CN103063838B

CN103063838B - 一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒

Info

Publication number: CN103063838B
Application number: CN201210385688.0A
Authority: CN
Inventors: 田纯见; 林志雄; 马静云; 罗琼; 鱼海琼; 罗长保; 陈茹; 刘志玲; 王宏; 吴晓薇; 毕英佐
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2032-10-11
Also published as: CN103063838A

Abstract

一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒，包含3块预包被ELISA微孔板：分别预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原、吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3B抗原、吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3D抗原；山羊抗猪抗体-辣根过氧化物酶结合物；洗涤液：0.15mol/L、pH7.2的PBS；底物：0.1%TMB溶液；显色剂：0.015%H₂O₂；样本稀释液：0.1%牛血清白蛋白，0.1%叠氮化钠作保护剂；终止液：2mol/LH₂SO₄；阳性对照品，500倍稀释，0.1%叠氮化钠作保护剂；阴性对照品，500倍稀释，0.1%叠氮化钠作保护剂。

Description

一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种家畜口蹄疫感染与免疫鉴别试剂盒。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）又称口疮热（Aphthous fever），是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性传染病。除了猪、牛、羊等主要家畜之外，FMDV还可以感染三十多种野生动物，感染后发病率几乎高达100％。患病动物的口、舌、蹄和乳房等部位出现水泡，破溃并形成烂斑。人也可以感染FMD，症状较轻，大多病程呈良性经过。世界各国都高度重视FMD疫情，世界动物卫生组织（OIE）和世界粮农组织（FAO）将其列为A类动物传染病之首。

区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物能准确反映一个地区的FMD感染状态，也是OIE判断一个国家或地区有无FMD的依据。在采取FMD计划免疫的预防措施的国家或地区，也必须实行严格的FMD进口检疫和国内疫情监测。在疫情监测的过程中，通常是以动物血清抗体检测为主，然而现有的血清学检测方法主要是针对FMDV的结构蛋白（structural protein）抗体的监测，这种检测可以确定动物是否接触过FMDV，但难以区分FMD免疫动物和自然感染动物。OIE规定存在FMD的地区必须进行疫苗免疫，而且一般采用灭活苗免疫。因为在疫苗制备过程中，病毒要经过灭活，纯化和乳化等过程，FMDV16的非结构蛋白（nonstructural protein，NSP）受到严重破坏，疫苗中几乎不存在NSP，因此，免疫动物体内无NSP抗体。感染FMD的动物，野毒在成熟或装配过程中伴随NSP的产生，因此感染动物体内存在NSP抗体。所以，检测NSP抗体可以区分免疫动物和感染动物。

NSP抗体检测方法包括以2C、3A、3B、3ABC和3D为基础的琼脂凝胶免疫扩散实验（AGID）、乳胶凝集实验、酶联免疫吸附实验（ELISA）、酶联免疫电转化斑点实验（enzyme immuno-transfer blotting，EITB）方法和免疫阻断方法（immuno-block method），De Dingo等（1997）应用ELISA的结果表明，ELISA是最佳方法，客观性强，敏感性高，适宜大规模样品的检测。

但是，现有的检测方法仍存在着缺点和不足，主要有以下几点：①未利用噬菌体表面展示的多拷贝NSP抗原；②抗原分离纯化工艺复杂。

发明内容

本发明的主要目的是，提供一种利用噬菌体表面展示的多拷贝NSP抗原，简化抗原分离纯化制备试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒，所述试剂盒包含：

一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3ABC抗原的氨基酸序列如SEQ ID: No.1所示；

一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3B抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3B抗原的氨基酸序列如SEQ ID: No.2所示；

一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3D抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3D抗原的氨基酸序列如SEQ ID: No.3所示；

酶结合物：山羊抗猪抗体-辣根过氧化物酶结合物的水溶液，浓度为55μmol/L；

洗涤液：0.15mol/L、pH7.2的PBS；

底物：浓度为0.1%g/mL）的TMB水溶液；

显色剂：浓度为0.015%g/mL）的H₂O₂水溶液；

样本稀释液：0.1%g/mL牛血清白蛋白，添加0.1%g/mL叠氮化钠作保护剂；

终止液：2mol/L的H₂SO₄；

阳性对照品：含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1：500进行稀释，添加0.1%g/mL叠氮化钠作保护剂；

阴性对照品：不含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1：500进行稀释，添加0.1%g/mL叠氮化钠作保护剂。

如上所述的试剂盒，其中优选地，所述ELISA微孔板为96孔ELISA微孔板。

如上所述试剂盒的使用方法，其步骤如下：

A. 用蒸馏水或去离子水将所述洗涤液按1:10的体积比稀释，作为工作洗涤液；

B. 用所述样本稀释液将待检血清按1:100的体积比稀释；

C. 取所述阴性对照品和阳性对照品各100μL分别加入一个反应孔内，并取100μL所述样本稀释液加入一个反应孔内作为空白对照，其余的每个样本检测孔中分别加已稀释待检血清100μL；37℃避光反应30分钟后甩去孔内液体，每个孔内注满所述工作洗涤液，重复洗涤3次，每次洗涤均停留1分钟后甩净拍干；

