액: 샘플을 희석하지 않고 약 50 g/L로 주입 부피 10 ㎕ (단백질 양 약 500 ㎍)로 주입하였다.

기준 용액: 인간 면역글로불린 (예, Intratect, Biotest AG)

표준 용액: Bio-Rad 겔 여과 표준물질 (Art.-No. 151-1901)

컬럼:

- 크기: l = 30 mm, Φ = 7.8 mm,

- 정지상: 상대적인 분자량 범위가 20 000 - 7 x 10⁶Da인 전반적인 단백질들을 분획화하는데 적합한, Tosoh Bioscience TSK-Gel G4000 SWXL

이동상: 디소듐 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트 4.873 g, 소듐 디하이드로겐 포스페이트 모노하이드레이트 1.741 g, 소듐 클로라이드 11.688 g, 및 소듐 아지드 50 mg을 물 1 L에 용해시킴.

유속: 0.5 ml/min

검출: 280 nm에서 스펙트로포토미터. 기준 용액으로 수득한 크로마토그램에서, 크로마토그램은 아래 체계에 따라 적분하고, 피크를 동정하였다:

● 폴리머 (>1200 kD), 10 - 13 min

● IgM (1200 - 750 kD), 13 - 19 min

● 이량체 / IgA (750 - 350 kD), 19 -20 min

● IgG (350 - 100 kD), 20 - 26 min

● 단편 (< 100 kD), 26 - 40 min

비특이적인 보체 활성화의 검출

헤모라이신 전처리한 양의 적혈구를 보체에 의해 용혈시킨다. 샘플내 보체-결합 항체에 의해, 용혈이 억제된다. 1 mg 면역글로불린에 의해 결합된 (불활성화된) 보체의 양을 측정한다.

특정 양 (10 mg)의 면역글로불린을 기니아 피그의 보체와 혼합하고, 유리형 보체를 적정한다. 항-보체 활성은 기준 용액의 사용 보체에 대한 사용 보체로서 표시된다. 보체 활성의 용혈 단위 (CH₅₀)는 최적 완충액 조건에서의 적혈구 총량 5 x 10⁸ 중 최적으로 준비된 적혈구 2.5 x 10⁸의 용혈을 야기하는 보체의 양이다.

최적으로 준비된 적혈구 (양으로부터 안정화된 적혈구 8 ml을 취하여, 젤라틴-바르비탈-완충액으로 3회 세척한 다음, 최종 1 ml 적혈구 침전물을 24 ml 젤라틴-바르비탈-완충액에 현탁함)는, 적혈구 현탁액 20 ml을 헤모라이신 20 ml과 혼합하고 (2 MHE/ml로 조정 - 최소 용혈 단위) 37℃에서 15분간 인큐베이션함으로써, 제조한다.

등량의 10 mg 면역글로불린을 젤라틴-바르비탈-완충액 (1 L 바르비탈 완충액 pH 7.3 중의 젤라틴 1 g, 5배 바르비탈-완충액 용액: 2 L 물 중의, 83 g 소듐 클로라이드, 10.192 g 소듐 바르비탈, pH 7.3)에 희석한다. 최종 부피 1 ml에, 100 CH₅₀/ml 보체 200 ㎕를 첨가한다. 테스트 튜브를 1시간 동안 37℃에서 교반하에 인큐베이션한다. 샘플을 희석하고, 최적으로 준비된 적혈구를 이용하여 적정한다. 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 샘플을 원심분리하고, 광학 밀도를 541 nm 파장에서 스펙트로포토미터를 이용하여 측정한다.

단백질 분해 활성 측정

단백질 분해 활성은, 발색 기질 (특히, 적어도 세린 프로테아제에 반응을 나타내는 기질)과 항체 조제물 샘플 (통상 완충액에 희석시켜, 분석의 선형 범위에 총족시킴)을 37℃에서 혼합하고, 스펙트로포토미터를 이용하여 흡광 카이네틱스를 모니터링함으로써 평가할 수 있다. 샘플의 단백질 분해 활성은 등식 C (U/L) = 313 S x ΔAbs/min x F (C = 단백질 분해 활성; S = 발색 기질의 특이적인 흡광 변화에 대한 변환 인수; 및 F = 희석 인수)을 이용하여 초기 흡광 차이 (ΔAbs/min)로부터 계산한다. 기질의 사용은 제조사의 지침에 따른다.

단백질 분해 활성은 특히 아래 단계를 통해 평가할 수 있다:

(a) 기질 S-2288 (Chromogenix) 25 mg을 주사용수 7.2 ml에 용해한다;

(b) 분석의 선형 범위에 맞추기 위해, 항체 조제물 샘플을 완충액 (100mM Tris.HCl pH 8.4, 106 mM NaCl)으로 희석하고, 온도를 37℃로 조정한다;

(c) 희석된 항체 조제물과 상기 용해시킨 기질을 동량 (예, 200 ㎕)으로 혼합한다;

(d) 스펙트로포토미터를 이용하여 37℃에서 1-3분간 405 nm에서 흡광 카이네틱스를 측정한다;

(e) 샘플의 단백질 분해 활성은, 등식 C (U/L) = 313 x ΔAbs/min x F (C = 단백질 분해 활성, F = 희석 인수)을 이용하여 초기 흡광 차이 (ΔAbs/min)로부터 계산한다.

본 방법의 정량 한계는 8 U/l이며, 본 발명의 항체 조제물 샘플을 이용한 단백질 분해 활성은 검출 불가하였다. 이와 같이 본 발명의 최종 산물의 단백질 분해 활성 수준은 8 U/l 미만이다.

실시예 1 - 분획 I/III으로부터 IgM 농화된 조제물의 제조

인간 혈장을 차가운 에탄올 분획 분별로부터 유래된 180 kg의 Cohn 분획 I/III를, 0.1 M 소듐 아세테이트 완충액 pH 5.05 720 L에 현탁하고, 현탁 온도 (22 ± 4 ℃)에 도달한 후 15-30분간 혼합하였다.

이 용액에, 옥탄산 19.8 kg (사용된 페이스트 I/III kg 당 0.110 kg)을 실온에서 첨가하여 처리하고, 단백질 용액을 진동 혼합기 (Vibromixer^®, 크기 4, Graber+Pfenniger GmbH, 2 - 3 단계로 설정한 Vibromixer)를 이용하여 80분간 더욱 혼합한다. 옥탄산을 30분에 걸쳐 서서히 첨가한다.

트리-칼슘 포스페이트 (Ca₃(PO₄)₂) 약 3 kg을 첨가하여, 단백질 용액을 적어도 15분간 더욱 혼합한다. 침전물을 필터 프레스를 이용하여 여과하여 맑게 함으로써 침전물을 제거한다. 추가적인 0.2 ㎛ 여과를 수행하고, 단백질 용액을 10 kDa 막으로 한외여과한다. 단백질 용액을 0.04 M NaCl 용액으로 정용여과한 다음, 단백질 농도 40 g/L로 조정한다.

