JP2013530950A - 免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセス - Google Patents

Abstract

免疫グロブリンを含む血漿画分から免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセス、及び該プロセスを用いて調製される抗体調製物を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ウィルス安全性を有する免疫グロブリン調製物を調製するためのプロセス、及び該プロセスを用いて調製することができる抗体調製物及び医薬組成物に関する。

ヒト血漿から調製され、静脈内投与に適する免疫グロブリン組成物は、当技術分野において知られており、数十年間に亘って広範な疾患の治療において重要な役割を果たしてきた。免疫グロブリンは、例えば、ヒトの感染症の治療に用いられ、様々な生化学的及び生理学的性質に基づいて様々なクラスに分類することができる。免疫グロブリンＧは、ウイルス抗原に対する防御に関与し、一方、ＩｇＭは、抗細菌及び抗毒素免疫反応において主たる活性を有する。

免疫グロブリン溶液は、様々な割合のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを含み、これらの割合が異なる調製物は、その治療適応も異なる。例えば、高割合のＩｇＭを含む調製物は、細菌感染症の予防又は治療に用いられる。ＩｇＧ調製物とは対照的に、ＩｇＭ抗体は溶液中で容易に凝集する。特に、ＩｇＭ抗体が血漿濃度に比べて富化されており、液体溶液として保存される場合、ＩｇＭ調製物を安定化させることは困難である。

免疫グロブリン溶液は、通常、血漿又は血清の画分、例えば、Ｃｏｈｎ画分から調製される。次いで、これら画分は、多数の精製工程に付されて、ウイルス、変性タンパク質、プロテアーゼ、及び脂質等の混入物が除去される。分画するためのヒト血漿は、数千人のドナーから回収されるので、元血漿を徹底的に試験しているにも関わらず、病原ウイルスを含有している場合がある。したがって、医療で使用するための安全な製品を得るためには、ウイルスを不活化又は除去するためのプロセス工程が必須である。ウイルスを不活化／除去するための幾つかの技術が、当技術分野において知られている。例えば、化学的処理、ＵＶＣ光の照射、又はナノ濾過であり、これらは、全体的なウイルス安全性を保証するために実施される。しかしながら、このような工程は、免疫グロブリンの活性にネガティブな影響を及ぼし得る。例えば、長時間のＵＶＣ照射は、最終産物である免疫グロブリン溶液中に得られるネイティブで活性のあるＩｇＭの収量を低減する場合がある。

前記プロセス工程のウイルス除去能又は不活化能は、生産プロセスの実験室規模のモデルを用いて検証され、各工程について、除去又は不活化係数が求められる。不活化／除去係数を増加させることにより、更なるウイルス安全性が医薬品に付加される。今日、規制機関による指針では、血漿に由来する医薬品の製造において、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに対する少なくとも２つの有効な工程を実施することが必要である。

十分な忍容性を有する製品を得るためには、潜在的に存在するウイルスに加えて、プロテアーゼ、タンパク質凝集体、及び変性免疫グロブリン等の他の混入物を除去する必要もある。特に変性免疫グロブリンは、補体を非特異的に活性化させる能力が高く、これら変性免疫グロブリンを投与されている患者に重篤な副作用をもたらすので、患者にとって潜在的なリスクである。この抗補体活性（ＡＣＡ）は、欧州薬局方に記載されている標準化試験により測定される。

これらのあらゆる混入物を除去することは、（１）製品が、静脈内投与後患者にとって忍容性を有するようにするため、（２）製品が、ウイルスの混入に関する生物学的安全性の指針に準拠することを保証するため、（３）製品が、長期保存に対し安定であるようにするため、及び（４）望ましい化合物混合物／医薬組成物を得るために、必須である。

ヒトＩｇＭ溶液の初期における精製は、古典的なＣｏｈｎ血漿分画法又はそのよく知られた改良法（例えば、Ｃｏｈｎ／Ｏｎｃｌｅｙ、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）により実施されている。低温エタノール沈殿プロセスを用いると、ＩｇＭ画分は、画分ＩＩＩ又は画分Ｉ／ＩＩＩ（Ｂ又はＢ＋Ｉとも呼ばれる）に回収される。ＩｇＭが富化されたタンパク質溶液を精製するために、画分ＩＩＩ又は画分Ｉ／ＩＩＩから出発する方法が報告されている。特許文献１には、オクタン酸、β−プロピオラクトン処理を用いる工程と、陰イオン交換樹脂を用いる吸着工程とを含む画分ＩＩＩから出発する精製方法が記載されている。この方法を用いてＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ（登録商標）が製造される。Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎは、今日まで、唯一市販されている静脈内投与用ＩｇＭ製品である。特許文献２は、陰イオン交換クロマトグラフィー、β−プロピオラクトン、ＵＶＣ光照射、及び高温（４０℃〜６０℃）におけるインキュベート工程を用いることにより抗補体活性が低下した静脈内投与用ＩｇＭ濃縮物の調製について記載している。β−プロピオラクトンは、存在する可能性のあるウイルスを不活化するために殺菌工程で用いられるよく知られた化学物質である。β−プロピオラクトンは、タンパク質の化学修飾を引き起こす非常に反応性の高い物質であるので、免疫グロブリンの抗ウイルス活性及び抗細菌活性もかなり失われる。この方法により製造される調製物は、化学修飾されているので液体溶液中で安定である時間は限られていた。ＩｇＭ濃度は、総免疫グロブリン含量の５０％超であった。

β−プロピオラクトンで化学修飾されていないＩｇＭ富化タンパク質溶液の調製について、特許文献３及び４に記載されている。これらの方法は、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩ又は画分ＩＩ／ＩＩＩから出発して、好適なタンパク質溶液をオクタン酸処理及び陰イオン交換クロマトグラフィーに付すことを含む。特許文献４では、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩ中に存在する脂質を除去するために、１５分間撹拌することによりオクタン酸処理が実施される。

多量の免疫グロブリンを患者に静脈内投与するので、忍容性のある医薬調製物を達成しなければならない。ＩｇＭ調製物は、これまで静脈内用途用に調製することが困難であるとして記述されてきた。ＩｇＭは、元来、抗原と結合して補体の強力な活性化剤となる。したがって、変性ＩｇＭ分子の非特異的抗補体活性は、変性ＩｇＧ分子の場合よりも患者にとって遥かに危険である。特許文献３に係る調製物は、０．６ＣＨ５０／ｍｇタンパク質〜０．８ＣＨ５０／ｍｇタンパク質という低い抗補体活性を有していたが、安定化及びβ−プロピオラクトンによるウイルスの不活化を行わなければならなかった。低い抗補体活性とは、免疫グロブリンに関するＥＰモノグラフに従って１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質以下であるとみなす。

特許文献４には、抗補体活性を低下させるために、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることによる静脈内投与用ＩｇＭ富化調製物の調製について記載されている。更に、４０℃〜６０℃、好ましくは５０℃〜５４℃にてｐＨ４〜ｐＨ４．５で熱処理すると抗補体活性が低下することが記載されている。この調製物は、数ヶ月間調製物の安定性を確保するために凍結乾燥させなければならなかった。液体溶液として長期安定性を有することについて示すことはできなかった。

４０℃〜６２℃、好ましくは４５℃〜５５℃で、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０にてＩｇＭ調製物を穏やかに熱処理して、非特異的な補体活性化を減少させる別の方法が記載されている（特許文献５）。この特許出願では、プレカリクレインアクチベータ及びリポタンパク質を遠心分離により除去するために、オクタン酸をＣｏｈｎ画分ＩＩＩ懸濁液に添加する。しかし、この処理でもＩｇＭの抗原決定基が一部失われる。これによって、新生抗原が生じるリスクが増し、ヒトにおける免疫原性の上昇又は活性の喪失が導かれる場合もある。