D. 除空白对照孔外其余每孔内加入1滴所述酶结合物，37℃下避光反应30分钟后甩去孔内液体，按照步骤C中所述的操作对孔进行洗涤，拍干；

E. 各孔内分别加入所述底物和显色剂各一滴，混匀，37℃下避光显色10分钟，之后分别加入所述终止液一滴，混匀，终止反应；

F. 通过仪器判断结果，以空白对照调零，以620nm作参比波长，用酶标仪于450nm读取O.D值，若检孔O.D值大于阴性对照2.1倍为阳性，当阴性对照O.D值低于0.08时按0.08计算。

注意事项：试剂盒在2-8℃下保存，每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间不可混用，各试剂盒之间不可混用。

洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放三十秒钟后甩去孔内液体。禁用自来水等其它水源。

为提高实验的可比性建议使用仪器判读结果，并对阴性对照测复孔以减少误差。

一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3ABC基因，其特征在于，

上游引物T4-3A的核苷酸序列如SEQ ID: No.4所示，

下游引物T4-3C的核苷酸序列如SEQ ID: No.5所示。

一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3B基因，其特征在于，

上游引物T4-3B1的核苷酸序列如SEQ ID: No.6所示，

下游引物T4-3B2的核苷酸序列如SEQ ID: No.7所示。

一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3D基因，其特征在于，

上游引物T4-3D1的核苷酸序列如SEQ ID: No.8所示。

下游引物T4-3D2的核苷酸序列如SEQ ID: No.9所示。

本发明的有益效果为：

本发明首次将口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）3ABC、3B和3D展示在T4噬菌体表面，并使用改造的高效可溶性表达载体对3B蛋白进行融合表达，建立4种区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物DIVA－ELISA方法。

本发明还提供了利用T4噬菌体表面多拷贝展示口蹄疫病毒NSP抗原3ABC、3B及3D制备的ELISA试剂盒，为感染与免疫鉴别诊断提供了新的技术手段。

具体实施方式

一、制备抗原蛋白

1. 根据GenBank中注册的O型FMDV的3ABC和3D基因序列设计特异性的引物对T4-3A/T4-3C和T4-3D1/T4-3D2，分别用于克隆和表达3ABC和3D基因：

上游引物T4-3A：SEQ ID: No.4；

下游引物T4-3C：SEQ ID: No.5；

上游引物T4-3D1：SEQ ID: No.8；

下游引物T4-3D2：SEQ ID: No.9。

采用RT-PCR方法扩增3ABC和3D基因片段并克隆到pGEM-T Easy载体中进行序列测定。对两个基因的操作过程相同，详述如下。

（1）总RNA的萃取：

取含FMDV的乳鼠体，剪碎，加入Eppendorf管中称重。按照1g加入10mL的比例逐渐加入199培养液（美国Gibco公司产品），在消毒的玻璃研磨器内反复研磨得到均匀的混悬液。从中吸出250μL混悬液，加入TRIZOL LS总RNA抽提溶液（美国Invitrogen公司产品）750μL，混合备用，可置-80℃保存。

抽提BHK21细胞传代适应的FMDV时，待细胞单层出现100%细胞病变（CPE）时，细胞脱壁悬浮。无菌收集细胞和培养液，10,000rpm离心10min。取沉淀，按照每10cm²的BHK21细胞单层加入1mL TRIZOL LS，用移液器吹打溶解为均匀的混悬液，即用或置-80℃保存。

将上述制备好的样品置Eppendorf管中，15～30℃下孵育5min。然后按照每1mL TRIZOL LS加入0.2mL氯仿的比例加入氯仿，盖紧，大力摇动15次（共约15s），置室温孵育2-3min后，在预先致冷至2-8℃的冷冻高速离心机中离心15 min。

离心后用1mL一次性注射器吸取上清，置新的无菌Eppendorf管中，按照1mL TRIZOL LS原量加入异丙醇0.5mL，室温下置10 min，再在预先致冷至2-8℃的冷冻高速离心机中离心10 min。

用移液器吸去上清，沉淀按TRIZOL LS原量加入等量75%乙醇，轻轻振摇，在预先致冷至2-8℃的冷冻高速离心机中离心15 min。

用移液器去掉酒精，打开Eppendorf管盖，置超净工作台吹风干燥5-10min。管底的微量白色物质即为抽提出的总RNA。

（2）反转录：

取0.2mLEppendorf管，作为A管，加入：

5×反转录酶XL 缓冲液	4μL
		dNTP	5μL
RNA酶抑制剂	0.5μL

将A管置冰盒中，加入AMV反转录酶XL 2μL；

在抽提的总RNA的Eppendorf管中，加入：

上游引物	2μL
		下游引物	2μL
DEPC水	3-5μL

轻轻吹打溶解，从中吸取8.5μL加入A管。将A管以5,000rpm离心10s，置HYBAID PCR仪中，42℃保温1h。

（3）PCR扩增：

在0.5mL Eppendorf管中，制备反应体系，总量为100μL，其中加入：

反转录产物	10μL
		上游引物	1μL
下游引物	1μL
		ExTM Taq DNA聚合酶	1μL
10×ExTMTaq缓冲液	10μL
		MgCl₂溶液	8μL
dNTP混合物	5μL
		DEPC-水	64μL