단백질 용액을 주사용수로 1+1로 희석한 다음, pH 4.0 ± 0.1로 처리한다. pH 조정은 1 M HCl을 첨가하여 수행하고, 단백질 용액을 9시간 동안 37℃ ± 2℃에서 인큐베이션한다. pH 4에서 인큐베이션한 후, 단백질 용액의 pH를 1 M NaOH로 pH 5.8로 조정한다. 제조되는 단백질 용액을 배치 모드 (단백질 kg 당 75 g DEAE Sephadex)로 DEAE 세파덱스를 첨가하여 정제한다. 단백질 용액을 교반하면서 60분 이상 실온에서 인큐베이션한다. DEAE 세파덱스는 여과에 의해 정화시켜 제거한다. 단백질 용액을 0.2 ㎛로 여과한다.

단백질 용액을 0.1 ㎛ 필터와 Pall, Ultipor VF DV50, 20" 필터로 여과한다. 플로우-쓰루 UVivatec^® 프로세스 장치 (Bayer Technology Services / Sartorius Stedim)를 UVC 조사량 240 J/m²로 이용하여 254 nm에서 UVC를 여과물에 조사하여, 여과물을 추가로 가공 처리한다. 조사 처리한 단백질 용액을 한외여과에 의해 단백질 농도 50 - 70 g/l로 농축시키고, 정용여과 (10 kD 막, 0.32 M 글리신 완충액 pH 4.3 이용)한다. 최종 산물을 0.2 ㎛ 필터로 여과하고, 2 - 8℃에서 보관한다.

실시예 2 - 옥탄산 처리 단계의 조건 평가

옥탄산 처리를 위해, 아래 실험 범위를 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 서로 조합하여 테스트하였다 (결과는 미기재함).

- 옥탄산 양: 0.09 kg/kg 내지 0.13 kg/kg (사용 분획 I/III kg 당 옥탄산 양) (옥탄산 120 내지 180 mM)

- pH 4.8 - 5.3의 옥탄산 처리 pH

- 반응의 온도 범위: 14℃ 내지 30℃

- 인큐베이션 시간: 40 내지 110분

테스트한 모든 조건들에서, 추가적인 공정에서 쉽게 정화되며, 현탁된 Cohn 분획 I/III에서 수 천 U/L의 단백질 분해 활성이 광범위하게 감소된, 중간체가 만들어진다. 이들 중간체는 단백질 분해 활성이 정량 한계인 8 U/l 미만인 최종 산물이 된다 (아래 실시예 6에 기재된 바와 같이 계산함).

실시예 3 - 진동혼합기를 이용한 바이러스 감소 - 진동혼합기를 사용하거나 사용하지 않고 옥탄산을 처리한 경우의 바이러스 제거 인수의 결정

분획 I/III의 현탁액 250 ml을 30분간 pH 5.05 및 22℃에서 균질화하였다. 이 현탁물에 바이러스 스톡 용액 2.6 ml을 넣었다(spiking). 여기에 옥탄산 (110 g/kg)을 첨가하여, 진동혼합기를 사용하여 60분간 균질화하였다. 병렬 실험으로, 동일한 혼합물을 표준 교반하여 균질화하였다. 60분 후에, 트리-칼슘 포스페이트 (0.15 g/kg 옥탄산)를 첨가하여, 현탁물을 15분간 교반하였다. 현탁물을 필터 디스크로 심층 여과하여 맑게 만들었다. 필터 디스크를 완충액 70 - 80 ml로 미리 세척하였다. 여과 후, 필터를 완충액 80 ml로 세척하였다. 여과물과 세척액을 모아, 샘플을 바이러스 적정을 위해 취하였다.

옥탄산을 첨가하기 전과 여과한 후에 취한 샘플의 바이러스 역가를 SV40, Reo 및 PPV (CV-1, CCL.7.1 및 PK13)에 대한 적정 지표 세포(indicator cell)에서 측정하였다. 마지막으로, 제거 인수(removal factor)를 바이러스 검증(virus validation) 실험에 대한 현행 가이드라인에 준하여 계산하였다.

바이러스 검증 실험에서, SV40 및 Reo와 같은 비-외막형 바이러스를 각각 4 log₁₀ 이상 및 5 log₁₀이상으로 효과적으로 제거되었다. 또한, PPV는 3 log₁₀ 이상으로 제거되었다. 이들 값은 진동혼합없이 표준 교반 조건에서 동일하게 옥탄산 처리한 결과의 10배 이상, 최대 1000배이다.

표 1: 진동혼합기를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우에서의 옥탄산 처리에 따른 바이러스 감소 인수 (log ₁₀ )의 비교

	표준 교반 + 옥탄산 반응 [log ₁₀ 감소]	진동혼합 + 옥탄산 반응 [log ₁₀ 감소]
PPV	2.15 ± 0.32	3.39 ± 0.36
REO	2.34 ± 0.38	5.46 ± 0.28
SV40	2.05 ± 0.4	4.71 ± 0.34

실시예 4 - UVC 처리 평가

UVC 조사량의 최적 범위를 조사하였다. 비-외막형 바이러스에 대해 4 log₁₀이상의 불활성화를 달성하기 위한 필수 최소 조사량과, Fab의 항원 결합 기능 손상 및 보체 활성화에 영향을 미치는 Fc 기능 손상을 일으키는 IgM 분자의 변성을 방지하는 최대 허용 조사량에 균형이 존재한다. 200 - 400 J/m²의 범위에서, 면역글로불린 응집체는 일부 약간 증가하고, 단편 함량에는 유의한 효과가 없음을 관찰할 수 있었다.

실험에서, 오리지날 단백질 용액의 광학 밀도 (OD)를 이용하여 UVivatec 랩 시스템에서 판매사가 제공하는 BTS의 엑셀-시트(customer Master Calculation Sheet UVivatec Lab II Version 3.0)를 이용하여 유속을 계산한다. 유속은 램프 성능, UV 신호 램프 센서의 세트 포인트 및 바람직한 UVC 조사량을 고려하여 계산된다.

IgM을 함유하는, 단백질 함량 약 55 g/l의 용액 (Batch 86GB005BE07)을, 단일 플로우-쓰루에 대해 200 J/m²조사량을 달성하기 위해, UVivatec 시스템을 통해 유속 5.8 l/h로 펌핑하였다. 조사량 300 J/m²은 상기 단백질 용액을 유속 3.9 L/m²로 상기 시스템으로 펌핑함으로써 달성하였다. 조사량 400 J/m²은 상기 단백질 용액을 유속 2.9 L/m²로 상기 시스템으로 펌핑함으로써 달성하였다.

