CN105137076B - 小片段gG抗原及其在检测伪狂犬病毒gG抗体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测伪狂犬病毒抗体的小片段gG抗原、试剂盒以及检测伪狂犬病毒抗体的方法。该小片段gG抗原在大肠杆菌中主要以可溶的形式表达，表达产物用间接ELISA分析具有免疫原性，且表达产物不需变性、复性处理，提纯简便易行。以初提纯的表达产物作为抗原，可以检测样品中的gG抗体，可以鉴别gG基因缺失疫苗免疫猪和感染野毒的血清学阳性猪，敏感性强、特异性高、操作简便，适合于临床大量检测。

Description

小片段gG抗原及其在检测伪狂犬病毒gG抗体中的应用
技术领域
本发明涉及动物疫病检测领域，具体涉及一种用于检测伪狂犬病毒抗体的gG抗原片段、试剂盒，以及检测伪狂犬病毒抗体的方法。
背景技术
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,伪狂犬病毒)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科中的猪的I型疱疹病毒，它能引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。该病严重危害着全球养猪业，可引起妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎；初生仔猪多为急性致死经过，具有明显的神经症状，死亡率几乎100％；成年猪多为隐性感染。免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略，目前应用比较多的是缺失伪狂犬病毒复制必需基因的伪狂犬病毒弱毒疫苗。gG基因是伪狂犬病毒中的一个分泌性的非必需的糖蛋白基因，标志疫苗是在TK基因缺失的基础上，将病毒的非必需糖蛋白基因进行缺失，这样得到的突变株就不产生被缺失的糖蛋白，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性。将这种双基因缺失疫苗注射动物后，动物不能产生抗所缺失蛋白的抗体。
伪狂犬病毒弱毒疫苗虽然能有效地阻止感染后临床症状的出现，但接种猪仍可能被强毒感染，感染能形成潜伏和随后潜伏感染的病毒能被激活和引起散播，通过血清学方法可以将感染野毒的血清学阳性猪与基因缺失疫苗注射猪区分开来，接种基因缺失疫苗的猪，血清中不含有缺失蛋白的抗体，如果在猪血清中检测出了缺失蛋白的抗体，说明猪已经被伪狂犬病毒的野毒感染。建立伪狂犬病毒的早期快速鉴别基因缺失弱毒疫苗毒和野毒感染的抗体检测方法十分重要。
伪狂犬病毒的抗体检测方法很多，包括乳胶凝集(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)几种。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测伪狂犬病毒抗体的小片段gG抗原、试剂盒以及检测伪狂犬病毒抗体的方法，所述方法可用于鉴别伪狂犬病毒野毒感染动物和gG缺失疫苗免疫动物。
本发明的一方面提供一种用于检测伪狂犬病毒抗体的小片段gG抗原，其氨基酸序列如下：
YADYYDVHIFRSESDDEVVHGDAPEAPEGEEVTEEEAELTSSDLDNIEIEVVGSPAAPAEGPATEEGRGAEEDEELTSSDLDNIEIEVVGSPRPPASSPPPPPPRPHPRGRDHDHDHGHHRADDRGPQRHHRLPPEPT(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，所述小片段gG抗原是重组的。在进一步的实施方案中，所述小片段gG抗原是由大肠杆菌表达的重组多肽。
在一些实施方案中，所述小片段gG抗原除SEQ ID NO:1所示的序列之外，还包含hig tag。
本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原的编码核酸序列。优选所述核酸序列如下：
TACGCCGACTACTACGACGTGCACATCTTCCGCTCGGAGTCTGACGACGAGGTCGTCCACGGCGATGCCCCCGAGGCCCCCGAGGGCGAGGAGGTGACCGAGGAGGAGGCCGAGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGATCGAGGTCGTGGGCTCTCCCGCCGCTCCCGCCGAGGGCCCGGCGACGGAGGAGGGGCGCGGGGCCGAGGAGGACGAGGAGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGATCGAGGTCGTGGGCTCGCCGCGGCCGCCCGCTTCTTCGCCGCCTCCACCACCCCCGCGCCCCCACCCGCGCGGCCGAGATCACGACCATGACCACGGTCACCACCGTGCGGACGACCGAGGACCCCAGCGGCATCACCGACTGCCGCCGGAGCCGACC(SEQ ID NO:2)。