5,000rpm离心10s；用0.2mL Eppendorf管分装，10μL/管，向每管中加入10μL PCR矿物油，5,000rpm离心10s。按照温度梯度，置HYBAID梯度PCR仪上，进行降落PCR扩增，相应的循环条件和温度列表如下：

循环数	变性	复性	聚合
				首轮循环	94℃，3min	55-65℃，45s	72℃，60s
后续循环（30个）	94℃，45s	55-65℃，45s	72℃，60s
				末轮循环	94℃，45s	55-65℃，45s	72℃，10min

（4）PCR产物的检测：

用1×TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，其中添加0.5ug/mL溴化乙锭。取PCR扩增产物5μL，加入2μL加样缓冲液，混匀后加入一个加样孔，设置蛋白Marker对照，用恒压80V（约35mA）电泳20～50分钟。用紫外透射仪观察结果，凝胶成像系统拍照。

（5）PCR产物的回收与纯化：

应用DNA快速纯化回收试剂盒（德国QIAGEN公司产品）回收PCR产物：用1×TAE制备1%琼脂糖回收凝胶，其中添加0.5ug/mL溴化乙锭，加宽梳形成回收槽孔。在PCR产物中加入适量加样缓冲液，混匀后移入琼脂回收槽孔，另设一较小的DNA Marker孔道：用新鲜1×TAE电泳缓冲液，在EC-320电泳仪上80V恒压电泳45分钟。将回收胶取出，置紫外透射仪上小心地切下有所需大小的DNA条带的琼脂，操作中保持干净不受污染。

按照1g加入3mL的比例混合琼脂和溶液B，在装有切下琼脂的Eppendorf管中加入溶液B，盖紧，置50～55℃水浴10～20分钟，至琼脂胶充分溶化。其间漩涡振荡三次，以保证琼脂胶充分溶化。将溶化的琼脂倒入离心柱中，置50℃培养箱中静置20分钟，8,000离心60s。一次加不完可分两次离心。加入500μL溶液C，8,000rmp离心60s，倒掉溶液。重复一次。15,000rpm离心60s，去掉水份。取出离心柱，置于Eppendorf管中，加入50℃预热的溶液D，在50℃培养箱中静置20min。15,000rpm离心60s，Eppendorf管中即为回收的DNA。检测合格后，置-20℃保存备用。

（6）PCR产物加尾：

取0.2mL Eppendorf管，加入：

10×EXTM Taq缓冲液	1μL
		dATP	1μL
PCR回收纯化产物	6μL
		PCR矿物油	10μL
10×EXTM Taq酶	2μL

5,000离心10s；置HYBAID PCR仪上，70℃运行30min，为PCR产物加上多聚A（腺苷酸）尾巴。

（7）PCR产物与pGEM-T Easy载体质粒连接：

取0.2mL Eppendorf管，加入：

2×T4 DNA连接酶缓冲液	5μL
		pGEM-T Easy载体	1μL
T4 DNA连接酶	1μL
		已加多聚A尾巴的PCR产物	3μL

5,000rpm离心10s。置4℃冰箱连接过夜。

（8）E.coli DH5α感受态细胞的制备和连接产物的转化：

在新鲜LB培养板上划线接种E.coli DH5α，置37℃培养过夜。从培养板上挑取单个菌落，接种于2-3mL LB培养液中，37℃下以220rpm振摇培养过夜。将菌液置0℃的冰水混合物中3h。取1mL菌液接种至100mL新鲜LB培养液，置250mL三角烧瓶中，37℃下以200rpm振摇培养2-3h，使菌落OD值（600nm）达到0.3-0.4。将三角瓶取出，立即冰水浴15 min。

在无菌条件下，将菌液转移至4℃预冷的两个50 mL离心管中，3,000rpm 4℃离心10 min。弃去上清液，两支管均加入4℃预冷的灭菌双蒸水，重悬浮菌体。将离心管的菌液合并，3,000rpm 4℃离心10 min。弃去上清液，加入4℃预冷的0.1mol/L灭菌CaCl₂ 10mL，重悬浮菌体，冰水浴15分钟，3,000rpm 4℃离心10分钟。尽量弃去上清液，加入4℃预冷的0.1mol/L灭菌CaCl₂ 1mL。将菌液分装，每个0.2mL Eppendorf管加入50μL，再加入10μL 4℃预冷的灭菌甘油，混匀后，置-80℃保存备用。

