CN102127531A - 一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒。该试剂盒含有以韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液A、显色液B、终止液、阳性对照和阴性对照。VP1重组蛋白是以下述方法获得：以韩国新型鸭肝炎病毒作为材料，通过RT-PCR方法对其VP1基因进行扩增、克隆得到重组质粒pMD-VP1。然后定向插入到pET-32a(+)表达载体，筛选获得重组表达质粒pET-32a(+)-VP1。经ITPG诱导表达、纯化，获得VP1重组蛋白。该检测试剂盒用于韩国新型鸭肝炎的检测，其特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种新型鸭肝炎病毒抗体检测试剂盒，专用于韩国新型(基因C型)鸭肝炎病毒抗体的快速检测，属于生物技术领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎是危害雏鸭的一种急性、高度致死性和接触性的传染病。通常将鸭肝炎病毒分为3个血清型，即1型(DHV-1)、2型(DHV-2)和3型(DHV-3)。其中1型DHV呈世界性分布。近年来，国内许多地区出现新型鸭肝炎的报道，其与DHV-1在序列上存在显著差异，且新型DHV均不与DHV-1产生交叉反应，严重制约了养鸭业的发展。为了区分上述毒株，国内学者将其分别称为“台湾新型”、“韩国新型”和“血清1型”DHV。目前的研究发现，血清1型、“台湾新型”和“韩国新型”等DHV在进化分析中属于三个不同的基因型，即基因A型(血清1型)、基因B型(台湾新型)和基因C型(韩国新型)。迄今为止，国内报道的新型DHV毒株与“韩国新型”DHV的序列相似性非常高，均为基因C型。除台湾外，内陆尚未见基因B型DHV的报道。

长期以来鸭肝炎的检测一直依赖于传统的病毒分离和中和试验，该方法费时费力，不适于批量样品的检测。基于全病毒建立的ELISA方法因DHV纯化比较困难而限制了该方法的推广应用。目前尚未见针对韩国新型鸭肝炎抗体ELISA检测方法的报道。VP1作为鸭肝炎主要的保护蛋白，编码主要的抗原位点，已成为研究的首选基因。因此，利用基因工程技术研制开发适用于韩国新型鸭肝炎抗体检测的特异的、敏感的、适合基层应用的ELISA检测试剂盒，对于韩国新型鸭肝炎的预防和控制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服传统的鸭肝炎检测方面的不足，提供一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白的制备，包括以下步骤：

1)以韩国新型鸭肝炎病毒作为材料，通过RT-PCR方法对其VP1基因(SEQ-1)进行扩增、克隆得到重组质粒pMD-VP1；扩增VP1基因的上下游引物分别是：

正链引物(上游引物)：5’-GAATTCGGTGATTCCAATCAGCT-3’(SEQ-3)(EcoR I位点)，

负链引物(下游引物)：5’-CTCGAGTTCAATCTCCAGATGGA-3’(SEQ-4)(Xhol I位点)，

扩增片段大小为720bp。

2)以EcoR I和Xhol I同时对重组质粒pMD-VP1和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，16℃连接过夜，转化BL21(DE3)感受态细胞，提取质粒，经EcoR I和Xhol I双酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-VP1。

3)将阳性重组表达质粒pET-32a(+)-VP1及空白载体pET-32a(+)分别转化BL21(DE3)感受态细胞，获得的阳性质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后4h的菌体，超声波破碎，离心后取沉淀进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，经鉴定的重组菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCL溶液中显色5～10min，最后用双蒸水洗涤。将目的蛋白条带切下，PBS洗涤3次，用玻璃棒将其捣细，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。

本发明的技术方案是：一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是，包括以韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板。

ELISA板的最佳制备条件为：用pH8.5的0.05M Tris-HCL缓冲液作包被液，将韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白稀释为25μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2小时，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中保存。

本发明的进一步技术方案是：一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，包括以下组分：以韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板：5块；样品稀释液：200mL；10×浓缩洗涤液：400mL(用前1∶10稀释)；酶结合物工作液：50mL；显色液A：50mL；显色液B：50mL；终止液：60mL；阳性对照：2mL；阴性对照：2mL。

