CN105158476A - 一种全量程c反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒 - Google Patents

一种全量程c反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，通过浊度的变化，达到定量检测的目的。该试剂盒包含试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为磷酸盐缓冲溶液，试剂R2为两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物。同时，该试剂盒与全自动特定蛋白分析仪联合使用，提高了检测的灵敏度与准确度，缩短了检测时间。本发明的全量程C反应蛋白检测试剂盒既可以测定高浓度CRP含量，又可以测定低浓度CRP含量，具有灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、重复性好及价格便宜等优点。

Description

一种全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒
技术领域
本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，具体来说涉及一种全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。
背景技术
C-反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)由肝细胞合成，在胎儿期产生，非母体胎盘传递。其产生机理是：当机体受感染或组织受损伤时巨噬细胞和其他白细胞等被激活，产生白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等细胞因子及其他介导物，这些细胞因子和介导物到达肝脏，刺激肝细胞和上皮细胞合成CRP。C反应蛋白因检测方法灵敏度的不同，可分为普通CRP、超敏CRP(hs-CRP)、全量程CRP。普通CRP临床上主要用于评价感染、组织损伤和炎症性疾病，同时为炎症性疾病的诊断提供数据支持，也为疾病的治疗和监控提供了诊疗信息。超敏CRP是诊断低水平炎症状态的灵敏指标，同时血清hs-CRP水平与动脉粥样硬化及急性脑梗死(ACI)等心脑血管疾病的发生、严重程度及预后也密切相关。全量程CRP可用于评估疾病活动性和疗效监控，也可用于预示健康人未来发生心血管疾病的概率，还可用于评价疾病感染的程度。
所谓全量程CRP是基于其测定方法更敏感，测定范围更宽广而命名。临床常规测定CRP的方法为免疫比浊法，测定范围一般为3～200mg/L，但存在灵敏度相对较低，无法准确测定3mg/L以下水平的CRP含量，因此，无法作为心血管疾病的危险指标，预测健康人将来心血管疾病发生的危险性。临床超敏CRP测定范围为0.3～100mg/L，测定范围又相对较窄，无法准确测定高浓度水平的CRP含量，因此，无法用于感染性疾病的诊断或疗效观察。
发明内容
发明目的：为克服现有技术的上述不足，本发明提供一种既可以测定高浓度CRP含量、又可以测定低浓度CRP含量、且灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、重复性好、价格便宜的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。
技术手段：为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：一种全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为磷酸盐缓冲溶液；所述的试剂R2为两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物(包括平均粒径较大的羧基化聚苯乙烯胶乳和平均粒径较大的羧基化聚苯乙烯胶乳)。
其中，所述的两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别为平均粒径范围为0.2μm～3μm的苯乙烯胶乳S1和0.005μm～0.2μm的苯乙烯胶乳S2。本发明所述的不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳，其平均粒径在0.005μm～3μm之间，粒径小于0.005μm时，胶乳颗粒聚集产生的吸光度变化很小，结果很难实现试验敏感度的要求，且制备较为复杂，延长了生产时间，增加了试剂的生产成本且不利于重复性，但当粒径大于3μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的吸光度变化超过了检测限，而且颗粒较大会加速自聚集，分散性降低。
本发明不同平均粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳中，平均粒径较小的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径优先在0.008μm～0.2μm之间选择，更为优选地，粒径范围为0.08μm，以保证所制备的检测试剂盒使得抗原抗体反应试验能够在一个较宽的范围内进行，并且能够延长时间稳定。本发明中不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳中，平均粒径较大的聚苯乙烯胶乳颗粒的最佳粒径优选为：0.2μm～2.8μm之间，更为优选地，粒径为0.198μm。
所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒中包含C反应蛋白标准品，所述C反应蛋白标准品中C反应蛋白含量介于0～500mg/L。
所述的试剂R1为包含4wt％聚乙二醇、0.5wt％Nacl和0.05wt％TritonX-100的磷酸盐缓冲液。
其中，所述的试剂R2的制备方法如下：
(1)将大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体按照质量比为3:7～7:3的比例混合得到抗体混合物，混合后的溶液中，抗体浓度保持在5～20mg/ml；
(2)将步骤(1)得到的抗体混合物分别致敏两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳，其中一种羧基化聚苯乙烯胶乳的平均粒径范围为0.2μm～3μm，另一种为0.005μm～0.2μm，分别将上述两种致敏的胶乳溶于0.15M、pH7.4缓冲液中形成试剂A和试剂B，将试剂A和试剂B混合，混合比例按胶乳的质量浓度小粒径：大粒径在900：100～999:1之间进行，得到试剂R2。
本发明进一步提出了上述全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒在检测CRP浓度上的应用。
具体地，在使用时，将所述全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒与全自动特定蛋白分析仪联合使用，检测过程样本用量为3μl，检测时间为5min。
