CN112763725B - 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用 - Google Patents

一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112763725B
CN112763725B CN202011591127.7A CN202011591127A CN112763725B CN 112763725 B CN112763725 B CN 112763725B CN 202011591127 A CN202011591127 A CN 202011591127A CN 112763725 B CN112763725 B CN 112763725B
Authority
CN
China
Prior art keywords
latex
crp antibody
solution
microspheres
crp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011591127.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112763725A (zh
Inventor
李珂
夏另朝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOSINO BIO-TECHNOLOGY AND SCIENCE Inc
Original Assignee
BIOSINO BIO-TECHNOLOGY AND SCIENCE Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOSINO BIO-TECHNOLOGY AND SCIENCE Inc filed Critical BIOSINO BIO-TECHNOLOGY AND SCIENCE Inc
Priority to CN202011591127.7A priority Critical patent/CN112763725B/zh
Publication of CN112763725A publication Critical patent/CN112763725A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112763725B publication Critical patent/CN112763725B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4737—C-reactive protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种胶乳比浊法测定C反蛋白检测试剂的制备及应用，属于体外诊断检测试剂领域。本发明提供的检测试剂中包括大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球；利用大小粒径胶乳微球与CRP抗体的偶联物进行C反应蛋白的检测。采用本发明提供的CRP抗体‑小粒径胶乳微球及CRP抗体‑大粒径胶乳微球可对C反应蛋白进行全量程的检测，且检测结果具较高的灵敏度和特异性。

Description

一种胶乳比浊法测定C反蛋白检测试剂的制备及应用
技术领域
本发明属于体外诊断检测试剂领域，具体涉及一种胶乳比浊法C反应蛋白检测试剂的制备及应用。
背景技术
C反应蛋白(CRP)是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白，一种非特异的炎症标志物。健康人血清中含量很低，当人体受到微生物等多种因子侵袭后，人体血清中几小时后会产生一种急性期反应蛋白，这种蛋白与肺炎球菌C多糖体超反应。在结构上，CRP含5个多肽链亚单位，非共价地结合为盘形多聚体，分子量为11.5万—14万，是一种典型的急性时相蛋白。
CRP检测试剂盒根据检测范围可分为：常规CRP(约10-300mg/L)、超敏CRP(约0.1-20mg/L)、全量程CRP(约0.1-300mg/L)。一次性检测常规CRP和超敏CRP，这种方法被称为全程CRP检测。常规CRP和超敏CRP在化学本质上无区别，是同一种物质，只是检测方法的定量下限不同。目前市场上CRP的检测方法中，常规CRP检测低值样本的灵敏度较低，检测范围不能覆盖微量CRP；超敏CRP比常规CRP灵敏度更高，能准确测定0.1-20mg/L样本，可作为冠状动脉疾病或急性冠脉综合征复发的预警指示物，但是检测线性范围较窄，不能检测浓度更高的样本。