上述韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒中，样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.05M pH7.4的磷酸盐缓冲液；10×浓缩洗液为含0.5％吐温-20的0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液；酶结合物工作液为美国KPL公司生产的HRP-羊抗鸭IgG；显色液A为0.2mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液；阳性对照为经韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白免疫获得的阳性血清(OD_450nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤；阴性对照为经筛选获得的阴性血清(OD_450nm≤0.25)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤。

上述韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒使用方法：将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育45min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。其检测样本的判定标准为：以待检样本OD_450nm值与阴性对照OD_450nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD_450nm值大于0.228判为阳性。

本发明具有下列优点：

1.本发明选择原核表达载体pET-32a(+)构建重组表达质粒进行融合表达，利用其组氨酸标签进行重组蛋白的纯化，解决了DHV全病毒纯化困难的问题。

2.本发明以基因工程表达的重组VP1蛋白为基础制备而成，重组VP1蛋白为非全病毒抗原，安全性好，不含无关杂蛋白，只与韩国新型鸭肝炎病毒阳性血清特异结合，不与其它病毒阳性血清发生交叉反应，具有良好抗原性，因此所发明的检测试剂盒具有很高的特异性和敏感性。

3.本发明建立的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。

附图说明

图1是VP1基因扩增的电泳图片，其中1：韩国新型DHV VP1基因，2：DNA MarkerDL2000。

图2是VP1基因克隆到pMD18-T载体得到的重组质粒pMD-VP1的酶切鉴定图片，其中1：DNAMarker DL2000，2：重组质粒pMD18-VP1的酶切片段。

图3是VP1基因插入到pET-32a(+)载体得到的重组质粒pET-32a(+)-VP1的酶切鉴定图片，其中1：DNA Marker DL2000，2：重组质粒pET-32a(+)-VP1的酶切片段，3：DNA MarkerDL15000。

图4是诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析图片，其中1：蛋白Marker，2～5重组质粒pET-32a(+)-vp1分别诱导表达1h，2h，3h，4h的沉淀，6：空载体诱导4h对照，7～10：重组质粒pET-32a(+)-vp1分别诱导表达1h，2h，3h，4h的上清。

图5是韩国新型DHVVP1表达产物的Western-blot分析图片，其中M：预染蛋白Marker，1：诱导表达蛋白，2：空载体诱导对照。

图6是重组蛋白的纯化图片，其中1：蛋白Marker，2：纯化的重组蛋白，3：未纯化重组蛋白。

具体实施方式

1.VP1基因的扩增与表达载体的构建

根据GenBank中已登录的韩国新型DHV VP1基因序列(SEQ-1)，设计一对引物：上游引物：5’GAATTCGGTGATTCCAATCAGCT 3’(SEQ-3)；下游引物：5’CTCGAGTTCAATCTCCAGATGGA 3’(SEQ-4)。利用Trizol试剂提取韩国新型DHV RNA模板。RT反应体系(20μL)：25mmol/L Mg²⁺1.2μL、10mmol/L dNTP 2.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、下游引物1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板10.3μL。置于PCR扩增仪进行反应，反转录酶1μL于42℃时加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。PCR反应体系(50μL)：ddH₂O 38.1μL、10×缓冲液4.0μL、25mmol/L Mg²⁺1.4μL、5U/μL rTaqDNA聚合酶0.5μL、上游引物1.0μL、RT产物5.0μL。置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃5min预变性；94℃变性30sec、50℃退火30sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，以确定产物大小(如图1所示)。将扩增出的VP1基因克隆至pMD18-T载体中，经EcoR I和Xhol I双酶切鉴定、测序正确的阳性克隆命名为pMD-VP1(如图2所示)。以EcoRI和Xhol I同时对重组质粒pMD-VP1和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，16℃连接过夜，转化BL21(DE3)感受态细胞，提取质粒，经EcoR I和Xhol I双酶切鉴定、测序正确的阳性克隆命名为pET-32a(+)-VP1(如图3所示)。

2.重组表达质粒的诱导表达

将阳性重组表达质粒pET-32a(+)-VP1及空白载体pET-32a(+)分别转化BL21(DE3)感受态细胞。阳性质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，进行诱导表达。收集不同诱导时间表达的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，并对表达产物进行Western blot分析，一抗用鸡抗韩国新型DHV阳性血清，二抗用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG，DAB显色。结果表明重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，分子量约为47ku，与预期结果相符，以诱导后4h表达量最大(如图4所示)。Western-blot分析发现，表达的重组蛋白能够与韩国新型鸭肝炎阳性血清进行反应，具有良好的免疫学活性(如图5所示)。