本发明采用的胶乳增强免疫比浊法，特别之处在于，使用化学交联与共价交联相结合的方式，使得反应更快，试剂更稳定，灵敏度更高。小粒径胶乳颗粒使试剂具有宽范围，可以检测高浓度范围内被检测物的含量，而大粒径胶乳颗粒使试剂具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度范围内被检测物的含量。本发明采用两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物做试剂R2，使得抗原抗体反应试验从低浓度到高浓度这样一个很宽的范围内有高灵敏度和高准确性，且两种交联方式的联合使用，使得试剂的稳定性更强，同时适用于全自动特定蛋白分析仪使用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有优点：
(1)将两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物做试剂R2，使得试剂在保证高灵敏度的同时也保证了宽线性范围，同时拓宽了试剂的检测范围。普通CRP检测试剂盒仅限于检测3mg/L以上的CRP含量，不能用于预测将来心血管疾病发生的危险性以及局部感染或小病灶的检测。然而，本发明的试剂盒不仅可以准确测定3mg/L以下水平的CRP含量，灵敏度可达0.01mg/L，能够用于心血管疾病发生的危险性预测以及局部感染或小病灶的检测，而且还可以测定高浓度水平CRP含量(含量高达500mg/L)，因而能够用于诊断各种感染性和炎症等疾病。
(2)采用共价键交联与化学交联相结合的抗体包被技术，使得灵敏度有了较大的提高，检测线性范围也得以扩大，同时提高了试剂的稳定性；
(3)采用微孔过滤技术取得大小粒径均一的聚苯乙烯胶乳颗粒，使得试剂更稳定，不易发生自沉，有效的延长了定标有效期、提高了试剂的均一性、提高了反应的准确性和灵敏度。
附图说明
图1为胶乳凝集过程随反应时间示意图。
图2为胶乳增强免疫比浊检测原理示意图。
具体实施方式
本试剂盒涉及的主要原材料如下：
大鼠抗人CRP抗体(货号：NO501194)，小鼠抗人CRP抗体(货号：NO501195)、苯乙烯胶乳(JSR货号：P0014、P0113)、PEG(聚乙二醇)。
本发明主要试剂的配制方案如下：
试剂R1：4％PEG(聚乙二醇)，0.5％Nacl，0.05％TritonX-100的磷酸盐缓冲液，该试剂为无色透明溶液。聚乙二醇是一种敏化剂，可以提高试剂的分析灵敏，氯化钠保持试剂的电离强度，TritonX-100保持胶乳颗粒的分散性，避免胶乳自身凝聚。
试剂R2：用大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体混合后蛋白浓度10mg/ml的混合液分别致敏粒径为80nm和240nm的两种胶乳颗粒，致敏后置于0.15M、pH7.4的缓冲液中形成试剂，然后将这两种不同粒径的试剂按胶乳的质量浓度小粒径：大粒径＝950：50的比例混合即为试剂R2，具体过程如下：在1ml苯乙烯胶乳中，加入碳化乙二胺(EDC)3mg，然后加入NHS15mg；在25℃混匀30min，在2-8℃下离心30min；弃去上清液，加入10ml0.05MpH5.5的2-吗啉乙磺酸(MES)溶液，超声重悬；然后用50mMpH6.0MES稀释上述两种鼠单抗混合物，得到10ml5mg/L的抗体稀释液；将10ml抗体稀释液加入10ml超声重悬的胶乳中，混匀；25℃混匀3h，离心30min；弃去上清液，再加入10mlpH7.4的磷酸盐缓冲溶液(0.15M)，超声重悬，25℃混匀30min，在规定温度下离心30min；弃去上清液，加入0.15M、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，使得其中结合有大鼠抗CRP抗体和小鼠抗CRP抗体的苯乙烯胶乳的含量达到空白吸光度在0.3-1.4范围内。
本试剂盒的具体检测过程：
检测工具：日立7080型全自动分析仪。
分析方法：两点终点法；样品量：试剂1(R1)：试剂2(R2)＝3μl：200μl：50μl；校准方式：样条函数Spline；测定温度：37℃；样品与R1混匀，37℃恒温5分钟，空白管调零570nm处测吸光度；然后加入试剂R2混匀，37℃恒温5分钟，空白管调零570nm处测定反应开始时吸光度A1和结束时吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。
计算方法：根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
参考范围：血清C反应蛋白≤8.0mg/L(成人)，健康人无感染时C反应蛋白≧1mg/L，能预示将来发生心血管疾病的危险性；血清>8.0mg/L，用于感染性疾病的诊断或疗效观察。
本发明采用胶乳增强免疫比浊法检测C反应蛋白，是一种抗原抗体动态反应过程，具体原理如图2所示，分别选取粒径均匀一致的大小两种羧基化聚苯乙烯胶乳，将符合要求的大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体分别吸附在上述两种粒径均一的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。胶乳随反应时间的凝集过程如图1所示。在两种粒径均一的羧基化聚苯乙烯胶乳的作用下，大胶乳颗粒在低浓度区域迅速反应，小胶乳颗粒在高浓度区域迅速反应，由此提高高低浓度区域的精密度，且不会发生前带现象。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，与待测抗原量呈正比，也就是与检测体系中抗原量成正比，用全自动特定蛋白仪在570nm波长下测定吸光度(OD值)，利用校准品绘制标准曲线，计算CRP浓度。
本全量程CRP检测试剂盒的各项性能指标测试结果如下：
(1)灵敏度试验
测定8种不同CRP含量的样品，每个样品测定10次，通过计算平均值和SD，从表1可以得出该试剂盒的灵敏度为0.01mg/L。
表1：该试剂盒测量不同浓度CRP样品时所得测定值
均值(MEAN) SD M+2SD M-2SD
0 0.0001 0.0029 0.0059 -0.0057
0.005 0.0006 0.0058 0.0122 -0.0110
0.01 0.0101 0.0015 0.0131 0.0071
0.02 0.0199 0.0019 0.0237 0.0161
0.03 0.0303 0.0025 0.0353 0.0253
0.05 0.0498 0.0027 0.0522 0.0444
0.08 0.0799 0.0028 0.0855 0.0743
0.1 0.1001 0.0032 0.1065 0.0937
(2)高值线性测定
测定10种不同CRP含量的样品，每个样品测2次，从表2可见，本试剂盒的最高检测范围可达500mg/L。
表2：该试剂盒测量不同高浓度CRP样品时所得实际值
CRP理论值(mg/L) CRP实际值(mg/L)
1 0 0.09
2 50 50.11
3 100 100.20
4 150 151.12
5 200 201.02
6 250 249.08
7 300 301.19
8 350 349.69
9 400 402.20
10 450 451.21
11 500 495.59
12 550 520.01
(3)精密度试验
取两种不同CRP含量的血清样本，测定发现本试剂盒的批内精密度为1.98％和2.56％，而批间精密度为6.42％和5.48％。
表3：该试剂盒测量不同CRP血清样本所得批内差和批间差
(4)干扰实验
准备一份样品，样品CRP含量为8.0mg/L,取部分样品，向其中加入CRP标准品制得高浓度样品，经测定CRP浓度为43.26mg/L。向上述两种浓度的CRP血清样品中分别加入浓度为病理样本的最高浓度的干扰物，然后分别采用本发明试剂盒进行测定，每个浓度测定20次,干扰物对本试剂盒的干扰均在2％以内。
表4：各干扰物对CRP样品测量值的影响