표 2: 농축시킨 최종 산물에 대한 UVC 처리 전과 처리 후의 활성 및 역가 결정에 대한 분석 결과

		UVC 비-조사, IgM 산물	UVC 200J/m²조사 후 IgM 산물	UVC 300J/m²조사 후 IgM 산물	UVC 400J/m²조사 후 IgM 산물
단백질 함량	g/l	56.3	56.2	57.6	54.4
IgG 함량 (비탁법)	%	56.1	55.5	55.7	54.9
IgA 함량 (비탁법)	%	20.1	20.6	20.5	20.7
IgM 함량 (비탁법)	%	23.7	23.9	23.7	24.4
HPSEC 응집체 > 1200 kD 단편 < 100 kD	면적 % 면적 %	1.9 0.66	2.6 0.73	3.3 0.76	4.0 0.79
ACA	CH50/mg 단백질	0.68	0.48	0.46	0.46
PA	U/l	< 8	< 8	< 8	< 8

200 - 400 J/m² 범위에서는 면역글로불린 함량, 단백질 분해 활성 또는 ACA에서 유의한 차이는 관찰할 수 없었다. 200 J/m²는 비-외막형 바이러스를 불활성화시키는데 매우 충분하고, 300 J/m²에서는 응집체 형성 및 항체 역가에 대한 유의한 효과를 관찰할 수 없었기 때문에, 바람직한 조사량 범위는 200 - 300 J/m²이었다. 바람직한 조사량은 225 J/m²이다.

희석된 IgM을 함유하는, 단백질 함량 8 - 12 g/l의 용액 (Batch 86BB059BE07)을, 단일 플로우-쓰루에 대해 200 - 300 J/m²조사량을 달성하기 위해, UVivatec 시스템을 통해 유속 5.8 l/h로 펌핑하였다.

표 3: 여러가지 UVC 조사량으로 UVC 처리 전과 처리 후의 IgM 용액에 대한 분석 결과

배치 분획 I/III 86BB059BE07		UVC 조사 전	UVC: 200 J/m²	UVC: 225 J/m²	UVC: 250 J/m²	UVC: 300 J/m²
단백질 IgG 함량 IgA 함량 IgM 함량	g/l % % %	11.34 59.2 19.6 21.1	10.56 59.1 19.6 21.3	10.65 58.5 20.2 21.2	10.69 58.6 20.1 21.4	10.56 57.1 20.3 22.6
HSEC 응집체 > 1200 kD 　단편 < 100 kD	% %	0.20 0.47	0.39 0.46	0.54 0.25	0.3 0.26	0.47 0.47
PA PKA ACA	U/l U/ml CH50/mg 단백질	< 8 3 0.1	< 8 3 0.08	n.t. 3 0.1	n.t. 3 0.1	n.t. 3 0.18
항-E.coli O1:K1 - IgG 항-E.coli O1:K1 - IgA 항-E.coli O1:K1 - IgM	U/mg U/mg U/mg	24.7 9.4 14.1	20.5 9.5 13.0	18.9 9.5 15.1	19.5 9.1 13.9	20.2 8.9 13.4
항-칸디다 알비칸스 - IgG 항-칸디다 알비칸스 - IgA 항-칸디다 알비칸스 - IgM	U/mg U/mg U/mg	15.6 11.3 13.8	16.8 11.6 13.3	17.9 10.5 13.7	17.3 10.3 13.9	17.0 10.4 13.1
항-엔테로코커스 패칼리스 - IgG 항-엔테로코커스 패칼리스 - IgA 항-엔테로코커스 패칼리스 - IgM	U/mg U/mg U/mg	13.0 11.3 17.2	15.5 10.5 14.1	13.5 10.1 16.7	14.8 9.7 14.0	15.0 9.6 13.9
항-뉴모코커스 사카라이드 -IgG 항-뉴모코커스 사카라이드 -IgA 항-뉴모코커스 사카라이드 -IgM	U/mg U/mg U/mg	23.2 13.3 17.5	24.1 12.1 15.1	24.7 18.0 18.0	24.0 16.5 16.4	25.7 14.8 16.6

면역글로불린 클래스 분포는 이들 조사량 범위 처리에서의 UV 조사에 아무런 영향없이 유지된다. 또한, HPSEC로 분석한 분자량 분포 패턴도 변하지 않는다. CZE로 분석한 순도 수준도 변하지 않는다. 단백질 분해 활성 (PA), 프리칼리크레인 활성자 (PKA) 및 항-보체 활성 (ACA)에도 변화가 없다. 또한, ELISA 방법으로 측정한 항세균 활성도 모든 면역글로불린 클래스들에서 유의하게 바뀌지 않는다.

분액 - UV 세기를 증가시켜 조사한 - 을 최종 산물이 될 때까지 추가로 처리하고, 동일한 분석 테스트 패널로 수행하였다. 최종 산물에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 테스트한 모든 항체들의 역가는 늘 UVC 조사 처리한 대조군 조제물의 100 + 10 %의 범위내이다.

실시예 5 - 진동혼합기/pH4 처리 및 UVC 처리를 통한 전체적인 바이러스 감소 - 바이러스 제거 인수 결정

3단계의 진동혼합 + 옥탄산 처리, pH4 처리 및 UVC 처리(215 J/m²)에 대한 바이러스 제거/불활성화 검증을 아래 모델 바이러스를 이용하여 수행하였다: C형 간염 바이러스에 대한 모델 바이러스로서 소 바이러스 설사 바이러스 (BVDV), 인간 헤르페스 바이러스의 모델 바이러스로서 위 광견병 바이러스 (PRV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1), 코로나 바이러스에 대한 모델 바이러스로서 말 동맥염 바이러스 (EAV), 플라비 바이러스에 대한 모델 바이러스로서 신드비스 바이러스 (SinV), A형 간염 바이러스에 대한 모델 바이러스로서 뮤라인 뇌척수염 바이러스 (MEV), 기타 비-외막형 바이러스에 대한 모델 바이러스로서 네오바이러스 (Reo), 인간 파보바이러스 B19에 대한 모델 바이러스로서 돼지 파보바이러스 (PPV).

3가지 단계, 옥탄산 처리, pH4 및 UVC 처리로 수행한 이들 실험 결과를 아래 표 4에 열거한다.

표 4: IgM 생성 과정에 의한 총 바이러스 감소

모델 바이러스	BVDV	PRV	HIV-1	EAV	SinV	MEV	Reo	PPV
총 감소 (log ₁₀ )	>12.5	>10.1	>12.7	>8.4^a	>13.7^a	9.2	>11.0	>8.4

^a UVC 조사 단계에 대한 검증 데이타가 없는 감소 인수

최대 공칭 기공 크기 약 50 nm인 필터를 이용한 선택적인 나노여과는, 바이러스의 크기에 따라 17 log₁₀ 이상으로 총 감소율을 증가시킴으로써, 추가적인 안전성을 부여한다. HIV-1는 E.g >17.5 log₁₀이지만, PPV는 나노여과에 의해서 추가로 제거되지 않았다.