目前国内胶乳比浊法全量程CRP检测试剂盒方法中，一种是单一粒径的胶乳微球，偶联CRP抗体；另一种是使用双胶乳微球，大粒径微球偶联CRP多抗，小粒径微球偶联CRP单抗，再按一定比例混合后形成检测试剂。国内双粒径胶乳微球方法中：单抗使用量大，试剂成本高，且大部分产品在低值区域的灵敏度并不高，不能准确测定低值样本(0.1-3.0mg/L)。
发明内容
本发明的目的是基于胶乳比浊法，提供一种全量程的C反应蛋白检测试剂盒的制备及应用。
为了克服现有技术中的不足之处，本发明使用粒径大小不同的两种胶乳微球，分别标记CRP多克隆抗体，灵敏度高、线性范围宽，可同时检测低浓度和高浓度样本。由于使用不同亲和力的CRP多抗，与使用CRP单抗相比，试剂成本更低，且能够准确测定低值样本(0.1-3.0mg/L)。
本发明的技术方案如下：
筛选合适粒径的羧基胶乳微球。小粒径胶乳微球(60-120nm之间)的筛选结果见图1；图1中显示60-100nm之间的小粒径微球偶联抗体后的试剂反应结果，60nm、80nm微球效果更好；大粒径胶乳微球(120-220nm之间)的筛选结果见图2；图2中显示123-220nm之间的微球偶联抗体后的试剂反应结果，220nm微球效果更好。
确定大小粒径胶乳微球与抗体偶联的组合。发明人使用CRP多克隆抗体进行大小粒径微球的偶联，得到了良好的检测效果。因此，筛选亲和力不同的CRP多克隆抗体，大粒径胶乳微球偶联强亲和力抗体，小粒径胶乳微球偶联弱亲和力抗体。按一定比例混合两种抗体微球偶联物的溶液，形成检测试剂2(R2)，混合溶液的检测灵敏度结果见图3，图3中显示，将标记好的大小粒径微球溶液混合，可形成低值区域灵敏度高，线性范围更宽的检测试剂。
本发明第一方面提供测定C反应蛋白的CRP抗体胶乳微球组合物，包括CRP抗体-大粒径胶乳微球和CRP抗体-小粒径胶乳微球；所述CRP抗体-大粒径胶乳微球，是220nm胶乳微球与210-310mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物；所述CRP抗体-小粒径胶乳微球，是80nm胶乳微球与620-720mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物；
优选地，所述胶乳微球为羧基胶乳微球。
在进行大小粒径胶乳微球活化时，所述220nm胶乳微球占活化液体积的0.30-0.38％；所述80nm胶乳微球占活化液体积的1.0-1.4％。
具体地，本发明所述CRP抗体-大粒径胶乳微球是，占活化液体积0.30-0.38％的220nm胶乳微球活化后，与210-310mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物；所述小粒径胶乳微球是，占活化液1.0-1.4％的80nm胶乳微球活化后，与620-720mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物。
在本发明提供的CRP抗体胶乳微球组合物中，所述CRP抗体为CRP多克隆抗体。
在本发明提供的CRP抗体胶乳微球组合物中，CRP抗体-大粒径胶乳微球溶液与CRP抗体-小粒径胶乳微球溶液的体积比为(0.8-1.2):(2.4-2.8)；
优选地，CRP抗体-大粒径胶乳微球溶液与CRP抗体-小粒径胶乳微球溶液的体积比为1:2.6。
本发明所提供的CRP抗体胶乳微球组合物，适合C反应蛋白全量程的测定。发明人在长期的C反应蛋白检测实践中，为了得到良好的C反应蛋白检测结果，对检测试剂盒中所用试剂组分进行探索，发现了适合220nm胶乳微球及80nm胶乳微球的活化液，及进行抗体偶联时配套使用的缓冲液。
本发明第二方面提供含有上述CRP抗体胶乳微球组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1：在活化液中活化胶乳微球；
S2：在偶联缓冲液中，将活化后的胶乳微球与CRP抗体偶联，得CRP抗体-胶乳微球偶联体系；
S3：使用封闭液对S2所述CRP抗体-胶乳微球偶联体系进行封闭，得CRP抗体-胶乳微球混合体系；
S4：使用清洗液缓冲液，清洗S3中所述CRP抗体-胶乳微球混合体系，得CRP抗体胶乳微球；
S5：在保存液中保存S4所述CRP抗体胶乳微球，得CRP抗体胶乳微球溶液；
S6：混合S5得到的不同粒径大小的CRP抗体胶乳微球溶液，得到CRP抗体胶乳微球组合物。
具体地，制备含有CRP抗体胶乳微球组合物的方法，包括以下步骤：
(1)活化胶乳微球