取制备好的感受态细胞E.coli DH5α 50-100μL，加入2-3 μL连接产物，轻轻旋转以混合均匀，冰水浴30 min。在HYBAID PCR仪上，42℃热休克1.5min，立即取出冰水浴3 min。将转化的细胞吸出，加入200μL LB培养液中，37℃下以150rpm振摇培养1.5h。

取LA培养板两个，各加入20mg/mL 的X-gal 40μL和IPTG 4μL，无菌涂布均匀，置37℃吸附30min。取振摇培养的转化细菌100-150μL，分别加在两个板上，涂布均匀，37℃培养过夜。

观察菌落生长情况，检查经过24～48h培养的蓝白斑菌落。挑取白色菌落，分别接种2-3mL LA培养液，37℃下以220rpm振摇培养，用于阳性重组子的筛选。

（9）阳性重组子筛选：

取0.5mL Eppendorf管，加入：

上游引物	1.5μL
		下游引物	1.5μL
Taq DNA聚合酶	4μL
		10×PCR缓冲液	10μL
dNTP	7μL
		DEPC水	66μL

5,000rpm离心10s；取0.2mL Eppendorf管，每管加入9μL上述PCR混合液，在其中分别加入1μL不同白色菌落的培养液和10μL PCR矿物油，5,000rpm离心10s；置HYBAID PCR仪上进行扩增，相应的循环条件和温度列表如下：

循环数	变性	复性	聚合
				首轮循环	94℃，3min	58℃，40s	72℃，1min
后续循环（30个）	94℃，40s	58℃，40s	72℃，1min
				末轮循环	94℃，40s	58℃，40s	72℃，10min

PCR产物按前法电泳检查，看是否有条带及条带是否正确。

（10）阳性重组子质粒的抽提和鉴定：

选PCR阳性重组子（单个菌落）2-3个的培养液，分别取100μL接种LA培养液20mL，37℃下以220rpm振摇培养过夜。从中取1.5 mL菌液，加入1.5mL Eppendorf管，15,000rpm离心10s，倒掉上清液，再加入1.5mL菌液，同样离心，取沉淀。在其中加入10μL溶液A和200μL溶液B（DNA快速纯化回收试剂盒，德国QIAGEN公司产品），用力充分振荡悬浮，室温静置10分钟。加入200μL溶液E，轻轻颠倒混匀4-6次，见溶液变粘即可。加入200μL溶液C，用力颠倒混匀4-6次，见到白色沉淀。12,000rpm离心5min，取上清到离心柱中，室温静置5min。8,000rpm离心60s，弃下清，柱中加入500μL溶液D，8,000rpm离心60s，弃下清。重复一次。15,000rpm离心60s，去除残留水份。取离心柱置于1.5mL Eppendorf管中，加入55℃预热的溶液F 30μL，在55℃恒温箱中保温10min，12,000rpm离心60s，管底溶液即为质粒DNA溶液。

取2-5μL质粒DNA溶液，同前法进行琼脂凝胶电泳，看是否回收到质粒DNA。取抽提出的质粒按照菌液的方法进行PCR扩增鉴定；PCR鉴定阳性的质粒及其菌液，送宝生物（大连）有限公司和上海基康生物技术公司测序。测序应用T7和SP6启动子通用引物，测得的序列合并，经校对后，应用NCBI -BLAST检索其是否是FMDV 3C的序列。

结果获得5个毒株的3ABC和3D基因核苷酸序列，其中L1～L4分离株的3ABC基因全长均为1,311bp，编码437个氨基酸；L5分离株的3ABC基因全长为1,281bp，编码427个氨基酸。5个毒株的3D基因全长均为1,410bp，编码470个氨基酸。5个分离株的3ABCD基因中，L1～L4核苷酸的同源性高达98.7%～99.5％，推导氨基酸序列同源性高达98.8％～99.3％；L5株的基因与前4株基因的核苷酸同源性介于91.6％～92.3％，氨基酸同源性约为93％；L5分离株与2002年的香港毒株和1999年在台湾流行泛亚的O型泛亚毒株同源性较高，而且它们的3A蛋白都缺失10个氨基酸残基。SOSUI软件分析得出5株FMDV的跨膜区主要存在于3A蛋白的1～23氨基酸处和56～77氨基酸处。

2. 利用前文所述的根据3ABC和3D基因设计的特异性引物对T4-3A/T4-3C和T4-3D1/T4-3D2，以及根据3B基因设计的特异性引物对T4-3B1/T4-3B2：

上游引物T4-3B1：SEQ ID: No.6；

下游引物T4-3B2：SEQ ID: No.7。

用PCR方法从上述3ABC和3D基因克隆到pGEM-T Easy载体中得到的重组质粒中，扩增编码3ABC、3B、3D基因片段，大小分别为1,311bp、213 bp和1,410bp，各编码437、71和470个氨基酸。