따라서, 본 발명에 따른 정제 과정은, 지금까지 IgM을 함유하는 조제물이 달성하지 못했던 바이러스 불활성화/감소율 8 log₁₀ 이상으로, IgM 조제물에 상당한 바이러스 안정성을 부여한다. 이런 점은, 일반적으로 크기가 작고 지질 외막이 없어 바이러스 불활성화 및 제거 공정에 더 잘 견디는, MEV, Reo 및 PPV와 같은 비-외막형 바이러스에 대해 특히 중요하다.

실시예 6: 진동혼합기의 사용한 옥탄산 처리 및 진동혼합기를 사용하지 않은 옥탄산 처리에 따른 잔류 단백질 분해 활성 측정

옥탄산 처리를 실시예 1에서와 같이 수행하였고, 병행 실험으로 진동혼합기를 사용하지 않고 블레이드 교반기를 이용한 일반적인 왕성한 교반을 조합하여 수행하였다. 옥탄산/트리칼슘 포스페이트 처리 및 한외여과/정용여과 후, 샘플의 단백질 분해 활성을, 발색 기질 S-2288 (Chromogenix)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 사용하여 측정하였다.

기질 S-2288 (Chromogenix) 25 mg을 주사용수 7.2 ml에 용해하고, 분석의 선형 범위에 맞도록 완충액 (100 mM Tris/HCl pH 8.4, 106 mM NaCl)으로 희석하였으며, 예컨대, 완충액 200 ㎕를 샘플 200 ㎕ (혼합 및 37℃로 온도 조절)와 발색 기질 용액 200 ㎕와 혼합하였다. 흡광 카이네틱스를 37℃에서 405 nm (1-3 min)로 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였다. 샘플의 단백질 분해 활성을 등식 C (U/L) = 313 * ΔAbs/min * F (C = 단백질 분해 활성, F = 희석 인수)을 이용하여 초기 흡광 차이 (ΔAbs/min)로부터 계산하였다.

표 5: 옥탄산 처리에 의한 단백질 분해 활성의 감소

	옥탄산 처리, 진동혼합 비-수행	옥탄산 처리. 진동 혼합 수행
출발 물질 (U/l) 옥탄산 처리 (U/L) 후 평균 단백질 분해 활성 잔류 수준	5630 42	5630 < 8 (LOD)

옥탄산 처리 후 여과물은 진동혼합을 적용하였을 때 맑았다. 비교 실험에서, 블레이드 교반기를 사용하면서 옥탄산을 처리한 이후의 여과액 매우 불투명하고, 여과하기 어려웠다.

실시예 7: 본 발명에 따른 IgM 조제물의 항세균 역가

상업적으로만 구입가능한 정맥내 투여가능한 IgM 함유 조제물인 펜타글로빈(Pentaglobin)과 비교하기 위해, 항세균 활성을 이러한 잘 확립된 약물의 3가지 배치를 대상으로 본 발명에 따른 조제물과 비교하여 분석하였다. 항세균 또는 항진균 항원에 대한 IgM 조제물내 IgA 또는 IgM 클래스 항체를 ELISA로 결정하였다. 마이크로타이터 플레이트를 해당 항원으로 코팅하고, 표준 또는 IgM 조제물과 함께 인큐베이션하였다. 항원에 결합된 항체는 항-인간-IgA 또는 항-인간-IgM 접합체를 이용하여 검출하였다. 검출은 효소 기질을 이용하여 수행하였다. 발현되는 색 변화는 IgM 조제물에 존재하는 항원의 양과 일치한다.

표 6: 본 발명에 따른 조제물과 상업적으로 구입가능한 펜타글로빈에서의 IgM의 항세균 결합 활성 비교

파라미터	단위	본 발명의 IgM 조제물, 평균	상업 제품 펜타글로빈, 평균
뉴모코커스 사타라이드에 대한 IgM 항체	U/mg IgM	72	21
에스케리치아 콜라이에 대한 IgM 항체	U/mg IgM	62	39
엔테로코커스 패칼리스에 대한 IgM 항체	U/mg IgM	69	27
칸디다 알비칸스에 대한 IgM 항체	U/mg IgM	61	41
클라미디아에 대한 IgM 항체	U/mg IgM	71	6

표 7: 본 발명에 따른 조제물과 상업적으로 구입가능한 펜타글로빈에서의 IgA의 항세균 결합 활성 비교

파라미터	단위	본 발명의 IgM 조제물, 평균	상업 제품 펜타글로빈, 평균
뉴모코커스 사타라이드에 대한 IgA 항체	U/mg IgA	86	25
에스케리치아 콜라이에 대한 IgA 항체	U/mg IgA	83	26
엔테로코커스 패칼리스에 대한 IgA 항체	U/mg IgA	93	21
클라미디아에 대한 IgA 항체	U/mg IgA	65	38
헬리코박터 필로리에 대한 IgA 항체	U/mg IgA	59	24

새로운 조제물의 IgM 및 IgA 매개 활성은 전형적으로 펜타글로빈의 적어도 1.5배로 높은 수준이었으며, 이는 펜타글로빈의 IgM 및 IgA가 β-프로피오락톤에 의해 화학적으로 변형된다는 점으로 해명된다. 이 단계가 본 발명에 따른 보다 온화한 공정으로 치환된다.

전체적으로 이들 데이타는, 최종 조성물내 IgM의 결합 영역이 기능적으로 완전히 활발하게 작용한다는 것을 입증해준다.

실시예 8: 액체 IgM 산물을 이용한 저장 안정성 실험

UVC를 처리하지 않은 실시예 1에 따른 산물을 2 - 8℃에서 10 또는 100 ml 유리 바이얼 (충전 부피 5 ml 또는 50 ml)에서 저장하여, 상세 내용에 따른 모든 파라미터들을 분석하였다. 그 결과는 표 8에 나타낸다. 안정성 표시와 관련된 파라미터는 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC), 단백질 분해 활성 (PA) 및 항-보체 활성 (ACA)으로 측정되는 응집체(aggregate)와 단편(fragment)의 함량이다. 이들 파라미터는 정맥내 허용성에 중요하며, 장기간 저장하는 동안에 변할 가능성이 높다. 2-8℃에서, 이들 파라미터에 유의한 변화는 없었다. 실온 (23 - 27℃)에서 보관하더라도, 이들 수치들은 실온에서 24시간 저장한 후 단편이 약간 증가하였을 뿐, 지정된 범위내로 유지되었다. 발색, 유백광, pH 값과 같은 기타 파라미터도 측정하였으며, 전체 실험하는 기간 동안 변화없이 유지되었다. 다양한 박테리아에 대한 IgM 및 IgA 역가들은 2-8℃에서 2년간 안정적으로 유지되었다.

