RU2660584C1 - Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека - Google Patents
Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660584C1 RU2660584C1 RU2017119909A RU2017119909A RU2660584C1 RU 2660584 C1 RU2660584 C1 RU 2660584C1 RU 2017119909 A RU2017119909 A RU 2017119909A RU 2017119909 A RU2017119909 A RU 2017119909A RU 2660584 C1 RU2660584 C1 RU 2660584C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hemolysis
- function
- complement
- degrees
- difference
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека на основе реакции связывания комплемента, в котором оценивается степень гемолиза сенсибилизированных антителами кролика эритроцитов барана в основной системе, включающей растворы иммуноглобулина, антигена, комплемента, и контрольной системе, содержащей растворы иммуноглобулина, ФР (физиологического раствора) и комплемента; определяется разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах, рассчитывается индекс FC-функции путем деления разности степеней гемолиза в двух системах для испытуемого препарата на разность степеней гемолиза в двух системах для раствора сравнения с известной величиной индекса FC-функции. Изобретение обеспечивает возможность выполнения способа определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека без использования сложного аппаратурного оснащения, простоту в интерпретации результатов. 1 пр., 2 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к контролю качества препаратов крови, методам определения функциональной активности молекул иммуноглобулина.
Прототипом является способ определения Fc-функции иммуноглобулиновых препаратов методом, изложенным в статье 2.7.9 Европейской Фармакопеи. Метод основан на измерении гемолиза сенсибилизированных антигеном краснухи эритроцитов человека, обусловленного реакцией антиген-антитело-комплемент. Измерение гемолиза проводят для исследуемого образца иммуноглобулина и для раствора сравнения - биологического референсного препарата иммуноглобулина человека. Строят кривые зависимости изменения оптической плотности от времени, на кривой определяют наибыстрейший участок, рассчитывают угол наклона этого участка путем деления разности оптической плотности на промежуток времени. Для исследуемого препарата вычисляют индекс Fc-функции, который равен отношению углов наклона кривых исследуемого препарата и референсного и выражен в процентах. Значение полученного индекса должно быть не менее величины, указанной в паспорте биологического референсного препарата (European Pharmacopoeia, 8.2, статья 2.7.9., 2015).
Использование в фармакопейном методе в качестве сенсибилизирующего агента труднодоступного антигена краснухи ограничивает его применение в практике контроля качества препаратов крови.
Аналогом патентуемого способа является реакция связывания комплемента (РСК) - серологическая реакция для выявления антител в сыворотке крови человека на определенный антиген при диагностике заболеваний. В реакции участвуют две системы и комплемент. Первая система состоит из антигена и антитела. Вторая система индикаторная, в нее входят эритроциты барана и гемолизин - сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитела, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитела соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Процесс связывания комплемента комплексом визуально невидимый, для его выявления добавляют индикаторную систему. Если в первой системе комплемент связался, то при добавлении индикаторной системы гемолиз эритроцитов не произойдет - реакция положительная. Если же комплемент не связался в первой системе из-за отсутствия антител, то он свяжется с индикаторной системой, в результате чего произойдет гемолиз эритроцитов - реакция отрицательная.
Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка способа определения Fc-функции препаратов иммуноглобулина человека на основе реакции связывания комплемента. Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются использование доступных реактивов отечественного производства, не требует серьезного аппаратурного оснащения, простота в интерпретации результатов.
Для осуществления метода готовятся 3 системы и комплемент с определенной гемолитической активностью.
Первая система (основная) включает исследуемый препарат с определенным содержанием белка иммуноглобулина и антиген. Для образования связи антитело-антиген система инкубируется при 37°C в течение часа.
Вторая система (контрольная) состоит из исследуемого препарата с содержанием белка иммуноглобулина, как в основной системе, и физиологического раствора, заменяющего антиген.
Способ предусматривает обязательное использование раствора сравнения - биологического референсного препарата иммуноглобулина для определения Fc-функции. Основная и контрольная системы аналогичным образом готовятся для раствора сравнения.
Третья система (индикаторная) состоит из стандартизованной суспензии эритроцитов барана и гемолизина - сыворотки крови иммунизированных эритроцитами барана кроликов.