由于3ABC和3D基因存在EcoRⅠ酶切位点（GAATTC），而表达质粒pSOC和噬菌体穿梭质粒pR只能用EcoRⅠ酶切位点插入外源基因，利用引物对T4-3A/T4-3C和T4-3D1/T4-3D2，进行拼接重叠延伸聚合酶链反应，对3ABC（含3B）和3D基因EcoRⅠ酶切位点进行定点突变。突变好的3ABC和3D基因和3B基因通过EcoRⅠ限制位点分别插入pSOC表达质粒soc基因的3’端，获得重组质粒pSOC-3ABC、pSOC-3B和pSOC- 3D。用上述重组表达质粒分别转化E.coli BL21（DE3）菌株，在1mmol/L IPTG诱导下进行表达。

经SDS-PAGE和Western-Blot检测表明，获得了3种融合蛋白SOC-3ABC、SOC-3B和SOC-3D，其最高表达量分别占菌体蛋白量的26.3%、29.8%和24.5%，分子量大小分别为57Ku、17Ku和63Ku，该蛋白条带可与FMDV感染血清特异性结合。

将3ABC、3B、3D基因片段插入pR整合质粒的EcoRⅠ限制位点，获得重组整合质粒pR-3ABC、pR-3B和pR-3D，用此重组质粒分别转化E.coli E2感受态细胞获得重组菌pR-3ABC-E2、pR-3B-E2和pR-3D-E2。

将重组菌与溶菌酶基因缺陷的T4噬菌体T4-Z1进行同源重组并用特异性引物进行PCR筛选，将含有3ABC、3B、3D基因的噬菌体命名为ΦT4-3ABC、ΦT4-3B和ΦT4-3D。

采用SDS-PAGE和Western-Blot检测纯化的重组噬菌体ΦT4-3ABC、ΦT4-3B和ΦT4-3D，在电泳凝胶和硝酸纤维素膜上检测到分子量大小分别为57Ku、17Ku和63Ku的特异性蛋白条带，该蛋白条带可与FMDV感染血清特异性结合。

采用3B基因引物T4-3B1/T4-3B2从质粒T-3ABC-L1质粒中扩增3B基因，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将3B基因插入线性化载体pET32a-（+）载体和pEM中，经过PCR筛选，获得2个重组子pET-3B和pEM-3B，分别转化E.coli BL-21（DE3），在1mmol/L IPTG诱导下进行表达。

经SDS-PAGE和Western-Blot检测表明，获得2种融合蛋白0M-3B和EM-3B，其最高表达量分别占菌体蛋白量的26.0%和50.0%，分子量大小分别为31Ku和40Ku，两种融合蛋白均能与FMDV感染血清发生特异性结合反应。对融合蛋白EM-3B进行纯化和含量测定，经紫外分光光度计测定，纯化后的EM-3B蛋白浓度为2.188 mg/mL。

将重组噬菌体ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D进行大量扩增、收集和纯化，与纯化的可溶性表达的融合蛋白EM-3B作为诊断抗原，建立了4种FMDV NSP的抗体检测DIVA-ELISA试剂盒。

所述试剂盒的组成为：

预包被板：3块预包被ELISA微孔板：一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原，一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3B抗原，一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3D抗原；

酶结合物：山羊抗猪抗体-辣根过氧化物酶（1:1）结合物水溶液，浓度为55μmol/L；

洗涤液：0.15mol/L、pH7.2的PBS；

底物：含0.1%g/mL TMB水溶液；

显色剂：含0.015%g/mL H₂O₂水溶液；

终止液：2mol/L的H₂SO₄；

阳性对照品：含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1：500进行稀释，添加0.1% g/mL叠氮化钠作保护剂；

阴性对照品：不含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1：500进行稀释，添加0.1% g/mL叠氮化钠作保护剂。

所述试剂盒的使用方法如下：

①用蒸馏水或去离子水将浓缩洗涤液按1：10的体积比稀释。用样本稀释液将待检血清按1:100的体积比稀释，充分混匀。阴、阳对照不用稀释，直接加样。

②向每个样本检测孔中分别加已稀释样本血清100μL，同时设阴性、阳性及空白对照各一孔，取阴性、阳性对照各100μL分别加入反应孔内，空白对照孔仅加入100μL样本稀释液。37℃避光反应30分钟后甩去孔内液体，每孔注满工作洗涤液洗涤3次，每次均需停留1分钟后再甩净拍干。

③除空白对照孔外其余每孔加酶结合物1滴，37℃避光反应30分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干。

④加底物和显色剂各一滴，混匀，37℃下避光显色10分钟。加终止液一滴，混匀，终止反应（加终止液后蓝色会变为黄色）。

⑤以空白对照调零，620nm作参比波长，用酶标仪于450nm读取O.D值，若检孔O.D值大于阴性对照2.1倍则为阳性；当阴性对照O.D值低于0.08时按0.08计算。

4种ELISA方法均能区分注苗动物和自然感染动物，具有很高的特异性（对于未免疫猪的特异性为100％）和敏感性（感染豚鼠的敏感性均大于97.5％），并且不受不同血清型FMDV感染的限制。