UVC를 처리한 실시예 1에 따른 산물도 2 - 8℃ 및 실온에서 10 또는 100 ml 유리 바이얼 (충전 부피 5 ml 또는 50 ml)에서 저장하였고, 상술된 사항에 따라 모든 파라미터들을 분석하였다. 그 결과는 표 9에 나타낸다. 이러한 계속적인 안정성 실험에서, 현재 이용가능한 12개월 데이타가 UVC 처리하지 않은 제품과 동일한 안정성 프로파일을 나타내어, 24개월 안정성의 외삽으로 구할 수 있다.

표 8: 2-8℃에서 테스트한 배치 A586067의 안정성 라이닝 포지션(lying position)의 충전 크기: 5 ml

검사한 파라미터	요건 (허용성)	보관 개월 수 2-8 ℃							23-27℃
검사한 파라미터	요건 (허용성)	0	3	6	9	12	18	24	24
단백질 (g/l)	45-55	50.3	51.4	50.3	50.4	50.5	49.6	50.8	49.8
HPSEC 응집체 % > 1200 kD 단편 % < 100 kD	≤ 5 ≤ 5	0.9 0.2	0.6 0.6	0.5 1.1	0.8 0.7	0.6 1.6	1.0 0.9	1.3 1.2	1.7 4.1
단백질 분해 활성 (U/l)	< 8	< 8	< 8	< 8	n.t.	< 8	n.t.	< 8	< 8
면역글로불린 함량 (%)	> 95 %	96.7	99.0	100	n.t.	99.5	n.t.	98.4	97.5
IgM 함량	≥ 20 %	21.6	22.1	22.1	n.t.	22.3	n.t.	20.9	20.5
항-보체 활성 CH50/mg 단백질	≤ 1.0	0.48	0.56	0.48	0.66	0.70	0.64	0.54	0.38

n.t. = 검사 안함

표 9: 2-8℃에서 테스트한 배치 A586057의 안정성 라이닝 포지션의 충전 크기: 50 ml

검사한 파라미터	요건 (허용성)	보관 개월 수 2-8 ℃							23-27℃
검사한 파라미터	요건 (허용성)	0	3	6	9	12	18	24	24
단백질 (g/l)	45-55	50.2	50.8	49.7	50.4	50.3	49.4	50.3	49.7
HPSEC 응집체 % > 1200 kD 단편 % < 100 kD	≤ 5 ≤ 5	0.9 0.3	0.5 0.6	0.4 1.0	0.8 0.9	0.6 1.4	1.0 1.2	1.3 1.2	1.5 4.2
단백질 분해 활성 (U/l)	< 8	< 8	< 8	< 8	n.t.	< 8	n.t.	< 8	< 8
면역글로불린 함량 (%)	> 95 %	98.6	98.9	100	n.t.	99.5	n.t.	98.5	98.0
IgM 함량	≥ 20 %	21.3	22.3	24.5	n.t.	22.0	n.t.	20.9	20.1
항-보체 활성 CH50/mg 단백질	≤ 1.0	0.48	0.82	0.52	0.64	0.68	0.48	0.60	0.40

실시예 9: IgM 산물을 이용한 시험관내 비특이적인 보체 활성화

실시예 9A - C5a 수준 결정

IgM 조제물이 시험관내에서 비특이적으로 보체를 활성화시킬 가능성을 최종 보체 경로 활성화의 마커로서 인자 C5a를 이용하여 분석하였다. 이를 위해, 인간 혈청을 120분간 면역글로불린 산물 또는 완충액과 인큐베이션하였다. 인큐베이션하면서, 0, 5, 15, 60 및 120분 경과 시점에 샘플을 취하였다. 시험관내 시스템이 적절하게 작동하는지를 확인하기 위해, 보체 저해 뿐만 아니라 보체 시스템의 충분한 활성화를 확인하였다. 보체 인자의 농도는 상업적으로 구입가능한 효소 연계성 면역흡착 분석 (ELISA) 키트 (Quidel MicroVue C5a Plus EIA Kit; A025)를 이용하여 포토미터에서 광학 밀도 측정을 통해 측정하였다.

인간 혈청 (Quidel NHS; A113)을 37℃에서 신속하게 해동시킨 다음 즉시 얼음 위에 두었다. 각각의 하나의 샘플이 혈청을 포함하는 반응 배치 (100 ㎕)를 구성한다. 첨가제를 파이펫으로 첨가한 다음, 인간 혈청을 첨가하여 각 반응 배치에서 반응을 개시하였다.

어떠한 첨가제도 첨가되지 않은 인간 혈청을 블랜크로 사용하였으며, 이는 실험 계획에 따라 보체 활성화의 베이스라인이 되었다. 열처리하여 응집시킨 IgG (HAAG Quidel; A114; 1.3 ㎕)는, 시험관내 시스템의 반응성을 확인하기 위한 인간 혈청 보체의 강력한 활성인자로서 사용하였다. 전체 반응 시간과 실험 처리 기간 동안 보체의 활성화를 완전히 저해하기 위해, 인간 혈청에 EDTA (최종 농도 10 mM)를 첨가하였다. IgM 조제물, 펜타글로빈 (EP0013901) 및 EP0413187에 따른 IgM 조제물은 각 반응에서 IgM 농도를 1.72 mg/ml로 조정하였다. 음성 대조군으로서 동일한 부피의 각 제형화 완충액을 사용하였다.

안정화 용액 (Quidel 샘플 안정화제 A9576; 140 ㎕)을 첨가하여, 37℃에서 일정하게 교반하면서 0, 5, 15, 16 및 120분간 인큐베이션 한 후, 반응들을 모두 정지시켰다. 이후, 샘플을 희석시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 분석을 수행하였다. 실험은 독립적인 2세트로 수행하였고, 평균 값을 계산하였다. 결과는 표 10과 도 2에 나타낸다.

활성인자 (열처리에 의해 응집된 IgG)를 첨가하면, 15분 이내에 C5a가 크게 증가하는데, 이는 보체 활성화를 검출하는데 있어 시험관내 시스템이 민감하게 반응함을 의미한다. 저해제로서 EDTA를 첨가한 결과, 전체 인큐베이션 기간 동안 수치 변화가 없었으며, 이는 보체 활성화가 특이적이며, 샘플 취급 또는 제조로 인한 부작용이 아님을 의미한다. 37℃에서 인간 혈장을 인큐베이션하고, 이를 인공 표면에 노출시키면 블랜크 수준으로서 밝혀진 미세한 보체 활성화가 유도되었다.