本发明的另一方面提供一种非诊断目的检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的方法，其特征在于，使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体。
在优选的实施方案中，所述检测是定性检测，即检测样品中是否存在伪狂犬病毒gG抗体。
在另一个优选的实施方案中，所述检测是定量检测，即检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的水平。
本发明的另一方面提供一种非诊断目的鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品的方法，其特征在于，使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体，如果样品中存在伪狂犬病毒gG抗体，则样品感染伪狂犬病毒野毒，如果样品中不存在伪狂犬病毒gG抗体，则样品为gG缺失疫苗免疫样品。
本发明的另一方面提供一种用于检测伪狂犬病毒抗体的试剂盒，其中包含上述小片段gG抗原
在进一步的实施方案中，该试剂盒中进一步包含基于抗原抗体反应的抗体检测方法所需的一种或多种试剂。
在优选的实施方案中，所述一种或多种试剂是间接ELISA方法所需的一种或多种试剂，可以选自：96孔板、包被液、洗液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗、显色剂、终止液、阳性对照、阴性对照以及其它所需的试剂。
其中，包被液可以是pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，其中含Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)。
其中，洗液可以含有NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO41.42g/L，KH2PO40.27g/L、0.05％Tween-20,pH7.2。
其中，封闭液可以含有NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO41.42g/L，KH2PO40.27g/L、0.05％Tween-20、BSA 50g/L。
其中，样品稀释液可以含有NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO41.42g/L，KH2PO40.27g/L、0.05％Tween-20,BSA 1g/L，pH7.2。
其中，显色液A液可以含有醋酸钠27.2g/L、柠檬酸27.2g/L、30％H2O20.6ml/L，显色液B液可以含有EDTA-Na 0.4g/L、柠檬酸1.9g/L、甘油100ml/L、TMB 0.4g/L。
其中，终止液可以是每L蒸馏水中含108.5ml浓硫酸，逐滴加入。
所述阳性对照可以是感染伪狂犬病毒野毒的动物的阳性血清，所述阴性对照可以是未感染伪狂犬病毒野毒，也未接种伪狂犬病毒疫苗的动物的血清。
本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列或上述试剂盒在非诊断目的检测样品中伪狂犬病毒gG抗体中的应用。
本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列或上述试剂盒在非诊断目的鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品中的应用。
本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列或上述试剂盒在制备用于检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的试剂中的应用。
本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列或上述试剂盒在制备用于鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品的试剂中的应用。