В основную и контрольную системы добавляется раствор комплемента с гемолитической активностью 2 CH50/мл. Для образования комплексов антиген-антитело-комплемент обе системы инкубируются при 37°C в течение часа.
При добавлении индикаторной системы в основную и контрольную происходит гемолиз эритроцитов барана. Измеряется оптическая плотность растворов при длине волны 540 нм с длиной оптического пути 10 мм. Рассчитывается степень гемолиза в обеих системах для всех образцов в соответствии с формулой 1
где Y - степень гемолиза в пробе, %;
ОП - оптическая плотность в пробе;
ОПкэр - оптическая плотность в контроле самопроизвольного гемолиза эритроцитов, состоящего из ФР и индикаторной системы;
ОП100% - оптическая плотность в контроле полного гемолиза, состоящего из воды очищенной и индикаторной системы.
Определяется разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах для стандарта и испытуемого образца. Индекс Fc-функции испытуемого образца рассчитывается по формуле 2
где IFC - расчетная величина индекса Fc-функции испытуемого образца;
ΔYобр - разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах для испытуемого образца;
ΔYBRP - разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах для раствора сравнения;
100% - значение индекса Fc-функции раствора сравнения.
Если полученное значение индекса Fc-функции испытуемого образца превышает значение, указанное в паспорте раствора сравнения, считается, что исследуемый препарат обладает достаточной функциональной активностью.
Пример
Перед работой проводится трехкратное отмывание эритроцитов барана в физиологическом растворе натрия хлорида pH 7,0 (ФР), из отмытых эритроцитов готовится 3% суспензия. Полученная суспензия стандартизуется: 0,25 мл готовой суспензии гемолизируются в 1 мл воды очищенной, измеряется величина оптической плотности (ОП) при длине волны 540 нм против воды очищенной. Суспензия считается пригодной при величине ОП 1,2±0,1.
Определяется рабочее разведение гемолитической сыворотки (ГС). Готовится ряд разведений ГС от 1:1000 до 1:9000 с шагом 400. Затем для каждого разведения подготавливается индикаторная система (ИС): смешиваются 0,25 мл 3% суспензии эритроцитов барана и 0,25 мл готового разведения. Смеси инкубируются при 37°С в течение 30 мин. По окончании инкубации во все пробы добавляется по 0,25 мл маточного раствора комплемента морской свинки (разведение 1:10) и по 0,5 мл ФР. Для определения полного гемолиза смешиваются 1,0 мл воды очищенной и 0,25 мл 3% суспензии эритроцитов барана, для контроля самопроизвольного гемолиза - 1,0 мл ФР и 0,25 мл 3% суспензии. Все пробы инкубируются при 37°С 60 минут. По окончании инкубации пробы охлаждаются при 2-8°C в течение 10 минут, центрифугируются при 1500 об/мин в течение 10 минут, измеряется оптическая плотность (ОП) надосадочной жидкости при длине волны 540 нм против ФР. Рассчитывается степень гемолиза Y% согласно формуле 1.
За рабочее разведение (титр) ГС принимается максимальное разведение, при котором наблюдался полный гемолиз 3% суспензии. Для дальнейшего анализа готовится ИС: смешиваются равные объемы 3% суспензии и раствора гемолизина в двойном титре, смесь инкубируется при 37°C в течение 30 минут.
Далее определяется рабочее разведение комплемента морской свинки. Из маточного раствора комплемента (разведение 1:10) готовится 20 разведений в соответствии с таблицей 1.