オクタン酸沈殿工程後にプロテアーゼ処理（例えば、ペプシン処理）を行うことによる静脈内投与用ＩｇＭ含有タンパク質溶液の調製が、特許文献６に記載されている。プロテアーゼ処理により、免疫グロブリン分子が部分的に断片化され、Ｆａｂ及びＦｃ部分の全体的な機能活性が低下する。したがって、プロテアーゼ処理された免疫グロブリンは、修飾されていないとみなすことはできない。また、この調製方法では、分子量１００ｋＤ未満の断片が約５％生じる。

オクタン酸処理を実施するための知られた方法（特許文献３及び６）は、非エンベロープウイルスの除去及び不活化に対してオクタン酸処理が有効ではなく、また、全てのタンパク質分解活性を実質的に除去するものではないという問題点を有する。

特許文献７には、治療用途のための少なくとも３３％のＩｇＭを含む高濃度ＩｇＭ調製物が開示されており、前記調製物は、同種凝集素力価を実質的に有しない。この特許出願では、オクタン酸を添加することによりオクタン酸沈殿が実施され、同種凝集素は、Ｓｙｎｓｏｒｂアフィニティクロマトグラフィーにより除去される。最終調製物は、凍結乾燥させる必要があった。

総じて、免疫グロブリンが化学的に若しくは酵素的に修飾されている、クロマトグラフィーにより更に精製される、及び穏やかな熱処理に付される、のうちの少なくとも１つにより、抗補体活性の低いＩｇＭ含有調製物の調製が可能である。

それにもかかわらず、修飾されていない免疫グロブリン調製物に関する先行技術の方法は、潜在的に存在するあらゆるウィルスのためのウィルス不活化能を達成することはできない。エンベロープウイルスの不活化又は除去には、溶剤／界面活性剤処理、オクタン酸処理、ナノ濾過、及び熱処理等の幾つかの方法が有効であるが、例えば、パルボウイルス等の非エンベロープウイルスを不活化又は除去するための方法は、僅かしか知られていない。これら非エンベロープウイルスは、多くの場合非常に小さく、通常２０ｎｍ超の孔径のナノフィルタを通過する。この孔径は、３０ｎｍ以下の直径を有するＩｇＭ分子には小さすぎる。非エンベロープウイルスは、β−プロピオラクトン等の化学物質により有効に不活化されるが、機能の低下した修飾免疫グロブリンも生じさせる。別の有効な処理は、ＵＶＣ照射（特許文献８、ＣＡＦ−ＤＣＦ）である。しかし、知られた溶剤／界面活性剤処理、オクタン酸処理、及び穏やかな熱処理は、非エンベロープウイルスに対して実質的に効果を有しない。

したがって、先行技術の方法によって調製され且つ抗補体活性が低下した化学的に修飾されていないＩｇＭ含有調製物はいずれも、パルボウィルスなど非エンベロープウィルスに関して、ヒトへの使用において安全なものではない。

要約すると、静脈内用途に忍容なＩｇＭ含有調製物を得る先行技術の方法は、例えば、効果的に非エンベロープウィルスを不活化又は除去することができない、高量のＩｇＭを溶液中に維持しながらタンパク質分解活性を取り除く能力に制限がある、などの問題点を有する（タンパク質分解活性は、調製物中に存在しているプロテアーゼの合計量を意味する）。液体タンパク質調製物は、長期間（例えば、２年間）安定である必要があるので、医薬組成物の分解を引き起こし得る残存プロテアーゼ活性を取り除かなくてはならない。

したがって、本発明の目的は、これらの問題点に対処することにある。

欧州特許第００１３９０１号明細書 欧州特許第０３５２５００号明細書 欧州特許第０４１３１８７号明細書（Ｂｉｏｔｅｓｔ） 欧州特許第０４１３１８８号明細書（Ｂｉｏｔｅｓｔ） 欧州特許第０４５０４１２号明細書（Ｍｉｌｅｓ） 欧州特許第０８３５８８０号明細書（米国特許第６１３６３１２号明細書、ＺＬＢ） 欧州特許第０３４５５４３号明細書（Ｂａｙｅｒ、Ｍｉｌｅｓ） 欧州特許第１８４２５６１号明細書

Ｍ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．"Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ"，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ２３，１１９−１２５（１９７２）

第１の態様において、本発明は、免疫グロブリンを含む血漿画分からＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセスであって、
（ａ）血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として準備する工程；
（ｂ）Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸を前記溶液と混合し、該混合溶液を振動式撹拌機で処理して混入タンパク質を沈殿させる工程；
（ｃ）沈殿した前記タンパク質を前記溶液から分離してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る工程、
を含むプロセスを提供する。

驚くべきことに本出願人らは、免疫グロブリン溶液をカルボン酸と混合する工程における振動式撹拌機の使用が、非常に有利であることを見出した。該工程により、望ましくないタンパク質（プロテアーゼなど）がより効率的に除去され、免疫グロブリン製剤を製造するために行われる下流の処理工程により適した中間生成物が得られる。即ち、該中間生成物は、これら下流の処理工程をより効率的にする。特に、工程（ｃ）で得られるＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物は、穏やかな酸性条件での処理、ＵＶＣ照射による処理などの更なる処理工程に付すことができ、これにより、静脈内投与に適した、次の有利な性質、（ｉ）化学的に修飾されていないこと；（ｉｉ）ウィルス安全性を有すること；（ｉｉｉ）タンパク質分解活性が低いこと（そのため、長期保存安定性を有すること）；（ｉｖ）抗補体活性が低いこと；（ｖ）ネイティブで活性のあるＩｇＭを高レベルに維持すること、という性質を有するＩｇＭ含有免疫グロブリン製品又は抗体調製物が製造される。本明細書に記載の方法で達成されるウィルス安全性のレベルは、これまで得られることができなかったレベルである。更に、本発明の方法を用いることにより、これまで得ることができなかった、これら特徴を組合わせて有するＩｇＭ含有免疫グロブリン製品又は抗体調製物が得られる。

特に、本発明の方法の工程は、ウィルス粒子の不活化率及び除去率をより高め、特にパルボウィルスなどの耐性の高い非エンベロープウィルスの不活化率及び除去率を高める。これらのウィルスは、通常、オクタン酸処理に対する感受性があまりない。更に、従来の撹拌に比べて、タンパク質分解活性をよりよく取り除くことができる。これらの特徴は、化学的に修飾されていないＩｇＭの量を高く維持しながら達成される。この知見は、オクタン酸による処理は、非エンベロープウィルスに対して有効な工程ではなく、ウィルス安全性を改善するためには、β−プロピオラクトン処理などのより過酷な方法でウィルスを不活化しなければならないという従来の見解と対照的である。また、タンパク質分解活性を完全に取り除くために例えばオクタン酸濃度を上げることが、多量のＩｇＭを失うことになることは、よく知られていた。

本発明のこのような結果は、オクタン酸処理と組合わせて振動式の混合装置を使用することで達成される。ＩｇＭは、不所望の高い抗補体活性をもたらし得るせん断応力に対して感受性が非常に高いことが知られているので、この事実は、特に驚くべきことである。したがって、ＩｇＭ組成物を調製するために振動式混合機を用いることは、誰も考えないであろうし、ＩｇＭ含有溶液の処理に振動式混合機を用いることでこのような望ましい影響を期待する者もないであろう。

更に、本発明の方法において、工程（ｂ）で得られるオクタン酸処理済溶液の濾過による清澄化などの工程（ｃ）で達成される分離は、振動式混合装置を用いることで向上する。分離がより容易に達成されると、処理時間が短縮され製造コストが低減する。工程（ｃ）により、下流の処理に有利な透明溶液が得られる。オクタン酸処理済ＩｇＭ含有溶液を撹拌し濾過して得られる従来の溶液は、乳白色又は不透明である。