3.重组蛋白的纯化

选用KCL显色法：将破碎好的重组菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCL溶液中显色5-10min，最后用双蒸水洗涤。将目的蛋白条带切下，PBS洗涤3次，用玻璃棒将其捣细，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。结果只有一条47ku的目的蛋白条带，表明KCL显色法获得了较纯的目的蛋白(如图6所示)。

4.样品稀释液、洗涤液、终止液的配制

样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄0.2g，NaHPO₄·12H₂O 2.9g，NaCL 8g，定容至1000mL，再加0.5mL吐温-20)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄2g，NaHPO₄·12H₂O 29g，NaCL 80g，定容至1000mL，再加5mL吐温-20)；终止液为2M硫酸溶液(取111.2mL浓硫酸即18M，稀释定容至1000mL)。

5.阳性对照和阴性对照的制备

将用韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白免疫获得的阳性血清用样品稀释液作1∶100稀释(OD_450nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为韩国新型鸭肝炎抗体间接ELISA检测试剂盒中的阳性对照；将筛选获得的阴性血清(OD_450nm≤0.25)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为韩国新型鸭肝炎抗体间接ELISA检测试剂盒中的阴性对照。

6.显色液的配制

显色液A：称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL；显色液B：称取21g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，28.2g无水磷酸氢二钠(Na₂HPO4)，6.4mL 0.75％过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调pH值4.5～5.0。

7.检测新型鸭肝炎抗体的间接ELISA反应条件的确定

抗原和血清最佳工作浓度的确定：采用方阵试验确定。用包被缓冲液将VP1重组蛋白作1∶10，1∶20，1∶40，1∶80等系列稀释，包被ELISA反应板，100μL/孔；韩国新型DHV阳性血清和阴性血清用样品稀释液分别作1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800等系列稀释；进行间接ELISA测定。显色液显色，终止液终止反应；测定光波长450nm的OD值。取阳性血清OD_450nm1.0左右，阴性血清OD_450nm0.2左右，且阳性血清OD_450nm/阴性血清OD_450nm即P/N值大于2.1的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度，结果如表1所示，结果表明血清最佳稀释度为1∶100，抗原最佳浓度25μg/mL。

表1抗原和血清最佳工作浓度的确定(OD_450nm值)

8.结果判定标准

将收集的40份无韩国新型DHV抗体的鸭血清，在最佳工作条件下进行间接ELISA测定，以确定鸭血清在无韩国新型DHV感染时其吸收值范围(X±3SD＝0.201±3×0.009＝0.228)，因此确定以待检样本OD_450nm值与阴性OD_450nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD_450nm值大于0.228判为阳性。

9.韩国新型鸭肝炎抗体检测ELISA板的制备

用pH8.5的0.05M Tris-HCL缓冲液作包被液，将韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白稀释为25μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2小时，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中备用。

10.ELISA操作程序的确定

按以上确定的优化条件进行操作，即得到本方法的最佳操作程序：

将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育45min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。

实施例：

一、韩国新型鸭肝炎抗体ELISA检测试剂盒，包括以下组分：

1)ELISA板条(96孔)：5块

2)10×浓缩洗涤液：400mL(用前1∶10稀释)

3)样品稀释液：200mL

4)羊抗鸭酶标二抗(酶结合物工作液)：50mL

5)显色液A：50mL

6)显色液B：50mL

7)终止液：60mL

8)阳性血清对照(+)：2mL

9)阴性血清对照(-)：2mL

二、操作步骤：

1、将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性血清对照、阳性血清对照，37℃孵育45min；

2、弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；

3、每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；

4、重复步骤2；

5、依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育15min；

6、加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。

三、应用

1、特异性试验

11交叉试验：用VP1重组蛋白建立的间接ELISA检测试剂盒分别检测鸭瘟、番鸭细小病毒病、鸭新城疫、鸭流感、传统1型鸭肝炎(基因A型)、韩国新型鸭肝炎(基因C型)等阳性血清及韩国新型鸭肝炎阴性血清，每样本4个重复，进行交叉反应性测定，检测结果显示韩国新型鸭肝炎阳性血清为阳性结果，其余均为阴性，表明该检测试剂盒与上述病毒无交叉反应；