EP0413187에 따른 IgM 비교 조제물은 60분 후 1000 ng/ml 이상으로 보체를 활성화시켰다 (표 10). 상업적으로 구입가능한 화학적으로 변형된 비교 조제물인 펜타글로빈(EP0013901)도, EP0413187 산물과 비교하여 절반 수준의 보체를 활성화시킬 수 있는 가능성이 있는 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 IgM 조제물을 처리한 혈청에서의 C5a의 농도는, 첨가제를 첨가하지 않은 혈청(블랜크) 또는 제형화 완충액 (300 mM 글리신, pH 4.3 또는 0.45 % NaCl/2.5% 글루코스, pH 6.8)을 처리한 혈청에서 측정되는 C5a 농도와 비슷하다. 즉, 본 발명에 따른 IgM 조제물내 면역글로불린은 인간 혈청에서의 시험관내 테스트 시스템에서 실질적으로 보체를 비특이적으로 활성화시키지 않는다.

표 10: IgM을 포함하는 면역글로불린을 처리한 인간 혈청에서 검출되는 평균 C5a 농도

시간 [분]	0	5	15	60	120
IgM 조제물 (본 발명) C5a [ng/ml]	23.8	42.0	110.5	162.0	150.8
펜타글로빈 (EP0013901) C5a [ng/ml]	46.4	55.4	329.2	460.9	653.5
EP0413187 산물 C5a [ng/ml]	21.1	149.5	423.2	1029.4	1084.2
대조군
블랜크 C5a [ng/ml]	22.3	30.7	66.2	149.5	168.1
활성인자 (IgG 폴리머) C5a [ng/ml]	19.4	897.6	3409.2	4536.1	4829.6
저해재 EDTA C5a [ng/ml]	25.9	22.3	25.5	23.8	27.5
제형화 완충액 IgM C5a [ng/ml]	19.8	35.5	101.2	112.8	173.4
제형화 완충액 펜타글로빈 C5a [ng/ml]	26.2	33.1	56.7	82.6	187.2

실시예 9B - C3a 수준 측정

IgM 조제물의 시험관내에서 비특이적으로 보체를 활성화시킬 가능성을 보체 경로 활성화의 마커로서 인자 C3a를 이용하여 분석하였다. 이를 위해, 인간 혈청을 120분간 면역글로불린 산물 또는 완충액과 인큐베이션하였다. 인큐베이션하면서, 0, 5, 15, 60 및 120분 경과 시점에 샘플을 취하였다. 시험관내 시스템이 적절하게 작동하는지를 확인하기 위해, 보체 저해 뿐만 아니라 보체 시스템의 충분한 활성화를 확인하였다. 보체 인자의 농도는 상업적으로 구입가능한 효소 연계성 면역흡착 분석 (ELISA) 키트 (Quidel MicroVue C3a Plus EIA Kit; A032)를 이용하여 포토미터에서 광학 밀도 측정을 통해 측정하였다.

어떠한 첨가제도 첨가되지 않은 인간 혈청을 블랜크로 사용하였으며, 이는 실험 계획에 따라 보체 활성화의 베이스라인이 되었다. 코브라 독 인자 (CVF Quidel; A600; 20 U/ml)는, 시험관내 시스템의 반응성을 확인하기 위한 인간 혈청 보체의 강력한 활성인자로서 사용하였다. 전체 반응 시간과 실험 처리 기간 동안 보체의 활성화를 완전히 저해하기 위해, 인간 혈청에 EDTA (최종 농도 10 mM)를 첨가하였다. IgM 조제물과 펜타글로빈 (EP0013901)은 각 반응에서 IgM 농도를 1.72 mg/ml로 조정하였다. 음성 대조군으로서 동일한 부피의 각 제형화 완충액을 사용하였다.

안정화 용액 (Quidel 샘플 안정화제 A9576; 140 ㎕)을 첨가하여, 37℃에서 일정하게 교반하면서 0, 5, 15, 16 및 120분간 인큐베이션 한 후, 반응들을 모두 정지시켰다. 이후, 샘플을 희석시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 분석을 수행하였다. 실험은 독립적인 2세트로 수행하였고, 평균 값을 계산하였다. 결과는 표 11과 도 3에 나타낸다.

활성인자 (CVF)를 첨가하면, 15분 이내에 C3a가 크게 증가하는데, 이는 보체 활성화를 검출하는데 있어 시험관내 시스템이 민감하게 반응함을 의미한다. 저해제로서 EDTA를 첨가한 결과, 전체 인큐베이션 기간 동안 수치 변화가 없었으며, 이는 보체 활성화가 샘플 취급 또는 제조로 인한 부작용이 아님을 의미한다. 37℃에서 인간 혈장을 인큐베이션하고, 이를 인공 표면에 노출시키면, 블랜크 수준으로서 밝혀진 미세한 보체 활성화가 유도되었다.

상업적으로 구입가능한 화학적으로 변형된 비교 조제물인 펜타글로빈(EP0013901)은 블랜크에 비해 3배 높은 C3a 활성화 가능성을 보여주었다.

본 발명에 따른 IgM 조제물을 처리한 혈청에서의 C3a의 농도는, 첨가제를 첨가하지 않은 혈청(블랜크) 또는 제형화 완충액 (300 mM 글리신, pH 4.3 또는 0.45 % NaCl/2.5% 글루코스, pH 6.8)을 처리한 혈청에서 측정되는 C3a 농도와 비슷하다. 즉, 본 발명에 따른 IgM 조제물내 면역글로불린은 인간 혈청에서의 시험관내 테스트 시스템에서 실질적으로 보체를 비특이적으로 활성화시키지 않는다.

표 11: IgM을 포함하는 면역글로불린을 처리한 인간 혈청에서 검출되는 평균 C3a 농도

시간 [분]	0	5	15	60	120
IgM 조제물 (본 발명) C3a [ng/ml]	1458.3	2484.1	3972.1	5280.7	5703.1
펜타글로빈 (EP0013901) C3a [ng/ml]	1371.9	3069.4	7585.9	10225.4	11769.5
대조군
블랜크 C3a [ng/ml]	1301.1	1742.6	2468.7	3361	4117.4
활성인자 (CVF) C3a [ng/ml]	1194.3	6077.1	12796.8	27679.1	27284.5
저해제 EDTA C3a [ng/ml]	1140.2	1098.0	1025.7	964.2	1004.8
제형화 완충액 IgM C3a [ng/ml]	1060.3	2262.3	2907.3	3480.7	4435.4
제형화 완충액 펜타글로빈 C3a [ng/ml]	1070.9	1965.8	3548.0	4008.1	5251.9

실시예 10: IgM 산물에 대한 생체내 실험

안전성과 허용성을 검증하기 위해, 5일간 정맥내 주입을 반복 수행한 후 동맥 혈압에 대한 IgM 조제물의 효과를 의식있는 8마리의 시노몰구스 원숭이를 대상으로 실험하였다. 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 IgM 조제물을 190 mg/IgM/kg/day의 용량으로 투여하였다. 상업적으로 구입가능한 정맥내 허용되는 IgM을 함유하는 조제물인 펜타글로빈은 비교 물질로서 몇마리 원숭이에게 투여하였다. 펜타글로빈을 동일한 IgM 용량이 투여되는 방식으로 투여하였다. 주입한 후, 투여가 허용되지 않는 수준의 비특이적인 보체 활성화와 연관되는지를 확인하기 위해, 혈압을 측정하였다. 0.9% NaCl로 대조군 용량을 면역글로불린 조제물을 투여하기 수시간 전에 동물에 투여하였다. 우측 대퇴 동맥을 통해 하부 복부 대동맥으로 압력 카테터를 삽입하여, 혈압을 측정하였다. 결과는 원격 측정에 의해 전송받았다.