在活化液中加入胶乳微球，继续向活化液中加入溶解的N-羟基琥珀酰亚胺、碳化二亚胺溶液，室温混匀20分钟，离心弃掉上清溶液，得活化后的胶乳微球；
(2)胶乳微球与CRP抗体偶联
在偶联缓冲液中加入活化后的胶乳微球，使活化后的胶乳微球在偶联缓冲液中复悬，超声混匀，向包含活化后胶乳微球的偶联缓冲液中缓慢加入CRP抗体溶液搅拌混匀15小时，得偶联反应体系；
(3)封闭偶联抗体的胶乳微球
偶联反应结束后，向偶联反应体系中加入体积为偶联反应体系15-25％的封闭液，室温搅拌混匀2小时，完成胶乳微球封闭，得偶联封闭体系；
(4)清洗偶联CRP抗体的胶乳微球
将偶联封闭体系离心，弃掉上清溶液，得混合胶乳微球，向混合胶乳微球中加入清洗液，超声复悬微球至完全分散均匀，再次离心弃掉上清溶液，得偶联抗体的胶乳微球；
(5)保存偶联CRP抗体的胶乳微球
向偶联抗体的胶乳微球中加入保存液，复悬超声混匀，2-8℃保存，得CRP抗体胶乳微球；
(6)混合两种粒径的CRP抗体胶乳微球，得到CRP抗体胶乳微球组合物。
在本发明提供的CRP抗体胶乳微球组合物的制备方法中，所使用的各试剂的组分为：
活化液：10mmol/L的2-吗啉乙磺酸，pH为6；
偶联缓冲液：10mmol/L的磷酸二氢钠，pH为7.6；
封闭液：10mmol/L甘氨酸缓冲液，200mg/L牛血清白蛋白，pH为7.2；
清洗缓冲液：10mmol/L甘氨酸缓冲液，pH为7.6；
保存液：50mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为8.1；保存液中还可添加：50g/L蔗糖或50g/L甘露醇或50g/L甘油或20g/L海藻糖或体积百分数为0.1％的Proclin-300中的一种或多种。
进一步将含有CRP抗体胶乳微球组合物的试剂2(R2)与试剂1(R1)组合成检测试剂盒，在全自动生化分析仪上进行CRP样本检测。
本发明的第三方面提供一种C反应蛋白检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R2包含上述CRP抗体胶乳微球组合物或上述的制备方法制备得到的CRP抗体胶乳微球组合物。
在本发明提供的C反应蛋白检测试剂盒中，还包括试剂R1，所述试剂R1的pH为7.8，组分包括：50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、0.5mol/L氯化钠、0.01g/L吐温-80、0.01g/L吐温-20、0.03g/L聚氧乙烯月桂醚、0.02g/L脂肪醇聚氧乙烯(3)醚、0.1％叠氮钠。
本发明的第四方面提供C反应蛋白检测方法，使用上述的CRP抗体胶乳微球组合物或上述制备方法得到的CRP抗体胶乳微球组合物或上述的试剂盒进行C反应蛋白的检测。
在本发明提供的C反应蛋白检测方法中，若所述试剂盒与全自动生化分析仪配套可用于C反应蛋白免疫透射比浊法测定；若所述试剂盒与特种蛋白分析仪配套可用于C反应蛋白散射比浊法测定。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的C反应蛋白检测方法中，胶乳微球偶联时使用的抗体是兔抗CRP多抗，亲和力好，效价高；且两种抗体均为多克隆抗体，比单克隆抗体的原料成本更低。
(2)本发明提供的C反应蛋白检测方法中，小粒径微球标记的CRP抗体是弱亲和力抗体，有更宽的检测范围；大粒径微球标记强亲和力抗体，提高低值区域的检测灵敏度。
(3)本发明提供的C反应蛋白检测试剂盒，适用于透射比浊法和散射比浊法；所述检测试剂盒与全自动生化分析仪配套可用于免疫透射比浊法测定；与特种蛋白分析仪配套可用于散射比浊法测定。
附图说明
图1为本发明中小粒径微球偶联抗体实验结果图。
图2为本发明中大粒径微球偶联抗体实验结果图。
图3为本发明中已标记的大小粒径微球溶液混合后检测灵敏度结果图。
图4本发明实施例2所提供的试剂盒的线性范围检测。
图5本发明实施例2所提供的试剂与进口性能较好试剂测值相关性图。
图6本发明实施例2所提供的试剂与对比试剂的钩状效应的反应结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1试剂R2中缓冲液的制备
配制各种类型缓冲液
(1)活化液：2-吗啉乙磺酸(MES)浓度为10mmol/L，pH:6.00；
(2)偶联缓冲液：磷酸二氢钠，浓度为10mmol/L，pH:7.60；
(3)封闭液：甘氨酸缓冲液，浓度为10mmol/L，牛血清白蛋白(BSA)含量：200mg/L，pH:7.20；
(4)清洗缓冲液：甘氨酸缓冲液，浓度为10mmol/L，pH:7.60；