Claims (8)

1.一种全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述的试剂R1为磷酸盐缓冲溶液；所述试剂R2为两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物，其中大鼠抗人CRP抗体与小鼠抗人CRP抗体的质量比为3:7～7:3。
2.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别为平均粒径范围为0.2μm～3μm的苯乙烯胶乳S1和0.005μm～0.2μm的苯乙烯胶乳S2。
3.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，大鼠抗人CRP抗体和小鼠抗人CRP抗体与羧基化聚苯乙烯胶乳的交联方式为共价交联与化学交联相结合。
4.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒中包含C反应蛋白标准品，所述C反应蛋白标准品中C反应蛋白含量介于0～500mg/L。
5.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1为包含4wt%聚乙二醇、0.5wt%Nacl和0.05wt%TritonX-100的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R2的制备方法如下：
（1）将大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体按照质量比为3:7～7:3的比例混合得到抗体混合物，混合后的溶液中，抗体浓度保持在5~20mg/ml；
（2）将步骤（1）得到的抗体混合物分别致敏两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳，其中一种羧基化聚苯乙烯胶乳的平均粒径范围为0.2μm～3μm，另一种为0.005μm～0.2μm，分别将上述两种致敏的胶乳溶于0.15M、pH7.4缓冲液中形成试剂A和试剂B，将试剂A和试剂B混合，混合比例按胶乳的质量浓度小粒径：大粒径在900：100～999:1之间进行，得到试剂R2。
7.权利要求1所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒在检测CRP浓度上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在使用时，将所述全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒与全自动特定蛋白分析仪联合使用，检测过程样本用量为3μl，检测时间为5min。
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