在优选的实施方案中，在上述方法和应用中，所述“检测样品中伪狂犬病毒gG抗体”可以是使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体。
在优选的实施方案中，在上述方法和应用中，所述“鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品”可以是使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体，如果样品中存在伪狂犬病毒gG抗体，则样品感染伪狂犬病毒野毒，如果样品中不存在伪狂犬病毒gG抗体，则样品为gG缺失疫苗免疫样品。
在进一步优选的实施方案中，所述基于抗原抗体反应的抗体检测方法包括以下步骤：(1)将上述小片段gG抗原固定于基质上；(2)在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下，使固定有上述小片段gG抗原的基质与待测样品接触；(3)对形成的抗原抗体免疫复合物进行检测。
在进一步优选的实施方案中，所述基于抗原抗体反应的抗体检测方法是间接ELISA方法、乳胶凝集试验或间接血凝试验。
在特别优选的实施方案中，所述基于抗原抗体反应的抗体检测方法包括以下步骤：(1)用纯化的上述小片段gG抗原包被固相支持物；(2)在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下，使固定有上述小片段gG抗原的固相支持物与待测样品温育；(3)清洗除去未结合的抗体；(4)加入经标记的第二抗体，在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下温育；(5)清洗除去未结合的第二抗体；(6)检测温育混合物中的抗原抗体免疫复合物。
其中，所述样品可以是来自受试者的血液、血清、血浆、尿液、体液、唾液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。
其中，所述固相支持物可以是有机或无机多聚物。
其中，所述第二抗体可以是抗IgG抗体、抗IgM抗体和/或抗IgA抗体，且用放射性同位素标记，或用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶进行标记。
在特定的实施方案中，上述步骤(6)“检测温育混合物中的抗原抗体免疫复合物”是显色后测定450nm波长的OD值，如果待检样品孔的OD平均值与阴性对照孔的OD平均值之比大于等于2.1，则待检样品为阳性。所述“阳性”表示样品中存在伪狂犬病毒gG抗体，或者样品感染伪狂犬病毒野毒
在优选的实施方案中，所述动物是猪。
所述样品是指来自受试者的血液、血清、血浆、尿液、唾液、体液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。在优选的实施方案中，所述样品是血清。
本发明人通过对伪狂犬病毒gG蛋白的抗原片段进行筛选，获得了一种小片段gG抗原，该抗原片段在大肠杆菌中主要以可溶的形式表达，表达产物用间接ELISA分析具有免疫原性，且表达产物不需变性、复性处理，提纯简便易行。以初提纯的表达产物作为抗原，可以检测样品中的gG抗体，可以区分gG基因缺失疫苗免疫猪和感染野毒的血清学阳性猪，敏感性强、特异性高、操作简便，适合于临床大量检测。
本发明的优点如下：
(1)操作简便：应用本发明的小片段gG抗原检测猪血清的gG抗体，操作步骤少，普通实验人员即可掌握操作方法，易于推广。
(2)可用于gG基因缺失苗的鉴别诊断，用于区分疫苗免疫和野毒自然感染产生的抗体。
附图说明
图1是转化有重组质粒pET32a-gG的大肠杆菌BL21的未诱导菌液和IPTG诱导菌液的SDS-PAGE图。其中第1泳道是Marker，第2泳道是未诱导菌液，第3和第4泳道是IPTG诱导菌液。
图2是转化有重组质粒pET32a-gG的大肠杆菌BL21的IPTG诱导菌液的上清和沉淀的SDS-PAGE图。其中第1泳道是上清，第2泳道是沉淀。
图3用His单抗鉴定表达蛋白的Western blot图。
图4是用阳性血清和阴性血清鉴定表达蛋白的Western blot图。其中阳性血清是伪狂犬病毒阳性猪的血清，阴性血清是未感染伪狂犬病毒也未接种伪狂犬病毒疫苗的猪的血清。
图5是用小片段gG抗原进行ELISA检测时，阴性样品的OD值。
图6是用小片段gG抗原进行ELISA检测时，弱阳性样品的OD值。
图7是用小片段gG抗原进行ELISA检测时，阳性样品的OD值。
具体实施方式
除非另有说明，本文中所使用术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。
本发明中使用的术语“gG抗原”是指具有抗原性的伪狂犬病毒gG蛋白的片段，其可以是伪狂犬病毒gG蛋白全长或它的一部分。
