CN107782902A - 一种肌红蛋白单克隆抗体‑酶结合复合物及含有它的检测肌红蛋白含量的试剂盒 - Google Patents

一种肌红蛋白单克隆抗体‑酶结合复合物及含有它的检测肌红蛋白含量的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肌红蛋白单克隆抗体‑酶结合复合物，由肌红蛋白单克隆抗体与胆碱酯酶通过交联反应制得。本发明还公开了一种胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；所述R2试剂的组分包括所述的肌红蛋白单克隆抗体‑酶结合复合物。本发明同时解决了普通免疫比浊法灵敏度低和化学发光免疫分析法价格昂贵的问题，可以广泛推广。

Description

一种肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物及含有它的检测肌 红蛋白含量的试剂盒
技术领域
本发明涉及肌红蛋白测定技术领域，具体地说涉及一种肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物及含有它的检测肌红蛋白含量的试剂盒。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin,MYO)是一种氧结合血红素蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质，它的氧饱和曲线为双曲线型。主要分布于心肌和骨骼肌组织，约占肌肉总量的0.1～0.2％。
测定血清肌红蛋白可用于早期排除急性心肌梗死(AMI)诊断的重要指标，如Myo阴性，则基本排除心肌梗死，还可用于再梗死的诊断，结合临床，如Myo重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展。另外Myo增高，还见于急性心肌梗死早期、急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎、急性或慢性肾功能衰竭、严重充血性心力衰竭和长期休克等。可用于多种临床疾病的诊断。
目前临床上肌红蛋白的检测方法主要有胶体金法、免疫比浊法、免疫荧光法、化学发光免疫分析法等。胶体金法的缺点在于无法准确进行定量且批间差异较大，无法持续监控患者肌红蛋白的水平；免疫荧光法存在反应时间差，对环境要求高，容易受空气尘埃影响的缺点，且多为96人份/盒，使用稀土标记物等缺点也使此免疫方法无法大规模使用；而化学发光免疫分析法多为进口试剂，价格昂贵不利于在基层医院推广。
而免疫比浊法因其检测线性范围宽，且操作简便，易操作，自动化程度高的优点，成为临床测定首选方法，但是目前免疫比浊法存在灵敏度差的缺点，对于心肌梗死的判断不利，因此，本领域需一种能检测便利、灵敏度高、易于推广等优点的肌红蛋白检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种反应灵敏度高的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物及含有它的检测肌红蛋白含量的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，由肌红蛋白单克隆抗体与胆碱酯酶通过交联反应制得。
进一步地，肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的制备方法包括以下步骤：
a)将胆碱酯酶溶于戊二醛溶液中，室温下进行静置，再通过生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，再于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析后，加入甘氨酸，室温下进行反应，之后加入饱和硫酸铵溶液，2～8℃下进行反应，然后离心处理，得到的沉淀溶于磷酸缓冲液中，经过透析，得到肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物；
b)向氯化金溶液中加入柠檬酸三钠，用饱和碳酸钾溶液调节pH至8.5，然后加入肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，搅拌后，加入BSA溶液，混匀，经洗涤、离心处理后，得到所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物。
进一步地，所述戊二醛溶液的浓度为2～10wt％，所述胆碱酯酶的加入量为2～20mg/ml。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，所述胆碱酯酶与肌红蛋白单克隆抗体的质量比例为3:1～1:3。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，甘氨酸的加入量为1M。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的浓度为50mM，pH为9.6。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，所述磷酸缓冲液的浓度为50mM，pH为7.4。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，所述氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液的浓度均为1wt％，所述氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液添加比例为1:1～1:4。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物的加入量为0.2ng/ml。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
进一步地，BSA溶液的加入量为10wt％。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用此条件，产率高，且最终获得的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的质量较好，检测灵敏度高。
一种胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；所述R2试剂的组分包括有所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物。
进一步地，所述R1试剂包括如下组分：
所述R2试剂包括如下组分：
进一步地，还包括肌红蛋白校准品，所述肌红蛋白校准品由两份以上浓度互不相同的肌红蛋白溶液组成。