IgM 조제물 (15 ml/kg/day)을 투여한 결과, 동맥 혈압 (평균, 수축기 및 이환기)에 거의 미세한 효과만 나타났다. 각각의 주입 후, 테스트전 수치 대비, 4시간까지의 차이는 4 mmHg을 넘지 않았다. 이러한 차이는 생물학적으로 관련없는 것으로 간주할 수 있다.

표 12a: IgM 조제물 투여 후 C3a 수준 [ng/ml]

	대조군 (0.9% NaCl, pH 4.5) C3a [ng/ml]	IgM 조제물 투여 C3a [ng/ml]
평균	229	240
SD	83	37
N	8	8

표 12b: 비교 조제물 펜타글로빈 투여 후 C3a 수준 [ng/ml]

	대조군 (0.9% NaCl, pH 6.8) C3a [ng/ml]	IgM 조제물 투여 C3a [ng/ml]
평균	204	263
SD	20	61
N	4	4

보체 경로의 비특이적인 활성화에 대한 마커로서 C3a 수준을 주입 후 취한 혈장 샘플에서 측정하였다. C3a 수준 [ng/ml]은 IgM 조제물 (15 mL/kgBW)의 투여시 매우 약간 증가하였으며, 상업적으로 구입가능한 비교 조제물인 펜타글로빈을 동일한 IgM 수준으로 사용하였을 때 보다는 훨씬 더 낮았다. 처리 후 약 6시간째에 혈액 채혈을 실시하였다.

IgM 조제물에 기인한 실질적인 독성 결과들은 없었으며, 펜타글로빈에서 관찰되지 않은 관련된 변화는 없었다. 펜타글로빈의 안전성은 다년간의 임상적인 실무에서 충분히 확립되었으므로, 이러한 변화가 어떠한 임상적인 문제가 되지 않는다고 결론내리는 것이 합리적이다.

또한, IgM 조제물의 우수한 허용성과 안전성을 24명의 건강한 남성과 여성 지원자를 대상으로 인간 I상 실험으로 검증하였다. 투여한 후 처음 4시간째에 수축기 혈압은, kg BW/d 당 IgM 조제물 91 - 274 mg을 0.5 ml/min으로 주입한 후, 평균 약 9 % (11.9 mmHg) 감소하였다.

이는 위약 0.9 % NaCl-용액 (9.4%, 11.7 mmHg)과 동일한 범위였다.

심각한 부작용은 보고되지 않았고, 비-중증 부작용 모두 자가 제어되었다. 아울러, PCT 측정에 의해 입증된 바와 같이, 감염성 물질이 전파된다는 증거는 없었다.

관련 질환에 대한 동물 모델을 대상으로 한 효능 실험의 유효성은, 인간 혈장으로부터 수득한 IgM 조제물의 면역원성과 사전형성된 Gal-항체로 인해, 제한된다. 그러나, 질병 치료에 있어서의 펜타글로빈의 사용에 관한 종래 지식과 본 발명의 방법에 의해 제조된 IgM 조제물의 항세균 항체 역가 (실시예 7에 기술됨)를 고려하면, IgM 조제물이 임상적으로 효과가 있다고 결론내릴 수 있다.

실시예 11: 항체 조제물의 Fc 영역의 기능 완전성(functional integrity)

본원에 기술된 방법에 따라 제조된 항체 조제물에서 항체의 Fc 영역의 기능적 완전성을, IgG 조제물에 대한 유럽 가이드라인 ICH S6 (CPMP/ICH/302/95)에 따라 현행 Ph. Eur. 방법 (2.7.9 면역글로불린의 Fc 기능 테스트 Eur. Ph. 현행 편집판, 2011년 4월)으로 분석하였다. 면역글로불린의 유럽 약전 모노그래프(01/2005:20709)는 면역글로불린의 Fc 기능에 대한 루벨라 항원을 이용한 테스트를 제시한다.

구체적으로, tanned group O 인간 적혈구에 루벨라 바이러스 항원를 부가하였다. 특정 부피의 항체 조제물을 항원으로 피복된 혈액 세포와 인큐베이션하였다. 여기에 기니아 피그 보체를 첨가하여, 혈액 세포의 보체에 의해 개시되는 세포 용해를 착수하였다. 이후 용혈 카이네틱스는 541 nm에서의 시간-의존적인 흡광도 변화를 통해 측정하였다. 평가는 시간 당 최대 흡광도 변화를 이용하여 수행하였다. 인간 면역글로불린 생물학적 비교: BRP 배치 3번을 비교로서 사용하였다.

항체 분자의 Fc 영역의 활성을 IgM을 포함하는 항체 조제물 배치 7개에서 측정하였으며, 이들 배치 모두 생물학적 비교 조제물 (BRP)에 대해 96.5 - 103.3%이었으며, 즉, IgM을 포함하는 항체 조제물의 기능성이 입증되었다.