工程（ｃ）で得られるＩｇＭ含有組成物は、穏やかな酸性条件（例えば、ｐＨ４）での処理及びＵＶＣ照射工程に付して、ウィルス安全性を更に高めると共に最終産物を安定化させることが好ましい。工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物の清澄度を高めることにより、３ｌｏｇ_１０超又は４ｌｏｇ_１０超の非エンベロープウィルスを不活化するために必要なＵＶＣ照射時間を短縮することが可能である。これにより、ＵＶＣ処理後のネイティブで活性のあるＩｇＭの量がより多くなる。

驚くべきことに、これらの工程により、ネイティブで活性のあるＩｇＭが高量であり、抗補体活性が低く、タンパク質分解活性が低く、抗菌活性及び抗ウィルス活性が高く、静脈内投与用の医薬にとって重要な特徴であるエンベロープウィルス及び非エンベロープウィルスに関する顕著なウィルス安全性を有する、化学的にも酵素的にも修飾されていないＩｇＭ含有溶液が得られる。更に、処理されたＩｇＭ含有溶液は、改善された長期安定性を有し、２℃〜８℃で１２ヶ月間を超える期間、溶液として非常に安定である。

したがって、更なる態様において本発明は、上述の本発明のプロセスで得られる抗体調製物、及びタンパク質分解活性が８Ｕ／Ｌ未満であるＩｇＭ含有抗体調製物を提供する。特に、前記抗体調製物は、ヒトにおける静脈内投与に適しており、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを含み、免疫グロブリンの総量の少なくとも５％がＩｇＭである。

更に本発明は、医薬において使用するための本発明の抗体調製物を提供する。一実施形態においては、前記抗体調製物は、免疫障害又は細菌感染症の治療において使用される。

更なる態様において、本発明は、本発明の抗体調製物を投与することを含む患者の治療方法を提供する。

添付の図面を参照して、本発明をより詳細に説明するが、以下の説明はほんの１例に過ぎない。

図１は、本発明に係る静脈内投与に適した抗体調製物を得るために用いることができる各工程を示す本発明の一実施形態の概要である。このうち、振動式混合機を用いるオクタン酸処理、ｐＨ４処理、及びＵＶＣ処理がハイライトされている。出発材料は、ヒト血漿の標準的な低温エタノール沈殿プロセスにより得られる。

上述したように、本発明は、免疫グロブリンを含む血漿画分からＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセスを提供する。免疫グロブリン医薬組成物の調製に適した血漿画分及びそれらの製造方法は当技術分野においてよく知られている。特に、前記免疫グロブリン医薬組成物がヒトに投与するためのものである場合には、前記血漿画分は、ヒト血漿から得られる。前記血漿画分は、沈殿した血漿画分が好ましく、Ｃｏｈｎ分画法又はそのよく知られた改良法（例えば、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）のプロセスにより得られた沈殿血漿画分が最も好ましい。前記画分は、低温エタノール分画法により得られる画分Ｉ／ＩＩＩ又は画分ＩＩＩ（画分Ｂ＋Ｉ又は画分Ｂとしても知られる）が最も好ましい。前記血漿画分の免疫グロブリンは、少なくとも５％のＩｇＭを含むことが好ましい。

工程（ａ）は、血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として準備することを含む。多くの場合、免疫グロブリンの含有する血漿画分は、固体又は半固体の形態となる。したがって、この工程の目的は、前記血漿画分のタンパク質を確実に工程（ｂ）におけるカルボン酸との混合に適した状態にする、又はそのような状態になるように前記血漿画分のタンパク質を溶液状にすることである。この工程は、血漿画分を好適なバッファと混合することを含んでいてもよい。バッファのモル濃度は低いことが好ましく（即ち、１Ｍ未満）、ｐＨは４．５〜５．５であることが好ましい（例えば、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ５．０５±０．１）。混合は、ブレードミキサー又は振動式撹拌機を用いて完了させることができる。

工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた溶液をＣ_７〜Ｃ_９カルボン酸と振動式撹拌機を用いて混合し、混入タンパク質（例えば、プロテアーゼ、ウィルスなど）を沈殿させる。前記カルボン酸は、分岐していてもよいし、工程（ｂ）の効果を実質的に変えることがない置換基を有していてもよいし、分岐しており且つそのような置換基を有していてもよい。前記カルボン酸は、オクタン酸が好ましい。前記カルボン酸は、少なくとも０．０７５ｋｇ／ｋｇ血漿画分の濃度、多くても０．２ｋｇ／ｋｇ血漿画分の濃度で添加されることが好ましい。前記カルボン酸は、０．８ｋｇ／ｋｇ血漿画分〜０．１５ｋｇ／ｋｇ血漿画分で添加されることがより好ましく、０．０９ｋｇ／ｋｇ血漿画分〜０．１３ｋｇ／ｋｇ血漿画分で添加されることが最も好ましい。酸のモル濃度を適宜調整するで正確な濃度にすることができる。

振動式撹拌機は、化学品／医薬品業界での使用に好適ないかなる種類の市販の振動式撹拌機も用いることができる。好適な振動式撹拌機としては、例えば、Ｇｒａｂｅｒ＋Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ有限会社から市販されている。特に、「Ｌａｂｏｒｍｏｄｅｌｌ Ｔｙｐ １」振動式混合機は実験室規模の実験に用いることができ、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｍｉｘｅｒ Ｔｙｐ ４」は生産規模の調製に用いることができる。前記振動式混合機は、製造業者の説明書に従って、特にタンパク質を含有する溶液の混合に好適であるとして製造業者によって記載されている設定で用いることができる。前記振動式混合機は、通常、１００Ｈｚ未満、振幅１０ｍｍ未満で運転させることができる。例えば、本発明者らは、「Ｌａｂｏｒｍｏｄｅｌｌ Ｔｙｐ １」を用いる実験室規模での振動混合を、２３０Ｖ電源を用いる場合には、５０Ｈｚで行った。前記混合プロセスの振動振幅は、０ｍｍ〜３ｍｍとし、ＩｇＭ調製物の場合には、好ましい振幅である３ｍｍとした。直径２３ｍｍ〜６５ｍｍの撹拌プレートを実験室規模の実験に用いた。生産規模では、直径３９５ｍｍの撹拌プレートを用いた（孔径：１３．５ｍｍ〜１６ｍｍ）。

工程（ｂ）においては、混合溶液のｐＨは、４．５〜５．５が好ましく、４．８〜５．３がより好ましい。この工程は、酢酸ナトリウムバッファ中で行うことができ、例えば、約０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファが用いられる。工程（ｂ）を行う際の温度は、１０℃〜３５℃が好ましく、１４℃〜３０℃がより好ましい。

振動式撹拌機による混合時間は、特に限定されないが、少なくとも３０分間〜最長３時間であることが好ましく、４０分間〜１１０分間であることがより好ましい。インキュベーション時間が３０分間未満であると、ウィルスの不活化レベルが低下することがある。

工程（ｂ）の一実施形態においては、リン酸三カルシウムを工程（ｂ）における前記溶液と混合する。これは、０．０１ｋｇ／ｋｇ血漿画分〜０．０２ｋｇ／ｋｇ血漿画分で添加されることが好ましい（リン酸三カルシウムは、固体又は半固体の形態であるので）。リン酸三カルシウムは、カルボン酸と同時に、別々に又は順次添加することができる。好ましい実施形態においては、リン酸三カルシウムは、カルボン酸の添加後少なくとも２０分間の間に添加される。