最适ELISA工作浓度的测定

为了消除ΦT4噬菌体和大肠杆菌的干扰，在ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D作为包被抗原的间接ELISA中，向抗体稀释液（0.1%BSA，添加0.1%叠氮化钠作保护剂）中加入1%ΦT4噬菌体，在EM-3B间接ELISA的抗体稀释液中加入1％的大肠杆菌破碎产物。

采用棋盘滴定方法，测得最佳的抗原抗体反应的稀释浓度分别为：

纯化重组噬菌体ΦT4-3B以1:20稀释，阳性血清1:20倍稀释P/N值较大，为4.07；

纯化重组噬菌体ΦT4-3ABC以1:20稀释，阳性血清1:20倍稀释P/N值较大，为5.85；

纯化重组噬菌体ΦT4-3D以1:20稀释，阳性血清1:20倍稀释P/N值较大，为4.17；

纯化蛋白EM-3B以1:40稀释，其含量为54.7μg/mL，阳性血清1:20倍稀释P/N值较大，为8.58。

1. 为了检验本实验所用的无免疫无感染血清的背景，采用现有技术中的两种试剂盒对40份无免疫无感染猪血清进行测定。

（1）按照中国农业科学院兰州兽医研究所研制的口蹄疫非结构蛋白3ABC-I-ELISA试剂盒（批号2005101908）的说明书进行测定，将待检血清和阴性、阳性对照血清进行1:21倍稀释后检测。

实验成立的条件是：阳性对照平均OD值应大于0.6，阴性对照平均OD值应小于0.2。本次实验测出的阳性对照平均OD值为0.608，阴性对照平均OD值0.045，符合实验成立的条件。

根据以下标准进行判定：抗体效价=（样品的OD450值-阴性血清的OD450均值）/（阳性血清的OD450均值-阴性血清的OD450均值），若效价<0.2为阴性，效价>0.3为阳性，效价0.2～0.3为可疑。本次实验的测定结果是，40份血清全部为阴性。

（2）按照北京世纪元亨动物防疫技术有限公司研制的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒（批号CB05040701）的说明书进行测定。首先将待检血清1:1比例进行稀释，阴性、阳性对照血清不用稀释进行检测。

实验成立的条件是：阴性对照平均OD值-阳性对照平均OD值应≥0.6，阳性对照阻断率均≥55％。本次实验测出的阳性对照OD值分别为0.426、0.370，阳性对照平均OD值为0.398；阴性对照OD值分别为1.402、1.368，阴性对照平均OD值为1.385；阴性对照平均OD值-阳性对照平均OD值=1.385-0.398=0.987≥0.6，阳性对照阻断率分别为69.2％和73.3％，均符合试剂盒的实验条件。

根据以下标准进行判定：阻断率（Inh%）=（阴性对照平均OD值-样品OD值）/阴性对照平均OD值×100％，被检血清样品（猪血清）阻断率（Inh%）≥30％，判为FMDV-NS抗体阳性；20％≤Inh%<30%，判为FMDV-NS抗体可疑；Inh%<20%，判为FMDV-NS抗体阴性。本次实验的测定结果是，全部40份血清样品的阻断率都低于10％，均为阴性血清。

2. 以最适抗原包被浓度包被ELISA板，即纯化重组噬菌体ΦT4-3B、ΦT4-3ABC、ΦT4-3D以1:20稀释，纯化蛋白EM-3B以1:40稀释，随机取无免疫无感染的40天龄的保育猪血清样品40份、标准阳性感染血清1份、标准阴性血清1份，全部血清稀释1:20倍后进行ELISA检测，测定血清的OD450值。

采用ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B 4种不同NSP抗原建立的DIVA-ELISA方法测定的40份非免疫非感染的血清样品的平均OD450值分别为：0.3023、0.2862、0.3122、0.2910；均差（SD）分别为0.0389、0.0383、0.0365、0.0420。参考中国农业科学院兰州兽医研究所刘在新等（2005）制定的临界值判定标准：阴性血清最高效价=血清的OD450均值+2SD，阳性血清最低效价=血清的OD450均值+3SD，校正后阴性血清效价上限=（阴性血清最高效价-阴性血清的OD450均值）/（阳性血清的OD450均值-阴性血清的OD450均值），校正后阳性血清效价下限=（阳性血清最低效价-阴性血清的OD450均值）/（阳性血清的OD450均值-阴性血清的OD450均值）。

因此，根据公式：阴性血清最高效价=血清的OD450均值+2SD，阳性血清最低效价=血清的OD450均值+3SD，计算出4种不同NSP抗原DIVA-ELISA方法测定的阴性血清最高效价分别为：0.3801、0.3628、0.3852、0.3750；阳性血清最低效价分别为：0.4190、0.4011、0.4217、0.4170；标准猪O型阳性血清OD450均值分别为：0.996、0.963、0.958、1.029；标准猪阴性血清OD450均值分别为：0.230、0.208、0.242、0.215；因此计算出校正后阴性血清效价上限都是0.2，校正后阳性血清效价下限都是0.3。由此确定4种不同NSP抗原建立的DIVA-ELISA方法的判断标准为：检测样本血清的抗体效价小于0.2为阴性，介于0.2～0.3之间为可疑，大于0.3为阳性。