Claims

인간에 대한 정맥내 투여용으로 적합한 안정한 항체 조제물로서,
상기 조제물은 IgG, IgA 및 항체 총량의 5 중량% 이상으로 IgM을 포함하며,
상기 조제물은 인간 혈장으로부터 제조되며,
상기 항체 조제물은 특이적인 보체 활성화 활성을 나타내며,
상기 항체 조제물은 비-외막형 바이러스 (non-enveloped virus)를 3 log₁₀보다 높은 수준으로 제거할 수 있는 처리 (process)에 의해 제조되며;
상기 항체 조제물은, 보체를 비-특이적으로 활성화하는 능력을 측정하는데 적합한 인간 혈청을 이용한 시험관내 분석에서, IgM 농도가 1.72 mg/ml로 조정되었을 때, (i) 분석 60분 후 C5a를 200 ng/ml 미만으로 생성시키거나, 또는 (ii) 분석 60분 후 C3a를 6000 ng/ml 미만으로 생성시키며,
상기 항체 조제물은 1200 kDa 이상의 응집체(aggregate)를 1.5% 미만 포함하는 것을 특징으로 하는, 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 항체의 총량에 대해 IgA를 5 중량% 보다 많이, IgG를 40 중량% 보다 많이 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 항체의 총량에 대해 IgM을 10 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 항체의 총량에 대해 IgM을 15 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 시험관내 혈청 분석에서, 인간 혈청 단독의 경우와 비교하여, 인간 혈청에 상기 항체 조제물을 첨가하는 경우에, C5a 또는 C3a의 생성 수준이 동일 수준 ± 70%인 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 상기 항체 조제물이 C5a를 200 ng/ml 미만으로 생성시키는 것을 확인하기 위한 상기 시험관내 혈청 분석은
(a) 상기 항체 조제물을 인간 혈청 100 ㎕에 첨가하여, IgM을 1.72 mg/ml로 포함하는 반응 혼합물을 제조하고, 이 반응 혼합물을 일정하게 교반하면서 60분간 37℃에서 인큐베이션하는 단계;
(b) ELISA에 적합한 상기 반응 혼합물의 희석액 세트를 제조하는 단계;
(c) C5a에 대한 1차 항체와 2차 항체 및 발색 물질을 이용하여, 상기 반응 혼합물의 희석액 세트에 대해 샌드위치 ELISA를 수행하는 단계로서, 상기 2차 항체는 효소가 접합된 것이고, 상기 발색 물질은 상기 효소의 기질인 것인 단계; 및
(d) 상기 2차 항체를 통해 C5a에 결합된 효소와 상기 발색 물질을 접촉시켜 발생되는 색 변화를 토대로, 상기 반응 혼합물내 C5a의 양을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 상기 항체 조제물이 C3a를 6000 ng/ml 미만으로 생성시키는 것을 확인하기 위한 상기 시험관내 혈청 분석은
(a) 상기 항체 조제물을 인간 혈청 100 ㎕에 첨가하여, IgM을 1.72 mg/ml로 포함하는 반응 혼합물을 제조하고, 이 반응 혼합물을 일정하게 교반하면서 60분간 37℃에서 인큐베이션하는 단계;
(b) ELISA에 적합한 상기 반응 혼합물의 희석액 세트를 제조하는 단계;
(c) C3a에 대한 1차 항체와 2차 항체 및 발색 물질을 이용하여, 상기 반응 혼합물의 희석액 세트에 대해 샌드위치 ELISA를 수행하는 단계로서, 상기 2차 항체는 효소가 접합된 것이고, 상기 발색 물질은 상기 효소의 기질인 것인 단계; 및
(d) 상기 2차 항체를 통해 C3a에 결합된 효소와 상기 발색 물질을 접촉시켜 발생되는 색 변화를 토대로, 상기 반응 혼합물내 C3a의 양을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서, 상기 조제물의 항-보체 활성(anti-complementary activity)이 1.0 CH50/(단백질)mg 미만인 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서,
(i) 상기 항체 조제물이 면역글로불린을 단백질 총량의 95% 보다 많이 포함하거나;
(ii) 상기 항체 조제물이 40℃ 이상에서 10분 이상 열처리하는 단계 없이 인간 혈청으로부터 제조되거나; 또는
(iii) 상기 항체 조제물이 항체를 화학적 변형 또는 효소학적 변형시키는 단계 없이 인간 혈청으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제9항에 있어서, 상기 항체 조제물이 항체를 β-프로피오락톤과 접촉시키는 단계인 화학적 변형 단계 없이 제조되는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서,
(a) 인간 혈장으로부터 면역글로불린을 포함하는 용액으로서 혈장 분획을 제조하는 단계;
(b) C₇ 내지 C₉의 카르복시산을 상기 용액과 혼합하고, 혼합한 용액을 진동 교반기(vibrating agitator)로 처리하여 오염 단백질을 침전시키는 단계;
(c) 상기 용액으로부터 침전된 단백질을 분리하여, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 수득하는 단계;
(d) 상기 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 pH 3.5 내지 pH 4.5에서 인큐베이션하여, 인큐베이션한 용액을 수득하는 단계;
(e) 상기 인큐베이션한 용액에 UVC를 조사하여, UVC 조사한 용액을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 UVC 조사한 용액을 무균 조건 하에 여과하여, 인간에 정맥내 투여하기 적합한 항체 조제물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 인간 혈장으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제11항에 있어서, 상기 방법은 단계 (d)에서 수득되는 상기 인큐베이션한 용액을 단계 (e)에서 조사하기 전에 나노여과(nanofiltration)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제1항에 있어서,
(i) 상기 항체 조제물은 동맥 혈압을 처리전 수준에 비해 감소율이 10% 보다 높지 않게 하면서 시노몰구스 원숭이에 115 mg IgM/(체중)kg/시간으로 투여할 수 있거나;
(ii) 상기 조제물내 90% 이상의 항체가 생물학적으로 활성이거나; 또는
(iii) Fc 기능을 결정하는데 적합한 시험관내 루벨라 항원을 이용한 분석에서, 상기 항체 조제물 내 항체의 Fc 영역의 활성이 생물학적 기준 조제물의 활성과 비교하여 동일 수준 ± 10% 수준인 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
안정한 항체 조제물로서,
항체의 총 양에 대한 퍼센트로서 IgM을 15% 이상으로, IgA를 5% 보다 높게, 그리고 IgG를 40% 보다 높게 포함하며,
고성능 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바에 따르면 1200 kDa 이상인 응집체를 면역글로불린의 총량에 대해 1.5% 미만으로 포함하는, 안정한 항체 조제물.
제14항에 있어서,
0.75 CH50/(단백질)mg 미만의 항-보체 활성을 가지며,
면역글로불린의 Fc 영역에 대한 유럽 약전 2.7.9. 검사에 의해 결정된 바에 따르면 조제물내 90% 이상의 항체가 생물학적으로 활성인 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제14항에 있어서, 비-외막형 바이러스가 없는, 안정한 항체 조제물.
인간 혈장으로부터 제1항에 따른 안정한 항체 조제물을 제조하는 방법으로서,
(a) 인간 혈장으로부터 면역글로불린을 포함하는 용액으로서 혈장 분획을 제조하는 단계;
(b) 상기 용액과 C₇ - C₉ 카르복시산을 혼합하고, 이 혼합 용액을 진동 교반기로 처리하여, 오염 단백질들을 침전시키는 단계;
(c) 상기 용액으로부터 침전된 단백질을 분리하여, IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 수득하는 단계;
(d) 상기 IgM을 포함하는 면역글로불린 조성물을 pH 3.5 내지 pH 4.5에서 인큐베이션하여, 인큐베이션한 용액을 수득하는 단계;
(e) 상기 인큐베이션한 용액에 UVC를 조사하여, UVC 조사한 용액을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 UVC 조사한 용액을 무균 조건하에 여과하여, 인간에게 정맥내 투여하기 적합한 안정한 항체 조제물을 수득하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 질환 또는 세균 감염증의 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
제18항에 있어서, 면역 질환이 IgM 결핍 장애(IgM deficiency disorder)인 것을 특징으로 하는 안정한 항체 조제물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제