(5)保存液：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)浓度为50mmol/L，pH:8.10；除HEPES外，保存液中还可添加：蔗糖：50g/L、甘露醇：50g/L、甘油：50g/L、海藻糖：20g/L、0.1％Proclin-300。
实施例2
1、CRP抗体-大粒径胶乳微球溶液的制备
(1)胶乳微球活化
在活化液中加入胶乳微球，大粒径胶乳微球(220nm)，微球含量为活化液体积的0.35％，继续向活化液中加入溶解的N-羟基琥珀酰亚胺、碳化二亚胺溶液，使得NHS终浓度为0.3mmol/L，NHS终浓度为1.0mmol/L，室温混匀20分钟，离心弃掉上清溶液，得活化后的胶乳微球；
(2)胶乳微球与CRP抗体偶联
向偶联缓冲液中加入(1)中活化后的胶乳微球，使活化后的胶乳微球在偶联缓冲液中复悬，超声混匀，向包含活化后胶乳微球的偶联缓冲液中缓慢加入CRP抗体溶液(终浓度:300mg/L)搅拌混匀15小时，得偶联反应体系；
(3)偶联抗体的胶乳微球封闭
向(2)中得到的偶联反应体系中加入体积为偶联反应体系20％的封闭液，室温搅拌混匀2小时，完成胶乳微球封闭，得偶联封闭体系；
(4)偶联CRP抗体的胶乳微球清洗
将(3)中得到偶联封闭体系离心，弃掉上清溶液，得混合胶乳微球，向混合胶乳微球中加入清洗液，超声复悬微球至完全分散均匀，再次离心弃掉上清溶液，得抗体胶乳微球偶联物；
(5)偶联CRP抗体的胶乳微球保存
向(4)中得到的抗体胶乳微球偶联物中加入保存液，复悬超声混匀，2-8℃保存，得CRP抗体-大粒径胶乳微球。
2、CRP抗体-小粒径胶乳微球溶液的制备
CRP抗体-小粒径胶乳微球溶液的制备步骤同CRP抗体-大粒径胶乳微球溶液，仅步骤(1)中，向活化液中加入小粒径胶乳微球(80nm)，微球含量为活化液体积的1.4％，加入溶解的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、碳化二亚胺(EDC)溶液。终浓度分别为NHS:3mmol/L，NHS:12mmol/L。室温混匀20分钟，离心弃掉上清溶液，保留活化后的胶乳微球。
步骤(2)中，向偶联缓冲液中加入活化后的小粒径(80nm)胶乳微球，CRP抗体溶液终浓度:700mg/L，搅拌混匀15小时；最终得到偶联CRP抗体的小粒径胶乳微球。
标记好的大小粒径胶乳微球，按大小球体积比1:2.6混合后，即CRP抗体大粒径胶乳微球与CRP抗体小粒径胶乳微球的体积比为1:2.6；室温搅拌2小时充分混匀，微球总含量为0.29％，制备成试剂2(R2)溶液，2-8℃保存。
3、试剂R1中溶液的制备
pH为7.8，50mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.5mol/L氯化钠、0.01g/L吐温-80、0.01g/L吐温-20、0.03g/L聚氧乙烯月桂醚、0.02g/L脂肪醇聚氧乙烯(3)醚、0.1％叠氮钠。
4、CRP校准品制备
HEPES缓冲液的pH为7.2、10mmol/L、BSA：1.0％、蔗糖：2.0％、proclin-300:0.1％，CRP抗原。
试剂性能测试
采用全自动生化分析仪进行试剂性能测试的参数如表1。
表1全自动生化分析仪参数
Figure BDA0002869121950000081
Figure BDA0002869121950000091
1、线性范围
用超出线性范围上限的高浓度样本(350mg/L)和低浓度样本，混合成稀释成10个梯度样本，每个稀释度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释度(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程。线性范围可以达到350mg/L，且线性相关结果较好，相关系数R＞0.995，结果参照图4。
2、分析灵敏度
试剂测试浓度值约5.0mg/L的样本，计算出吸光度差值△A，见表2。
表2吸光度差值△A
Figure BDA0002869121950000092
3、准确度
重复测定ERM-DA474/IFCC参考物质3次，计算均值与标示值的相对偏差，结果见表3。
表3准确度结果
Figure BDA0002869121950000101
4、重复性
重复测定高、低浓度血清或血浆样本各10次，计算测定值的均值
Figure BDA0002869121950000103
和标准差(s)。按公式
Figure BDA0002869121950000104
计算变异系数(CV)。不同浓度值样本的CV较小，结果较好，重复性结果见表4。
表4重复性结果