В два ряда пробирок вносится по 0,25 мл из каждого разведения комплемента, добавляется по 0,5 мл ФР и 0,5 мл ИС. Для контроля самопроизвольного гемолиза - 0,75 мл ФР и 0,5 мл ИС, полного гемолиза - 0,75 мл воды очищенной и 0,5 мл ИС. Пробы инкубируются при 37°C в течение 60 минут. По окончании инкубации пробы охлаждаются при 2-8°C в течение 10 минут, центрифугируются при 1500 об/мин в течение 10 минут, измеряется ОП надосадочной жидкости при длине волны 540 нм против ФР. Рассчитывается степень гемолиза Y% согласно формуле 1. Строится график зависимости степени гемолиза от объема комплемента в пробе (по оси абсцисс - количество добавленного комплемента в мл; по оси ординат - степень гемолиза). За рабочее разведение комплемента принимается наименьшее разведение, при котором наблюдается полный гемолиз 3% суспензии. Данная величина соответствует 2 гемолитическим единицам (2 СН50/мл) комплемента. Готовится рабочее разведение комплемента, содержащее 2 СН50/мл.
Для приготовления основной системы для испытуемого образца и раствора сравнения в пробирки вносится объем препарата, содержащий 2,5 мг белка иммуноглобулина. Общий объем раствора доводится ФР до 0,25 мл. Затем добавляется 0,25 мл раствора антигена - вакцины коревой.
Для приготовления контрольной системы для испытуемого образца и раствора сравнения в пробирки вносится объем препарата, содержащий 2,5 мг белка иммуноглобулина, общий объем доводится до 0,5 мл физиологическим раствором.
Готовятся контрольные пробы: контроль активности комплемента, содержащий 0,5 мл ФР, и контроль спонтанного связывания комплемента антигеном, включающий 0,25 мл ФР и 0,25 мл антигена.
Основная и контрольная системы для испытуемого образца и раствора сравнения, контрольные пробы инкубируются при 37°C в течение часа.
По окончании инкубации в обе системы и контрольные пробы добавляется по 0,25 мл рабочего раствора комплемента с гемолитической активностью 2 СН50/мл. Пробы инкубируются при 2-8°C в течение 18 часов.
Затем во все смеси вносится по 0,5 мл свежеприготовленной ИС. Обе системы и контрольные пробы инкубируются при 37°C в течение часа. Измеряется ОП надосадочной жидкости при 540 нм и длине оптического пути 10 мм. Рассчитывается степень гемолиза Y% по формуле 1. Находится разность степеней гемолиза основной и контрольной систем для испытуемого образца. Аналогично находится разность степеней гемолиза основной и контрольной систем для раствора сравнения.
Рассчитывается индекс Fc-функции (IFc) испытуемого образца иммуноглобулина по формуле 2.
В таблице 2 представлены результаты определения индекса Fc-функции для испытуемого образца.
Величина индекса Fc-функции испытуемого образца составила 98,1%, что превышает значение, указанное в паспорте раствора сравнения - не менее 60%, следовательно, испытуемый препарат обладает достаточной функциональной активностью антител.
Claims (12)
- Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека на основе реакции связывания комплемента, отличающийся тем, что оценивается степень гемолиза сенсибилизированных антителами кролика эритроцитов барана в основной системе, включающей растворы иммуноглобулина, антигена, комплемента, и контрольной системе, содержащей растворы иммуноглобулина, ФР (физиологического раствора) и комплемента, в соответствии с формулой (1)
- где Y - степень гемолиза в пробе, %;
- ОП - оптическая плотность в пробе;
- ОПкэр - оптическая плотность в контроле самопроизвольного гемолиза эритроцитов, состоящего из ФР и индикаторной системы;
- ОП100% - оптическая плотность в контроле полного гемолиза, состоящего из воды очищенной и индикаторной системы,
- где индикаторная система состоит из стандартизованной суспензии эритроцитов барана и гемолизина - сыворотки крови иммунизированных эритроцитами барана кроликов;
- определяется разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах, рассчитывается индекс FC-функции путем деления разности степеней гемолиза в двух системах для испытуемого препарата на разность степеней гемолиза в двух системах для раствора сравнения с известной величиной индекса FC-функции в соответствии с формулой (2)
- где IFC - расчетная величина FC-функции испытуемого образца;
- ΔYобр - разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах для испытуемого образца;
- ΔYBRP - разность степеней гемолиза в основной и контрольной системах для раствора сравнения.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017119909A RU2660584C1 (ru) | 2017-06-06 | 2017-06-06 | Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017119909A RU2660584C1 (ru) | 2017-06-06 | 2017-06-06 | Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2660584C1 true RU2660584C1 (ru) | 2018-07-06 |
Family
ID=62815400
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017119909A RU2660584C1 (ru) | 2017-06-06 | 2017-06-06 | Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2660584C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090042800A1 (en) * | 2001-02-15 | 2009-02-12 | Ivan Mikhailovich Petyaev | Assay |
RU2617532C2 (ru) * | 2010-04-22 | 2017-04-25 | Биотест Аг | Препараты антител |
-
2017
- 2017-06-06 RU RU2017119909A patent/RU2660584C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090042800A1 (en) * | 2001-02-15 | 2009-02-12 | Ivan Mikhailovich Petyaev | Assay |
RU2617532C2 (ru) * | 2010-04-22 | 2017-04-25 | Биотест Аг | Препараты антител |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GEORGAKOPOULOS ET AL., An improved Fc function assay utilizing CMV antigen-coated red blood cells generated with synthetic function-spacer-lipid constructs.Vox Sang. 2012 Jan;102(1):72-8. doi: 10.1111/j.1423-0410.2011.01512.x. Epub 2011 Jul 12. * |
GEORGAKOPOULOS ET AL., An improved Fc function assay utilizing CMV antigen-coated red blood cells generated with synthetic function-spacer-lipid constructs.Vox Sang. 2012 Jan;102(1):72-8. doi: 10.1111/j.1423-0410.2011.01512.x. Epub 2011 Jul 12. GUREVICH V., et al., Determination of Fc function with frozen red blood cells.Biologicals. 2006 Sep;34(3):221-2. Epub 2006 Feb 23. * |
GUREVICH V., et al., Determination of Fc function with frozen red blood cells.Biologicals. 2006 Sep;34(3):221-2. Epub 2006 Feb 23. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105181962B (zh) | 一种类风湿因子检测试剂 | |
KR940704003A (ko) | 생체내 진척된 글리코실화 종말 산물의 면역 화학적 검출(immunochemical detection of in vivo advanced glycosylation endproducts) | |
Chow et al. | The purification of the antibodies in type I anti-pneumococcus serum, and the chemical nature of the type-specific precipitin reaction | |
HU188057B (en) | Analytical process based on reaction of antigene-antibody and reagent for the process | |
CN106290907B (zh) | 全血中血清淀粉样蛋白a定量检测试剂以及检测方法 | |
US4210622A (en) | Kit for assay of immune complexes | |
CN107656069A (zh) | 全血中全量程c‑反应蛋白定量检测试剂及方法 | |
JPH09508975A (ja) | 全血試料中に存在する分析対象成分の定量に用いる分析用キュベット、定量方法及び診断検査キット | |
CN102809654A (zh) | 一种双粒子复合的c-反应蛋白检测试剂盒 | |
CN104407156B (zh) | 检测多糖结合蛋白(lbp)的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 | |
CN112763725B (zh) | 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用 | |
CN101592660A (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒 | |
RU2660584C1 (ru) | Способ определения FC-функции препаратов иммуноглобулина человека | |
CN104730231B (zh) | 一种用于荧光免疫定量检测的样本缓冲液及其应用 | |
US7919266B2 (en) | Method of detecting red cell antigen-antibody reactions | |
Fazekas et al. | Methods in Immunochemistry of Viruses. 1. Equilibrium Filtration. | |
CN110133270A (zh) | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 | |
SU1367838A3 (ru) | Способ определени антистрептолизин- @ -овых антител в крови (его варианты) | |
JP3849945B2 (ja) | 血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤 | |
Spaet et al. | Studies on the normal serum panagglutinin active against trypsinated human erythrocytes: II. Relationship to cold agglutination | |
Fife Jr et al. | Isolation and characterization of a serologically active exoantigen of Schistosoma mansoni cercariae | |
US4554248A (en) | Composition and method for detecting Antistreptolysin O | |
Sandholm | Development and evaluation of immunoassays for complement diagnostics | |
RU2747420C1 (ru) | Способ приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного | |
CN102207500A (zh) | 补体结合酶联免疫吸附试验 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200607 |