工程（ｃ）では、工程（ｂ）で沈殿させた混入タンパク質を前記溶媒から分離除去してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る（即ち、免疫グロブリン含有溶液）。この分離工程は、特に限定されず、当技術分野で知られたいかなる好適な方法によっても行うことができる。しかしながら、前記分離工程は、濾過により行うことが好ましく、限外濾過により行うことがより好ましい。したがって、工程（ｃ）の結果物は、濾過溶液である。

上述したように、本発明の方法は、混入タンパク質をより効率的に沈殿させ、その結果、工程（ｃ）が実施し易くなるので、製造効率の点で有利である。工程（ｂ）の結果得られる混合物を分離すると、透明で清澄な溶液、即ち、ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物が得られる。したがって、濾過は、より迅速且つより容易になる。

後続の処理工程は、工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を静脈内投与に適した免疫グロブリン調製物にするために必要である。

したがって、好ましい実施形態においては、本発明のプロセスは、工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を穏やかな酸性条件で処理する更なる工程、また、酸処理済組成物をＵＶＣ照射に付す更なる工程を含む。

穏やかな酸性条件での処理のために、工程（ｃ）で得られた前記ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物をｐＨ３．５〜ｐＨ４．５、好ましくはｐＨ３．８〜ｐＨ４．２でインキュベートして、インキュベート溶液を得る。穏やかな酸性条件は、好適な酸をＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物に添加することにより達成できる。例えば、０．２Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨを調整することができる。

このインキュベーション工程は、３２℃〜４２℃で行うことが好ましく、３５℃〜３９℃で行うことがより好ましい。インキュベーション時間は、少なくとも２時間〜最長２４時間であることが好ましく、少なくとも９時間〜最長１６時間であることがより好ましい。

前記照射工程では、上述の穏やかな酸処理により得られたインキュベート溶液をＵＶＣ光で処理してＵＶＣ照射溶液を得る。この工程は、ＵＶｉｖａｔｅｃ（登録商標）装置（Ｂａｙｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）などの市販の装置を用いて行うことができる。潜在的に存在するウィルス及びプロテアーゼを更に不活化するためには、前記インキュベート溶液は、２５４ｎｍ±１０ｎｍで２００Ｊ／ｍ^２〜５００Ｊ／ｍ^２、より好ましくは２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２で処理することが好ましい。なお、通常必要とされるよりも穏やかな条件でのＵＶＣ処理は、振動撹拌によるオクタン酸処理後に本発明によって得られる清澄な濾液で初めて可能となる。標準的な撹拌技術で通常得られる、より乳白色又は不透明な溶液の場合には、照射時間をより長くする必要があり、ＩｇＭ活性の変性を促進すると共にウィルス不活化率を低下させ得る。

前記穏やかな酸処理及びＵＶＣ照射のほかに、静脈内投与用の免疫グロブリン調製物を得るための追加の工程として、一回以上の濾過工程を任意に行うことができる。一実施形態においては、処理されるタンパク質溶液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）に吸着させた後、深層濾過によりＳｅｐｈａｄｅｘから分離することができる。望ましくない付随タンパク質であるセルロプラスミンを除去するために、例えば、タンパク質溶液を７５ｍｇ／ｋｇＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ｐＨ５．８でバッチ式吸着に更に付してもよい。

特に好ましい実施形態においては、ＵＶＣ照射処理に先立ち、穏やかな酸処理により得られたインキュベート溶液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘに吸着させ、深層濾過により前記Ｓｅｐｈａｄｅｘから分離する。

他の実施形態においては、処理される免疫グロブリン溶液をナノメートルフィルタで濾過してもよい。孔径７５ｎｍ±５ｎｍ〜３５ｎｍ±５ｎｍのフィルタ、又は公称孔径７５ｎｍ〜３５ｎｍのフィルタ（例えば、Ｐａｌｌ社製、Ｕｌｔｉｐｏｒ（登録商標）ＤＶ５０）を前記プロセス中の各段階で用いることができる（例えば、公称孔径５０ｎｍは、５０ｎｍ以上の大きさのウィルスに対して保持率４ｌｏｇ_１０以上であることを意味する）。好ましい実施形態においては、上記段落に記載したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ工程から得られた溶液を、ＵＶＣ照射に先立ち０．２μｍフィルタで濾過する。更に好ましい実施形態においては、ＵＶＣ照射後に得られた免疫グロブリン溶液をナノ濾過、好ましくは孔径４０ｎｍ〜５０ｎｍのフィルタを用いるナノ濾過に付す。この工程は、滅菌条件下で行われることが好ましい。

上に定義したプロセスにより得られた最終抗体調製物（即ち、処理されたＩｇＭ含有免疫グロブリン溶液）は、滅菌条件下でそのまま容器に充填してもよい。或いは、前記抗体調製物は、グリシンなどの安定化剤と共に製剤化してもよい。特に、前記調製物は、ｐＨ４〜ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ４．１〜ｐＨ４．５でグリシン含有バッファ中で製剤化してもよい。前記抗体調製物はまた、４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌのタンパク質濃度、好ましくは５５ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌのタンパク質濃度に希釈してもよい。

本発明の方法は、調製物中の抗体の化学的修飾、酵素的修飾、及び熱処理（例えば、１０分間以上の４０℃以上での抗体の処理など）の１つ以上を伴う工程を含まないことが好ましい。本発明のプロセスは、抗体をβ−プロピオラクトン及びペプシンの少なくともいずれかに接触させる工程を含まないことがより好ましい。

本発明は更に、上述のプロセスにより得られる免疫グロブリン調製物又は抗体調製物を提供する。前記免疫グロブリン調製物は、ポリクローナルであり、少なくとも５％のＩｇＭ、好ましくは少なくとも１５％のＩｇＭ、最も好ましくは少なくとも２０％のＩｇＭを含むことができる。その他の免疫グロブリンは、ＩｇＧとＩｇＡである。前記免疫グロブリン調製物は、５％〜３０％のＩｇＭ（最も好ましくは１５％〜３０％）、５％〜３０％のＩｇＡ（最も好ましくは１５％〜３０％）、及び４０％〜７０％のＩｇＧ（最も好ましくは４５％〜７０％）を含むことが好ましい。最も好ましい製品においては、ＩｇＧ含量が約５０％であり、ＩｇＭ含量とＩｇＡ含量がそれぞれ約２５％である。これらの値は、例えばＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭの合計に対するＩｇＭなどのパーセンテージを意味する。しかしながら、陰イオン交換クロマトグラフィーなどのよく知られた方法で、ＩｇＭ含量を更に上げることもできる。これらの値は、比濁分析法又はＰｈ．Ｅｕｒ．（現行版（２０１０）２．９．１７）に基づく免疫沈降法により測定することができる。

特に、前記免疫グロブリン調製物中の免疫グロブリンは、化学的に修飾されていない。前記免疫グロブリン調製物は、その製造プロセスにおいて、当該製品を滅菌するためにβ−プロピオラクトンなどの化学物質で処理されたものではない。同様に、前記調製物は、当該製品を滅菌するためにペプシンなどの添加されたプロテアーゼで処理されたものではない。したがって、前記免疫グロブリンは、実質的にネイティブの形態である。

前記抗体調製物は、先行技術における抗体調製物よりもタンパク質分解活性が低い。特に、２℃〜８℃で保存したときに、前記調製物にタンパク質分解活性が検出されない。タンパク質分解活性は、以下のアッセイの項目及び実施例６に記載される発色性基質を用いる方法など、当技術分野において知られた標準的な試験方法により測定することができる。かかる方法において、タンパク質分解活性は、発色基質（特に、少なくとも１つのセリンプロテアーゼに対して感受性である発色基質）と３７℃の抗体調製物のサンプル（通常、バッファで希釈して線形範囲でアッセイできるようにする）とを混合し、分光光度計を用いて吸収速度をモニタリングすることによりアッセイすることができる。サンプルのタンパク質分解活性は、方程式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝Ｓ×ΔＡｂｓ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性；Ｓ＝発色基質の特異的吸光変化に関する変換係数；及びＦ＝希釈倍率）を用いることにより、初期吸収差（ΔＡｂｓ／分）から計算される。基質の使用は、製造業者の説明書に従う。

タンパク質分解活性は、具体的には、以下の工程でアッセイすることができる：
（ａ）２５ｍｇの基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を７．２ｍＬの注射用水に溶解させる；
（ｂ）抗体調製物のサンプルをバッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４、１０６ｍＭのＮａＣｌ）で希釈して、線形範囲でアッセイできるようにし、温度を３７℃に調整する；
（ｃ）等量（例えば、２００μＬ）の希釈された抗体調製物と溶解した基質とを混合する；
（ｄ）分光光度計を用いて３７℃で１分間〜３分間、４０５ｎｍで吸収速度を測定する；
（ｅ）方程式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝３１３×ΔＡｂｓ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性、Ｆ＝希釈倍率）を用いることにより初期吸収差（ΔＡｂｓ／分）からタンパク質分解活性を計算する。

この方法の定量限界は、８Ｕ／Ｌであり、本発明の抗体調製物のサンプルは検出不可能である。したがって、本発明の最終産物におけるタンパク質分解活性のレベルは、８Ｕ／Ｌ未満である。

当技術分野において知られた調製物と同様に、本発明の抗体調製物は、５℃±３℃で保存することができる。しかしながら、本発明の方法による効率的な精製により、前記抗体調製物の安定性は非常に優れている。最終産物は、２℃〜８℃で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、最も好ましくは２年間、液状で安定である。これは、ＨＰＳＥＣで測定される１．５％超のＩｇＭの断片化及び重合化がないこと、タンパク質分解活性の上昇がないこと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対するＩｇＭ抗体活性及びＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅに対するＩｇＭ抗体活性の２５％超の低下がないこと、抗補体活性の２５％超の上昇がなく、１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満を維持していることを意味する。更に、本発明の方法により製造される最終産物は、同一の基準で評価されたときに、室温（２３℃〜２７℃）で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、最も好ましくは１年間、液状で安定である。

本発明のプロセスは更に、先行技術のプロセスよりも高いレベルのウィルス除去を提供し、これにより、特にパルボウィルスなどの活性な非エンベロープウィルス関して、先行技術の抗体調製物よりも安全な抗体調製物が得られる。本発明の方法は、３ｌｏｇ_１０超、好ましくは４ｌｏｇ_１０超、最も好ましくは５ｌｏｇ_１０超のウィルス、特に非エンベロープウィルスを除去／不活化することができる。これにより、ウィルスを実質的に含有しない抗体調製物、特に非エンベロープウィルスを実質的に含有しない（即ち、ウィルス安全性を有する）抗体調製物となる。更に、本発明の方法は、前記抗体調製物の活性ＩｇＭの量と抗補体活性のいずれに対しても大きな影響を与えることなく、前記レベルのウィルス粒子除去／不活化を達成することが可能である。したがって、エンベロープウィルス及び非エンベロープウィルスに関してウィルス安全性を有し、少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％のＩｇＭを含有し、抗補体活性が１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質以下である抗体調製物が得られる。

本発明の抗体調製物は、医薬における使用に適しており、免疫障害及び感染症、特に、ＩｇＭ欠乏症及び細菌感染症の治療に用いることができる。本発明のプロセスにより調製することができる静脈内投与用ヒトＩｇＭ富化多価免疫グロブリン調製物は、多価免疫グロブリンＧ調製物に比べて、臨床的に重要なグラム陰性菌及びグラム陽性菌に対する抗体力価が高く、且つグラム陰性菌のエンドトキシン及びグラム陽性菌のエンドトキシンに対する抗体力価も高い。

特に、本発明の抗体調製物は、患者への静脈内投与に適しており、特にヒトにおける静脈内注射に適している。

本発明はまた、本発明の抗体調製物を患者に投与することを含む患者の治療方法を提供する。特に、前記患者は、免疫障害又は細菌感染症に罹患している患者である。より好ましい実施形態においては、前記抗体調製物は、静脈内投与される。

本発明をより詳細に説明するが、以下の説明はほんの一例に過ぎない。

抗補体活性を測定するための試験方法について
抗補体活性を測定するためのアッセイは、欧州薬局方（方法２．６．１７，Ｐｈ．Ｅｕｒ．６．Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８）に記載の方法に従って行った。

ヘモリシンで前処理したヒツジ赤血球を補体により溶血させる。サンプル中の補体結合抗体により、溶血を抑制する。１ｍｇの免疫グロブリンに結合している（不活化されている）補体の量を求める。

一定量の免疫グロブリン（１０ｍｇ）とモルモットの補体とを混合し、遊離補体を滴定する。抗補体活性は、レファレンス溶液中の使用された補体に対する、使用された補体として表される。補体活性の溶血単位（ＣＨ５０）は、最適なバッファ条件において、合計５×１０^８個の赤血球のうち、最適に調製された赤血球を２．５×１０^８個溶血させる補体の量である。

最適に調製された赤血球（ヒツジ由来の安定化赤血球８ｍＬをゼラチン−バルビタール−バッファで３回洗浄し、最後に赤血球沈殿物１ｍＬをゼラチン−バルビタール−バッファ２４ｍＬに懸濁させる）は、２０ｍＬの赤血球懸濁液と２０ｍＬのヘモリシン（２ＭＨＥ／ｍＬ（最低溶血単位）に調整されている）とを混合し、３７℃で１５分間インキュベートすることにより調製する。

１０ｍｇの免疫グロブリンをゼラチン−バルビタール−バッファ（バルビタールバッファ１Ｌ中ゼラチン１ｇ（ｐＨ７．３）、５倍バルビタールバッファ溶液：水２Ｌ中塩化ナトリウム８３ｇ、バルビタールナトリウム１０．１９２ｇ（ｐＨ７．３））で希釈する。最終体積が１ｍＬになるように、２００μＬの補体１００ＣＨ５０／ｍＬを添加する。３７℃で１時間、振盪させながら試験管をインキュベートする。サンプルを希釈し、最適に調製された赤血球に対して滴定する。３７℃で１時間インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、５４１ｎｍの波長で分光光度計を用いることにより吸光度を求める。

実施例１−画分Ｉ／ＩＩＩからのＩｇＭを富化した調製物の調製
ヒト血漿の低温エタノール分画から得られたＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩＩ １８０ｋｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０５）７２０Ｌに懸濁させ、懸濁温度（２２±４℃）に達した後１５分間〜３０分間混合する。

室温のオクタン酸（用いたペーストＩ／ＩＩＩ １ｋｇ当たり０．１１０ｋｇ）１９．８ｋｇを添加することにより溶液を処理し、振動式混合機（Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ（登録商標）、サイズ−４、Ｇｒａｂｅｒ＋Ｐｆｅｎｎｉｇｅｒ有限会社製、レベル２〜３に調整されたＶｉｂｒｏｍｉｘｅｒ）を用いてタンパク質溶液を更に８０分間混合する。オクタン酸は、３０分間かけてゆっくりと添加する。

約３ｋｇのリン酸三カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を添加し、タンパク質溶液を少なくとも１５分間更に混合する。フィルタプレスを用いて清澄濾過することにより沈殿物を除去する。更に０．２μｍ濾過を実施し、タンパク質溶液を１０ｋＤの膜を用いる限外濾過に付す。タンパク質溶液を０．０４ＭのＮａＣｌで透析し、その後、タンパク質濃度を４０ｇ／Ｌに調整する。