Figure BDA0002869121950000102
5、测值相关性
实施例2所提供的试剂与进口性能较好的试剂同时检测高值、中值、低值的样本，以进口试剂测值(xi)为自变量，实施例2的测值(yi)为因变量求出线性回归方程。结果见图5。图5中结果显示，本发明制备得到的试剂，在对高值、中值、低值样本的测定时，与进口试剂的测试值-偏差较小，测值相关系数R＞0.999，结果较好。
对比例1
对比例1中试剂2(R2)制备过程需要的缓冲液参照实施例1。
本对比例中CRP抗体-大粒径胶乳微球溶液的操作步骤如下：
(1)胶乳微球活化
在活化液中加入胶乳微球，大粒径胶乳微球(220nm)，微球含量为活化液体积的0.4％，继续向活化液中加入溶解的N-羟基琥珀酰亚胺、碳化二亚胺溶液，使得NHS终浓度为0.3mmol/L，NHS终浓度为1.0mmol/L，室温混匀20分钟，离心弃掉上清溶液，得活化后的胶乳微球；
(2)胶乳微球与CRP抗体偶联
向偶联缓冲液中加入(1)中活化后的胶乳微球，使活化后的胶乳微球在偶联缓冲液中复悬，超声混匀，向包含活化后胶乳微球的偶联缓冲液中缓慢加入CRP抗体溶液(终浓度:320mg/L)搅拌混匀15小时，得偶联反应体系；
(3)偶联抗体的胶乳微球封闭
向(2)中得到的偶联反应体系中加入体积为偶联反应体系20％的封闭液，室温搅拌混匀2小时，完成胶乳微球封闭，得偶联封闭体系；
(4)偶联CRP抗体的胶乳微球清洗
将(3)中得到偶联封闭体系离心，弃掉上清溶液，得混合胶乳微球，向混合胶乳微球中加入清洗液，超声复悬微球至完全分散均匀，再次离心弃掉上清溶液，得抗体胶乳微球偶联物；
(5)偶联CRP抗体的胶乳微球保存
向(4)中得到的抗体胶乳微球偶联物中加入保存液，复悬超声混匀，2-8℃保存，得到CRP抗体-大粒径胶乳微球溶液。
本对比例中CRP抗体-小粒径胶乳微球溶液的制备步骤同实施例2，仅步骤(1)中，向活化液中加入小粒径胶乳微球(80nm)，微球含量为活化液体积的1.0％，加入溶解的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、碳化二亚胺(EDC)溶液。终浓度分别为NHS:3mmol/L，NHS:12mmol/L。室温混匀20分钟，离心弃掉上清溶液，保留活化后的胶乳微球。
步骤(2)中，向偶联缓冲液中加入活化后的小粒径胶乳微球(80nm)，使活化后的胶乳微球在偶联缓冲液中复悬，超声混匀，向包含活化后胶乳微球的偶联缓冲液中缓慢加入CRP抗体溶液(终浓度:700mg/L)搅拌混匀15小时，得偶联反应体系。
将标记好的CRP抗体-大小粒径胶乳微球，按大小球体积比1:2.5混合后，即CRP抗体大粒径胶乳微球与CRP抗体小粒径胶乳微球的体积比为1:2.5；室温搅拌2小时充分混匀，微球总含量为0.29％，制备成试剂2(R2)溶液，2-8℃保存。
对比例2
与对比例1的区别是：偶联抗体时大粒径胶乳微球浓度：0.35％，CRP抗体终浓度：280mg/L；小粒径胶乳微球浓度1.2％，CRP抗体终浓度800mg/L。其余比例不变。
对比例1、对比例2与实施例2的区别是：大小粒径胶乳微球的浓度、抗体添加的量不同，做了适当调整。试剂的分析灵敏度，测试低值样本、高值样本有较大差异。对比例1、2的分析灵敏度下降较多，测试低值样本偏高，高值样本偏低。数据见表5、表6：
表5不同胶乳微球溶液的分析灵敏度测试
Figure BDA0002869121950000121
表6梯度样本测试
Figure BDA0002869121950000122
Figure BDA0002869121950000131
对比例3
实施例2中得到的R2试剂与其他厂家C反应蛋白检测试剂盒中的R2试剂同时检测高值样本，检测两个试剂盒中试剂R2的钩状效应。检测结果见图6，图6中显示本发明所提供的R2试剂的钩状效应浓度值更高，浓度值约1500mg/L，其他厂家试剂R2的钩状效应约800mg/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.检测C反应蛋白的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1的pH为7.8，组分包括：50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、0.5mol/L氯化钠、0.01g/L吐温-80、0.01g/L吐温-20、0.03g/L聚氧乙烯月桂醚、0.02g/L脂肪醇聚氧乙烯(3)醚、0.1%叠氮钠；