本发明中使用的术语“gG抗体”是指动物在感染伪狂犬病毒野毒、或者接种了非gG缺失疫苗之后，体内产生的能识别gG抗原的抗体。
本发明中使用的术语“基于抗原抗体反应的抗体检测方法”是使抗原性物质与待检对象中的相应抗体发生特异性结合反应，通过对该特异性结合反应的检测来检测待检对象中是否存在相应抗体或者检测待检对象中相应抗体的水平的方法。基于抗原抗体反应的抗体检测方法是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于间接ELISA方法、乳胶凝集试验或间接血凝试验。
本发明中使用的术语“样品”是指来自受试者的血液、血清、血浆、尿液、唾液、体液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。
本发明中使用的术语“纯化”是指从天然环境或重组生产来源中分离的多肽。纯化的多肽可以是通过层析技术获得的纯化多肽。
本发明所述的“伪狂犬病毒野毒”是指天然存在的未经基因修饰的伪狂犬病毒。通常伪狂犬病毒野毒包含毒力基因TK、gE、gG、gC、gI等。
本发明所述的“伪狂犬病毒野毒感染动物样品”是指感染伪狂犬病毒野毒的动物的样品。
本发明所述的“gG缺失疫苗免疫动物样品”或“gG缺失疫苗免疫样品”指接种了伪狂犬病毒gG缺失疫苗，且未感染伪狂犬病毒野毒的动物的样品。
本发明所述的“鉴别样品伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品”是指鉴定待检样品是感染伪狂犬病毒野毒的动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品。所述“待检样品”是来自于接种了伪狂犬病毒gG缺失疫苗的动物的样品。伪狂犬病毒的gG缺失疫苗为弱毒疫苗，而伪狂犬病毒野毒为强毒，通常，接种了gG缺失的伪狂犬病毒疫苗的动物也有可能感染伪狂犬病毒野毒，此时可以使用本发明的小片段gG抗原鉴定作为样品来源的动物是感染伪狂犬病毒野毒还是gG缺失疫苗免疫动物。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1：扩增小片段gG抗原，构建重组质粒
以伪狂犬病毒的cDNA为模板，通过PCR方法获得小片段gG抗原的核酸序列。DNA聚合酶/dNTPs/Buffer购自全式金生物技术有限公司，采用20μl PCR体系，其中：
引物序列如表1所示，由生工生物工程有限公司合成。
表1小片段gG抗原扩增引物
引物名称 序列 酶切位点
P1 CGGAATTCTACGCCGACTACTACGACG Ecor1
P2 CCAAGCTTGGGTCGGCTCCGG Hind3
用Ecor1和Hind3分别酶切pET32a载体和小片段gG抗原核酸序列的PCR产物，然后用T4DNA连接酶进行连接，获得重组质粒pET32a-gG。其中，T4DNA连接酶/Buffer购自全式金生物技术有限公司，pET32a购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司，Ecor1和Hind3购自takara公司。
连接体系如下:
将获得的重组质粒按照常规方法转化大肠杆菌DH5α，提取质粒对小片段gG抗原的核酸序列进行测序鉴定，测序由上海生工公司完成，结果如下：核酸序列：
TACGCCGACTACTACGACGTGCACATCTTCCGCTCGGAGTCTGACGACGAGGTCGTCCACGGCGATGCCCCCGAGGCCCCCGAGGGCGAGGAGGTGACCGAGGAGGAGGCCGAGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGATCGAGGTCGTGGGCTCTCCCGCCGCTCCCGCCGAGGGCCCGGCGACGGAGGAGGGGCGCGGGGCCGAGGAGGACGAGGAGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGATCGAGGTCGTGGGCTCGCCGCGGCCGCCCGCTTCTTCGCCGCCTCCACCACCCCCGCGCCCCCACCCGCGCGGCCGAGATCACGACCATGACCACGGTCACCACCGTGCGGACGACCGAGGACCCCAGCGGCATCACCGACTGCCGCCGGAGCCGACC。
对应的氨基酸序列：
YADYYDVHIFRSESDDEVVHGDAPEAPEGEEVTEEEAELTSSDLDNIEIEVVGSPAAPAEGPATEEGRGAEEDEELTSSDLDNIEIEVVGSPRPPASSPPPPPPRPHPRGRDHDHDHGHHRADDRGPQRHHRLPPEPT。