注射用水で１＋１希釈した後、タンパク質溶液をｐＨ４．０±０．１で処理する。ｐＨの調整は、１ＭのＨＣｌを用いて行い、タンパク質溶液は、３７℃±２℃で９時間インキュベートする。ｐＨ４でのインキュベーションの後、タンパク質溶液のｐＨを１ＭのＮａＯＨを用いて５．８に調整する。バッチ方式でＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを添加することにより（タンパク質１ｋｇ当たりＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５ｇ）、得られたタンパク質溶液を更に精製する。タンパク質溶液を室温で６０分間以上撹拌しながらインキュベートする。清澄濾過によりＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを除去する。タンパク質溶液を０．２μｍ濾過に付す。

タンパク質溶液を０．１μｍのフィルタ及びＰａｌｌ社製，Ｕｌｔｉｐｏｒ ＶＦ ＤＶ５０，２０”フィルタに通して濾過する。ＵＶＣ線量２４０Ｊ／ｍ^２で、フロースルーＵＶｉｖａｔｅｃ処理装置（Ｂａｙｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ社製）を用いて、２５４ｎｍでＵＶＣ光処理することにより濾液を更に処理する。製造業者の説明書に従ってＵＶＣ反応機を通過する流速を計算する。照射されたタンパク質溶液を、限外濾過によりタンパク質濃度が５０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌになるように濃縮し、透析（１０ｋＤの膜、０．３２Ｍのグリセリンバッファ（ｐＨ４．３）を用いる）に付す。最終産物を０．２μｍのフィルタに通して濾過し、２℃〜８℃で保存する。

実施例２−オクタン酸処理工程における条件の検討
オクタン酸処理に関して、実施例１に記載の方法を用いて以下の実験範囲について、また実験範囲を互いに組み合わせて試験した（結果は示さない）。
− オクタン酸の量：０．０９ｋｇ／ｋｇ〜０．１３ｋｇ／ｋｇ（用いた画分Ｉ／ＩＩＩ １ｋｇ当たりのオクタン酸量）（１２０ｍＭ〜１８０ｍＭのオクタン酸）
− オクタン酸処理のｐＨ：ｐＨ４．８〜ｐＨ５．３
− 反応の温度範囲：１４℃〜３０℃
− インキュベート時間：４０分間〜１１０分間

試験した全ての条件で、更に処理するための清澄化が容易であり、且つタンパク質分解活性が、懸濁Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩＩ中数百Ｕ／Ｌから著しく低下している中間体が得られる。これら中間体から、定量限界である８Ｕ／Ｌ（下記実施例６に記載の通り計算）未満のタンパク質分解活性を有する最終産物が得られる。

実施例３−Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒの使用によるウイルスの減少−オクタン酸処理にＶｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いる場合及び用いない場合のウイルス除去係数の決定
２５０ｍＬの懸濁画分Ｉ／ＩＩＩをｐＨ５．０５及び２２℃で３０分間ホモジナイズした。懸濁液を２．６ｍＬのウイルス原液を加えた。オクタン酸を添加し（１１０ｇ／ｋｇ）、Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いて６０分間ホモジナイズした。平行して、同じ混合物を標準的な撹拌機でホモジナイズした。６０分間後、リン酸三カルシウム（０．１５ｇ／ｋｇオクタン酸）を添加し、懸濁液を１５分間撹拌した。フィルタディスクを用いて深層濾過により懸濁液を清澄化した。フィルタディスクは、７０ｍＬ〜８０ｍＬのバッファで予めすすいでおいた。濾過後、８０ｍＬのバッファでフィルタをすすいだ。濾液及び洗浄液をプールし、ウイルス滴定のためのサンプルを抜き取った。

ＳＶ４０、Ｒｅｏ、及びＰＰＶ（ＣＶ−１、ＣＣＬ．７．１、及びＰＫ１３）について適切な指示細胞において、オクタン酸の添加前及び濾過後に採取したサンプルのウイルス力価を求めた。最後に、ウイルス検証研究に関する現行の指針に従ってウイルス除去係数を計算した。

ウイルス検証研究では、ＳＶ４０及びＲｅｏ等の非エンベロープウイルスは、それぞれ４ｌｏｇ_１０超及び５ｌｏｇ_１０超のオーダーで効果的に除去された。更に、ＰＰＶは、３ｌｏｇ_１０超除去された。これら値は、Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いずに標準的な撹拌条件下で同じオクタン酸処理を行ったときの１０倍〜１，０００倍高い値である。

実施例４−ＵＶＣ処理の評価
ＵＶＣ照射線量の最適範囲について評価した。非エンベロープウイルスについて少なくとも４ｌｏｇ_１０不活化するための最低必須線量と、Ｆａｂの抗原に結合する機能を低下させ且つ補体活性化に影響を与えるＦｃの機能を低下させるＩｇＭ分子の変性を避けるための最高耐性線量とのバランスがある。２００Ｊ／ｍ^２〜４００Ｊ／ｍ^２の範囲では、免疫グロブリンの凝集体の僅かな増加がみられ、断片含量に対する著しい影響はなかった。

実験のために、オリジナルのタンパク質溶液の吸光度（ＯＤ）を用いて、ＢＴＳより提供されるＥｘｃｅｌシート（ｃｕｓｔｏｍｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ ＵＶｉｖａｔｅｃ Ｌａｂ ＩＩバージョン３．０）を用いてＵＶｉｖａｔｅｃラボシステムにおける流速を計算する。ランプの性能、ＵＶシグナルランプセンサの設定点、及び望ましいＵＶＣ照射線量を考慮して、流速を計算する。

シグナルフロースルーについて２００Ｊ／ｍ^２の線量を得るために、流速５．８Ｌ／ｈでＵＶｉｖａｔｅｃシステムを通過するように、タンパク質含量が約５５ｇ／ＬであるＩｇＭ含有溶液（Ｂａｔｃｈ ８６ＧＢ００５ＢＥ０７）をポンプで送った。流速３．９Ｌ／ｍ^２で前記システムを通過するようにタンパク質溶液をポンプで送ることにより、３００Ｊ／ｍ^２の線量を得た。流速２．９Ｌ／ｍ^２で前記システムを通過するようにタンパク質溶液をポンプで送ることにより、４００Ｊ／ｍ^２の線量を得た。

２００Ｊ／ｍ^２〜４００Ｊ／ｍ^２の範囲では、免疫グロブリン含量、タンパク質分解活性、又はＡＣＡについて有意な差はみられなかった。非エンベロープウイルスを不活化するには２００Ｊ／ｍ^２で十分であり、且つ３００Ｊ／ｍ^２で凝集体の形成及び抗体力価に対する著しい影響がみられなかったので、線量の好ましい範囲を２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２に設定した。好ましい線量は、２２５Ｊ／ｍ^２である。

シングルフロースルーについて２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２の線量を得るために、流速５．８Ｌ／ｈでＵＶｉｖａｔｅｃシステムを通過するように、タンパク質含量が８ｇ／Ｌ〜１２ｇ／Ｌである希釈したＩｇＭ含有溶液（Ｂａｔｃｈ ８６ＢＢ０５９ＢＥ０７）をポンプで送った。

この線量範囲内のＵＶ照射では、免疫グロブリンのクラスの分布は影響を受けなかった。ＨＰＳＥＣにより分析した分子量分布パターンも変化しない。ＣＺＥにより分析した純度のレベルも変化しなかった。タンパク質分解活性（ＰＡ）、プレカリクレインアクチベータ（ＰＫＡ）、及び抗補体活性（ＡＣＡ）も変化しない。また、ＥＬＩＳＡ法により測定した抗細菌活性は、全ての免疫グロブリンのクラスについて有意には変化しない。