所述试剂R2中包含CRP抗体胶乳微球组合物；所述CRP抗体胶乳微球组合物由220nm胶乳微球与300mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物和80nm胶乳微球与700mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物组成；
220nm胶乳微球与300mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物与80nm胶乳微球与700mg/L的CRP抗体偶联得到的偶联物的体积比为1:2.6；
所述胶乳微球为羧基胶乳微球；
所述220nm胶乳微球占活化液体积的0.35%；
所述80nm胶乳微球占活化液体积的1.4%；
所述CRP抗体为CRP多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，CRP抗体胶乳微球组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1：在活化液中活化胶乳微球；
S2：在偶联缓冲液中，将活化后的胶乳微球与CRP抗体偶联，得CRP抗体-胶乳微球偶联体系；
S3：使用封闭液对S2所述CRP抗体-胶乳微球偶联体系进行封闭，得CRP抗体-胶乳微球混合体系；
S4：使用清洗液缓冲液，清洗S3中所述CRP抗体-胶乳微球混合体系，得CRP抗体胶乳微球；
S5：在保存液中保存S4所述CRP抗体胶乳微球，得CRP抗体胶乳微球溶液；
S6：混合S5得到的不同粒径大小的CRP抗体胶乳微球溶液，得到CRP抗体胶乳微球组合物。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，
所述活化液：10mmol/L的2-吗啉乙磺酸，pH为6；
所述偶联缓冲液：10mmol/L的磷酸二氢钠，pH为7.6；
所述封闭液：10mmol/L甘氨酸缓冲液，200mg/L牛血清白蛋白，pH为7.2；
所述清洗缓冲液：10mmol/L甘氨酸缓冲液，pH为7.6；
所述保存液：50mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为8.1。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述保存液还包括：50g/L蔗糖或50g/L甘露醇或50g/L甘油或20g/L海藻糖或体积百分数为0.1%的Proclin-300中的一种或多种。
CN202011591127.7A 2020-12-29 2020-12-29 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用 Active CN112763725B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011591127.7A CN112763725B (zh) 2020-12-29 2020-12-29 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011591127.7A CN112763725B (zh) 2020-12-29 2020-12-29 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112763725A CN112763725A (zh) 2021-05-07
CN112763725B true CN112763725B (zh) 2022-03-22

Family

ID=75696875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011591127.7A Active CN112763725B (zh) 2020-12-29 2020-12-29 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112763725B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113358879A (zh) * 2021-06-10 2021-09-07 吉林基蛋生物科技有限公司 一种全量程c反应蛋白检测试剂盒
CN113671192A (zh) * 2021-07-29 2021-11-19 广西康柏莱科技有限公司 一种crp胶乳增强的试剂盒及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103073642B (zh) * 2012-08-29 2016-06-15 深圳伯美生物医药有限公司 Crp单克隆抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺
CN105158476A (zh) * 2015-06-03 2015-12-16 南京闻智生物科技有限公司 一种全量程c反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒
CN107656069A (zh) * 2017-09-28 2018-02-02 宁波普瑞柏生物技术股份有限公司 全血中全量程c‑反应蛋白定量检测试剂及方法
CN110702908A (zh) * 2019-10-10 2020-01-17 南京欧凯生物科技有限公司 一种全量程c反应蛋白检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN112763725A (zh) 2021-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018129885A1 (zh) 一种全血c反应蛋白检测试剂盒
CN102759631B (zh) 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒
CN103698525B (zh) 一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原ⅰ检测试剂盒
CN109596843B (zh) 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒
CN112763725B (zh) 一种胶乳比浊法测定c反蛋白检测试剂的制备及应用
CN103713140B (zh) 一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒
CN111337691B (zh) 一种灵敏、稳定的血清降钙素原测定试剂盒及其制备方法和应用
CN101377492A (zh) 胱抑素c测定试剂盒
CN103645323B (zh) 一种胱抑素c检测试剂盒及其制备方法
CN110702908A (zh) 一种全量程c反应蛋白检测试剂盒
CN101893619B (zh) 改进乳胶悬浊液稳定性的方法
CN107860929A (zh) 一种血清淀粉样蛋白a的免疫比浊检测试剂和方法
CN102636653A (zh) 复合胶乳粒子包被胱抑素c检测试剂盒
CN102662064A (zh) 检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法
CN108593641A (zh) 一种定量检测全血样品中待测物质的试剂盒及方法
CN111896748A (zh) 一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒
CN102809654A (zh) 一种双粒子复合的c-反应蛋白检测试剂盒
CN109212204A (zh) 一种乳胶免疫比浊法测定d-二聚体含量的试剂盒
CN106290907A (zh) 全血中血清淀粉样蛋白a定量检测试剂以及检测方法
Wu et al. Clinical Performance of the AMDL DR-70™ Immunoassay Kit for Cancer Detection
CN110596405A (zh) 胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白含量的试剂盒
CN112730848B (zh) 一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法
CN110940815B (zh) 定量测定猫血清淀粉样蛋白a的乳胶免疫比浊检测试剂盒
CN116593709A (zh) 一种基于乳胶增强免疫比浊法测定oxLDL的试剂盒及其制备方法
CN112698034B (zh) 一种癌胚抗原cea的检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Ke

Inventor after: Xia Lingchao

Inventor before: Li Ke

Inventor before: Xia Lingchao

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant