CN102095872A - 一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素c检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒。目前胱抑素C已经作为肾病早期检测的成熟指标。市场上已有市售的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，但多为来源于国外的产品。胶乳与抗体的连接是该类试剂盒开发的最重要环节，不恰当地选择材料或者交联的方法会严重的影响试剂盒的质量。本发明使用大粒径的胶乳制备的胱抑素C检测试剂盒与选择小粒径胶乳的试剂盒相比具有反应性更好、精密度好、分析灵敏度高、抗干扰能力强的优点。

Description

一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术，特别是涉及一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒。

背景技术

胱抑素C基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故机体胱抑素产生率相当恒定。因胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映变化的内源性标志物。

胶乳增强免疫透射比浊法：样品中的胱抑素C与试剂盒中的胶乳颗粒增强的抗胱抑素C抗体试剂发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，并在一定范围内反应液浊度与所加的抗原的量呈正相关，在546nm波长处测定反应液吸光度变化，其变化程度与样本中的胱抑素C的含量呈正比。

发明内容

本发明所要解决的问题是建立一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒，包括下述步骤：1)利用真核表达系统制备重组人胱抑素C作为标准品和免疫原。2)用自制重组人胱抑素C蛋白免疫山羊得到多克隆抗体。3)使用不同粒径胶乳与抗体进行交联制备胱抑素C胶乳增强试剂盒，并与国际知名企业相关产品进行试剂盒相关参数的比较。

所谓重组人胱抑素C是利用真核表达载体通过分子生物学等方法经克隆、表 达、纯化获得的与天然人胱抑素C具有相同免疫原性的高纯度重组蛋白。

所谓使用的多克隆抗体是采用山羊作为宿主以真核表达获得的重组胱抑素C作为免疫原，经免疫、亲和层析纯化获得的免疫球蛋白。

所谓不同粒径的胶乳，我们采用了在50nm-150nm范围内选择100nm的胶乳以及在151-300nm范围内选择200nm胶乳进行抗体的交联，交联方法选择了化学交联。

所谓参数比较，我们选择了反应线性、最低检出量、抗干扰度、精密度这几个参数。结果为我们自制的以200nm胶乳为材料的试剂盒性能最佳，且分析灵敏度、抗干扰度、精密度均优于其他以相对小粒径胶乳为材料的自制与某国际知名商品化试剂盒。

附图说明

图1是纯化后重组胱抑素C的SDS-PAGE图。1为胱抑素C蛋白，2为蛋白质分子量Maker。

图2是利用北京九强胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂盒所做的校准工作曲线。其中X轴表示胱抑素C的含量，Y轴表示吸光度。

图3是胱抑素C系列稀释后理论值与测定值比较图。

图4是使用本发明的100nm粒径胶乳胱抑素C胶乳增强免疫比浊法试剂盒工作曲线。其中X轴表示胱抑素C的含量(mg/mL)，Y轴表示吸光度。

图5是200nm粒径胶乳胱抑素C胶乳增强免疫比浊法试剂盒工作曲线。其中X轴表示胱抑素C的含量(mg/mL)，Y轴表示吸光度。

图6是某国际知名公司胱抑素C胶乳增强免疫比浊法试剂盒工作曲线。其中X轴表示胱抑素C的含量，Y轴表示吸光度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

胱抑素C真核表达载体的构建及其表达、纯化

1)胱抑素C真核表达载体的构建。

按照胱抑素C的序列设计引物，

上游引物ATCGGGATCCTCCAGTCCTGGCAAG

下游引物CGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGGCGTCCTGACAGGT，

其中在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引入EcoRI酶切位点及6X组氨酸标签(划线部分表示)。以56度为退火温度进行PCR扩增，胶回收后，进行酶切，与同样用BamHI、EcoRI消化的pcDNA3.1(+)载体连接并转化大肠杆菌DH5a，经过PCR鉴定，选择阳性重组子进行测序鉴定。

2)胱抑素C在CHO细胞中的表达

经过测序鉴定正确的克隆，大量制备质粒，使用lipofectAMINE试剂，依据说明书进行转染，加入G418(0.8mg/ml)，进行阳性克隆的筛选，将培养体系增大到1L，经过72小时的培养收集细胞，采用超声破碎法破碎细胞，离心后收集上清，使用Ni柱进行亲和层析。经过SDS-PAGE分析，蛋白大小为13KD左右与理论值相同，产量为3mg/L。根据SDS-PAGE的条带灰度估算蛋白浓度后，将蛋白浓缩到3mg/ml。

实施例2

使用北京九强公司胱抑素C检测试剂盒对纯化蛋白进行测定：

(1)先用迈瑞BS300全自动生化仪按照试剂盒说明书所说的方法步骤进行校准，其工作曲线见附图二。

(2)将纯化后的蛋白用蛋白保护液稀释到约8.50μg/ml，用以上曲线测定三次，结果均值为7.80μg/ml。

(3)用蛋白保护液将上面测定的蛋白倍比稀释成一系列值(包括原浓度和0浓度的蛋白保护液)，即7.80μg/ml，7.02μg/ml，6.24μg/ml，5.46μg/ml，4.68μg/ml，3.90μg/ml，3.12μg/ml，2.34μg/ml，1.56μg/ml，0.78μg/ml，0μg/ml。

(4)然后用生化仪对以上各浓度值测定三次取平均值，相关系数R＞0.99，理论稀释值与测定值比较图见附图三。

实施例3

胶乳自制试剂盒制备及不同粒径胶乳材料的试剂盒参数比较。

1)胶乳的连接采用化学交联法，步骤如下：

EDC和硫代NHS活化15min(PB Buffer)，振荡----20000rpm离心30min----弃上清后用PB复溶，加抗体室温振荡反应2小时---加等量0.1M PH＝8.0的甘氨酸缓冲液和10％BSA使终浓度为1％，反应半小时---20000rpm离心30min----用R2稀释液复溶。

R2稀释液为100mM Tris缓冲液

2)试剂盒的测定：

试剂盒测定使用迈瑞BS300全自动生化仪，检测主波长为546nm，副波长为670nm；

样品试剂比S∶R1∶R2＝3∶200∶50；

终点法，即加入R2后半分钟开始读点，5min后再次读点，然后吸光度算差值。

工作曲线测定

工作曲线制备标准曲线选择5点校准，分别为0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml。工作曲线结果见图4、图5、图6。可见使用200nm胶乳试剂盒的曲线相关系数最高。

精密度测定

批内精密度测定：

随机抽取一个正常血清样本和肾病病人血清样本连续进行20次测定，按照CV(％)＝SD/Mean×100进行计算。

批间精密度测定：用低值质控品和高值质控品选择3批试剂盒重复3次测 定。按照CV(％)＝(均值最大值-均值最小值)/总均值×100进行计算。

精密性结果如表一、表二、表三、表四、表五、表六所示。

结果显示使用200nm粒径胶乳为材料的试剂盒比同等条件下100nm粒径胶乳试剂盒与某国际知名试剂盒具有精密度更高的特点。

表一：100nm胶乳批内精密度结果

表二：200nm胶乳批内精密度结果

表三：某国际知名试剂盒批内精密度结果

表四：100nm胶乳批间精密度结果

表五：200nm胶乳批间精密度结果

表六：某国际知名试剂盒批间精密度结果

最低检出限测定：

取生理盐水和一个含量为0.7μg/ml的样本，按试剂盒使用说明书操作，重复测试20次，计算平均值 和标准差S，则最低检出限 

计算公式为：

$S=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(X-\stackrel{\‾}{X})}^2}{n-1}}$