进一步地，所述肌红蛋白溶液的溶剂为0～200mM的Tris-HCL溶液，且Tris-HCL溶液中含有浓度0.1～1wt％的牛血清蛋白、0.05～0.5wt％的PC-300以及5～50mM的乙二胺四乙酸二钠。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用这种溶剂，测试结果较为准确。
本发明的有益效果体现在：
1.本发明肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物能和人体中的肌红蛋白在特定的反应体系中发生抗原抗体反应形成一定的浊度，从而能够被基于分光光度计的生化分析仪检测到，并通过反应前后浊度的变化程度来对肌红蛋白进行定量分析，反应的灵敏度。
2.本发明胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒是基于本发明肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物的，由于提高了反应的灵敏度，使低含量物质能有效的与抗体结合，以供检测，因此本发明试剂盒具有校测灵敏度高的优点，与电化学发光法测试一致性达到0.99。
3.本发明同时解决了普通免疫比浊法灵敏度低和化学发光免疫分析法价格昂贵的问题，可以广泛推广。
附图说明
图1是实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒与市售肌红化学发光法检测试剂盒对比结果图。
图2是实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒的线性结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明。下面将结合实施例来详细说明本发明。本部分对本发明实验中所使用到的材料以及实验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。
实施例1
一种胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和肌红蛋白校准品；
所述R1试剂由如下组分组成：
所述R2试剂由如下组分组成：
所述肌红蛋白校准品由浓度分别为0ug/L、100ug/L、200ug/L、400ug/L、800ug/L的肌红蛋白溶液组成，溶剂为100mM的Tris-HCL溶液，且Tris-HCL溶液中含有浓度0.5wt％的牛血清蛋白、0.3wt％的PC-300以及30mM的乙二胺四乙酸二钠；
所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，按以下方法步骤制备而成：
a)按10mg/ml的加入量将胆碱酯酶溶于浓度为5wt％的戊二醛溶液中，室温下静置8小时，经生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，胆碱酯酶与肌红蛋白单克隆抗体的质量比例为1:1，在50mM、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析8小时后，加入1M的甘氨酸，室温下反应2小时，加入等体积饱和硫酸铵溶液，6℃下反应2小时，然后4000rpm下离心去除上清液，得到的沉淀溶于50mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，透析8小时，得到肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，向肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物中加入等体积甘油，置于-20℃保存，使用时去除甘油；
b)向1wt％的氯化金溶液中加入1wt％柠檬酸三钠溶液，比例为1:2，用饱和碳酸钾溶液调节pH至8.5，然后加入0.2ng/ml的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，搅拌后，加入10wt％的BSA溶液，混匀，经洗涤、离心处理后，得到所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，向肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物中加入0.1wt％的PEG2000缓冲液，2-5℃保存，使用时去除PEG2000缓冲液。
实施例2
一种胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和肌红蛋白校准品；
所述R1试剂由如下组分组成：
所述R2试剂由如下组分组成：
所述肌红蛋白校准品由浓度分别为0ug/L、100ug/L、200ug/L、400ug/L、800ug/L的肌红蛋白溶液组成，溶剂为0mM的Tris-HCL溶液，且Tris-HCL溶液中含有浓度0.1wt％的牛血清蛋白、0.05％的PC-300以及5mM的乙二胺四乙酸二钠；
所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，按以下方法步骤制备而成：
a)按2mg/ml的加入量将胆碱酯酶溶于浓度为10wt％的戊二醛溶液中，室温下静置8小时，经生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，胆碱酯酶与肌红蛋白单克隆抗体的质量比例为3:1，在50mM、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析8小时后，加入的1M甘氨酸，室温下反应2小时，加入等体积饱和硫酸铵溶液，2℃下反应2小时，然后4000rpm下离心去除上清液，得到的沉淀溶于50mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，透析8小时，得到肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，向肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物中加入等体积甘油，置于-20℃保存，使用时去除甘油；
b)向1wt％的氯化金溶液中加入1wt％柠檬酸三钠溶液，比例为1:1，用饱和碳酸钾溶液调节pH至8.5，然后加入0.2ng/ml的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，搅拌后，加入10wt％的BSA溶液，混匀，经洗涤、离心处理后，得到所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，向肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物中加入0.1wt％的PEG2000缓冲液，2-5℃保存，使用时去除PEG2000缓冲液。
实施例3