实施例2：小片段gG抗原的表达与鉴定
为表达小片段gG抗原，将重组质粒pET32a-gG转化入表达菌大肠杆菌BL21，37℃摇瓶培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含氨苄青霉素的100mL液体LB中，在37℃以250rpm培养4h，至OD600＝0.6左右。取1mL菌液作为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。预估目的蛋白(小片段gG抗原)加上载体标签蛋白(his tag)的大小约为40kD-50kD。以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示。由图1可见IPTG诱导后的菌液有大量40kD-50kD的蛋白表达。
为确定小片段gG抗原是以可溶形式还是包涵体形式表达，将上述的37℃诱导菌液在4℃以12000g离心5min，弃上清，将沉淀重悬于0.9％NaCl溶液中洗菌，随后在4℃以12000g离心5min，弃上清，得菌体，称菌体重量，并重悬于8mL PBS(pH 7.0)缓冲液中，菌体终浓度为50-100mg/mL。在冰浴条件下用超声波破碎大肠杆菌，超声设置为功率400W，工作15s，间隔45s，全程时间：30min(30次左右)，以菌液由白变透明，且不粘稠为依据。将超声波破碎的菌液在4℃以12000g离心15min，分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测，结果如图2所示，上清条带在40KD-50KD之间表达量最大；沉淀条带中未见大量表达带。
为探索可溶表达条件，在固定IPTG浓度下，分别在30℃和37℃以250rpm诱导4h。结果发现：在30℃条件下，上清目的蛋白含量明显提高。
对30℃条件下以250rpm诱导4h得到的上清目的蛋白进行Western blot鉴定，蛋白表达后使用His单抗和伪狂犬病毒阳性猪的血清作为一抗，进行Western blot检测，结果如图3和图4所示，发现his单抗和阳性血清多抗均能很好地识别表达的蛋白。
实施例3：小片段gG抗原的大量表达与纯化
按照实施例2所述方法进行小片段gG抗原的大量表达，在含氨苄青霉素的液体LB中，在30℃以250rpm培养用重组质粒pET32a-gG转化的大肠杆菌BL21，培养4h，加入终浓度为1mmol/L的IPTG继续培养4h。收获细胞，超声裂解后离心，弃去沉淀，去上清进行蛋白纯化。
使用全式金ProteinIsoTMNi-NTA Resin进行蛋白纯化，步骤如下：
(1)装柱：重悬介质，向层析柱中加入1ml介质，静置。
(2)平衡：用5倍床体积的含有10mM咪唑的可溶性蛋白平衡缓冲液，平衡层析柱。所述可溶性蛋白平衡缓冲液配方:300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑，10mM Trisebase，pH8.0。
(3)上样：将上清上样，流速为1mL/min。
(4)洗涤：用所述可溶性蛋白平衡缓冲液再洗5个床体积，流速为2mL/min，洗去杂蛋白。
(5)洗脱：用含有240mM咪唑的可溶性蛋白平衡缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，240mM咪唑，10mM Trisebase，pH 8.0)洗脱蛋白。
(6)将收集的洗脱液用15mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1.5mL，取1mL 4℃备用，其余-80℃保存。
按照上海生工的蛋白浓度测定试剂盒说明书，用Bradford法检测蛋白的浓度。
实施例4：使用小片段gG抗原检测伪狂犬病毒的gG-ELISA方法
使用实施例3中纯化的蛋白通过ELISA方法检测伪狂犬病毒。其中包被液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液(其中含Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)，PBS含NaCl 8g/L、KCl0.2g/L、Na2HPO41.42g/L，KH2PO40.27g/L，洗液为PBST溶液(含0.05％Tween-20,pH7.2的PBS)，封闭液为含BSA50g/L的PBST溶液，显色液A液含醋酸钠27.2g/L、柠檬酸27.2g/L、30％H2O20.6ml/L，显色液B液含EDTA-Na 0.4g/L、柠檬酸1.9g/L、甘油100ml/L、TMB 0.4g/L，终止液为每L蒸馏水中含108.5ml浓硫酸，逐滴加入。一抗稀释液为每升PBST溶液中含BSA1g，二抗稀释液为每升PBST溶液中含30g BSA。阳性对照为感染伪狂犬病毒野毒的猪的阳性血清，阴性对照为未感染伪狂犬病毒野毒、也未接种伪狂犬病毒疫苗的猪血清。