式中：

X——系列测定值；

——测定均值；

n——测定次数；

S——标准差。

分析灵敏度测定：样本单位数×最低检出限/吸光度变化均值

分析灵敏度按照上述标准测定结果如表七、表八、表九所示，结果显示使用200nm粒径胶乳为材料的试剂盒分析灵敏度为0.055mg/L。同等条件下100nm粒径胶乳试剂盒的分析灵敏度为0.086mg/L，而某国际知名试剂盒具有分析灵敏度则是0.1156ug/L，虽然三种方法的试剂盒均能满足测定需求，但较高的分析灵敏度将会使试剂盒应用面更广更有市场竞争力。结果证明使用200nm粒径胶乳为材料的试剂盒分析灵敏度最佳。

表七：100nm胶乳分析灵敏度结果

最低检测限(LLD)＝2.55+3*1.504＝7.062

分析灵敏度＝0.70*7.062/61.30＝0.0806(mg/L)

表八：200nm胶乳分析灵敏度结果

最低检测限(LLD)＝2.25+3*1.209＝5.877

分析灵敏度＝0.70*5.877/74.75＝0.0550(mg/L)

表九：某国际知名试剂盒分析灵敏度结果

最低检测限(LLD)＝3.40+3*1.501＝7.903

分析灵敏度＝0.70*7.903/47.85＝0.1156(mg/L)

抗干扰分析：干扰物选择配方如表十——表十二所示。结果显示使用200nm胶乳为材料的试剂盒抗干扰能力最好。

表十：100nm胶乳抗干扰结果

测定次数	CysC
		1	0.65
2	0.64
		3	0.65
4	0.65
		5	0.64
Mean	0.646
		SD	0.01
90％M	0.58
		110％M	0.71

干扰物	测定值	偏差CV(％)
			样本+生理盐水	0.646	-
样本+VC(1000mg/L)	0.67	3.7

样本+TBiL(740mg/L)	0.675	4.5
			样本+Hb(5.0g/L)	0.67	3.7
样本+甘油三酯(33g/L)	0.685	6
			样本+肝素钠(200U/ml)	0.665	2.9

表十一：200nm胶乳抗干扰结果

测定次数	CysC
		1	0.65
2	0.64
		3	0.65
4	0.65
		5	0.64
Mean	0.646
		SD	0.01
90％M	0.58
		110％M	0.71

干扰物	测定值	偏差CV(％)
			样本+生理盐水	0.646	-
样本+VC(1000mg/L)	0.66	2.2
			样本+TBiL(740mg/L)	0.67	3.7
样本+Hb(5.0g/L)	0.655	1.4

样本+甘油三酯(33g/L)	0.675	4.5
			样本+肝素钠(200U/ml)	0.66	2.2

表十二：某国际知名试剂盒抗干扰结果

测定次数	CysC
		1	0.65
2	0.64
		3	0.65
4	0.65
		5	0.64
Mean	0.646
		SD	0.01
90％M	0.58
		110％M	0.71

干扰物	测定值	偏差CV(％)
			样本+生理盐水	0.646	-
样本+VC(1000mg/L)	0.66	2.2
			样本+TBiL(740mg/L)	0.665	2.9
样本+Hb(5.0g/L)	0.66	2.2
			样本+甘油三酯(33g/L)	0.68	5.3
样本+肝素钠(200U/ml)	0.655	1.4

Claims (5)

1.一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒

2.根据权利要求1所述的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，它是基于免疫比浊法定量检测样本中胱抑素C含量的试剂盒。

3.根据权利要求1所述的大粒径胶乳，其特征在于，试剂盒涉及的胶乳粒径在大于150nm和小于300nm的范围内。

4.根据权利要求1所述的增强型，其特征在于该试剂盒性能比国际上知名的使用小粒径胶乳的市售试剂盒性能较优。

5.根据权利要求4所述的性能，其特征在于包括不限于试剂盒的分析灵敏度、精密度、抗干扰能力等。

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