漸増強度のＵＶを照射したアリコートを最終産物まで更に処理し、同パネルの分析試験に付した。この試験でも、最終産物に有意な差はみられなかった。試験した抗体力価は全て、常に、ＵＶＣ処理していない対照調製物の１００±１０％の範囲内である。

実施例５−Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ／ｐＨ４処理及びＵＶＣ処理の使用による全体的なウイルス減少−ウイルス除去係数の決定
以下の３工程：Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒで撹拌しながらオクタン酸処理する工程と、ｐＨ４処理工程と、ＵＶＣ処理（２１５Ｊ／ｍ^２）工程とによるウイルス除去／不活化の検証を、以下のモデルウイルスを用いて実施した：Ｃ型肝炎ウイルスのモデルウイルスとしてのウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ヒトヘルペスウイルスのモデルウイルスとしての偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、コロナウイルスとしてのウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、フラビウイルスのモデルウイルスとしてのシンドビスウイルス（ＳｉｎＶ）、Ａ型肝炎ウイルスのモデルウイルスとしてのマウス脳脊髄炎ウイルス（ＭＥＶ）、他の非エンベロープウイルスのモデルウイルスとしてのレオウイルス（Ｒｅｏ）、ヒトパルボウイルスＢ１９のモデルウイルスとしてのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）。

以下の３工程：オクタン酸処理工程、ｐＨ４処理工程、及びＵＶＣ処理工程を用いたこれら研究結果を以下の表２に示す。

公称孔径約５０ｎｍのフィルタを用いて更にナノ濾過して、ウイルスのサイズに依存して１７ｌｏｇ_１０超まで合計減少量を増加させることにより更に安全性を高める。例えば、ＨＩＶ−１では１７．５ｌｏｇ_１０超に達したが、ＰＰＶは、ナノ濾過を行ってもそれ以上除去されなかった。

したがって、ＩｇＭ含有調製物では現在までウイルス不活化／減少量が８ｌｏｇ_１０超に達しており、本発明に係る精製手順により優れたウイルス安全性を有するＩｇＭ調製物が得られる。これは、一般的に、サイズが小さく且つ脂質エンベロープが存在しないのでウイルス不活化及び除去手順に対する耐性が高いＭＥＶ、Ｒｅｏ、及びＰＰＶ等の非エンベロープウイルスにとって特に重要である。

実施例６−オクタン酸処理にＶｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いる場合及び用いない場合の残存タンパク質分解活性の測定
Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いずに、ブレードスターラを用いて激しく標準的な撹拌を行いながら、実施例１及び並行実験と同様にオクタン酸処理を実施した。オクタン酸／リン酸三カルシウム処理及び限外濾過／透析後のサンプルのタンパク質分解活性を、製造業者の説明書に従って発色基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を用いて測定した。２５ｍｇの基質Ｓ−２２８８を７．２ｍＬの注射用水に溶解させる。サンプルをバッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０６ｍＭのＮａＣｌ）で希釈して、線形範囲でアッセイできるようにする。例えば、２００μＬのバッファと２００μＬのサンプル（混合及び３７℃への温度調整）及び２００μＬの発色基質溶液とを混合する。分光光度計を用いて３７℃で４０５ｎｍ（１分間〜３分間）にて吸収動態を測定する。サンプルのタンパク質分解活性を、方程式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝３１３×ΔＡｂｓ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性、Ｆ＝希釈倍率）を用いることにより初期吸収差（ΔＡｂｓ／分）から計算する。

Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを使用したとき、オクタン酸処理後の濾液は澄んでいた。比較実験において、ブレードスターラを用いてオクタン酸処理した後の濾液は、非常に不透明であり、濾過が困難であった。

実施例７：本発明に係るＩｇＭ調製物における抗細菌力価
唯一市販されている静脈内耐性ＩｇＭ含有調製物であるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎと比較するために、この十分に確立されている薬剤３バッチで抗細菌活性を分析し、本発明に係る調製物と比較した。抗細菌抗原又は抗真菌抗原に対するＩｇＭ調製物中におけるＩｇＡ又はＩｇＭクラスの抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。対応する抗原でマイクロタイタープレートをコーティングし、標準物質又はＩｇＭ調製物と共にインキュベートした。抗原に結合している抗体を抗ヒトＩｇＡ又は抗ヒトＩｇＭコンジュゲートで検出した。酵素の基質を用いることにより検出を行った。生じる色の変化は、ＩｇＭ調製物中に存在する抗体の量に対応する。

新規調製物におけるＩｇＭ及びＩｇＡ媒介活性は、典型的に、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎの少なくとも１．５倍高かったが、これは、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ中のＩｇＭ及びＩｇＡがβ−プロピオラクトンで化学的に修飾されているという事実により説明することができる。この工程は、本発明に係るより穏やかな手順により置換される。

これらデータは、全体的に、最終調製物中のＩｇＭ分子の結合領域が機能的に完全に活性であることを示す。

実施例８：液体ＩｇＭ生成物を用いた保存安定性試験
ＵＶＣ処理を行わなかった実施例１の生成物を、２℃〜８℃にて１０ｍＬ又は１００ｍＬのガラスバイアル（充填体積５ｍＬ又は５０ｍＬ）中で保存し、仕様に従って全てのパラメータについて分析した。結果を表８に示す。安定性に関連するパラメータは、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を用いて測定する凝集体及び断片の含量、タンパク質分解活性（ＰＡ）、並びに抗補体活性（ＡＣＡ）である。これらパラメータは、静脈内耐性にとって重要であり、長期保存中に変化しやすい。２℃〜８℃では、これらパラメータに有意な変化はみられなかった。室温（２３℃〜２７℃）保存した場合でさえも、これら値は仕様の範囲内であったが、室温で２４ヶ月間保存した後は断片が僅かに増加する。着色、タンパク質光、ｐＨ値等の他のパラメータについても測定したが、全試験期間に亘って変化していなかった。様々な細菌に対するＩｇＭ及びＩｇＡの力価は、２℃〜８℃で２年間に亘って安定である。

また、ＵＶＣ処理を行った実施例１の生成物を、２℃〜８℃及び室温にて１０ｍＬ又は１００ｍＬのガラスバイアル（充填体積５ｍＬ又は５０ｍＬ）中で保存し、仕様に従って全てのパラメータについて分析した。結果を表９に示す。この進行中の安定性試験では、現在入手可能な１２ヶ月間のデータは、ＵＶＣ処理を行わなかった生成物と同じ安定性プロファイルを示しているので、２４ヶ月間安定であると推定できる。

実施例９ ＩｇＭ生成物を用いたインビトロ実験
安全性及び忍容性を確認するために、５日間に亘って反復静脈内注射した後の動脈圧に対するＩｇＭ調製物の影響を８頭の覚醒カニクイザルで試験した。１９０ｍｇ／ＩｇＭ／ｋｇ／日の用量の本明細書に記載の方法に従って調製したＩｇＭ調製物を投与した。比較物質として、市販の静脈内耐性ＩｇＭ含有調製物であるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎを何頭かのサルに投与した。同用量のＩｇＭを投与する方法でＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎを投与した。免疫グロブリン調製物を投与する前の時点で、対照用量の０．９％ＮａＣｌを動物に投与した。注射後に血圧を測定し、投与により許容できないレベルの非特異的な補体活性化が起こっているかどうかを判定した。

ＩｇＭ調製物（１５ｍＬ／ｋｇ／日）の投与は、動脈圧（平均、収縮期、及び拡張期）に対して僅かな影響しか与えなかった。予備試験の値と比較した各注射の４時間後までの差は、４ｍｍＨｇを超えなかった。これら差を、生物学的に関連しているとみなすことはできない。