96孔板购自corning公司，酶标二抗购自北京冠星宇公司，BSA购自Biotopped公司。
检测步骤如下：
(1)包被：向96孔板中加入小片段gG抗原1.092μg和抗原包被液100μl，37℃2hr或4℃过夜。洗液200μl洗涤，3次，每次静置3min。
(2)封闭：向每孔中加入封闭液200μl，37℃1hr或4℃过夜。洗液200μl洗涤，3次，每次3min。
(3)加样：将阴性和阳性对照用一抗稀释液进行50倍稀释之后，分别加在阴性和阳性对照孔中，待检孔第1孔加用一抗稀释液50倍稀释后的待检血清100μl，其它孔对待检血清做倍比稀释，不触及孔底和孔壁，轻晃混匀。
(4)温育：用封板膜封板后置37度，30min。洗液200μl洗涤，3次，每次3min。
(5)加酶标2抗：每孔加酶标抗体100μl(用二抗稀释液20000倍稀释)。
(6)温育：用封板膜封板后置37度，30min。洗液200μl洗涤，4次，每次3min。
(7)显色：显色剂A液与显色剂B液等量混匀，每孔100μl，37℃避光显色10min。
(8)终止：每孔加终止液50μl。
(9)测定：15min内，以450nm波长检测每孔OD值。
(10)结果判定：待检孔的OD平均值比阴性孔的OD平均值大于等于2.1可判为阳性。
实验结果见图5-7。图5是阴性样品的OD值，其中阴性样品是gG缺失苗免疫的实验猪的血清，该实验猪没有自然感染伪狂犬病毒野毒，也没有进行非gG缺失苗免疫。图6是弱阳性样品的OD值，其中弱阳性样品是没有经过伪狂犬病毒疫苗免疫，但具有非gG缺失苗母源抗体的实验猪的血清。图7是阳性样品的OD值，其中阳性样品是用非gG缺失疫苗免疫过的猪的血清。
由实验结果可见，使用本发明的小片段gG抗原，能够区分阴性样品、弱阳性样品和阳性样品，因此可以分辨伪狂犬病毒的gG缺失疫苗免疫猪和野毒自然感染猪。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (11)

1.一种小片段gG抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种编码小片段gG抗原的核酸序列，其序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种用于检测伪狂犬病毒抗体的试剂盒，其中包含权利要求1的小片段gG抗原。
4.权利要求3所述的用于检测伪狂犬病毒抗体的试剂盒，其中进一步包含基于抗原抗体反应的抗体检测方法所需的一种或多种试剂。
5.权利要求4所述的用于检测伪狂犬病毒抗体的试剂盒，其中所述一种或多种试剂选自：96孔板、包被液、洗液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗、显色剂、终止液、阳性对照、阴性对照以及其它所需的试剂。
6.一种非诊断目的检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的方法，其特征在于，使用权利要求1的小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体。
7.一种非诊断目的鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品的方法，其特征在于，使用权利要求1的小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体，如果样品中存在伪狂犬病毒gG抗体，则样品感染伪狂犬病毒野毒，如果样品中不存在伪狂犬病毒gG抗体，则样品为gG缺失疫苗免疫样品。
8.权利要求1的小片段gG抗原、权利要求2的核酸序列或权利要求3的试剂盒在非诊断目的检测样品中伪狂犬病毒gG抗体中的应用。
9.权利要求1的小片段gG抗原、权利要求2的核酸序列或权利要求3的试剂盒在非诊断目的鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品中的应用。
10.权利要求1的小片段gG抗原、权利要求2的核酸序列或权利要求3的试剂盒在制备用于检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的试剂中的应用。
11.权利要求1的小片段gG抗原、权利要求2的核酸序列或权利要求3的试剂盒在制备用于鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品的试剂中的应用。
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