一种胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和肌红蛋白校准品；
所述R1试剂由如下组分组成：
所述R2试剂由如下组分组成：
所述肌红蛋白校准品由浓度分别为0ug/L、100ug/L、200ug/L、400ug/L、800ug/L的肌红蛋白溶液组成，溶剂为200mM的Tris-HCL溶液，且Tris-HCL溶液中含有浓度1wt％的牛血清蛋白、0.5wt％的PC-300以及50mM的乙二胺四乙酸二钠；
所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，按以下方法步骤制备而成：
a)按20mg/ml的加入量将胆碱酯酶溶于浓度为2wt％的戊二醛溶液中，室温下静置8小时，经生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，胆碱酯酶与肌红蛋白单克隆抗体的质量比例为1:3，在50mM、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析8小时后，加入1M的甘氨酸，室温下反应2小时，加入等体积饱和硫酸铵溶液，8℃下反应2小时，然后4000rpm下离心去除上清液，得到的沉淀溶于50mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，透析8小时，得到肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，向肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物中加入等体积甘油，置于-20℃保存，使用时去除甘油；
b)向1wt％的氯化金溶液中加入1wt％柠檬酸三钠溶液，比例为1:4，用饱和碳酸钾溶液调节pH至8.5，然后加入0.2ng/ml的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，搅拌后，加入10wt％的BSA溶液，混匀，经洗涤、离心处理后，得到所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，向肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物中加入0.1wt％的PEG2000缓冲液，2-5℃保存，使用时去除PEG2000缓冲液。
实施例4
胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒的检测效果试验
分析方法：两点终点法
反应方向：上升反应
校准方式：logit-log(4P)或SPLINE
测定波长：505nm
测定温度：37℃
样本：R1试剂：R2试剂＝15:225:75(ul)
操作步骤：将225ul R1试剂加入15ul样本，37℃孵育5分钟后加入75ul R2试剂，30S后读取吸光度A1，3分钟后读取吸光度A2；
采用5点定标，在奥林巴斯AU680全自动生化仪上进行检测，校准品浓度分别为0ug/L、100ug/L、200ug/L、400ug/L、800ug/L。
4.1线性相关性
将实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒与市售肌红化学发光法检测试剂盒A对比检测120份血清样本，比较实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒与市售肌红化学发光法检测试剂盒检测结果的相关性。实验数据如表1所示，对比结果见图1(X,Y轴均为测定值，单位mg/L)。
表1
结果为，实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒的线性回归方程为y＝1.0257x-0.9163，相关系数R＝0.9947；
另外，采用相同方法比较，得出：实施例2的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒线性回归方程为y＝1.0123x-0.9304，相关系数R＝0.9867；实施例3的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒线性回归方程为y＝1.0457-0.9238，相关系数R＝0.9901。
结果表明本发明胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒与化学发光法检测试剂盒检测结果相关性较好，血清测试结果一致性良好。
4.2线性范围
取800ug/L的高值校准品，用纯化水分别稀释至800ug/L、400ug/L、200ug/L、100ug/L、50ug/L、25ug/L、12.5ug/L、0ug/L(水)。用实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒进行检测，每个样本重复测3次，分别计算测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。如图2所示，计算线性回归的相关系数r。以稀释浓度(Xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的相对偏差。详见表2。
表2
序号 相对浓度 1 2 3 平均数 绝对偏差 相对偏差
1 800 831.50 788.21 795.34 805.02 0.57 0.07％
2 400 414.95 390.80 402.88 402.87 0.99 0.25％
3 200 193.64 192.39 200.86 195.63 4.98 2.49％
4 100 95.60 102.85 102.90 100.45 0.48 0.48％
5 50 52.68 50.69 47.86 50.41 0.76 1.52％
6 25 24.05 25.45 25.93 25.14 0.65 2.62％
7 13 12.48 12.06 12.78 12.44 0.53 4.23％
8 0 0.25 0.24 0.26 0.25 0.92
结果为，实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒线性范围可达800ug/L，yi的估计值及yi与估计值的相对偏差均小于10％。
另外，采用相同方法测试，得出：实施例2的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒线性范围可达750ug/L，yi的估计值及yi与估计值的相对偏差均小于15％；实施例3的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒线性范围可达780ug/L，yi的估计值及yi与估计值的相对偏差均小于12％。
4.3准确度