補体経路の非特異的な活性化のマーカーとして注射後に採取した血漿サンプル中のＣ３ａ濃度を測定した。Ｃ３ａ濃度［ｎｇ／ｍＬ］は、ＩｇＭ調製物を投与しても僅かに増加するのみであり（１５ｍＬ／ｋｇＢＷ）、ＩｇＭと等量の市販のレファレンス調製物Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎによる増加よりも更に少なかった。処理の約６時間後に血液をサンプリングした。

ＩｇＭ調製物に起因する実質的な毒物学的所見はみられず、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎではみられなかった明らかな変化も生じなかった。Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎの安全性は長年に亘る臨床試験で十分に確立されているので、これら変化が任意の臨床的関連性を有しないと結論付けるのが合理的である。

また、ＩｇＭ調製物の優れた忍容性及び安全性は、２４人の健常男性及び女性のボランティアにおけるヒトの第Ｉ相試験でも検証された。投与の最初の４時間後における収縮期血圧は、平均して、０．５ｍＬ／分で９１ｍｇ〜２７４ｍｇのＩｇＭ調製物／ｋｇＢＷ／日を注射した後、約９％（１１．９ｍｍＨｇ）しか低下しなかった。

これは、プラセボである０．９％ＮａＣｌ溶液と同程度であった（９．４％、１１．７ｍｍＨｇ）。

重篤な有害事象は記録されず、全ての重篤ではない有害事象は自己制限的であった。更に、ＰＣＴ測定により示される通り、感染因子の伝染の証拠は存在しなかった。

関連疾患の動物モデルにおける有効性試験の有用性は、免疫原性及びヒト血漿から得られたＩｇＭ調製物中で予め形成されているＧａｌ抗体により制限されることに留意すべきである。しかし、疾患の治療におけるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎの使用に関する先行技術の知見及び本発明の方法により調製されるＩｇＭ調製物の抗細菌抗体力価（実施例７に示す）を鑑みて、ＩｇＭ調製物は臨床的有効性を有すると結論付けることができる。

Claims (37)

1. 免疫グロブリンを含む血漿画分からＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセスであって、
   （ａ）血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として準備する工程；
   （ｂ）Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸を前記溶液と混合し、該混合溶液を振動式撹拌機で処理して混入タンパク質を沈殿させる工程；及び
   （ｃ）沈殿した前記タンパク質を前記溶液から分離してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る工程、
   を含むプロセス。
2. 工程（ｂ）において、Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸の濃度が少なくとも０．０７５ｋｇ／ｋｇ血漿画分である請求項１に記載のプロセス。
3. 工程（ｂ）において、混合溶液のｐＨが４．５〜５．５である請求項１から２のいずれかに記載のプロセス。
4. 工程（ｂ）において、混合溶液の温度が１０℃〜３５℃である請求項１から３のいずれかに記載のプロセス。
5. 工程（ｂ）において、Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸が、免疫グロブリン含有溶液と少なくとも３０分間インキュベートされる請求項１から４のいずれかに記載のプロセス。
6. Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸がオクタン酸である請求項１から５のいずれかに記載のプロセス。
7. 血漿画分の免疫グロブリンが少なくとも５％のＩｇＭを含む請求項１から６のいずれかに記載のプロセス。
8. 血漿画分がＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩＩ又はＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ｂ若しくはＢ＋Ｉの沈殿物である請求項１から７のいずれかに記載のプロセス。
9. 工程（ｃ）が限外濾過を含み、免疫グロブリン組成物が濾過された溶液を含む請求項１から８のいずれかに記載のプロセス。
10. 工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物をｐＨ３．５〜ｐＨ４．５でインキュベートしてインキュベート溶液を得る工程を更に含む請求項１から９のいずれかに記載のプロセス。
11. 工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物をインキュベートする工程が３２℃〜４２℃で行われる請求項１０に記載のプロセス。
12. インキュベート溶液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）に吸着させる工程、及び前記ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを前記溶液から深層濾過により分離する工程を更に含む請求項１０から１１のいずれかに記載のプロセス。
13. 深層濾過で得られた濾液をナノ濾過に付す工程を更に含む請求項１２に記載のプロセス。
14. ナノ濾過が公称孔径３５ｎｍ〜７５ｎｍ、好ましくは公称孔径４０ｎｍ〜５０ｎｍのフィルターで行われる請求項１３に記載のプロセス。
15. 請求項１０から１１のいずれかにおけるインキュベート溶液又は請求項１２から１４のいずれかにおける濾液をＵＶＣ照射により処理してＵＶＣ照射溶液を得る工程を更に含む請求項１０から１４のいずれかに記載のプロセス。
16. インキュベート溶液又は濾液が、２００Ｊ／ｍ^２〜５００Ｊ／ｍ^２、好ましくは２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２でＵＶＣ照射により処理される請求項１５に記載のプロセス。
17. ＵＶＣ照射溶液を滅菌条件下で濾過して、静脈内投与に適した抗体調製物を製造する工程を更に含む請求項１５から１６のいずれかに記載のプロセス。
18. 抗体調製物をグリシン含有バッファ中でｐＨ４〜ｐＨ５．５で製剤化する工程を含む請求項１７に記載のプロセス。
19. 請求項１５から１６のいずれかにおけるＵＶＣ照射溶液又は請求項１７から１８のいずれかにおける抗体調製物を、滅菌条件下で容器に充填する工程を更に含む請求項１５から１８のいずれかに記載のプロセス。
20. 請求項１５から１６のいずれかにおけるＵＶＣ照射溶液又は請求項１７から１８のいずれかにおける抗体調製物のタンパク質分解活性が８Ｕ／Ｌである請求項１５から１９のいずれかに記載のプロセス。
21. 非エンベロープウィルスを３ｌｏｇ_１０超除去する請求項１５から２０のいずれかに記載のプロセス。
22. 請求項１７から２１のいずれかに記載のプロセスによって得られる免疫グロブリンを含む抗体調製物。
23. ヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物であって、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭを含み、タンパク質分解活性が８Ｕ／Ｌ未満であり、免疫グロブリンの総量の少なくとも５％がＩｇＭである抗体調製物。
24. ２℃〜８℃で保存したときに少なくとも２年間安定である請求項２３に記載のＩｇＭを含む抗体調製物。
25. 少なくとも１５％のＩｇＭを含む請求項２２から２４のいずれかに記載の抗体調製物。
26. 少なくとも２０％のＩｇＭを含む請求項２５に記載の抗体調製物。
27. 少なくとも２０％〜３０％のＩｇＭを含む請求項２６に記載の抗体調製物。
28. 安定化剤を更に含む請求項２２から２７のいずれかに記載の抗体調製物。
29. 安定化剤がグリシンである請求項２８に記載の抗体調製物。
30. 免疫グロブリンが化学的に修飾されていない請求項２２から２９のいずれかに記載の抗体調製物。
31. 請求項１から９のいずれかに記載の方法により得られるＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物。
32. 医薬において使用するための請求項２２から３０のいずれかに記載の抗体調製物。
33. 免疫障害又は細菌感染症の治療において使用するための請求項３２に記載の抗体調製物。
34. 免疫障害がＩｇＭ欠乏症である請求項３３に記載の抗体調製物。
35. 免疫障害又は細菌感染症の治療のための薬剤を製造するための請求項２２から３０のいずれかに記載の抗体調製物の使用。
36. 請求項２２から３０のいずれかに記載の抗体調製物を投与することを含む患者の治療方法。
37. 患者が免疫障害又は細菌感染症に罹患している請求項３６に記載の治療方法。

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