又，根据公式：抗体效价=（样品的OD450均值-阴性血清的OD450均值）/（阳性血清的OD450均值-阴性血清的OD450均值），计算每一份无免疫无感染血清的效价，结果显示，采用四种DIVA-ELISA方法的测定结果，40份猪未免血清效价都低于0.2，属于阴性血清。本实验4种间接ELISA方法对于未免猪的特异性达到100％，与上述现有技术中的两个试剂盒对未免猪检测结果的符合率达到100％。

将4种NSP抗原按照最佳浓度稀释后以100μL/孔包被酶标微孔板，4℃过夜，加入稀释好的血清后分别用5%脱脂奶粉、1%BSA和1%明胶作为封闭液，封闭时间2 h。对不同样品分别三次测定P/N值，进行ELISA实验，结果以5%脱脂奶粉/PBS或1%BSA/PBS封闭效果较好。因此，后续实验选用5%脱脂奶粉/PBS作为封闭液。

以最适浓度抗原包被酶标板，加入阳性和阴性对照血清反应，按ELISA步骤进行操作，采用不同的反应时间进行实验：抗原与一抗的反应时间分别为30 min、60 min和90 min，与二抗的反应时间分别为30 min、60min与90 min。同一样品进行反复三次测定OD450，计算出P/N值，选择合适的反应时间。结果表明，抗原与一抗和二抗的反应时间均采用60min的效果最好。因此，后续实验选用抗原与一抗和二抗反应时间各为60min作为最佳孵育时间。

用最适浓度抗原包被酶标板：100μL/孔，置于4℃冰箱过夜，分别加入对照血清测定其特异性。对照血清分别为豚鼠O型FMD阳性血清、豚鼠FMD阴性血清、豚鼠A型FMD阳性血清、豚鼠Asia1型FMD阳性血清、豚鼠C型FMD阳性血清、猪标准O型阳性血清、猪标准阴性血清、猪水疱病阳性血清、猪瘟阳性血清。

采用ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B 4种抗原建立的DIVA-ELISA方法测定的标准豚鼠O型阳性血清OD450均值分别为：1.010、1.015、1.064、1.770；标准豚鼠阴性血清OD450均值分别为：0.239、0.227、0.257、0.229；根据公式抗体效价=（样品的OD450均值－豚鼠阴性血清的OD450均值）/（豚鼠O型FMD阳性对照血清－豚鼠阴性血清的OD450均值），计算出4种DIVA-ELISA方法测定的豚鼠A型FMD阳性对照血清的效价分别为：0.59、0.66、0.44、0.76；豚鼠Asia1型FMD阳性对照血清的效价分别为：0.66、0.68、0.49、0.88；豚鼠C型FMD阳性对照血清的效价分别为：0.53、0.54、0.34、0.36，根据抗体效价大于0.3为阳性的判定标准可以得出，4种DIVA-ELISA方法无血清型特异性，与 O型、A型、Asia1型和C型的标准血清有交叉反应，每一种间接ELISA方法都可以同时测出O型、A型、Asia1型和C型的感染血清中的非结构蛋白抗体。

采用ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B4种抗原建立的DIVA-ELISA方法测定的标准猪O型阳性血清OD450均值分别为：1.036、1.125、0.996、1.118；标准猪阴性血清OD450均值分别为：0.201、0.193、0.201、0.196；根据公式抗体效价=（样品的OD450均值－猪阴性血清的OD450均值）/（猪O型FMD阳性对照血清－猪阴性血清的OD450均值），计算出4种DIVA-ELISA方法测定的猪水疱病标准阳性血清的效价分别为：0.14、0.12、0.15、0.12；猪瘟标准阳性血清的效价分别为：0.12、0.13、0.13、0.14。根据抗体效价低于0.2为阴性的标准可以判定4种方法与猪水疱病标准阳性血清和猪瘟标准阳性血清无交叉反应性，特异性良好。

ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B四种诊断抗原的阻断实验的（N-P）/N=（未阻断孔OD值-阻断孔OD值）/未阻断孔OD值均大于0.5，其中用猪阳性血清阻断，ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B诊断抗原的（N-P）/N分别为0.605、0.578、0.580和0.681。表明本研究采用4种不同NSP抗原建立的DIVA-ELISA方法特异性良好。

以ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B为包被抗原，分别取5份待检的豚鼠感染血清在同一条件下重复5次实验，求出变异系数（CV）。结果表明，4个DIVA-ELISA试剂盒的变异系数都小于8％，说明在不同时间的操作具有良好的重复性。

用已建立的4种ELISA方法检测40份送检猪免疫血清（免疫2次以上的母猪血清），同时用两种现有试剂盒进行对照，根据检测样本血清的抗体效价小于0.2为阴性，介于0.2～0.3之间为可疑，大于0.3为阳性的标准进行结果判断。