取具有溯源性的血清高值质控和低值质控各一份，用实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒进行检测6次，求均值，与靶值质控进行对照。详见表3。
表3
结果表明，实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒的检测结果均值接近靶值，相对偏差较小，准确度好。
另外，采用相同方法测试，得出：实施例2的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒相对偏差为3.25％，1.93％；实施例3的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒相对误差为2.25％，1.63％。
4.4精密度
选取低值血清样本和高值血清样本各一份，使用实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒对同一份血清样本连续测试10次，计算试剂盒检测样本的变异系数。实验数据见表4。
表4
1 176.81 49.24
2 180.30 50.28
3 184.20 51.35
4 184.25 54.59
5 189.38 51.71
6 176.42 50.11
7 178.76 53.16
8 181.12 50.42
9 180.68 55.53
10 182.77 51.42
平均值 181.47 51.78
SD 3.89 2.04
CV 2.14％ 3.94％
检测结果表明，实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒检测高值、低值样本变异系数分别为：2.14％、3.94％，精密度较好。
另外，采用相同方法测试，得出：实施例2的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒检测高值、低值样本变异系数分别为4.63％，3.82％；实施例3的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒检测高值、低值样本变异系数分别为3.26％，4.03％。
4.5定量检测限
选取几个浓度的低值血清(血清加水调试成不同浓度)，用实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒进行重复测试，定量检测限为CV值等于20％时对应的肌红浓度。结果见下表5。
表5
从表5中可以看出，实施例1的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒的定量检测限约为7.3ug/L，其检测灵敏度高。
另外，采用相同方法测试，得出：实施例2的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒检测限约为8.7ug/L；实施例3的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒检测限约为8ug/L。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，其特征在于，由肌红蛋白单克隆抗体与胆碱酯酶通过交联反应制得。
2.如权利要求1所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
a)将胆碱酯酶溶于戊二醛溶液中，室温下进行静置，再通过生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，再于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析后，加入甘氨酸，室温下进行反应，之后加入饱和硫酸铵溶液，2～8℃下进行反应，然后离心处理，得到的沉淀溶于磷酸缓冲液中，经过透析，得到肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物；
b)向氯化金溶液中加入柠檬酸三钠，用饱和碳酸钾溶液调节pH至8.5，然后加入肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物，搅拌后，加入BSA溶液，混匀，经洗涤、离心处理后，得到所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物。
3.如权利要求2所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，其特征在于，所述戊二醛溶液的浓度为2～10wt％，所述胆碱酯酶的加入量为2～20mg/ml。
4.如权利要求2或3所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，其特征在于，所述胆碱酯酶与肌红蛋白单克隆抗体的质量比例为3:1～1:3。
5.如权利要求2或3所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，其特征在于，所述氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液的浓度均为1wt％，所述氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液添加比例为1:1～1:4。
6.如权利要求2或3所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物，其特征在于，所述肌红蛋白单克隆抗体-酶结合物的加入量为0.2ng/ml。
7.一种胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂；所述R2试剂的组分包括如权利要求1至6中任一项所述的肌红蛋白单克隆抗体-酶结合复合物。
8.如权利要求7所述的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，其特征在于，
所述R1试剂包括如下组分：
所述R2试剂包括如下组分：
9.如权利要求8所述的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，其特征在于，还包括肌红蛋白校准品，所述肌红蛋白校准品由两份以上浓度互不相同的肌红蛋白溶液组成。
10.如权利要求9所述的胶乳增强免疫比浊法检测肌红蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述肌红蛋白溶液的溶剂为0～200mM的Tris-HCL溶液，且Tris-HCL溶液中含有浓度0.1～1wt％的牛血清蛋白、0.05～0.5wt％的PC-300以及5～50mM的乙二胺四乙酸二钠。
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