1.2阻抑试验：将韩国新型鸭肝炎阳性血清分别与等体积的韩国新型鸭肝炎病毒(200TCID₅₀/0.2ml)和鸭瘟病毒(200TCID₅₀/0.2ml)混合，室温作用30min，将处理后的血清与未作任何处理的血清分别按最佳反应条件进行阻抑试验测定，结果表明韩国新型鸭肝炎阳性血清只能被韩国新型鸭肝炎病毒特异性阻抑，而不能被鸭瘟病毒阻抑。

2、敏感性试验

10份韩国新型鸭肝炎阳性血清分别从1∶2开始倍比稀释，其余条件按最佳反应条件进行ELISA检测，同时用病毒中和试验(VN)对其终点滴度进行测定。结果表明，ELISA检测试剂盒的敏感性要明显高于中和试验(如表2所示)，二者的相关系数为0.985。

表2敏感性试验

3、重复性试验

用两次包被的酶标板，检测5份韩国新型鸭肝炎阳性血清和5份阴性血清，每个样品重复检测5次，测定其变异系数CV％(CV＝S.D./X×100％，S.D.：标准差，X：算术平均值)。结果表明变异系数最大为5.12％，最小为1.0％。10份血清变异系数都较小，具有较好的重复性。

4、临床应用

临床应用检验的样品为试验样品10份和部分送检的样品60份。应用ELISA检测试剂盒和血清中和试验(VN)同时检测送检样品，比较两种方法的符合率。其中ELISA检测试剂盒检出阳性血清为30份，阳性检出率为42.9％，中和试验检出阳性血清29份，阳性检出率为41.4％，两种方法的符合率为98.6％(如表3所示)。

表3ELISA检测试剂盒与中和试验比较

注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％

Claims (7)

1.韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白的制备，包括以下步骤：

1)以韩国新型鸭肝炎病毒作为材料，通过RT-PCR方法对其VP1基因进行扩增、克隆得到重组质粒pMD-VP1；扩增VP1基因的上下游引物分别是：

上游引物：5’-GAATTCGGTGATTCCAATCAGCT-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTCAATCTCCAGATGGA-3’

扩增片段大小为720bp；

2)以EcoR I和Xhol I同时对重组质粒pMD-VP1和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，16℃连接过夜，转化BL21(DE3)感受态细胞，提取质粒，经EcoR I和Xhol I双酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-VP1；

3)将阳性重组表达质粒pET-32a(+)-VP1及空白载体pET-32a(+)分别转化BL21(DE3)感受态细胞，获得的阳性质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后4h的菌体，超声波破碎，离心后取沉淀进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，经鉴定的重组菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCL溶液中显色5～10min，最后用双蒸水洗涤；将目的蛋白条带切下，PBS洗涤3次，用玻璃棒将其捣细，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。

2.一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板。

3.如权利要求2所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是，所述ELISA板的制备方法为：用pH8.5的0.05M Tris-HCL缓冲液作包被液，将韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白稀释为25μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭2小时，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时。

4.如权利要求2或3所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是，还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液A、显色液B、终止液、阳性对照和阴性对照。

5.如权利要求4所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是，所述样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.05M pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述10×浓缩洗液为含0.5％吐温-20的0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶结合物工作液为美国KPL公司生产的HRP-羊抗鸭IgG；所述显色液A为0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，所述显色液B为含0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；所述终止液为2M硫酸溶液；所述阳性对照为经韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白免疫获得的阳性血清，其OD_450nm≥1.0，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤后获得；所述阴性对照为经筛选获得的阴性血清，其OD_450nm≤0.25，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤后获得。

6.如权利要求5所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是，所述试剂盒各组分的量为：以韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板：5块；样品稀释液：200mL；10×浓缩洗涤液：400mL；酶结合物工作液：50mL；显色液A：50mL；显色液B：50mL；终止液：60mL；阳性对照：2mL；阴性对照：2mL。

7.如权利要求5或6所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征是，将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育45min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值；以待检样本OD_450nm值与阴性对照OD_450nm值的比值大于或等于2.1，且待检样本OD_450nm值大于0.228判为阳性。

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