用本发明建立的ΦT4-3ABC-I-ELISA方法对于经过多次免疫的猪的血清进行测定，根据效价介于0.2～0.3之间为可疑的判定标准，40份免疫血清中有5份为可疑血清，该ELISA方法对于免疫猪的特异性为87.5％（35/40），远远低于对于未免猪的特异性（100％）；ΦT4-3B-I-ELISA方法检测结果中有2份可疑血样，该方法对于免疫猪的特异性为95％；EM-3B-I-ELISA方法检测结果中有2份可疑血样，该方法对于免疫猪的特异性也是95％；ΦT4-3D-I-ELISA方法检测结果中有2份阳性，10份可疑血样，该方法对于免疫猪的特异性只有70％。说明猪体经过FMD疫苗多次免疫后FMDV非结构蛋白3D抗体大大提高，而3ABC抗体也略有升高。

从两种现有试剂盒的实验结果可以看出，兰州兽医研究所研制的3ABC-I-ELISA试剂盒检测40份猪免疫血清中，有4份呈现抗体可疑，对于免疫猪的特异性为90.0％（36/40），而口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒检测结果中只有1份可疑血清，对于免疫猪的特异性为97.5％（39/40）。

用本发明建立的ELISA方法检测40份具有明显的临床症状的人工感染豚鼠血清，同时用两种现有试剂盒进行对照。

取40份具有明显的FMD临床症状的豚鼠的FMD感染血清，用本研究建立的ΦT4-3ABC-I-ELISA方法、ΦT4-3B-I-ELISA方法和ΦT4-3D-I-ELISA方法检测全部为阳性，对于感染豚鼠的敏感性高达100％；而由EM-3B-I-ELISA方法检测只有39份阳性，1份为可疑，对于感染豚鼠的敏感性为97.5％。

使用两种现有试剂盒对同样的40份豚鼠FMD感染血清进行检测，其中兰州兽医研究所研制的3ABC-I-ELISA试剂盒检测40份感染血清全部为阳性，对于感染豚鼠的敏感性为100％；而口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒检测结果中有1份可疑血清（根据口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒对于其它动物血清的阻断率Ihn%≥40％为阳性，20％≤Ihn%<30％为可疑，Ihn%<20％为阴性的判定标准可以得出，40份豚鼠感染血清中有一份是可疑血清）对于感染豚鼠的敏感性为97.5％（39/40）。

除了ΦT4-3D-I-ELISA方法检测结果与3ABC-I-ELISA试剂盒和单抗阻断ELISA试剂盒检测结果符合率低于95％，分别为91.67％和89.17％以外（说明免疫动物体内含有较高水平的3D抗体）。本发明的其它3种间接ELISA方法与现有技术的两个试剂盒进行检测结果比较，符合率皆大于95％。

总的来讲，对于未免疫猪而言，本实验采用ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D、和EM-3B 4种不同抗原建立的4种DIVA-ELISA方法（ΦT4-3ABC-I-ELISA方法、ΦT4-3B-I-ELISA方法、ΦT4-3D-I-ELISA方法、EM-3B-I-ELISA方法）具有很高的特异性，全部为100％，与猪瘟和猪水疱病无交叉反应性，而且4个ELISA方法无型特异性，即不受不同血清型FMDV感染的限制。

对于经过多次免疫猪而言，本实验建立的4种DIVA-ELISA方法的特异性有所下降，特异性高低依次为：ΦT4-3B-I-ELISA方法的特异性=EM-3B-I-ELISA方法的特异性（都为95％）> ΦT4-3ABC-I-ELISA方法的特异性（87.5％）> ΦT4-3D-I-ELISA方法的特异性（70％），说明猪经过多次免疫后，非结构蛋白3D抗体大大升高，而3ABC抗体也略有升高。使用两种现有试剂盒也同样证实这一点。

对于感染FMD的豚鼠而言，本实验使用ΦT4-3ABC、ΦT4-3B、ΦT4-3D和EM-3B 4种不同抗原建立的DIVA-ELISA方法具有很高的敏感性，ΦT4-3ABC-I-ELISA方法、ΦT4-3B-I-ELISA方法、ΦT4-3D-I-ELISA方法和EM-3B-I-ELISA方法敏感性分别为100％、100％、100％和97.5％。这与两个现有试剂盒的结果相似（敏感性为100％和97.5％）。

本实验使用4种不同抗原建立的DIVA-ELISA方法与现有技术中的两个试剂盒的符合率除了ΦT4-3D-I-ELISA方法略为偏低以外，其它3种间接ELISA方法与试剂盒的符合率都比较高，大于95％。

Claims

1.一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

洗涤液：0.15mol/L、pH7.2的PBS；

底物：浓度为0.1%g/mL的TMB水溶液；

显色剂：浓度为0.015%g/mL的H₂O₂水溶液；

终止液：2mol/L的H₂SO₄；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ELISA微孔板为96孔ELISA微孔板。